补肺活血胶囊治疗或预防PM2.5引起的肺部损伤药物的用途的制作方法

本发明属于中药
技术领域：
，涉及补肺活血胶囊用于治疗或预防肺部损伤药物的用途，具体涉及补肺活血胶囊用于治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途。
背景技术：
：近年来，大气污染已经对人体健康构成了严重威胁，在目前公认的各种大气污染物中，颗粒物与人体健康效应各终点的流行病学联系最为密切，且颗粒物已经成为评价大气污染的定量健康危害的标志性污染物。越来越多的流行病学、毒理学资料研究已证实大气颗粒物尤其是直径<2.5um的颗粒物，与居民死亡和发病率的增加有关，能引起哮喘、肺功能下降、呼吸系统炎症、甚至累及心血管系统，促使癌症发生。“PM2.5对大鼠的肺损伤及其机制的研究”，曲红梅，兰州大学研究生学位论文，2006年研究表明PM2.5染毒后引起肺灌洗液中ACP、AKP、ALB、TP、LDH含量的升高；IgG、IgA升高，并呈现剂量依赖性关系；肺泡巨嗜细胞吞噬能力降低，提示PM2.5颗粒物进入机体后引起肺损伤，病引起肺实质和生物膜的损害，激发了机体局部免疫和黏膜免疫并从不同程度降低非特异性免疫功能。目前，临床上暂未有有效的治疗PM2.5引起的肺部损伤疾病的药物。补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂组成，益气活血，补肺固肾，用于肺心病(缓解期)属气虚血瘀证，症见：咳嗽气促，或咳喘胸闷，心悸气短，肢冷乏力，腰膝酸软，口唇紫绀，舌淡苔白或舌紫暗等。“补肺活血胶囊的作用与临床疗效”，吴镝等，中国实用医药，第7卷第8期，第148-149页，2012年3月指出补肺活血胶囊具有益气活血、补肺固肾的功效，可降低全血粘度、降低血气中二氧化碳分压、提高氧分压、氧饱和量，增加心输出量、冠脉血流量，降低血管外周阻力、冠脉阻力、心肌耗氧量，治疗支气管哮喘、尘肺、肺心病效果较好。《中国药典》2015版第一部记载了补肺活血胶囊处方及其制备方法，黄芪720g、赤芍720g、补骨脂360g，取赤芍180g粉碎成细粉，备用；其余药味加水煎煮二次，第一次加8倍量水，第二次加6倍量水，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.15(80℃)，加乙醇使含醇量达60％，充分搅拌，静置24小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.35～1.40(80℃)，加入上述赤芍细粉，混匀，干燥，粉碎，用90％乙醇制粒，干燥，加辅料适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。且该内容仅记载了对黄芪的主要有效成分黄芪甲苷和赤芍的主要有效成分芍药苷的含量进行了限定，并没有对补骨脂的有效成分补骨脂素和异补骨脂素的含量进行限定，我们发现通过该制备方法获得的补骨脂素和异补骨脂素的含量较低。此外，我们还发现目前已有的补肺活血胶囊在储存过程中易引湿性，导致药品不耐储存，影响药物的稳定性。鉴此，临床迫切需要疗效明确、毒副作用小、服用方便且药物易于储存的可用于治疗和/或预防PM2.5引起肺损伤的药物，以满足市场和患者之需。技术实现要素：本发明旨在提供补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，该中药组合物选用药材配伍相宜，符合中医药及现代医学研究理论，药效好且毒副作用低。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊主要由黄芪、赤芍和补骨脂组成。优选的，黄芪为50～100份(重量)、赤芍为50～100份(重量)、补骨脂为25～50份(重量)。更优选的，黄芪为72份(重量)、赤芍为72份(重量)、补骨脂为36份(重量)。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊含有重量百分比的下列活性物质：≥0.18％的黄芪甲苷、≥2.0％的芍药苷和≥0.75％的补骨脂素和异补骨脂素。优选的，含有≥0.20％的黄芪甲苷、≥2.3％的芍药苷和≥0.85％的补骨脂素和异补骨脂素。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊降低PM2.5引起的小鼠肺部损伤的肺的气道阻力，改善肺顺应性，改善肺通气功能。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊降低PM2.5引起的小鼠肺部损伤的肺组织中的炎症细胞因子浓度。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊修复PM2.5引起的小鼠的肺部损伤。