用于治疗肌肉萎缩的衍生物的制作方法

本发明涉及可用于治疗与肌肉萎缩相关的疾病的衍生物。

背景技术：

现如今，明显缺乏新的治疗方法来延缓与年龄相关的紊乱和疾病的发作和发展，这些紊乱和疾病伴有肌肉强度或力量的下降(例如肌肉减少症)，同时与衰老相关联的行动问题是非常严重的问题，具有广泛的健康方面的后果。

患有某些代谢紊乱或疾病的老年人经常面临瘦体重的损失，这至少部分地由于肌肉蛋白质合成的减少(例如肌肉减少症)、营养摄入的减少或炎症的存在。已知瘦体重下降与如下相关：疲劳、执行日常生活所需任务的能力降低、骨折风险增加、摔倒和住院增加、新陈代谢(葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性)受损和认知能力以及生活质量下降(fronterawr等，1991，baumgartner等，1998，lloydbd等，2009)。与恶病质(cachexia)不同，肌肉减少症患者可以有稳定的体重，但表现出肌肉重量明显减少以及同时典型地脂肪重量增加。

许多因素影响肌肉重量的下降。实质上，如在活动障碍中所见的，观察到了骨骼肌对蛋白质合成具有合成代谢耐受性，其可以至少部分地通过耐受性训练和膳食补充来改善(farnfieldmm等，2012)。也已表明神经支配的丧失和氧化性损伤可能起重要作用(chairj等，2011，o'neilled等，2010)，并导致涉及不同的细胞信号传导途径的肌肉萎缩，同时也导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)、蛋白质降解增加，或者甚至是负责肌肉再生的细胞的活化作用降低。因此，肌肉减少症是蛋白质降解与其合成之间失衡的结果，其中上述每个因素的确切贡献根据所研究的模型或案例而不同。已指出一些蛋白水解系统参与肌肉分解，例如钙激活蛋白酶(例如钙蛋白酶和胱天蛋白酶)、泛素蛋白酶体系统(hasselgrenpo等，2002，purintrapibanj等，2003)。就鉴别的肌肉减少症的发展过程的不同靶点而言，发现atrogin-1(也称为mafbx)和murf-1有所增加，akt/mtor/s6k下降。

自分泌产生的肌生成抑制蛋白(myostatin，其由肌肉本身产生)也是一个特别重要的因素，因为这种蛋白质在刺激蛋白质水解和抑制蛋白质合成方面均有作用。在衰老伴随着显著的激素变化的同时，肌生成抑制蛋白的分泌增加(léger等，2008)，其在成体肌肉中的表达随着萎缩的程度而增加。肌生成抑制蛋白也称为生长分化因子-8(gdf-8)，具有tgf-β家族蛋白共有的全部结构特征：疏水的氨基末端(充当分泌信号)、九个恒定的半胱氨酸残基以及弗林蛋白酶蛋白水解加工位点“rxxr”。蛋白质的蛋白水解切割产生了c-末端结构域，所述c-末端结构域形成同源二聚体，该二聚体是肌生成抑制蛋白的生物活性形式(thies等，2001)。多种脊椎动物物种的肌生成抑制蛋白的氨基酸序列比对表明，该蛋白在人、猿、牛、狗、小鼠、大鼠、火鸡和鸡之间高度保守(100％同一性)(mcpherron等，1997)。其表达主要局限于骨骼肌和脂肪组织，其中它对骨骼肌发育起着负调控子的作用(leels，2010，10：183-194)。

已经表明，肌生成抑制蛋白遗传缺陷的小鼠和牛展现出骨骼肌重量的显著增加，从而支持了肌生成抑制蛋白在抑制肌肉生长中的作用(wolfman等，2003)。在一些牛品种中，肌肉肥大是由于牛的肌生成抑制蛋白基因第三外显子的错义突变(bass等，1999)，其伴随着细胞数(或增生性生长)的升高以及细胞大小(或肥大性生长)的增加，导致更大更重的肌纤维。

