种植牙钉的制造方法以及由该方法制得的种植牙钉与流程

本发明属于牙科植入物领域，具体涉及种植牙钉及其制造方法。
背景技术：
：生物医用金属材料中，钛及钛合金材料具有良好的耐腐蚀性、机械性能和生物相容性，广泛用作制造例如种植牙等硬组织植入体。在钛及钛合金表面制备多级微纳结构，有利于植入体与人体骨组织形成良好的“骨结合”，从而改善植入效果，提高植入成功率。研究表明，生物医用金属材料的表面性质，如粗糙度、表面亲水性和表面化学组成等是影响其与骨组织结合的重要因素(CriticalReviewsinOralBioloGY16100090&Medicine1996,7:329-345)。通常，表面带有微米结构和纳米结构的复合结构更有利于细胞的增殖和分化(Biomaterials2011,32:3395-3403)。亲水性较好的表面更有利于细胞早期的粘附和铺展(JBiomedMaterResA2006；76A:323-334)。因此，利用多步表面处理获得合适的表面粗糙度和良好的润湿性能够显著改善植入材料与骨组织的结合，使其与骨组织形成良好的骨性结合。除了粗糙度和亲水性，表面化学组成也是影响生物金属材料与骨结合的一个重要因素。锌作为生命体必需的微量元素之一，对维持多种蛋白功能和结构起到至关重要的作用，对细胞增殖、分化、基因表达和骨整合均具有十分重要的作用。研究表明，锌能刺激细胞增殖，促进细胞碱性磷酸酶活性，促进胶原蛋白合成，提高成骨相关基因的表达(BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2011,412:273-278.)；锌在体内可以有效促进骨长入(Biomaterials2014,35:6882-6897)。从而促进生物植入材料与骨组织形成良好的“骨结合”。钙是人体骨骼的主要元素组成，能促进骨骼生长和成熟。因此，锌或者钙离子注入生物植入材料例如种植牙钉的表面可以有效改善植入材料的成骨活性。银作为一种具有广谱抗菌性的良好无机抗菌材料，早在公元前就已被人们用来预防感染。而银的抗菌机理至今未被完全阐明，有文献报道银能通过与细菌内含有巯基的蛋白质反应，阻碍细菌正常的生命活动从而杀死细菌；也有研究表明银能阻碍电子在细菌膜上的转移，破坏细菌结构(NatMater2008,7:236-241)。另一方面，有研究表明嵌入材料表面的银纳米颗粒不但不会对成骨细胞造成毒性，反而具有一定的促进成骨细胞增殖的作用(Biomaterials2011,32:693-705)。因此，银离子注入种植牙钉表面可以显著提高生物植入材料的抗菌性能。此外，锰是一种对骨生长和发育具有重要作用的微量元素[JournaloftraceelementsinmedicineandbioloGY16100090:organoftheSocietyforMineralsandTraceElements2012,26:149-52.]，是体内碳水化合物的新陈代谢及骨内粘多糖的合成过程中的重要辅因子[Biologicaltraceelementresearch2008,124:28-34.]，在某些关乎新陈代谢的信号通路及细胞内部的稳态平衡中起着重要作用[TrendsinbiotechnoloGY161000902013,31:594-605.]。有研究表明，氧化锰材料还是一种无机抗菌剂，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等多种细菌有较为显著的抑菌杀菌效果[AppliedmicrobioloGY16100090andbiotechnoloGY161000902012,95:213-22；CeramicsInternational2013,39:2239-46.]。因此，本发明在一些方面拟寻求一种方法在种植牙钉的钛表面进行锰元素微量掺杂，以期在种植牙钉中利用的锰元素的各种有益性能。技术实现要素：本发明为了解决现有的种植牙钉的表面亲水性(润湿性)、和成骨活性不佳的问题，利用喷砂处理、酸处理、碱处理、等离子体浸没离子注入和/或热处理多种表面改性方法，在种植牙钉的表面制备多级微纳结构，另外可以进一步地将生物活性元素例如锌或者钙注入到种植牙钉的表面。本发明提出了一种全新的提高种植牙钉润湿性和成骨活性的表面改性方法，从而制造出能够满足种植牙钉的临床应用需求。