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊的制备方法为：(1)将黄芪切片、赤芍和补骨脂粉碎成粗粉；(2)60％-70％乙醇回流提取2次，第一次加5倍量60％-70％乙醇，提取2h，第二次4倍量60％-70％乙醇，提取1h；(3)合并两次的提取液，滤过，滤液减压回收至无醇味，继续减压浓缩至相对密度为1.30-1.40的清膏；(4)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混匀，90％乙醇制粒，干燥，加入不超过5％的滑石粉和0.1％-2％的硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。补肺活血胶囊用于制备治疗和/或预防PM2.5引起的肺部损伤的药物的用途，所述的补肺活血胶囊的制备方法为：(1)将黄芪、赤芍和补骨脂粉碎，置于萃取釜中，以70％～90％乙醇为夹带剂；(2)调节超临界CO2流体温度、压力；(3)萃取温度为30℃～50℃，萃取压力为20MPa～40MPa，萃取时间为1h～3h；(4)收集萃取液，离心浓缩蒸干提取物；(5)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混匀，90％乙醇制粒，干燥，加入不超过5％的滑石粉和0.1％～2％的硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。优选的，补肺活血胶囊的制备方法为：(1)将黄芪、赤芍和补骨脂粉碎，置于萃取釜中，以80％乙醇为夹带剂；(2)调节超临界CO2流体温度、压力；(3)萃取温度30℃，萃取压力20MPa，萃取时间2h；(4)收集萃取液，离心浓缩蒸干提取物；(5)加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混匀，90％乙醇制粒，干燥，加入不超过5％的滑石粉和0.1％～1％的硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，即得。本发明具有以下优点：(1)本发明补肺活血胶囊选用优质中药材制成，成本低廉且配伍相宜，符合中医药及现代医学研究理论，并利用现代医药制药技术制成相关剂型，安全毒副作用低。(2)在PM2.5小鼠模型中，本发明补肺活血胶囊与模型对照组相比，可显著改善PM2.5小鼠的肺功能，病理切片及肺损伤修复指标结果显示，本发明中药组合物可使模型小鼠肺损伤明显改善，且可使炎症细胞因子量显著降低。(3)本发明补肺活血胶囊采用醇提法提取，制备工艺简单易操作，活性物质黄芪甲苷、芍药苷和补骨脂素、异补骨脂素的含量高，尤其是补骨脂素和异补骨脂素的含量明显高于对照组合物。(4)本发明补肺活血胶囊采用超临界提取法提取，活性物质黄芪甲苷、芍药苷和补骨脂素、异补骨脂素的含量高。(5)本发明补肺活血胶囊几乎无引湿性，稳定性好，耐储存。(6)本发明补肺活血胶囊制备简单，易于临床应用。(7)本发明补肺活血胶囊对活性物质黄芪甲苷、芍药苷和补骨脂素、异补附图说明图1为PM2.5模型小鼠肺病理切片。图2为PM2.5模型小鼠肺损伤病理切片。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。实施例1本发明补肺活血胶囊的原料配方组合物1：黄芪500g，赤芍1000g，补骨脂360g。组合物2：黄芪1000g，赤芍1000g，补骨脂500g。组合物3：黄芪500g，赤芍500g，补骨脂250g。组合物4：黄芪720g，赤芍720g，补骨脂360g。实施例2本发明补肺活血胶囊提取物的制备及活性物质的含量本发明补肺活血胶囊的制备：取实施例1组合物4的原料配方的黄芪切片、赤芍和补骨脂粉碎成粗粉，60％-70％乙醇醇回流提取2次，第一次加5量60％-70％乙醇，提取2h，第二次4倍量60％-70％乙醇，提取1h，合并两次的提取液，滤过，滤液减压回收至无醇味，继续减压浓缩至相对密度为1.30-1.40的清膏，即得。所述补肺活血胶囊提取物中含有下列活性物质：黄芪甲苷、芍药苷、补骨脂素和异补骨脂素，结果见表1，测定方法依照《中国药典》(2015版)第一部的方法。表1本发明补肺活血胶囊活性物质含量对比组合物制备方法：黄芪720g，赤芍720g，补骨脂360g，取赤芍180g粉碎成细粉，备用；其余药味加水煎煮二次，第一次加8倍量水，第二次加6倍量水，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.15(80℃)，加乙醇使含醇量达60％，充分搅拌，静置24小时，滤取上清液，回收乙醇至无醇味，继续浓缩至相对密度为1.35～1.40(80℃)，加入上述赤芍细粉，混匀，干燥，粉碎。