一种继发龋动物模型的制作方法

本发明涉及实验动物模型领域，具体提供了一种继发龋动物模型。

背景技术：

龋病是口腔最常见疾病之一，充填治疗是其最常规治疗方式。充填治疗的充填材料对于继发龋的抑制作用的评估急需解决但尚无可行性方案。自1928年mccollum将动物实验引入龋病研究，龋病的动物实验研究方法不断改进，直至1958年keyes建立了至今仍是最为广泛承认和使用的龋病研究的“keyes龋病动物模型”。keyes模型建立了一套完整的龋病发生，发展和评估的动物模型，多用于各种致龋因素的探究。但随着时代的发展，此方法也逐渐暴露出一些不能与时俱进的问题。最典型的就是，keyes模型适用于自然龋病的评估，并不适用于充填后的继发龋研究，当今用于龋病充填口腔材料层出不穷，对于它们的体外实验也种类繁多，唯独没有一种动物实验模型能够满足充填继发龋的评估，更不要说抑制继发龋的充填材料的评估。

技术实现要素：

基于现有技术仅能满足原发龋病研究，对于抑制口腔继发龋及其药物效用的评估并没有可行动物实验模型的这一问题，本发明提供了一种继发龋动物模型，它包括如下操作：

(1)取除人外的易产龋动物，抗生素处理三天，同时以spf级饲料喂养；

(2)抗生素处理完后，使用spf级饮用水和饲料喂养一天；

(3)麻醉后，在第一磨牙的第一裂隙处制备直径约0.6mm，深0.3-0.6mm的洞型，再在洞型内填入填充物；

(4)从第5日起，在易产龋动物口内接种可致龋的细菌，同时，换用蔗糖水、致龋饲料，饲养3周，即得继发龋动物模型。

本发明所述“易产龋动物”，是指容易产生龋齿的动物。

本发明一个具体实施方式中，蔗糖水的浓度为5％g/ml，致龋饲料为2000#。

其中，步骤(1)中，所述除人外的易产龋动物为啮齿动物或灵长类动物。

其中，所述啮齿选自大鼠，进一步为wistar大鼠或sd大鼠，优选使用wistar大鼠。

进一步地，本发明所使用的wistar大鼠为3周龄。

进一步地，步骤(1)中，所述抗生素为广谱抗生素；进一步选择青霉素类抗生素，优选为氨苄青霉素。本发明一个具体实施方式中，针对相对应的大鼠，给予氨苄青霉素水溶液浓度为1g/l。

进一步地，步骤(3)中，分别在上颌或下颌左右第一磨牙的第一裂隙处制备洞型。

进一步地，步骤(3)中，选择在上颌左右第一磨牙制备洞型。理论上，上下颌都可以，但是下颌的操作性极差，最后使用上颌第一磨牙也是综合了上下颌所有牙做出的选择。

进一步地，步骤(3)中，所述填充物是已知填充材料、待测材料或/和待测药物。填入填充材料后产生的龋称为继发龋。本发明一个具体实施方式中，一侧洞型选用材料为日本可乐丽公司(kuraray)生产的树脂粘结剂(sebond)，另一侧为加个一种抗菌药物dmaddm的sebond，其结果可测评两种药物的抗菌差异。在实际使用的过程中，同一只大鼠的两侧分别为不同药物，可形成在同一个体的左右对照，其数据更具说服力。

进一步地，步骤(4)中所述接种变异链球菌，是将10^8cfu/ml变异链球菌混悬液涂布于口腔内，每日涂布两次，间隔20-40分钟(本发明一个具体实施方式中间隔30分钟)，连续三日。

本发明提供的继发龋动物模型，解决了现无模型适用于充填体抑制继发龋效用评估的弊端，对继发龋填充材料或药物的研究提供了基础。

本发明中，口腔科一切可用于牙齿备洞的器材均可用于制备洞型，进一步地，根据动物口腔的大小，对于大鼠，推荐齿科直机配合长柄求钻，直径约0.6mm。

本发明中选用的洞型尺寸大小，是通过大量的实验数据发现，在操作便捷的情况下，同时满足备洞的固位型和不穿髓，只能采用本发明记录的尺寸范围，也仅有在此范围内才能成功造模。另外，本发明造模过程中，大鼠死亡是前期实验中遇见的一个障碍，实验发现，备洞是导致死亡的最重要操作过程。不仅如此，某些程度的备洞失败(如穿髓)，虽然不会导致死亡，但也导致样本的剔除，所以本发明造模过程中最核心和最“危险”的操作就是备洞。通过大量的实验发现，备洞最重要的就是器械选用和备洞位点，备洞位点如上所述，而器械则选用长柄球钻，球钻直径0.6mm。

基于上述动物模型，本发明还提供了对继发龋药物活性的评估方法，它包括如下操作步骤：

(1)按照上述方法制备继发龋动物模型中，不同的是，在同一动物模型左右制备的洞型中分别填入待测药物或对照物，但至少有一个洞型填入了待测药物；

(2)3周后，处死模型动物，取出备洞磨牙，染色，劈开，显微镜下观察并评分；评分标准如下：

第一，将洞型内全层厚度等分三份，外1/3为浅层(记为s)，1/3-2/3为中层(记为m)，2/3以上为深层x(记为x)；第二，每一层沿着洞缘的总长度等分三份，每一等份设为1个单位，长度的评估在每一层下单独评定，单位最小为1，不可再分；劈开的磨牙最终评分将取决于得分大的一侧；