增加的骨骼肌重量和强度也与代谢适应有关，其对身体组成、能量消耗、葡萄糖稳态和胰岛素需求有阳性影响。药理和基因数据表明，肌生成抑制蛋白调节能量代谢，并且其抑制作用可以显著减少代谢疾病(例如肥胖和糖尿病)的发展。例如，与同龄的野生型小鼠相比，肌生成抑制蛋白遗传缺陷的小鼠具有较低的体内脂肪积累(与脂肪细胞数量和尺寸的减少相关)(mcpherron等，2002)，从而证明肌生成抑制蛋白在脂肪生成和肌生成中的重要作用。

现有的肌肉减少症的测试性治疗方法依靠营养方式、体育锻炼、食欲刺激剂或促合成化合物(例如睾酮)的使用，但这些治疗方法的效果并不令人满意(morley等，2007)，并可能引起副作用。

本发明涉及用于治疗和/或预防哺乳动物的肌肉萎缩的衍生物和包含所述衍生物的药物组合物。

技术实现要素：

因此，本发明涉及用作药物的具有以下通式i的衍生物、或其对映异构体、非对映异构体、水合物、溶剂合物、互变异构体、外消旋混合物或药学上可接受的盐，

其中，

-r¹和r²各自独立地为氢原子或(c1-c6)烷基，优选甲基；

-n是1至2的整数，优选n＝1；

-r³代表

--oh基团；

--o(c1-c6烷基)基团，优选-oet或-oipr；

--o(c3-c6环烷基)基团，优选-o-环戊基；

--o(c3-c7杂环)基团，优选-o-四氢吡喃-4-基；

--o-杂芳基基团，优选-o-吡啶基；

--o-芳基基团，优选-o-苯基；

--o(c1-c6烷基)芳基基团，优选-o-苄基；

--nr⁷r⁸基团，其中

r⁷代表氢原子或c1-c6烷基基团，r⁸代表

-氢原子；

-杂芳基基团，该杂芳基基团优选含有一个或多个氮原子，特别地为哒嗪基基团或吡啶基基团；

-c1-c6烷基基团、优选乙基基团，该c1-c6烷基基团任选地被-nr⁹r¹⁰基团取代，其中r⁹和r¹⁰各自独立地代表氢原子或c1-c6烷基基团、优选甲基基团；

-c1-c6烷基基团、优选乙基基团，该c1-c6烷基基团任选地被-or¹¹基团取代，其中r¹¹代表氢原子或c1-c6烷基基团、优选甲基基团；

或者r⁷和r⁸以与氮原子组成杂环的形式提供，所述杂环特别是吡咯烷、哌啶、吗啉、哌嗪，所述杂环任选地被c1-c6烷基基团、优选甲基基团取代，特别地，r⁷和r⁸组成甲基哌嗪基；

-r⁴代表氢原子或c1-c6烷基基团，特别是-me或-et、更特别是-et；

-r⁵和r⁶各自独立地代表氢、卤素原子(优选cl)或选自以下的基团：

-cn基团；

-oh基团；

-o(c1-c6烷基)基团、优选-ome，所述烷基基团任选地被一个或多个卤素原子、优选f取代，例如为-ocf3或-ochf2；

c1-c6烷基基团、优选甲基，该c1-c6烷基基团任选地被一个或多个卤素原子、优选f取代，例如为-cf3；以及

-o(c3-c6环烷基)基团、优选o-环丙基，

所述药物用于：治疗和/或预防哺乳动物的肌肉萎缩、和/或限制哺乳动物的肌肉萎缩、和/或促进哺乳动物肌肉增强(该哺乳动物为锻炼并意在增加肌肉重量和品质的哺乳动物)、预防与年龄相关的肌肉减少症症状的出现或作用于肌肉损失后的康复，

