一种水溶性黑色素纳米颗粒的用途的制作方法

本发明涉及一种水溶性黑色素纳米颗粒的用途。

背景技术：

干细胞的移植治疗已经在实验室研究和临床试验研究中得到肯定，而且取得了非常大的进展。在干细胞移植到体内后，监测干细胞在体内的分布、归巢及成活情况，具有非常重要的意义。目前，常用的干细胞活体成像方法主要有磁共振成像、核素成像、超声成像、光学成像以及多种成像方法有机整合后的多模态成像，但这些成像方法均需要标记干细胞。因此，寻找一种不影响细胞活性、对机体毒性较低而且能够长期、稳定的标记干细胞的方法就显得尤为重要。磁共振干细胞示踪技术在目前的组织工程的干细胞研究中应用较多。常用的水溶性黑色素纳米颗粒的用途主要有超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)和钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)。SPIO是一种磁共振阴性对比剂，它可以明显降低T2WI或T2*WI图像信号，其标记方法简单易行，生物相容性较高，而且磁标时间长，敏感度也较高，甚至可检测出单个的磁标干细胞，但是单纯SPIO标记干细胞转染效率较低，需要借助转染剂来提高干细胞的标记率，Fe³⁺浓度过高对细胞的活性会产生一定影响，而且其在T2WI或T2*WI图像上产生的低信号难与出血后的含铁血黄素的低信号区分。Gd-DTPA作为磁共振阳性对比剂，已经被广泛的应用于临床疾病诊断中。近年来，有一些研究将其应用到干细胞的磁共振活体示踪中，其在T1WI图像上呈高信号，但是，Gd-DTPA转染率较低,常常需要借助合适的转染剂来提高转染率，而且敏感性较低，成像效果不佳。

钆是一种非生物稀土金属，其外层含有七个未成对电子，因而具有极强的顺磁性。但其自由离子形式毒性很大，尤其是肾毒性问题已引起了广泛的关注。因此寻找合适的辅助材料对于钆应用于临床非常重要。研究显示，目前临床上所用的钆造影剂会造成使用者急性肾功能衰竭，患者经肾活检显示出现包括不完整管状细胞坏死、肾小管细胞变性和管状细胞增殖等在内的急性肾小管细胞损伤。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水溶性黑色素纳米颗粒的用途，其可以解决现有技术中机体毒性较偏高而且不能够长期、稳定的标记干细胞的缺点。

本发明采用以下技术方案：

一种水溶性黑色素纳米颗粒的用途，其可用于制备干细胞磁性标记物。

所述干细胞磁性标记物为PEG-MNP-Gd3+的螯合物。

所述PEG-MNP-Gd3+的螯合物通过以下方法制备得到：

向配好的MNP-PEG溶液中加入10mg/mL的GdCl3水溶液2.5mL，超声振荡混匀后，40℃下磁力搅拌器搅拌1h；

将混匀后的液体移入50mL，30KD的超滤离心管中，配平；

低速离心机3500r/min，洗涤离心30min，重复4-5次。

PEG-MNP-Gd3+的螯合物为PEG-MNP与钆离子螯合后得到。

所述PEG-MNP为MNP经聚乙烯二醇表面修饰后得到。

所述PEG-MNP通过以下方法制备得到：

将黑色素放于样品瓶中，加入约8mL去离子水，超声水浴振荡溶解；然后先加200μL0.1mol/L NaOH溶液，超声水浴振荡溶解，调节其PH值到9.5；

取PEG 135mg放于玻璃小瓶中，加8mL左右超纯水，超声振荡溶解，然后先加200μL0.1mol/L NAOH超声水浴振荡溶解，调节PH值到9.5；

通入氮气约1min，中间倒入PEG，充分混匀后，测试PH值9.5，磁力搅拌器上常温下搅拌24h；移入超滤离心管，加入超纯水，离心15-20min转速4000-5000r/min，重复洗涤5次，测PH值，调整PH值至6.5-7.5；

