一种用于水光针注射的软凝胶的制备方法与流程

本发明涉及医用生物材料技术领域，采用轻度交联技术制备一款可注射的软凝胶，主要用于面部水光针注射以改善肤质，也可用于关节腔注射以减轻关节炎症状。

背景技术：

皮肤覆盖全身，它起着保湿、排汗、感觉温度和刺激等功能，同时还能保护人体的各种组织和器官免受外界的各种感染和侵害。年轻有活力的皮肤是饱满，均匀，细腻，有光泽且没有皱纹的。但随着年龄的增长皮肤会渐渐失去弹性，产生各种小小的凹坑和皱纹，且这种变化在面部往往表现的更加明显。除此之外，环境的污染，人们工作压力的增加，化妆品的滥用，以及饮食中的大量油脂都会加速皮肤情况的恶化。爱美之心人皆有之，市场上各种宣称可以美白、保湿、去皱的化妆品层出不穷。但无论这些化妆品中号称添加了何种有效成分，由于表皮只能透过分子量600以下的小分子物质，且经由皮肤的扩散作用十分缓慢，这些化妆品中的有效成分能真正深入皮下的微乎其微。

皮肤中的胶原决定了皮肤的弹性，其占皮肤干重的70％，以胶原纤维的形式存在。胶原分子首先通过相互缠绕形成右手螺旋结构，三股螺旋分子间再以一定间距、呈纵向对称交错排列形成原纤维，原纤维再聚集成纤维。三股螺旋分子的有序聚集使原纤维具有一定的强度和韧性。同时，微观上的有序结构有利于细胞的迁移与增殖，进而反过来促进胶原的分泌。

20世纪50年代，法国医生MichalPistor提出了一种中胚层疗法启发了美容界，经过几十年的努力开发出了水光针这种技术。水光针通过负压技术将数个极细的针头精确刺入皮下1-2毫米处，透过表皮层直接将修复物质输送入表皮和真皮之间，这样就可以解决化妆品中有效成分无法透过表皮屏障的问题。目前市场上水光针注射的成分以玻尿酸为主，由于是浅表层注射，要求注射物有一定的流动性，推挤力不可过大，故所用的玻尿酸绝大部分是未经交联过的透明质酸。但其在体内透明质酸酶的作用下会很快降解，使得疗效只能维持3个月甚至更短，若要维持效果则需多次注射。而以BDDE为交联剂的透明质酸(如瑞蓝)，虽然也是轻度交联，但其是颗粒状的产品，推挤力较大，较差的流动性会使得其在皮下分布不够均匀，不适用于水光针注射。同时，现有水光针产品均为微观无序结构，与皮肤中胶原纤维的微观有序聚集结构相去甚远，无法诱导细胞迁移和增殖，只是单纯的填充作用。

几丁质和几丁糖作为一类取自虾壳和蟹壳等天然组织的生物相容性材料，具有抑制疤痕形成，减少组织粘连，局部止血，润滑及生物屏障功能，且其在体内的代谢时间要长于透明质酸。本发明采用几丁质和几丁糖为主要成分，通过轻度交联技术制备出生物相容性好，推挤力小，可流动性强，在皮肤内存留时间长，达到一次注射可长时间维护修复效果(>6个月)的水光针注射软凝胶。该水光针产品在微观上呈线性排列，与胶原纤维的有序聚集类似，可以在一定程度上诱导细胞向注射位置进行迁移并增殖，并在原位分泌胶原蛋白增强修复效果。

技术实现要素：

本发明的目的之一是制备一种具有一定粘弹性的轻度交联的软凝胶，用于水光针注射以改善面部皮肤的干燥、发黄、暗淡无光泽、松弛、皱纹等问题。该材料基本组成是具有良好生物相容性的可降解几丁质或几丁糖材料，通过轻度交联技术在维持小推挤力的情况下延长材料在关节腔内的存留时间，从而只需一次注射即可达到长期(>6个月)维持修复效果的目的。

本发明的另一目的是选用对pH不敏感的DMTMM为催化剂，使得羧烷基化几丁质或几丁糖与多氨基交联剂在温和、简便的条件下进行反应，有利于大规模工业化生产。

本发明中，羧烷基化几丁质或几丁糖的制备方法按照专利CN 1306824A所述的方法得到。几丁质或几丁糖分子链上的羟基与卤化烷基酸反应，得到羧烷基化几丁质或几丁糖。几丁质或几丁糖上接上羧烷基的位置为3号或6号位，但因6号位反应活性更高，以6号位为主。得到的羧烷基化几丁质或几丁糖分子式如下：