所述肌肉萎缩是与年龄和/或药物治疗后果和/或活动障碍和/或恶病质有关的肌肉萎缩。

特别地，肌肉萎缩为与年龄相关，例如前期肌肉减少症、肌肉减少症或重度肌肉减少症。肌肉萎缩也可能与药物治疗(例如癌症治疗)的后果有关。肌肉萎缩也可能与活动障碍有关，特别是无论何种原因，例如由于与年龄相关的虚弱、事故或手术(例如臀部或膝部的假体)而导致的活动障碍。最后，肌肉萎缩可能与恶病质有关，特别是无论何种原因，例如由于神经性厌食症、癌症、心力衰竭、肝功能衰竭、肾功能不全、结核病或aids而导致的恶病质。

具体而言，哺乳动物可以是动物或人，优选哺乳动物是人。

根据本发明，式(i)的衍生物具有用于治疗和/或预防肌肉萎缩的活性，特别是与年龄相关的肌肉萎缩(例如前期肌肉减少症、肌肉减少症或重度肌肉减少症)、和/或与药物治疗(例如癌症治疗)的后果有关的肌肉萎缩、和/或与活动障碍有关的肌肉萎缩(特别是无论何种原因，例如与年龄相关的虚弱、事故或外科手术(例如臀部或膝部的假体的安装))、与恶病质相关的肌肉萎缩，以及一般而言，与哺乳动物的肌肉萎缩有关的病状。

式(i)的衍生物还可用于促进哺乳动物(特别是人)的肌肉生长，该哺乳动物锻炼并意在增加肌肉的重量和品质，例如预防与年龄相关的肌肉减少症的症状的出现。

本发明人发现，本发明所述的衍生物可以抑制肌生成抑制蛋白的基因表达，以增加肌细胞中的蛋白质合成和/或增加c2c12细胞中肌管的直径。

本发明进一步涉及如上所定义的、本发明所述的式(i)的衍生物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗和/或预防哺乳动物的肌肉萎缩、和/或限制哺乳动物的肌肉萎缩、和/或促进锻炼的哺乳动物的肌肉生长并意在增加肌肉重量和品质，以便预防与年龄相关的肌肉减少症症状的出现、或用于肌肉损失后的康复。

本发明还涉及如下的方法：治疗和/或预防和/或预防性治疗和/或推迟哺乳动物肌肉萎缩的发作、和/或限制哺乳动物的肌肉萎缩、和/或促进锻炼的哺乳动物的肌肉生长并意在增加肌肉重量和品质、预防与年龄相关的肌肉萎缩症症状的出现、或用于肌肉损失后的康复，所述方法包括将有效量的本发明所述的式(i)的衍生物给予有需要的受试者。

将根据待治疗的病症的性质和严重程度、给予途径以及受试者的体重和年龄对有效量进行调整。一般而言，剂量单位在每天0.5mg至2000mg(一次或多次剂量)变化，当受试者是人时，优选1mg至1000mg。

在优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，r⁴代表-(c1-c6)烷基基团、优选-et。

在另一个优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，n＝1；

在又一个优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，基团r⁵和/或r⁶代表卤素原子、优选氯原子。

在又一个优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，r⁵和r⁶各自独立地代表卤素原子、优选cl；特别地，r⁵和r⁶为氯，并且r⁴是c1-c6烷基基团、特别是et。

在另一个优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，r¹和r²均代表氢原子。

在又一个优选的实施方式中，用于本发明上下文的式(i)的衍生物为，r³代表-oh基团或-o(c1-c6烷基)基团、优选-oet或-oipr。

特别地，用于本发明上下文的式(i)的衍生物选自以下化合物。

(1)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-丁酸；

(2)4-(3,4-二氯苯基)-4-甲氧基亚氨基-丁酸；

(3)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-丁酸异丙酯；

(4)5-(3,4-二氯苯基)-5-乙氧基亚氨基-戊酸；

(5)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-n-(2-吡啶基)丁酰胺；

(6)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-n-(3-吡啶基)丁酰胺；

(7)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-n-哒嗪-3-基-丁酰胺；

(8)4-(3,4-二氯苯基)-n-(2-二甲基氨基乙基)-4-乙氧基亚氨基-丁酰胺；

(9)(4e)-4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-n-(3-羟丙基)丁酰胺；

(10)4-(3,4-二氯苯基)-4-乙氧基亚氨基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-1-酮；