将获得的PEG-MNP水溶液移入样品瓶中，调节溶液体积到2mL。

所述的黑色素直径为4.5nm。

所述黑色素为水溶性黑色素颗粒，其通过以下方法制备得到：

称取黑色素50mg，放入白色样品瓶中；

向样品瓶中缓慢加入0.1mol/L NaOH 8-9mL，超声振荡水浴混匀使其溶解；

再缓慢加入0.1mol/L HCl 4-5mL，并超声振荡，调节PH值到7-8；

将溶解好的液体移入50mL,30KD的超滤离心管中，4000-5000r/min离心15min；

离心结束后，继续向超滤离心管中加入双蒸水，再次洗涤离心，重复5-6次，直至过滤后的水泛清；

然后用移液枪移出至15mL的离心管中；

将离心管置入-80℃冰箱冷冻40-60min，取出后置于冷冻干燥机内,24小时后获得量为35mg的水溶性黑色素纳米颗粒。

本发明的优点是：MNP为人体内源性材料，具有安全、无毒、生物可降解、生物相容性好的优点。可以形成PEG-MNP-Gd³⁺螯合物，具有良好的水溶性、分散性和稳定性，该合成方法简单、易于操作，PEG-MNP-Gd³⁺无需转染剂即可成功标记细胞，细胞标记率高，细胞毒性亦非常低，它可以明显缩短磁共振T1弛豫时间，增强T1WI图像的信号，敏感性较高，而且标记时间较长，因此可以通过磁共振直观地、长期监测移植干细胞在体内的归巢、分布及成活情况，实验结果显示其标记后的BMSCs，在一个月后仍可在体内呈高信号。

附图说明

下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明，其中：

图1是本发明的PWS-MNP、PEG-MNP、Gd-PEG-MNP的分子结构式。

图2A的PWS-MNP粒子电镜图。

图2B是显示PWS-MNP粒子动态光散射法显示图。

图3A为MNP-PEG-Gd粒子的电镜图。

图3B为MNP-PEG-Gd粒子动态光散射法显示图。

图4为不同浓度的PWS-MNP、PEG-MNP、Gd-PEG-MNP溶液的T1加权图像图。

图5激光共聚焦显微镜下观察黑色素标记的干细胞图。

图6为PEG-MNP-Gd³⁺标记的干细胞进行活体注射后，不同时间点的T1加权图像。

具体实施方式

下面结合附图进一步阐述本发明的具体实施方式：

本发明公开了一种水溶性黑色素纳米颗粒的用途，其可用于制备干细胞磁性标记物。

所述干细胞磁性标记物为PEG-MNP-Gd³⁺的螯合物。PEG-MNP-Gd³⁺的螯合物为PEG-MNP与钆离子螯合后得到。所述PEG-MNP为MNP经聚乙烯二醇表面修饰后得到。所述的MNP直径为4.5nm。水溶性的黑色素纳米颗粒(PWS－MNP)直径约为4.5nm，经聚乙烯二醇(PEG)表面修饰后，它可以结合多种有机或无机功能基团，来进行多模态成像，甚至可以作为药物的载体，达到治疗疾病的目的。而且研究表明PEG-MNP在浓度低于1.5mg/mL时，不会对细胞产生毒副作用。PEG-MNP与钆离子(Gd³⁺)螯合后，形成PEG-MNP-Gd³⁺(也可示为MNP-PEG-Gd)螯合物，具有良好的水溶性、分散性和稳定性，该合成方法简单、易于操作，PEG-MNP-Gd³⁺无需转染剂即可成功标记细胞，细胞标记率高，细胞毒性亦非常低，它可以明显缩短磁共振T1弛豫时间，增强T1WI图像的信号，敏感性较高，而且标记时间较长，因此可以通过磁共振直观地、长期监测移植干细胞在体内的归巢、分布及成活情况，我们的实验结果显示其标记后的BMSCs，在一个月后仍可在体内呈高信号，如图4、6所示。

天然黑色素为人体内源性材料，安全、无毒、生物相容性好。而PEG-MNP-Gd³⁺螯合物急性毒性很小，且低分子量的MNP-GD的弛豫效能比标准的GD-DTPA的弛豫效能高2倍。人工合成的黑色素结合金属的能力与天然黑色素相同。同时，黑色素结合重金属钆的能力要比它与其他金属的结合能力更强。

