胆汁酸成分及熊胆的医药用途的制作方法

本发明涉及医药保健品领域，特别是涉及一种胆汁酸成分及熊胆的医药用途。

背景技术：

抑郁症是一种常见的精神疾病，主要表现为情绪低落，兴趣减低，悲观，思维迟缓，缺乏主动性，严重者可出现自杀念头和行为。在现代流行病的研究中，抑郁症已经成为人类关注的焦点，预计在未来几年中其将会发展为继冠心病后的第二大疾病，严重危害着人类的健康和生活。

目前临床上常用的抗抑郁药物包括三环类抗抑郁药物、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等，往往副作用大或者价格较为昂贵，限制其临床的广泛应用。通过药物治疗，其中大部分患者可获得不同程度的疗效。另外，在临床上还有相当数量的抑郁性神经症患者,虽然新型抗抑郁药应运而生，但仍满足不了临床各类人群的需求。随着临床用药瓶颈的出现以及对抑郁症发病机制的深入了解，天然抗抑郁药物的研究与开发成为了新的热点和发展趋势。目前常用的抑郁模型有慢性轻度不可预见性应激抑郁模型(CUMS)、药物诱导抑郁模型(糖皮质激素诱导、嗅球切除抑郁模型、转基因动物模型等。虽然诸多模型都不能完全模拟临床抑郁病人的症状，但是可以肯定的是压力能够导致抑郁。因此，压力导致的抑郁动物模型应用较为普遍。慢性轻度不可预见性应激抑郁模型是评价抑郁症状及筛选抗抑郁药物较为有效和可靠的一种模型，通过一系列的动物行为学检测(FST、TST、OFT、EPMT和SIT)，检验模型是否成功。CUMS模型具有高度的有效性，并可持续几个月，基本符合抑郁模型的要求，是目前国内外抗抑郁药物研究中广泛使用的模型。

熊胆是四大名贵动物药之一，为熊科动物的干燥胆囊。熊胆作为药用始载于唐代的《新修本草》，距今已有一千三百多年历史；明代李时珍的《本草纲目》也载有：熊胆，气味苦寒、无毒，入肝胆心经。现代医药学研究证实，熊胆具有清热解毒、疏肝利胆，去翳明目，解痉镇痛作用。在人类的肝胆系统、心脑血管系统、神经精神系统等诸多病症的治疗上，有着广泛的应用价值。人工引流熊胆的干燥品已作为天然熊胆的替代品入药并审批上市，命名为“熊胆粉”，在中医临床上广泛使用。熊胆粉的化学成分主要含结合型熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸等。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供胆汁酸成分及熊胆的新的医药用途。

具体地说，本发明的第一方面是提供了一种式(Ⅰ)化合物在制备防治抑郁症的药物或食品中的应用

其中，R1、R2、R3各自独立地选自H或者OH，R4选自NH(CH2)2SO3H、NH(CH2)2SO3Na或者OH。

在一优选例中，所述化合物为牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸或胆酸。

在另一优选例中，所述化合物作为唯一的活性成分用于制备防治抑郁症的药物或食品。

本发明的第二方面是提供了熊胆在制备防治抑郁症的药物或食品中的应用，所述熊胆以式(Ⅰ)化合物为活性成分：

其中，R1、R2、R3各自独立地选自H或者OH，R4选自NH(CH2)2SO3H、NH(CH2)2SO3Na或者OH。

在一优选例中，所述化合物为牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸或胆酸。

在另一优选例中，所述熊胆作为唯一的活性成分用于制备防治抑郁症的药物或食品。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1慢性不可预见性应激抑郁模型小鼠给予熊胆粉后的行为学表现

A.强迫游泳测试的不动时间；B.悬尾测试的不动时间。(mean±S.E.M,n＝12；与模型组比较*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)