本发明在第一方面提供了一种制造种植牙钉的方法，所述方法包括如下步骤：(1)喷砂处理：对种植牙钉进行喷砂处理，从而使所述种植牙钉的表面粗糙化；(2)酸处理：对经喷砂处理的种植牙钉进行酸处理，从而使表面形成微米级孔洞；和(3)碱处理：对经酸处理后的种植牙钉进行碱处理，从而使表面形成纳米纤维形成的网络结构；(4)等离子体注入处理：利用等离子体浸没离子注入方法对步骤(3)中得到的种植牙钉注入生物活性元素；和(5)热处理：将步骤(4)得到的种植牙钉在高温下处理以使表层氧化层发生相变从而提高其耐腐蚀性，然后冷却。本发明在第二方面提供了由本发明第一方面所述的方法制得的种植牙钉。由本发明方法制得的种植牙钉具有改善的表面粗糙度、表面亲水性和耐腐蚀性，适合于植入并且适合于细胞在植入后的粘附、铺展、增殖和生长，因而具有改善的骨结合性，所注入的生物活性元素还带来该元素所具有的相应有益效果，例如前文所述的锌、钙、银和/或锰等元素所具有的有益的技术效果。例如，如果对所述种植牙钉进一步进行热处理，可以使得所制得的种植牙钉具有如实施例中所展示的各种有益效果，这些有益效果例如所述种植牙钉的腐蚀性能有所提高，和有利于细胞例如小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)早期粘附、铺展、增殖和生长，以及对例如大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC细胞)的分化和成骨相关基因的表达具有显著促进作用；实施例的细胞粘附和增殖结果还证实，所制得的种植牙钉可以提高MC3T3-E1细胞的早期粘附和增殖；碱性磷酸酶活性实验和基因表达实验结果表明，经过本发明改性处理得到的种植牙钉可以促进rBMSCs细胞骨向分化和成骨相关基因(ALP，BMP2和OPN)的表达。本发明可用于改善种植牙钉的润湿性和成骨活性。附图说明图1为经实施例1改性处理得到的种植牙钉表面形貌，其中(a)为低倍图像，(b)为高倍图像；图2为经实施例2改性处理得到的种植牙钉表面形貌，其中(a)为低倍图像，(b)为高倍图像；图3为经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面形貌，其中(a)为低倍图像，(b)为高倍图像；图4为改性处理得到的种植牙钉表面水接触角值，其中，(a)为经实施例1改性处理得到的种植牙钉表面水接触角值，(b)为经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面水接触角值；图5为改性处理得到的种植牙钉表面XPS全谱，其中，(a)为经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面XPS全谱，(b)为经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面锌元素的XPS高分辨谱；图6为经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面XRD图谱；图7为经本发明改性处理得到的种植牙钉腐蚀电位分析图；图8a为经实施例1和2改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞形貌(图片由扫描电子显微镜拍摄)；图8b为经实施例1和2改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞增殖结果；图9a为经实施例2和3改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞形貌(图片由扫描电子显微镜拍摄)；图9b为经实施例2和3改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞增殖结果；图10a为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞粘附图片；图10b为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面成骨细胞粘附定量结果；图11为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性实验结果；图12为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面ALP的基因表达；图13为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面BMP2的基因表达；图14为经本发明改性处理得到的种植牙钉表