实施例1

本发明的水溶性黑色素颗粒(PWS－MNP)，其通过以下方法制备得到：

称取黑色素(MNP)50mg，放入白色样品瓶中；

向样品瓶中缓慢加入0.1mol/L NaOH 8-9mL，超声振荡水浴混匀使其溶解；

再缓慢加入0.1mol/L HCl 4-5mL，并超声振荡，调节PH值到7-8；

将溶解好的液体移入50mL,30KD的超滤离心管中，4000-5000r/min离心15min；

离心结束后，继续向超滤离心管中加入双蒸水，再次洗涤离心，重复5-6次，直至过滤后的水泛清；

然后用移液枪移出至15mL的离心管中，量约2mL左右；

将离心管置入-80℃冰箱冷冻40-60min。取出后置于冷冻干燥机内。24小时后获得量约35mg的水溶性黑色素纳米颗粒。

实施例2

PEG-MNP合成

将获得的水溶性黑色素纳米颗粒放于白色样品瓶中，加入约8mL去离子水，超声水浴振荡溶解；然后先加200μL0.1mol/L NaOH溶液，超声水浴振荡溶解，调节其PH值到9.5。(重复)

取135mg的PEG放于玻璃小瓶中，PEG量为黑色素的5倍量，加8mL左右超纯水，超声振荡溶解，然后先加200μL 0.1mol/L NAOH超声水浴振荡溶解，调节PH值到9.5；

通入氮气约1min(中间倒入PEG)，充分混匀后，测试PH值9.5，磁力搅拌器上常温下搅拌24h；

移入超滤离心管，加入超纯水，离心15-20min转速4000-5000r/min，重复洗涤5次，测PH值，调整PH值至7左右；

将获得的PEG-MNP水溶液移入样品瓶中，调节溶液体积到2mL。

实施例3

MNP-PEG-Gd³⁺纳米颗粒合成

向配好的MNP-PEG溶液中加入10mg/mL的GdCl3水溶液2.5mL，超声振荡混匀后，40℃下磁力搅拌器搅拌1h；

将混匀后的液体移入50mL，30KD的超滤离心管中，配平；

低速离心机3500r/min，洗涤离心30min，重复4-5次，得到MNP-PEG-Gd纳米颗粒。

其结构如图1所示,其结构表征如3所示。

实施例4

将MNP-PEG-Gd纳米颗粒溶液加入干细胞完全培养基中，调节其浓度至0.8mg/mL；

待干细胞长满25cm²的培养瓶时，向四瓶含细胞培养瓶中加入5mL含MNP-PEG-Gd纳米颗粒的培养基，放入5％CO2、37℃培养箱中孵育24h。

实施例5

MNP-PEG-Gd-Rhodamine B纳米颗粒荧光标记干细胞

配制罗丹明B溶液10mg/mL,取250微升加入1mL MNP-PEG-Gd纳米颗粒溶液(5mg/mL)中，此过程中注意避光；

超声振荡5min后，40℃磁力搅拌器搅拌1h；

将液体移入50mL、30KD超滤离心管中，3500r/min离心20min。重复洗涤4-5次；

干细胞铺于激光共聚焦专用皿，5％CO2、37℃培养箱中过夜孵育；

将激光共聚焦皿中的培养基弃去，重新加入1mL新鲜培养基，再加入100微升MNP-PEG-Gd-Rhodamine B溶液；对照组中加入1mL新鲜培养基，50微升罗丹明B溶液；

设置加入MNP-PEG-Gd-Rhodamine B溶液后细胞的孵育时间，实验组与对照组均为1、2、4三个时间点；

取出孵育好的细胞，避光，37℃PBS洗三次，每次3min；

4％多聚甲醛室温固定细胞20min；

DAPI室温下染细胞5-10min，37℃PBS洗涤三次，每次3-5min；

置于激光共聚焦显微镜下观察。

从图5可知，激光共聚焦显微镜下观察黑色素标记的干细胞，DAPI发蓝光，MNP-PEG-Gd-Rhodamine B发红光，发现MNP-PEG-Gd-Rhodamine B分布于胞浆内。

实施例6

干细胞活体MR示踪

取出孵育好的细胞，PBS轻轻冲洗3-4遍，直至冲洗液无色透明；

向每瓶中加入含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，待细胞回缩、变圆后，加入培养基终止消化，进行细胞计数并离心后100微升重悬；

使用1mL注射器抽取细胞悬液；

SD大鼠固定后，将细胞悬液打入大鼠大腿内侧肌肉；

对大鼠进行MR检查，活体示踪标记好的干细胞；如图6所示，可知28天后仍可以观察到高信号。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。