R₁：表示氢原子或碳原子为1-12的支链状或直链状的烷基，R₂：表示NHCOCH₃或NH₂。在同一个几丁质或几丁糖分子链上可随机的出现上述单元结构。(A)表示一个几丁质或几丁糖分子单元上的3号位被羧基化，(B)表示一个几丁质或几丁糖分子单元上的6号位被羧基化，(C)表示一个几丁质或几丁糖分子单元上的3号位和6号位同时被羧基化。

本发明的制备流程如下：

(1)将羧烷基化几丁质或几丁糖溶于适当的溶剂A中；

(2)加入多氨基交联剂溶于(1)中所形成的体系；

(3)将DMTMM加入(2)中所形成的体系，催化交联反应；

(4)从(3)中得到的产物于溶剂A中进行透析；或者用溶剂B对从(3)中得到的产物进行沉降，沉降得到的粉末可直接用溶剂A进行复溶，或者干燥后再用溶剂A进行复溶，然后透析。

(5)将从(4)中得到的交联羧烷基化几丁质或几丁糖软凝胶体系灌装入医用注射器中进行灭菌。

上述方法中，选用的羧烷基化几丁质或几丁糖分子量为100～1,000kDa，优先选用200～500kDa。

上述方法中，凝胶的交联程度在1：20～1：200(以1摩尔羧烷基化几丁质或几丁糖上所接胱胺的摩尔数计)。

上述方法中，羧烷基化几丁质或几丁糖与溶剂A的比重为1：12.5～1：250，优先1：25～1：150。

上述方法中，多氨基交联剂指任意带有氨基的小分子或高聚物。如胺类、亚胺类、酰肼类、胍基类、多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、氨基聚硅氧烷、氨基聚膦腈、氨基聚乙二醇等。交联剂与溶剂A的比重为1：20～1：800，优先1：50～1：400。在实施例中优先选用1，4-丁二胺，胱胺和多聚赖氨酸。

上述方法中，DMTMM与溶剂A的比重为1：25～1：1000，优先1：50～1：500。

上述方法中，加入DMTMM后的交联反应时间为2～144小时，优先选用12～72小时。

上述方法中，反应的温度在0～60℃，优先选用2～37℃。

上述方法中，反应体系的pH在3～11，优先选用5～9。

上述方法中，透析时间为1～14天，优先3～7天。

上述方法中，干燥时间为2～7天，优先先用3～5天。

上述方法中，溶剂A指纯水、注射用水、生理盐水、缓冲溶液、动植物或人体的体液、组织培养液、细胞培养液，或者为其它水溶液和不以有机溶剂为主体的介质。优先选用纯水、注射用水、生理盐水、缓冲溶液。

上述方法中，溶剂B指丙酮、丁酮、甲醇、乙醇、丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、咪唑等。优先选用丙酮、乙醇、二氯甲烷。

上述方法中，灭菌可选用高压蒸气灭菌或辐射灭菌。

上述方法中，为了减少水光针注射时的刺痛，可在灭菌前可以加入适量利多卡因。利多卡因占凝胶体系比重为0.1％～0.5％wt，优先0.3％wt。

本发明的轻度交联几丁质或几丁糖软凝胶作为水光针注射用美容制剂，其浓度为4～40mg/ml，优先8～20mg/ml。

本发明创新点：

1.本发明提出的轻度交联水光针注射软凝胶制备方法简单，条件温和，对反应温度、pH范围、反应时间有较强的适应性，适合大范围的工业化生产。

2.本发明制备的软凝胶，具有抗炎、抑制疤痕的功效。交联剂的引入使得形成的网络结构更加稳定，在体内存留的时间更长，可以达到一次注射长期维持的效果，从而增加患者的接受度，减少感染风险和医疗费用。

3.本发明制备的软凝胶呈线性排列，微观结构上有取向性，与皮肤中胶原纤维的微观结构类似。

4.本发明制备的软凝胶，克服了几丁质或几丁糖产品无法终端灭菌的缺点，且在灭菌后产品动力粘度会有一定的增强，这种增强型凝胶有更好的维持面部填充效果。

附图说明

图1软凝胶扫描电镜图片

图2推挤力测试图

图3动力粘度扫描图谱

图4弹性模量和粘性模量扫描图谱

图5新西兰大白兔皮内刺激(1，2和5天)