面OPN的基因表达；图15a为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞增殖结果；图15b为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞碱性磷酸酶活性实验结果；图15c为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞培养7天的基因表达结果；图15d为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞培养14天的基因表达结果；图16例示性地示出了根据本发明方法的一个具体实施方式的步骤和相应得到的表面形貌图，其中一步表面处理为喷砂处理和酸处理(下文有时统称喷砂酸蚀处理)；二步表面处理为碱处理；三步表面处理为等离子体注入处理；四步表面处理为热处理；右侧与各步相连的扫描电子显微镜拍摄照片为经相应表面处理步骤得到的表面形貌图。具体实施方式如上所述，本发明在第一方面提供了一种制造种植牙钉的方法，所述方法包括如下步骤：(1)喷砂处理：对种植牙钉进行喷砂处理，从而使所述种植牙钉的表面粗糙化；(2)酸处理：对经喷砂处理的种植牙钉进行酸处理，从而使表面形成微米级孔洞；(3)碱处理：对经酸处理后的种植牙钉进行碱处理，从而使表面形成纳米纤维形成的网络结构；(4)等离子体注入处理：利用等离子体浸没离子注入方法对步骤(3)中得到的种植牙钉注入生物活性元素；和(5)热处理：将步骤(4)得到的种植牙钉在高温下处理以使表层氧化层发生相变从而提高其耐腐蚀性，然后冷却。在一些优选的实施方式中，所述钛基种植牙钉为钛或钛合金种植牙钉。本发明对喷砂处理步骤中所使用的砂粒没有特别的限制，但是优选为氧化铝砂粒和氧化硅砂粒的混合砂，更优选的是采用粒径为100～300μm(例如100、200或300微米)的氧化铝砂粒和氧化硅砂粒的混合砂进行喷砂处理。本发明对喷砂压力没有特别的限制，但是在使用粒径为100～300μm的氧化铝砂粒和氧化硅砂粒的混合砂进行喷砂处理的情况下，优选的是在0.4～0.8MPa(例如0.4、0.5、0.6、0.7或0.8MPa)的压力下对种植牙钉进行20～60分钟(例如20、30、40、50或60分钟)的喷砂处理。本发明对所述酸处理中所使用的酸没有特别的限制，例如可以使用盐酸和/或硫酸。在一个优选的实施方式中，所述酸处理可以通过如下方式进行：把经喷砂处理的种植牙钉浸泡于10～30重量％(例如10、20或30重量％)盐酸和40～60重量％(40、50或60重量％)的硫酸的混酸中，在50～80℃(例如50、60、70或80℃)水浴条件下反应0.5～3小时(例如0.5、1、2或3小时)。本发明对所述碱处理中使用的碱没有特别的限制，但是优选使用的碱金属或者碱土金属的碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁，最优选的是使用氢氧化钠。在一些优选的实施方式中，所述碱处理可以通过如下方式进行：把经喷砂处理和酸处理的种植牙钉浸泡于1～5mol/L(例如1、2、3、4或5mol/L)NaOH溶液中，室温下反应2～4小时(例如2、3或4小时)。在一些优选的实施方式中，所述喷砂处理步骤(1)还可以进一步包括依次进行的清洗步骤和干燥步骤，更优选的是，所述清洗步骤通过依次在乙醇、去离子水和超纯水中进行超声清洗来进行。在一些优选的实施方式中，所述酸处理步骤(2)还可以进一步包括依次进行的清洗步骤和干燥步骤，更优选的是，所述清洗步骤通过依次在乙醇、去离子水和超纯水中进行超声清洗来进行。在一些优选的实施方式中，所述碱处理步骤(3)还可以进一步包括依次进行的清洗步骤和干燥步骤，更优选的是，所述清洗步骤仅包括使用超纯水进行清洗。在一些优选的实施方式中，所述碱处理步骤(3)还可以包括在碱处理之后用超纯水冲洗干净后放入0.1～0.2mol/L(例如0.1、0.15或0.2mol/L)稀盐酸中，室温放置2～4小时(例如2、3或4小时)，以除去材料表面残余的碱，取出种植牙钉，用超纯水冲洗干净后晾干。在一些优选的实施方式中，在步骤(4)中，本发明对注入元素没有特别限制，只要是对所述种植牙钉具有有益的效果即可。但是在一些更优选的实施方式中，所述生物活性元素选自由锌、钙、锰和银组成的组，进一步优选所述生物活性元素为锌元素和/或钙元素。本发明对等离子体浸没离子注入所采用的具体工艺参数没有特别的限制，只要能够完成预期的生物活性元素离子注入即可。