表2本发明补肺活血胶囊与对照组合物活性物质含量比较实施例3本发明补肺活血胶囊提取物的制备及活性物质的含量本试验是对超临界CO2萃取设备的工艺参数进行综合研究，寻找各种萃取条件(萃取温度、压力、夹带剂和时间)对萃取量及有效物质含量的影响，经考察夹带剂乙醇浓度影响较小(乙醇浓度为70％～90％，80％较优)，萃取压力、萃取温度、萃取时间和夹带剂是主要的影响因素，因此以黄芪甲苷和提取物的得率为指标用正交试验法考察四种因素对提取效果的影响。考察因素及水平见表3。表3本发明补肺活血胶囊提取工艺考察因素水平表试验方法称取黄芪720g，赤芍720g，补骨脂360g，粉碎后置于萃取釜中，调整CO2流体温度，调节萃取温度及压力，按正交试验表4的要求萃取，平行三份，合并提取液。表4本发明补肺活血胶囊超临界提取工艺考察正交表表5方差分析表F0.05(2,2)＝19.00F0.01(2,2)＝99.00由表5方差分析可知：最佳选择工艺应为A3B2C2。即萃取温度30℃，萃取压力40MPa，萃取时间1h。根据上述优选工艺，制得的补肺活血胶囊的活性物质含量如下表6所示。表6本发明补肺活血胶囊活性物质含量实施例4本发明补肺活血胶囊剂的制备根据实施例2或3的制备方法制得的清膏，加1.0～2.0倍重量份的淀粉，混匀，90％乙醇制粒，干燥，加入不超过5％的滑石粉和0.1％-2％的硬脂酸镁，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。本发明补肺活血胶囊引湿性的测定实验方法：取干燥的具塞玻璃称量瓶，试验前一天置于适宜的25℃±1℃恒温干燥器(设定温度为25℃±1℃，相对湿度为80％±2％)内，精密成定重量。取供试品适量，平铺于上述称量瓶中，供试品厚度为约为1mm，精密成定重量。将称量瓶敞口，并与瓶盖同置于上述恒温恒湿条件下24小时，盖好称量瓶盖子，精密成定重量。实验结果：本发明补肺活血胶囊增重百分率不超过2％，表明本发明补肺活血胶囊几乎无引湿性，见表7。表7本发明补肺活血胶囊的引湿性实施例5本发明补肺活血胶囊对PM2.5小鼠模型的影响试验目的：通过PM2.5小鼠模型试验，观察补肺活血胶囊对模型动物肺部功能、肺组织损伤的作用。动物：试验用动物为SPF级健康ICR雌性小鼠60只，体重22-26g(由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)。在温度22℃-28℃，相对湿度50％-60％的清洁环境中饲养，采用12/12照明。动物的使用和护理符合北京中日友好医院动物伦理协会的人道关怀。药物：由本发明实施例1的组合物4，根据其成人用量，配成0.41g生药/ml，灌胃给药。小鼠模型建立与药物干预：健康ICR雌性小鼠60只，按体重随机分为3组：正常对照组、PM2.5模型组、本发明中药组合物组，每组20只。空白对照组：分别于模型建立第1，8，15和22天经鼻腔滴入0.9％生理盐水(20μL/只)，其余时间正常饲养。PM2.5模型组：采用鼻腔滴注PM2.5悬液方法，分别于模型建立第1，8，15和22天经鼻腔滴注PM2.5悬液(40mg/kg·bw，20μL/只)，第1天至第22天，经口灌服0.9％生理盐水0.2ml/只/d。本发明中药组合物组：PM2.5小鼠模型建立方法同模型对照组，第1天至第22天，经口灌服补肺活血中药溶液(0.82g/Kg,0.2ml/只/d)。各个试验组均在最后一次染毒后48小时内处死。试验结果及分析：1、小鼠模型肺功能分析(高剂量染毒对照组)2％戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠(0.4mL/40g)，取仰卧位固定于操作台，剪开颈部皮毛，暴露气管，并钝性分离气管，于气管近头部处剪一切口，将插管的气管接头处插入气管，并用棉线固定，转移小鼠至体描仪平台，连接呼吸机与气管接头，记录小鼠的肺功能相关指标的变化。并用AniRes2005动物肺功能分析系统急性分析(肺功能仪：北京贝兰博科技有限公司)。结果见表8。表8补肺活血胶囊对PM2.5模型小鼠肺功能的影响**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05由表8结果可知，与模型组相比补肺活血胶囊组对小鼠的气道阻力(RL、RE)显著降低(p<0.01)，肺顺应性(Cdyn)显著改善(p<0.01)，肺通气功能(PEF)显著改善。表明，本发明中药组合物可显著改善PM2.5小鼠的肺功能。2、病理学分析(三种染毒剂量)脱颈处死小鼠，开胸暴露胸腔：分离靠近肺门处的左肺上叶固定于10％甲醛溶液24h，常规脱水石蜡包埋，切片行HE染色，光镜下观察；取右侧肺叶以备匀浆。结果见附图1。结果分析：空白对照组小鼠肺组织未见明显炎症细胞浸润；小支气管粘膜及支气管壁结构完整；肺泡分布均匀、结构完整，泡腔内少量炎性细胞浸润；肺间质炎症状态较轻；肺毛细血管结构完整，未见出血现象。