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述本发明，但不限于这些实施例。

实施例1

这个实施例描述了轻度交联羧甲基几丁质注射液的制备过程及凝胶微观取向结构的观察。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL注射用水和4g羧甲基几丁质，于室温下搅拌过夜溶解。加入1g1,4-丁二胺，于室温下搅拌1小时。再加入2g DMTMM，于室温下搅拌2个小时。然后停止搅拌，于室温下静置反应24个小时。得到的交联凝胶体系用丙酮进行沉降，丙酮用量为水凝胶体系的3倍。沉降得到的粉末用丙酮清洗3次，每次15分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥96个小时即可得到轻度交联羧甲基几丁质粉末。用生理盐水进行复溶，配制成10mg/mL的轻度交联羧甲基几丁质凝胶体系。然后于PBS中进行透析，共透析5天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于水光针注射。

取上述凝胶于液氮中骤冷，然后冷冻干燥72小时，放入扫描电子显微镜(日立，TM3000)中进行微观结构的观察并拍摄，结果如附图1所示，可以看出其有明显的取向性。

实施例2

这个实施例描述了轻度交联羧丁基几丁质注射液的制备过程及交联度测定。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL生理盐水和3g羧丁基几丁质，于室温下搅6小时。加入1g胱胺，于室温下搅拌1小时。再加入1gDMTMM，反应pH用盐酸调至5.5，于室温下搅拌12个小时。得到的交联凝胶体系于用乙醇进行沉降，乙醇用量为水凝胶体系的4倍。沉降得到的粉末用乙醇清洗3次，每次15分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥96个小时即可得到轻度交联羧丁基几丁质粉末。用生理盐水进行复溶，配制成10mg/mL的轻度交联羧丁基几丁质凝胶体系。然后于生理盐水中进行透析，共透析3天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于水光针注射。

取上述凝胶烘干至恒重，用有机元素分析仪分析其中的S元素含量，计算出胱胺的接枝量，从而反推出胱胺与羧丁基几丁质反应的比例，得到凝胶交联程度。实施例3

这个实施例描述了轻度交联羧甲基几丁糖-多聚赖氨酸注射液的制备过程及推挤力测定。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL注射用水和1g羧甲基几丁糖，于室温下搅拌2小时。加入0.5g多聚赖氨酸，于室温下搅拌1小时。再加入1g DMTMM，于4℃下静置反应4小时。得到的交联凝胶体系用二氯甲烷进行沉降，二氯甲烷用量为水凝胶体系的3倍。沉降得到的粉末用二氯甲烷清洗3次，每次15分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥72个小时即可得到交联羧甲基几丁糖-多聚赖氨酸粉末。用PBS进行复溶，配制成12mg/mL的轻度交联羧甲基几丁糖-多聚赖氨酸体系。然后于生理盐水中进行透析，共透析5天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于水光针注射。

将预灌装得到的软凝胶注射液加载在拉力/推挤力机上(GOTECH)进行推挤力测定，以曲线平滑，推挤力不大于8N，3个平行样之间差距不超过30％为优。本实施例中样品的推挤力测试曲线见附图2所示。

实施例4

这个实施例描述了轻度交联羧丁基几丁糖-多聚赖氨酸注射液的制备过程及动力粘度和储能模量、损耗模量测定。

在250mL圆口烧瓶中加入100mLPBS和2g羧丁基几丁糖，于室温下搅拌过夜溶解。加入0.25g多聚赖氨酸，于室温下搅拌1小时。再加入2g DMTMM，于4℃下搅拌24个小时。然后加入乙醇进行沉降，得到的沉淀物用乙醇清洗3次，每次15分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥72个小时即可得到轻度交联羧丁基几丁糖-多聚赖氨酸粉末。用PBS进行复溶，配制成12mg/mL的轻度交联羧丁基几丁糖-多聚赖氨酸凝胶体系。然后于PBS中进行透析，共透析3天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于水光针注射。

