低酯果胶在防治急性胰腺炎症方面的用途的制作方法

本发明涉及低酯果胶在防治急性胰腺炎症方面的用途，属于急性胰腺炎的预防和治疗技术领域。

背景技术：

急性胰腺炎作为重要的消化疾病之一，会引起全身炎症反应综合征以及多器官功能综合不全征，包括肠道屏障受损等，其具体的发病机制尚未完全明确。如何更有效的预防疾病的发生、在临床上如何更有效的阻断炎症扩散，治疗急性胰腺炎，使它避免发展成重症急性胰腺炎甚至胰腺癌，从而减少胰腺炎的病死率以及并发症发生率，探明急性胰腺炎的发病机制就尤为重要。

果胶是一种高分子量、阴离子的天然多聚糖，位于高等植物细胞壁中。果胶一般是应用作为一种高档天然食品添加剂和保健品，广泛应用于食品、医药保健品和一些化妆品中，具有降血脂、降胆固醇、抗辐射、吸附重金属离子、润肠通便和抗癌等作用。

果胶是一类聚半乳糖醛酸多糖，其半乳糖醛酸残基往往被一些基团酯化，如甲氧基、酰胺基等。酯化度指果胶中甲酯化、乙酰化和酰胺化比例的总和。根据果胶酯化度以及酯化种类的差异，可将果胶分为2类：高酯果胶(HMP，酯化度＞50％)、低酯果胶(LMP，酯化度＜50％)。食品工业常根据食品的理化性质选择低酯或者高酯果胶作为凝胶剂、稳定剂、悬浊剂等。果胶单独使用或与其它胶相结合可用做包埋剂使药物持续释放。据称高酯果胶能促进阿斯匹灵持续释放并可做为润药剂在给药过程中显著地减少胃肠刺痛。也有研究表明，低酯果胶可以缓解溃疡性结肠炎患者症状，这说明低酯果胶在提供营养的同时对炎症也具有一定的调节作用。然而结肠炎与对急性胰腺炎是两种完全不同的病症，故结肠炎治疗与对急性胰腺炎的保护并不等同，比如发明人之前研究显示丁酸可缓解结肠炎，而据目前已知文献，丁酸对急性胰腺炎并无保护作用。

寻找更多能够治疗/辅助治疗/预防急性胰腺炎的药物或者食品，对于急性胰腺炎的发病机制并开发相应的预防和治疗方法尤为重要。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明证明了低酯果胶对雨蛙素(CAE)诱导的急性胰腺炎小鼠发挥预防作用，并降低组织炎症程度。本发明涉及的低酯果胶，在安全剂量范围内对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠发挥保护作用，降低炎症程度，可作为有效成分添加到防治急性胰腺炎的膳食中。

本发明中的低酯果胶，是指酯化度＜50％的果胶，比如酯化度为7～30％的果胶。

在本发明的一种实施方式中，所述低酯果胶是酯化度为7％的低酯果胶。

在本发明的一种实施方式中，所述低酯果胶可以是本实验室提纯自备或者获自荷兰格罗宁根大学de Vos,Paul教授；也可购自生产或者销售的低酯果胶公司、生产或者销售以低酯果胶为主要成分的可用于药物或者食品的混合物的公司。

本发明的第一个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的药物或者药物组合物，其特征在于，所述药物或者药物组合物以低酯果胶作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或者药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，本发明的低酯果胶可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

在本发明的一种实施方式中，本发明的药物或者药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。

在本发明的一种实施方式中，用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

本发明的第二个目的是提供一种预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的食品或者饲料，所述食品或者饲料以低酯果胶作为主要有效成分。

在本发明的一种实施方式中，所述食品包括保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂等。

本发明本发明的第三个目的是提供一种降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的第四个目的是提供一种降低血清淀粉酶水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的第五个目的是提供一种降低胰腺组织中促炎症因子TNF-α，IL1β表达水平的制剂，所述制剂是以有效剂量的低酯果胶作为主要活性成分。

本发明的制剂是指药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂等。

发明的第六个目的是提供低酯果胶的新应用。所述应用，是制备预防和/或缓解和/或辅助治疗和/或治疗急性胰腺炎的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低血清胰脂肪酶和/或胰腺组织中MPO表达量，或者降低胰腺组织中促炎症因子TNF-α和/或IL1β表达水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是制备降低血清淀粉酶水平的药物、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明证明了只需要进行短期低酯果胶喂食(3天)即可对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎发挥保护作用，可作为有效的成分添加到防治急性胰腺炎的药物当中，降低临床上急性胰腺炎的发生发展和炎症程度。