PM2.5模型小鼠肺的主要病理表现为肺组织炎性改变，中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润明显增多。小支气管粘膜部分损伤，主要表现为小支气管壁增厚，伴有少量出血、渗出现象；肺泡腔增大，部分肺泡断裂、融合，腔内有分泌物，主要有单核细胞、中性粒细胞浸润，可见淋巴细胞增生，部分肺泡出现实变现象，肺泡间隔增宽；肺间质有大量炎性细胞浸润；肺毛细血管部分出现出血，伴炎性渗出，管壁不同程度增厚。与PM2.5模型小鼠相比补肺活血胶囊组可使模型小鼠肺组织的炎性改变明显减轻；小支气管粘膜损伤程度较轻；肺泡结构相对完整，腔内分泌物减少，炎性细胞浸润明显减轻；肺间质炎性细胞浸润有所改善；肺毛细血管结构较为完整，可见少量出血现象。3、ELISA检测(三种染毒剂量)取0.1g肺组织放入1.5mlEP管中，制备成10％肺组织匀浆液，离心4℃，12000r/min，20min，取上清。按ELISA试剂盒提示的操作步骤说明进行肺组织匀浆上清液中相关炎性介质含量。结果见表9-14。表9补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中IL-1的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组3616.25±1176.73**3616.25±1176.73**3616.25±1176.73**染毒组5253.98±1350.615327.92±1274.076005.13±1815.30中药组合物组4457.90±1425.27**4187.91±998.28**4782.04±1187.23**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。表10补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中IL-4的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组252.51±37.50**252.51±37.50**252.51±37.50**染毒组358.45±32.57371.97±37.063395.20±68.29中药组合物组256.42±65.80**233.86±50.61**299.63±53.85**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。表11补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中IL-6的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组3890.26±1015.36**3890.26±1015.36**3890.26±1015.36**染毒组5008.03±1518.925560.60±1738.325985.88±2086.78中药组合物组4466.32±1440.85**4179.10±1136.73**5226.43±1973.88**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。表12补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中IL-10的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组2930.63±632.28**2930.63±632.28**2930.63±632.28**染毒组4194.15±487.224741.14±1082.316219±724.16中药组合物组3120.58±691.67**3248.64±786.94**3647.24±1336.03**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。表13补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中IL-17的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组591.90±139.92**591.90±139.92**591.90±139.92**染毒组761.42±126.19883.38±116.301008.89±187.59中药组合物组583.11±136.36**643.62±101.51**616.28±169.70**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。