将预灌装得到的软凝胶注射液加载到流变仪上(HAAKE MARSIII)进行动力粘度与弹性模量的测定，在应变速率为10的情况下动力粘度于大于等于200mPaS(见附图3)，在频率0.1-10Hz的范围内损耗模量大于等于储能模量(见附图4)。从附图2可以看出灭菌后样品的动力粘度会比灭菌前有一定的增强，其原因是在交联反应中多氨基交联剂中有部分胺基并没有与几丁质或几丁糖上的羧基进行反应，而灭菌过程中的高温高压环境使得这部分未参与反应的胺基与几丁质或几丁糖上的羧基进行了二次反应，凝胶交联度进一步增加，动力粘度随之增大。

实施例5

这个实施例描述了用小动物多角度光学活体成像系统无创观察轻度交联羧丁基几丁糖注射液在体内的分布。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL注射用水和2g羧丁基几丁糖，于室温下搅拌4小时。加入1g胱胺和10μg Cy7(花青胺-7)，于室温下搅拌1小时。再加入2g DMTMM，于4℃下搅拌48个小时。然后加入丙酮进行沉降，得到的沉淀物用丙酮清洗6次，每次30分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥48个小时即可得到轻度交联羧丁基几丁糖-花青胺粉末。用生理盐水复溶，配制成10mg/mL的轻度交联羧丁基几丁糖凝胶-花青胺体系。然后于PBS中进行透析，共透析5天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用注射入新西兰大白兔的皮下。用小动物多角度光学活体成像系统(In Vivo Xtreme，Bruker)在注射后1天，3天，7天，14天时进行荧光检测，可实时观察注射液在体内的代谢与分布。

实施例6

这个实施例描述了用小动物X射线计算机断层成像系统无创观察轻度交联羧丁基几丁质注射液在体内的分布。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL PBS和3g羧丁基几丁质，于室温下搅拌2小时。加入1g1,4-丁二胺和0.1g 3-碘苄胺，于室温下搅拌1小时。再加入0.5gDMTMM，于室温下搅拌6个小时，再4℃反应24小时。然后加入乙醇进行沉降，得到的沉淀物用乙醇清洗6次，每次30分钟。清洗完成的粉末放入真空干燥箱中干燥72个小时即可得到轻度交联羧丁基几丁质-3-碘苄胺粉末。用PBS复溶，配制成10mg/mL的轻度交联羧丁基几丁质凝胶体系。然后于生理盐水中进行透析，共透析5天，每天换1次透析液。最后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用注射入新西兰大白兔的皮下。用小动物X射线计算机断层成像系统(SkyScan1176，Bruker)在注射后1天，3天，7天，14天时进行检测，可实时观察注射液在体内的代谢与分布。

实施例7

这个实施例描述了轻度交联羧丁基几丁糖水光针注射液的制备过程及动物皮试方法。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL PBS和4g羧丁基几丁糖，于室温下搅拌过夜溶解。加入0.5g多聚赖氨基，于室温下搅拌2小时。再加入1g DMTMM，于室温下搅拌12个小时。得到的交联凝胶体系用乙醇进行沉降得到粉末，然后加PBS复溶至12mg/ml，并用PBS透析，每天换一次透析液，共透析5天。透析后得到的产物加300mg利多卡因，搅拌均匀后灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于水光针注射。

将预灌装且灭菌得到的软凝胶注射液通过30G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，每个点注射200μl，共8个点。以皮肤不出现红肿为宜。本实施例中样品的皮试结果见附图5所示。

实施例8

这个实施例描述了轻度交联羧甲基几丁糖作为药物载体的制备过程。

在250mL圆口烧瓶中加入100mL PBS和2g羧甲基几丁糖，于室温下搅拌过夜溶解。加入1g1,4-丁二胺，于室温下搅拌1小时。加入0.1g布洛芬，于室温下搅拌1小时。再加入1g DMTMM，于4℃下搅拌24个小时。得到的交联凝胶体系用乙醇进行沉降得到粉末，然后加生理盐水复溶至15mg/ml并透析，每天换1次透析液，共透析5天。透析后得到的产物灌装于预灌装注射器中，高压灭菌后用于关节腔注射。羧甲基几丁糖本身的单糖结构与关节腔内的多糖相似，具有抗炎、缓震的功效，有利于关节面润滑。包裹的布洛芬通过缓慢释放可起到长效消炎、镇痛的作用。两者结合有望在较长时间内改善关节炎患者的症状，恢复运动能力。