但是在一些优选的实施方式中，在注入的生物活性元素为锌元素的情况下，所述等离子体注入处理的工艺参数优选如下所示：真空室温度20～50℃(例如20、30、40或50℃)，真空度3.0×10-3～5.0×10-3Pa(例如为3、4或5×10-3Pa)，注入电压-10～-20kV(例如-10、-15或-20kV)，频率5～10Hz(例如为5、6、7、8、9或10Hz)，脉宽200～550μs(例如为200、300、400、500、550μs)，注入时间0.5～3.0小时(例如为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0小时)。在另外一些优选的实施方式中，在注入的生物活性元素为钙元素的情况下，所述等离子体注入处理的工艺参数优选如下所示：真空室温度20～50℃(例如20、30、40或50℃)，真空度3.0×10-3～5.0×10-3Pa(例如为3、4或5×10-3Pa)，注入电压-10～-20kV(例如-10、-15或-20kV)，频率5～7Hz(例如为5、6或7Hz)，脉宽300～550μs(例如为300、400、500、550μs)，注入时间1.0～3.0小时(例如为1.0、1.5、2.0、2.5或3.0小时)。在一些优选的实施方式中，在步骤(5)中将种植牙钉在温度为300～500℃处理0.5～1.5小时，然后冷却。在步骤(5)中，本发明对热处理的处理温度和处理时间没有特别的限制，只要处理温度和处理时间能够导致表层氧化层发生相变从而提高其耐腐蚀性即可。在一些优选的实施方式中，所述高温可以为300～500℃(例如300、400或500℃)，并且处理时间为0.5～1.5小时(例如0.5、1.0或1.5小时)。更优选的是，所述热处理是在马弗炉中进行，并且所述冷却为随炉自然冷却。优选的是，所述种植牙钉可以为钛或者钛合金材质。本发明在第二方面提供了由本发明第一方面所述的方法制得的种植牙钉。所述种植牙钉可以具有改善的表面粗糙度、表面亲水性(或者润湿性)、和成骨性(即更加容易发生骨结合、更利于细胞的粘附和/或生长等)。下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，附图和实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的内容。实施例实施例中以种植牙钉为例进行说明，但是本发明的保护范围不应限于种植牙钉。实施例1(1)按30颗一批将纯钛TA3种植牙钉(购自浙江广慈医疗器械有限公司)放入自动喷砂机中进行氧化铝和氧化硅混合砂粒(体积比1：1，粒径均为200微米)喷砂处理，压力为0.6MPa，喷砂时间为40分钟，从而使表面形成不规则的粗糙面，依次置于乙醇、去离子水、超纯水中超声清洗，然后干燥；(2)对进行喷砂处理后的种植牙钉进行18wt％盐酸和48wt％硫酸的混酸(体积比1：1)处理，处理在65℃进行2小时，从而使表面形成微米级孔洞，依次置于乙醇、去离子水、超纯水中超声清洗，然后干燥。(3)把经过喷砂酸蚀处理的种植牙钉浸泡于5mol/LNaOH溶液中，室温下反应4h；反应结束后取出种植牙钉，用超纯水冲洗干净后放入0.1mol/L稀盐酸中，室温放置2h；最后取出种植牙钉，用超纯水冲洗干净后晾干。图1为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表面形貌。由图1可见：经本实施例改性处理后，种植牙钉表面形成了微米级“锯齿状”结构，并且将倍数放大可知，该微米级结构上形成了纳米线状纤维结构。由此可见，采用本发明的方法能够成功地在种植牙钉表面制备了微纳复合结构。经过喷砂酸蚀处理的种植牙钉接触角较高，为75°左右。而经本实施例改性处理得到的具有微纳复合结构的种植牙钉，其接触角小于5°，达到超亲水水平。由此可以看出，采用本发明的方法能够显著地提高了种植牙钉的润湿性。实施例2使用实施例1中经过步骤(3)制得的种植牙钉进行等离子体注入处理步骤(4)，即，利用等离子体浸没离子注入技术注入锌元素，具体参数如表1所示；表1锌离子注入参数靶脉冲弧注入电压(kV)-15注入脉宽(μs)550550频率(Hz)55注入时间(h)1.5真空度(Pa)3.5×10-3图2为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表面形貌。由图可见：经本实施例改性处理后，种植牙钉表面的微纳复合结构依然存在，经过离子注入后表面的纳米线状结构被轻微破坏。