图2胆汁酸标准品总离子流图

1.TUDCA，2.THDCA，3.GUDCA，4.TCA，5.GCA，6.TCDCA，7.UDCA，8.TDCA，9.HDCA，10.GCDCA，11.CA，12.GDCA，13.TLCA，14.CDCA，15.DCA，16.LCA

图3熊胆粉中胆汁酸总离子流图

1.TUDCA，2.TCA，3.Unknow，4.TCDCA，5.UDCA，6.CA，7.Unknow，8.CDCA，9.Unknow

图4慢性不可预见性应激抑郁模型小鼠给予TUDCA、TCDCA、UDCA、TCA、CDCA、CA后的行为学表现

A.强迫游泳测试的不动时间；B.悬尾测试的不动时间。(mean±S.E.M,n＝12；与模型组比较*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)

具体实施方式

本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：胆汁酸成分及熊胆可以降低慢性不可预见性应激抑郁小鼠的在强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，故而其可以作为抑郁症的预防和治疗药物。

如本发明所用，本发明的胆汁酸成分化合物具有如下结构式：

其中，R1、R2、R3各自独立地选自H或者OH，R4选自NH(CH2)2SO3H、NH(CH2)2SO3Na或者OH。

如本领域的普通技术人员所公知，上述化合物分别具有如下结构式：

本发明的胆汁酸成分及熊胆可通过商业途径从黑龙江黑宝药业股份有限公司等处购买获得。其纯度均符合药用标准。

本发明的胆汁酸成分及熊胆可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的胆汁酸成分及熊胆及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的胆汁酸成分及熊胆。“可药用载体”不会破坏本发明的胆汁酸成分及熊胆的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明的胆汁酸成分及熊胆以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。

本发明的胆汁酸成分及熊胆以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

除了制成药剂之外，亦可在本发明的胆汁酸成分及熊胆中加入抗氧化剂、色素、酶制剂等各种食品添加剂，按本领域的常规方法制成保健食品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1熊胆抗抑郁药效学研究

材料：

熊胆粉样品来源：黑龙江黑宝药业股份有限公司，批号：150516+20141112。

方法：

1.慢性不可预见性应激抑郁小鼠模型的建立及给药

四周龄雄性C57BL/6小鼠自购买后，适应性饲养两周，随机分为空白对照组、模型组、阳性药组(文拉法辛12.5mg/kg)、熊胆粉低剂量组(low 0.05g/kg)、熊胆粉中剂量组(middle0.1g/kg)、熊胆粉高剂量组(high 0.2g/kg)，每组12～16只。空白组小鼠每笼4只正常饲养，其他组小鼠单笼孤养，且每天不定时给予以下刺激：①束缚3h，②昼夜颠倒48h，③禁食24h，④禁水12h，⑤冷水浴5min，⑥潮湿垫料12h，⑦夹尾1min，⑧空笼24h(笼中无垫料)，⑨倾斜45°处理24h，⑩大鼠垫料干扰24h。每种刺激不连续重复出现，总刺激时间为5周。在给予小鼠刺激的第三周开始灌胃给药，连续给药两周，其中空白对照组和模型组给予等体积的溶剂。

2.运用行为学检测手段确定熊胆粉的抗抑郁作用

2.2行为学检测：强迫游泳测试(forced swimming test,FST)：将小鼠置于预先注有20cm深清水，温度25±1℃的圆柱型透明器皿内(高30cm，直径20cm)，分别记录每只小鼠在6min内的累计不动时间，比较后4min内的累计不动时间；悬尾测试(tail suspension test,TST)：将小鼠尾部2cm处用胶带固定在一根水平木棍上，使动物呈倒挂状态，其头部离水平面约5～6cm，分别记录每只动物在6min内后4min的累计不动时间。

结果：

研究结果表明：慢性不可预见性应激抑郁模型小鼠给予熊胆粉后发现，小鼠的抑郁症状得到了显著改善(图1)。

从图1A可见，模型组的游泳不动时间较正常对照组相比显著增长(P<0.01)，提示模型组小鼠更容易绝望，造模成功，而给予阳性药及熊胆粉中剂量组和高剂量组后游泳不动时间较模型组相比显著减少(middle vs model P<0.001,high vs model P<0.01,positive vs model P<0.05)，接近正常组。从图1B可见，模型组的悬尾不动时间较正常对照组相比显著增多(P<0.05)，提示模型组小鼠更容易绝望，造模成功，而给予阳性药及熊胆粉中剂量组和高剂量组后悬尾不动时间较模型组相比显著缩短(middle vs model P<0.05,high vs model P<0.001,positive vs model P<0.05)，接近正常组甚至比正常组更短。