表14补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中TNF-α的影响低剂量染毒组中剂量染毒组高剂量染毒组空白组10365.69±1530.90**10365.69±1530.90**10365.69±1530.90**染毒组15017.8±1284.7718838.35±716.0120278.18±1896.80中药组合物组12732.06±1184.12**14130.99±3103.43**13216.5±1332.48**定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。由表9-14结果可知，与模型组相比，补肺活血胶囊组对不同浓度PM2.5模型小鼠肺组织中炎症细胞因子(IL-1、4、6、10、17，TNF-α)抑制作用显著，各炎症细胞因子含量显著降低(P<0.01)。4、Masson三色法步骤：(高剂量染毒组)(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)依次自来水和蒸馏水洗；(3)用Regaud苏木精染液5-10min；(4)充分水洗,如过染可盐酸酒精分化；(5)蒸馏水洗；(6)用Masson丽春红酸性复红液5-10min；(7)2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(8)1％磷钼酸水溶液分化3-5min；(9)不经水洗,直接用苯胺蓝液染5min；(10)以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(11)95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。每张切片选取6个不重复的视野(×200倍)，MASSON染色以蓝色胶原沉积为阳性信号，用ImageProplus多媒体彩色病理图像分析软件进行分析。计算小鼠肺组织胶原沉积面积与视野内肺组织总面积的比值，并取平均值。结果见附图2。由附图2可知，A中可见HMBG1主要见于肺泡间隙，B中可见KGF主要出现在气管壁及肺泡组织间隙中。C中可见补肺活血胶囊对PM2.5模型小鼠肺组织中胶原沉积及组织纤维化的影响，其中胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核黑蓝色。5.免疫组化(高剂量染毒组)肺组织切片常规脱蜡后，按照免疫组化试剂盒具体操作步骤进行检测。采用美国MediaCybernetics公司生产的Image-ProPlus图像分析软件进行分析，以累积光密度(IntegratedOpticalDensity，IOD)反映蛋白表达总量。表15补肺活血胶囊组对PM2.5模型小鼠肺损伤修复指标影响MASSONHMGB1KGF空白组7.43±1.42**9804.32±5175.90**18232.15±8342.99**染毒组22.44±5.4321655.11±5053.6725278.79±10469.46中药组合物组10.0±1.98**10323.82±5580.02**17697.89±6162.62**相关定量分析用表示，**表示与模型组相比P<0.01，*表示与模型组相比P<0.05。由表15可知，与模型组相比，补肺活血胶囊组队对PM2.5模型小鼠肺损伤修复指标显著改善(P<0.01)。6.PCR检测：(高剂量染毒组)取小鼠肺组织100mg，Trizol一步法抽提总RNA，经逆转录合成cDNA(其中2μgRNA、1μloligo(dT)、DEPC水至12μl)。小鼠肺组织β-actin引物序列：正向引物5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，反向引物5’-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’；IL-8引物序列：正向引物5’-CATCTTCGTCCGTCCCTGTG-3’，反向引物5’-GCCAACAGTAGCCTTCACCCA-3’；sIgA引物序列：正向引物5’-GCTACAGTGTGTCCAGCGTCCT-3’，反向引物5’-TGCCAGACTCAGGATGGGTAAC-3’。采用相对定量研究分析法，以2-△△Ct作指标进行分析。表16IL-8和sIgA的mRNA在不同组别小鼠肺组织匀浆液中的表达IL-8sIgA空白组0.58±0.43**0.039±0.029**染毒组1.80±0.700.347±0.101中药组合物组1.14±0.36**0.157±0.104**IL-8和sIgA在小鼠中的表达量用表示，**表示与模型组相比P<0.01，n≥8IL-8和sIgA的mRNA在不同组别小鼠肺组织匀浆液中的表达。空白对照组与模型组相比IL-8和sIgA的表达明显降低，补肺活血胶囊物组干预组炎性介质含量明显低于模型组。当前第1页1 2 3