实施例3使用实施例1中经过步骤(3)制得的种植牙钉进行等离子体注入处理步骤(4)和热处理步骤(5)。在等离子体注入处理如下步骤(4)中，利用等离子体浸没离子注入技术注入锌元素，具体参数如表2所示；表2锌离子注入参数在热处理步骤(5)中，将离子注入后的种植牙钉于马弗炉中进行热处理，处理温度为450℃，时间为1h，随炉冷却，使种植牙钉表面的氧化钛层转化为锐钛矿相。图3为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表面形貌。由图3可见：经本实施例改性处理后，种植牙钉表面的微纳复合结构依然存在，经过离子注入和热处理后表面的纳米线状结构被破坏，形成纤维网络结构。经本实施例改性处理得到的种植牙钉，其水接触角约为20°，依旧保持良好的润湿性。图5中的图(a)为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表面XPS全谱。从图可知：表面除了Ti、O、C三种元素外，还检测到了Zn元素，说明离子注入成功地将锌元素引入制备有微纳复合结构的种植牙钉表面。图5中的图(b)为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表锌元素的高分辨谱。由图可见：锌元素在表面以ZnO(结合能为1020.9eV)的形式存在。图6为经本实施例改性处理得到的种植牙钉表面XRD图谱。从图可知：经过锌离子注入和热处理后，表面形成了锐钛矿相的氧化钛。实施例4对经上述实施例改性处理得到的种植牙钉进行耐腐蚀性能测试：工作电极为测试样品、对电极为石墨棒、参比电极为甘汞电极，利用电化学工作站，对材料的耐腐性能进行测试，测试电压为-0.8V～0V。图7为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉腐蚀电位分析图。其中：SLA表示经过喷砂酸蚀处理得到的样品，SLAA表示经过喷砂酸蚀处理后进行碱处理得到的样品，Zn-SLAA表示喷砂酸蚀处理后碱处理并进行锌离子注入和热处理得到的样品。由图可见：相比于样品SLA，经过碱处理的样品腐蚀电位向负方向移动，而种植牙钉Zn-SLAA腐蚀电位正向偏移，说明耐腐蚀性能得到了提高。实施例5对经实施例1和2改性处理得到的种植牙钉进行小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)增殖实验：样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为5×104个/mL的细胞悬浮液1mL接种于样品表面，培养特定时间(1,4,7天)后，用PBS清洗样品2遍，加入0.5mL含有5％阿尔玛蓝的无酚红培养基进一步培养4h，取100μL测试570nm和600nm波长处的吸光度值并通过试剂说明书计算细胞增殖率。图8a为经实施例1和2改性处理得到的种植牙钉表面培养细胞1，4和7天后通过扫描电子显微镜观察的细胞形貌图。其中：SLA表示经过喷砂酸蚀处理得到的样品，SLAA表示经过喷砂酸蚀处理后进行碱处理得到的样品，Zn-SLAA-1表示喷砂酸蚀处理后碱处理并进行锌离子注入但未进行热处理得到的样品。由图可见：培养1天后所有样品表面的细胞增殖率未见显著差异；培养4天后也未见显著差异，但是相比第1天时可见丝状伪足，说明细胞生长较好；培养7天后经实施例1改性处理得到的种植牙钉表面细胞增殖率高于未改性样品，大量细胞基本覆盖样品表面，而经实施例2改性处理得到的样品表面细胞增殖率略低于SLA，说明经过本发明改性后的种植牙钉表面能够促进细胞增殖，但是未经热处理对生物活性提高不明显。图8b所示的细胞增殖率结果与形貌结果一致。实施例6为了研究热处理对种植牙钉表面细胞相容性的影响，对经实施例2和3改性处理得到的种植牙钉进行小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)增殖实验：样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为5×104个/mL的细胞悬浮液1mL接种于样品表面，培养特定时间(1,4,7天)后，用PBS清洗样品2遍，加入0.5mL含有5％阿尔玛蓝的无酚红培养基进一步培养4h，取100μL测试570nm和600nm波长处的吸光度值并通过试剂说明书计算细胞增殖率。图9a为经实施例2和3改性处理得到的种植牙钉表面培养细胞1，4和7天后通过扫描电子显微镜观察的细胞形貌图。