实施例2熊胆中胆汁酸成分的检测及抗抑郁药效学研究

1.利用UPLC-MS检测熊胆中的胆汁酸成分

1.1.标准品总离子流图

采用UPLC-MS全扫模式，对标准品进行全扫，得指纹图谱结果如图2。

对照品溶液的制备：取16种胆汁酸对照品(表1)各2mg，精密称定，分别加1mL甲醇使溶解，制成2mg/mL的各对照品溶液。取各对照品溶液适量，加甲醇混匀，制成100μg/mL的混合对照品溶液。

表1

熊胆粉样品来源：黑龙江黑宝药业股份有限公司，批号：150516+20141112。

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH柱(1.7μm,1.0mm×100mm)；以含0.1％甲酸的5mM醋酸铵溶液为流动相A，甲醇为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：45℃；自动进样器温度：4℃；进样体积：5μL。

表2熊胆粉UPLC-MS胆汁酸测定流动相梯度洗脱条件

供试品溶液的制备：取熊胆粉样品100mg，精密称定，加10mL甲醇，超声处理5min，冷却，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液适量，过0.22μm膜，再加甲醇稀释30倍，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。

采用UPLC-MS全扫模式，对熊胆粉样品进行全扫，得指纹图谱结果如图3。如图3所示：熊胆粉中牛磺酸结合型胆汁酸含量最高，游离型胆汁酸较少，不含有甘氨酸结合型胆汁酸。其中牛磺酸结合型胆汁酸含量为49.91％-52.80％；游离型胆汁酸含量为2.06％-2.51％；总胆汁酸含量为51.92％-54.87％。含量最高的TUDCA与TCDCA分别为25.54％-28.02％和22％左右，质量配比(TUDCA/TCDCA)的比值范围为1.1-1.3。其余含量较低的胆汁酸含量分别为TCA(1.56％-1.89％)、CDCA(0.74％-1.67％)、UDCA(0.62％-1.14％)、CA(0.12％-0.19％)。

2.熊胆中胆汁酸成分的药效学研究

四周龄雄性C57BL/6小鼠自购买后，适应性饲养两周，随机分为空白对照组、模型组、阳性药组(文拉法辛12.5mg/kg)、TUDCA组(0.02g/kg)、TCDCA组(0.02g/kg)、UDCA组(0.01g/kg)、TCA组(0.01g/kg)、CDCA组(0.01g/kg)和CA组(0.01g/kg)每组12～16只。造模方法和行为学检测方法均同实施例1。

研究结果表明：TUDCA、TCDCA、UDCA、TCA、CDCA和CA均有抗抑郁的作用(图4)。从图4A可见，模型组的游泳不动时间较正常对照组相比显著增长(P<0.001)，提示模型组小鼠更容易绝望，造模成功，而给予阳性药及TUDCA、TCDCA、UDCA、TCA、CDCA、CA组后游泳不动时间较模型组相比显著减少(TUDCA vs model P<0.05,TCDCA vs model P<0.05,UDCA vs model P<0.05,TCA vs model P<0.001,CDCA vs model P<0.05,CA vs model P<0.001,positive vs model P<0.001)，接近正常组。从图4B可见，模型组的悬尾不动时间较正常对照组相比显著增多(P<0.05)，提示模型组小鼠更容易绝望，造模成功，而给予阳性药及TUDCA、TCDCA、UDCA、TCA、CDCA、CA组后悬尾不动时间较模型组相比显著缩短(TUDCA vs model P<0.01,TCDCA vs model P<0.05,UDCA vs model P<0.001,TCA vs model P<0.05,CDCA vs model P<0.05,CA vs model P<0.05,positive vs model P<0.01)，接近正常组甚至比正常组更短。

研究结论：

以上研究结果表明：熊胆粉及其胆汁酸成分均可以降低慢性不可预见性应激抑郁小鼠的在强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，故而其可以作为防治抑郁症的药物。

本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。