本发明通过低酯果胶对雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型进行预防性处理，对其胰腺组织进行病理组织形态观察，小鼠血清胰脂肪酶、血清淀粉酶、组织中炎症细胞释放酶MPO的水平、组织及血清中促炎性细胞因子TNFα，IL1β进行测定。比较低酯果胶处理组与炎症模型组小鼠的各个指标水平，低酯果胶处理组小鼠各项指标显著优于炎症模型组。

附图说明

图1是用髓过物氧化酶试剂盒、血清淀粉酶试剂盒和血清胰脂肪酶酶联免疫吸附法试剂盒分别测定的小鼠胰腺组织中髓过物氧化酶(MPO)水平(图1A)、血清中的淀粉酶(AMY)水平(图1B)以及血清中的胰脂肪酶(lipase)(图1C)，比较低酯果胶处理组与炎症模型组的炎症程度；其中，CON表示对照组，CAE表示急性胰腺炎模型组，LMP+CAE表示低酯果胶预防处理组；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

图2是用HE染色的方法观察胰腺组织的病理变化；其中，CON表示对照组，CAE表示急性胰腺炎模型组，LMP+CAE表示低酯果胶预防处理组。

图3是用酶联免疫吸附法测定小鼠胰腺组织匀浆上清液即血清中的炎症因子水平，比较低酯果胶处理组与炎症模型组的炎症程度；其中，肿瘤坏死因子用TNF-α表示(图3A和3B)，白介素1β用IL-1β表示(图3C和3D)表示，CON表示对照组，CAE表示急性胰腺炎模型组，LMP+CAE表示低酯果胶预防处理组；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

具体实施方案

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1.急性胰腺炎模型建立

将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分成对照组(CON)、急性胰腺炎组(CAE)、低酯果胶预防组(LMP+CAE)，采用腹腔注射的方式分别给对照组和疾病组小鼠注射生理盐水(0.90％)和雨蛙素(50ug/kg)；每小时注射一次，连续注射8次。预防组于注射雨蛙素造模前连续摄入三天的5％(低酯果胶质量g/饲料总重g，低酯果胶是获自荷兰格罗宁根大学de Vos,Paul教授的酯化度为7％的低酯果胶)低酯果胶饲料。

实施例2.低酯果胶抵抗急性胰腺炎发生时胰腺组织MPO的表达

白细胞尤其中性粒细胞的活化作为急性胰腺炎发病机制中的重要一环，在其病理过程中发挥着极其重要的作用。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞的功能和活性状态。中性白细胞中存在有髓过氧化酶，每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5％，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，并测定中心白细胞的数目。其原理如下：

MPO+H₂O₂→复合物；复合物+AH₂(供氢体)→H₂O+MPO+A产物。

通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定A产物的生成量，从而推算出MPO的活力及H₂O₂减少的量和白细胞的数目。如图1A，结果显示，对照组、急性胰腺炎模型组的胰腺MPO含量分别为0.15U/g、0.31U/g，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的胰腺MPO含量为0.13U/g，比急性胰腺炎模型组降低了58％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现胰腺MPO含量分别比急性胰腺炎模型组降低了34％、42％。

以上结果表明，急性胰腺炎组的胰腺MPO活力较正常组明显上升，低酯果胶处理组的MPO活力较疾病组明显下降。由此可得，经低酯果胶预防处理后急性胰腺炎小鼠的胰腺MPO活力显著下调，从而改善急性胰腺炎。

实施例3.低酯果胶降低急性胰腺炎发生时血清淀粉酶(AMY)的水平

已有数据显示，90％以上急性胰腺炎患者的血清中的AMY都会增高，因此本发明检测了AMY含量变化。

淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出AMY的活力。如图1B，结果显示，对照组、急性胰腺炎模型组的血清淀粉酶含量分别为8832U/dl、19547/dl，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的血清淀粉酶含量12832U/dl，比急性胰腺炎模型组降低了34.4％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现血清淀粉酶含量分别比急性胰腺炎模型组降低了20.1％、14.5％。

以上结果表明急性胰腺炎组的AMY活力较正常组明显上升，低酯果胶处理组的AMY活力较疾病组明显下降。由此可得，经低酯果胶预防处理后急性胰腺炎小鼠的AMY活力显著下调，从而改善急性胰腺炎。

实施例4.低酯果胶降低急性胰腺炎发生时血清胰脂肪酶(lipase)的水平

血清淀粉酶增高程度常与病情严重程度不成正比，且血清淀粉酶也可以在除急性胰腺炎以外的许多疾病中升高，如胃穿孔，胰腺肿瘤等。因此单独用血清淀粉酶诊断急性胰腺炎是有局限性的。血清脂肪酶在急性胰腺炎发病后活性升高，也可用于急性胰腺炎的测定。通常但其特异性更高，持续时间更长，因此，对血清脂肪酶进行测定以验证结论的准确性。