其中：Zn-SLAA-1表示喷砂酸蚀处理后碱处理并进行锌离子注入但未进行热处理得到的样品，Zn-SLAA表示喷砂酸蚀处理后碱处理并进行离子注入和热处理得到的样品。由图可见：培养1天后两种样品表面的细胞增殖率未见显著差异；培养4天后经实施例3改性处理得到的种植牙钉表面细胞增殖率高于实施例2改性处理得到的种植牙钉，可见丝状伪足；培养7天后经过热处理的种植牙钉表面细胞增殖率依然显著高于未经热处理的种植牙钉，大量细胞基本覆盖样品表面，说明经过热处理得到的带有锐钛矿相TiO2的种植牙钉表面比未经热处理的种植牙钉表面更有利于细胞增殖，证实经过热处理可以显著提高种植牙钉的生物活性。图9b所示的细胞增殖率结果与形貌结果一致。实施例7对经上述实施例改性处理得到的种植牙钉进行小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)早期粘附实验：样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为5×104个/mL的细胞悬浮液1mL接种于样品表面，培养24h后，用PBS清洗样品2遍，4％多聚甲醛(PFA)固定10min后用曲通进行通透，DAPI染核，于荧光显微镜下观察。图10a为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉细胞粘附图，图中被染色的是细胞核。其中：SLA表示经过喷砂酸蚀处理得到的样品，SLAA表示经过喷砂酸蚀处理后进行碱处理得到的样品，Zn-SLAA表示喷砂酸蚀处理后碱处理并进行锌离子注入和热处理得到的样品。由图可见：样品Zn-SLAA和SLAA上的细胞数量明显多于样品SLA，尤其是SLAA表面，说明经本发明优选的改性方法处理得到的种植牙钉有利于细胞的粘附。图10b为对上述图片中细胞数进行计数后的结果。由图10a可知：样品表面的细胞数量以SLA，Zn-SLAA，SLAA的顺序依次增加。从图4可知，经过本发明优选的改性方法获得的种植牙钉的表面的润湿性得到了显著的提高，样品表面非常亲水，因而有利于细胞的粘附。实施例8对经上述实施例改性处理得到的种植牙钉进行干细胞碱性磷酸酶活性(ALP)实验，即样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为1.0×104个/mL(7天)和0.5×104个/mL(14天)的细胞悬液1mL接种于样品表面，培养特定时间后，用PBS清洗样品2遍，将样品浸泡在裂解液中于4℃保存40min，然后将细胞从样品表面洗脱并在磷酸对硝基苯酯中于37℃保存30min，测试其在405nm波长处的吸光度来表征碱性磷酸酶含量。利用BCA蛋白法检测总蛋白量，通过公式计算，最后用μM/μg总蛋白来表征碱性磷酸酶活性。图11为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉表面第7天和第14天碱性磷酸酶活性结果。由图可见：培养7天后，经过本发明优选的改性处理方法得到的种植牙钉(SLAA和Zn-SLAA)表面碱性磷酸酶活性表达显著高于未经处理的样品(SLA)，尤其是样品SLAA；培养14天后，碱性磷酸酶在经过本发明优选的改性处理方法得到的种植牙钉表面表达依然高于SLA，说明经本发明改性处理得到的种植牙钉可以显著促进干细胞的碱性磷酸酶活性。实施例9对经上述实施例改性处理得到的种植牙钉进行实时定量PCR(即RT-PCR)实验，将密度为1.0×104个/mL(7天)和0.5×104个/mL(14天)的细胞悬液1mL接种于经过灭菌的样品表面，培养7天和14天后，用TRIzol试剂裂解细胞，并从中提取RNA，将提取的RNA进行反转录，最后利用Lightcycle480(Roche)设备进行PCR实验。图12为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉表面碱性磷酸酶活性(ALP)的基因表达结果。由图12可见：培养7天后，经本发明的优选改性处理方法处理后的SLAA样品表面ALP表达显著高于样品SLA，样品Zn-SLAA表面ALP表达也高于SLA，但低于SLAA；培养14天后，经本发明改性处理的样品表面ALP表达略低于SLA。图13为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉表面骨形态发生蛋白2(BMP2)的基因表达结果。