(3)得到的左右磨牙评分将用于比较继发龋的严重程度，评分越高，说明在此层下龋病越重；比较左右磨牙高低，即可得出待测药物对于继发龋的抑制作用。

本发明各步骤参数和条件环环相扣，是一个有机的整体，只有在本发明所提供的一系列条件下制作模型，才能够达到较为准确的龋齿分级，满足对药物评估的需求。如果随意改变参数条件，例如延长致龋时间、增加菌株接种频率或抗生素处理不足等，龋病情况会有显著影响，例如可能龋病会严重到使双侧的评分都达到最高级(3单位，三层)，导致双侧的对比性消失，左右评估对比失败，所以，本发明所给出的最佳条件，并非是致龋的最佳条件，而是追求达到对龋病程度的控制，使其既不会太严重也不会太轻，保证达到左右可对比的目的。

本发明中3个等级的划分，在理论上具有“不大不小”的程度，如若划分过细(如5个等级)则会大大降低人眼的分辨率，而过粗(如2个等级)则会降低模型的检验效能。

使用本发明评估方法，首次实现了在动物模型中对继发龋药物的活性评价，并且，该方法可以在同一个体上同时进行药物组和对照组的比较，能够较为准确地反映待测药物对继发龋的影响效果。

本发明所述“第一裂隙”(英文为sulci)，在1958年keyes研究中被报道，是指从近中向远中数的第一个裂隙，此为口腔领域术语。

本发明中记载的“第5日”，是从大鼠第一次使用抗生素处理之日起计。

附图说明

图1评分示意图。图中黑色区域用以代替镜下染红的龋坏组织，评分将厚度分为三层，分层评估长度：外层(厚度外1/3)总长度累及约2/3，即3个单位中的2个，中层累及约1个单位，内层为1个单位。最终评分记为(2，1，1)。

图2验证实验评分数据图。评估分为三层，即浅层(s-plane)，中层(m-plane)，深层(x-plane)，药物将在三层上的评分分别被左右配对比较，图2中的a，b，c为三层的比较结果，横坐标：control组是为添加药物的纯粹粘结剂组，dmaddm为加入了此药的粘结剂组；纵坐标：score为评分法的评分，评分越高，说明在此层下某组的龋病越重。最高为3，最低为0。

具体实施方式

实施例1模型的制作方法

1.选取wistar品系大鼠，3周龄，spf级别环境饲养，性别不限，建议雄性。

2.抗生素处理：广谱抗生素水(推荐氨苄青霉素1g/l)；普通spf级别饲料，喂养3天。

3.洗脱：普通spf级别饮用水和饲料喂养一天。

4.充填处理：在洗脱期间完成，腹腔注射麻醉大鼠(推荐10％水合氯醛，根据体重剂量为0.5ml/kg)，使用球钻在其左右上颌第一磨牙的第一裂隙处制备直径约0.6mm，深0.3-0.6mm的洞型，左右洞型内分别充填待测充填材料和对照药物。

5.致龋：从第5日，国际标准变异链球菌ua159，浓度调至10^8cfu/ml，使用棉签蘸取涂于大鼠口内，每日两次，间隔30分钟，连续三日。

6.从第5日，换用5％蔗糖水，2000#致龋饲料，饲养3周即可。

按照实施例1方法，本发明已经成功造模26例，证明该方法重复性较好。

实施例2使用该模型进行评分的方法

(1)3周后，安乐死处死，取出上颌骨(上面包含备洞牙齿)样本用0.4％紫脲酸铵染色12小时，然后沿近远中方向劈开(用于劈颌骨的切割机刀片不厚于0.1毫米)，将处理后的样本置于体视显微镜下观察并评分。

(2)评分：包含两方面，第一，对于洞型内全层厚度的三等分(外1/3为浅层s，1/3-2/3为中层m，2/3以上为深层x)；第二，每一层沿着洞缘的总长度三等分(每一等分设为1个单位)。长度的评估(单位数)将在每一层下单独评定，单位最小为1，不能进一步再分，劈成2侧的样本最终评分将取决于得分大的一半。

(3)镜下，龋坏组织将被染成红色。得到的左右双侧磨牙评分将用于比较双侧继发龋的严重程度，评分越高，说明在此层下某组的龋病越重。从评分比较双侧充填物对于继发龋抑制作用的效用。相关案例评分示意图见图1。

实施例3验证一种季铵盐添加的口腔粘结剂对继发龋的抑制效用

按实施例1、2实施，左右上颌洞型内分别充填季铵盐粘结剂和普通粘结剂，经过致龋，处死，制备样本等过程，评分后统计学检验得到以下结果(图2)。继发龋在三层皆有差异，说明添加季铵盐的粘结剂在浅中深三个层次深度比普通粘结剂有更强的抑制继发龋的效用。

三级的继发龋评分如图2，统计学上显示在三级上左右皆有差异(p<0.05)，说明药物对抑制继发龋有效，三级划分具有可识别的科学性，且有效性能被此方法检出。