采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清lipase水平。分别向预先包被了小鼠lipase单克隆抗体的酶标孔中加入lipase温育；温育后，加入生物素标记的抗lipase抗体，再与联袂亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠lipase的浓度呈正相关。如图1C，对照组、急性胰腺炎模型组的血清胰脂肪酶含量分别为1398pg/ml、2093pg/ml，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的血清胰脂肪酶含量1636pg/ml，比急性胰腺炎模型组降低了21.8％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现血清胰脂肪酶含量分别比急性胰腺炎模型组降低了12.6％、15.9％。

结果显示，CAE小鼠的血清胰脂肪酶较CON组小鼠高，且LMP+CAE小鼠的血清胰脂肪酶较急性胰腺炎小鼠明显下调。由此可得，经低酯果胶预防处理后急性胰腺炎小鼠血清胰脂肪酶在血清中的表达水平显著降低，从而改善急性胰腺炎。

实施例5.低酯果胶缓解小鼠急性胰腺炎胰腺组织水肿及炎症浸润程度

用HE染色的方法，将对照组(CON)、炎症模型组(CAE)、表示低酯果胶预防处理组(LMP+CAE)的胰腺经固定、脱水、染色、脱蜡、透明和封片等主要过程，观察胰腺组织的组织完整性，胰腺水肿程度和炎症细胞浸润程度。如图2，结果显示，CON组胰腺组织结构密实，无明显裂纹。CAE小鼠胰腺组织结构疏松，有明显水肿及炎症浸润现象，而LMP+CAE组较CAE组则有明显的改善作用。

实施例6.低酯果胶减少急性胰腺炎小鼠胰腺组织中炎症因子的释放

在急性胰腺炎中，TNFα与IL1β是促炎因子。急性胰腺炎发生后TNFα高表达，阻断其升高可减轻炎症病情。IL1β在急性胰腺炎早期即升高，并与TNFα协同作用，不但可以刺激自身的释放，还可以促进彼此的释放。

采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠胰腺组织5％匀浆上清液TNF-α和IL-1β水平。分别向预先包被了小鼠TNF-α和IL-1β单克隆抗体的酶标孔中加入TNF-α和IL-1β，温育；温育后，加入生物素标记的抗TNF-α和IL-1β抗体，再与联袂亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中小鼠TNF-α和IL-1β的浓度呈正相关。

如图3A和3B，对照组、急性胰腺炎模型组的5％胰腺组织匀浆TNF-α含量分别为136pg/ml、238pg/ml，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的5％胰腺组织匀浆TNF-α含量154pg/ml，比急性胰腺炎模型组降低了35.3％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现5％胰腺组织匀浆TNF-α含量分别比急性胰腺炎模型组降低了13.6％、20.4％。对照组、急性胰腺炎模型组的血清TNF-α含量分别为14.5pg/ml、29.5pg/ml，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的血清TNF-α含量10.6pg/ml，比急性胰腺炎模型组降低了64％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现5％胰腺组织匀浆TNF-α含量分别比急性胰腺炎模型组降低了17.9％、36.6％。结果显示，CAE组胰腺和血清中TNF-α水平明显高于CON组，而LMP+CAE组的TNF-α水平相较于CAE组则显著下调。

如图3C和3D，对照组、急性胰腺炎模型组的5％胰腺组织匀浆IL-1β含量分别为214pg/ml、808pg/ml，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的5％胰腺组织匀浆IL-1β含量508pg/ml，比急性胰腺炎模型组降低了37.1％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现5％胰腺组织匀浆IL-1β含量分别比急性胰腺炎模型组降低了14.6、25.4％。对照组、急性胰腺炎模型组的血清IL-1β含量分别为123pg/ml、187pg/ml，而使用本发明的酯化度7％的低酯果胶的预防处理组的血清IL-1β含量113pg/ml，比急性胰腺炎模型组降低了39.6％。同时，发明人还使用了酯化度为15％、30％的低酯果胶，结果发现5％胰腺组织匀浆TNF-α含量分别比急性胰腺炎模型组降低了16.9％、32.6％。结果表明，CAE组胰腺与血清中IL-1β水平明显高于CON组，而LMP+CAE组的IL1β水平相较于AP组则显著下调。综上可得，经低酯果胶预防处理后，能够急性胰腺炎小鼠TNF-α和IL-1β在其胰腺组织及血清中的表达水平显著降低，从而改善急性胰腺炎的胰腺炎症程度。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。