由图13可见：培养7天后，经本发明优选的改性处理方法处理后的SLAA样品表面BMP2表达是样品SLA的4.5倍左右，样品Zn-SLAA表面BMP2表达也高于SLA；培养14天后，SLA和SLAA样品表面的BMP2表达较为接近，但是样品Zn-SLAA表面的BMP2表达明显提高。图14为经上述实施例改性处理得到的种植牙钉表面骨桥蛋白(OPN)的基因表达结果。由图14可见：培养7天后，经本发明优选的改性处理方法处理后的样品OPN表达要高于SLA样品，尤其是SLAA样品；培养14天后SLAA表面的OPN表达是SLA的11倍，Zn-SLAA表面OPN表达约为SLA的3.5倍。说明经本发明改性处理的种植牙钉可以显著提高成骨相关基因的表达。实施例10根据实施例1所述的方法对种植牙钉进行喷砂酸蚀处理和碱处理，然后对改性得到的种植牙钉利用等离子体浸没离子注入技术注入钙元素，具体参数如表3所示。表3钙离子注入参数靶脉冲弧注入电压(kV)-15注入脉宽(μs)500500频率(Hz)55注入时间(h)2.0真空度(Pa)3.0×10-3对经上述改性处理得到的种植牙钉进行人成骨肉瘤MG-63细胞增殖实验：样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为1×104个/mL的细胞悬浮液1mL接种于样品表面，培养特定时间(1,3,7和14天)后，用PBS清洗样品2遍，加入0.2mL含有10％CCK-8的无酚红培养基进一步培养2h，取100μL测试450nm波长处的吸光度值来表征细胞相对增殖率。对经上述改性处理得到的种植牙钉进行人成骨肉瘤MG-63细胞碱性磷酸酶活性(ALP)实验，即样品经75％酒精灭菌2h后，将密度为1.0×105个/mL的细胞悬液1mL接种于样品表面，培养特定时间(7,14和21天)后，用PBS清洗样品2遍，将样品浸泡在裂解液中于4℃保存40min，然后将细胞从样品表面洗脱并在磷酸对硝基苯酯中于37℃保存30min，测试其在405nm波长处的吸光度来表征碱性磷酸酶含量。利用BCA蛋白法检测总蛋白量，通过公式计算，最后用nmol/min/mg总蛋白来表征碱性磷酸酶活性。对经上述改性处理得到的种植牙钉进行实时定量PCR(即RT-PCR)实验，将密度为1.0×105个/mL的细胞悬液1mL接种于经过灭菌的样品表面，培养7天和14天后，用TRIzol试剂裂解细胞，并从中提取RNA，将提取的RNA进行反转录，最后利用Lightcycle480(Roche)设备进行PCR实验。图15a为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞增殖结果。其中：Ti表示纯钛，SLA表示经过喷砂酸蚀处理得到的样品，Ca-SLA表示经过喷砂酸蚀处理后进行钙离子注入得到的样品。由图15a可见：培养1天和3天后所有样品表面的细胞增殖率未见显著差异；培养7天后SLA表面比Ti表面细胞增殖率低，而Ca-SLA表面细胞增殖率显著高于Ti和SLA表面；培养14天后细胞增殖率按照Ti<SLA<Ca-SLA的顺序依次递增。图15b为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞碱性磷酸酶活性实验结果。由图15b可见：培养7天后，经过喷砂酸蚀处理的钛表面ALP表达显著高于Ti表面，经过钙离子注入后的Ca-SLA表面则具有最高的ALP表达；培养14天后，ALP的表达情况和第7天类似，依然按照Ti<SLA<Ca-SLA的顺序有依次递增；培养21天后，所呈现的规律和第7天类似，说明经过钙离子注入改性处理得到的种植牙钉可以显著促进MG63细胞的碱性磷酸酶活性。图15c为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞培养7天的基因表达结果。由图15c可见：培养7天后，成骨细胞特异性转录因子Osterix(OSX)、I型胶原(COL1A1)、骨涎蛋白(BSP)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OC)和骨桥蛋白(OPN)和Runx2等7种基因的表达在Ca-SLA表面上调最显著，SLA表面基因表达均高于Ti表面。图15d为经实施例10改性处理得到的种植牙钉表面MG63细胞培养14天的基因表达结果。由图可知：OSX、COL1A1、BSP、ALP、OC、OPN和Runx2等7种基因的表达依然按照Ti<SLA<Ca-SLA的顺序递增，说明SLA和Ca-SLA表面均有利于MG63细胞基因的表达。当前第1页1 2 3