特别地，现有技术中描述了其它用途的由通式(i)涵盖的下列化合物(1至10)：

事实上，专利申请wo2010011302描述了由通式(i)所涵盖的化合物1至10的合成及其在神经退行性疾病治疗领域的应用，但是没有描述对肌肉萎缩的活性。因此，本发明人惊奇地发现，这些已知化合物在对与哺乳动物的肌肉萎缩相关病理的治疗和/或预防方面具有活性。

在本发明的上下文中，术语“芳基基团”是指具有5至8个碳原子的芳族环或具有5至14个碳原子的多个稠合芳族环。特别地，芳基基团可以是单环或双环基团、优选苯基或萘基。优选地，芳基基团是苯基基团(ph)。

在本发明的上下文中，术语“杂芳基基团”是指含有一个或多个(特别是一个或两个)杂原子(例如硫、氮或氧原子、特别是一个或多个氮原子)的3-9个原子的任何芳族烃基。本发明所述的杂芳基可以由一个或多个稠环组成。杂芳基基团的实例为呋喃基、异噁唑基、吡啶基、噻唑基、嘧啶基、哒嗪基、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、吡唑。优选地，杂芳基基团选自哒嗪基、吡唑基和吡啶基基团。

在本发明的上下文中，术语“卤素原子”应理解为是指任何卤素原子，优选地选自cl、br、i或f，特别是选自f、cl或br，特别是f或cl，更具体地cl。

在本发明的上下文中，术语“c1-c6烷基基团”是指具有1至6个碳原子的任何直链或支链烷基基团，特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基。优选地，c1-c6烷基基团是甲基(me)、乙基(et)、异丙基(ipr)或叔丁基(tbu)基团，特别是甲基、乙基或异丙基基团，更特别是甲基或乙基基团。

在本发明的上下文中，术语“c3-c6环烷基基团”是指任何饱和并含有3至6个碳原子的基于烃的环，特别是环丙基、环丁基、环戊基或环己基基团。优选地，c3-c6环烷基基团是环戊基或环己基基团。

在本发明的上下文中，术语“杂环基团”是指含有一个或多个杂原子(例如硫、氮或氧原子，特别是氮和氧原子，更特别是一个或多个氮原子)的3至9个原子的任何饱和环烃基团。本发明所述的杂环基团可以由一个或多个稠环组成。杂环基团的实例是四氢呋喃、四氢吡喃、吡咯烷、哌嗪、哌啶、硫杂环戊烷(thiolane)、环氧乙烷、噁烷、噻烷(thiane)、噻唑烷、吗啉基团。优选地，杂环基团选自四氢吡喃、哌啶、吡咯烷、哌嗪和吗啉基团。

在本发明的范围内，术语“药学上可接受”是指可用于制备这样的药物组合物：通常安全无毒，既非不符合生物学需要也非不符合其它方面需要，并且对于兽药用途以及人类药物而言是可接受的。

在本发明的范围内，术语“化合物的药学上可接受的盐”是指如本文所定义的药学上可接受的、并且具有母体化合物的所需的药理学活性的盐。此类盐包括：

(1)与无机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，有机酸例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基萘甲酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、2-萘磺酸、丙酸、水杨酸、琥珀酸、二苯甲酰-l-酒石酸、酒石酸、对甲苯磺酸、三甲基乙酸、三氟乙酸等；或

(2)存在于母体化合物的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)替换形成的盐；或者存在于母体化合物的酸性质子与有机或无机碱配位形成的盐。可接受的有机碱包括二乙醇胺、乙醇胺、n-甲基葡糖胺、三乙醇胺、氨基丁三醇等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠。

在本发明的上下文中，术语“化合物的溶剂合物”应理解为是指通过将惰性溶剂分子加合至本发明所述的化合物上而获得的任何化合物，所述溶剂合物因它们的相互吸引力而形成。溶剂合物是例如化合物的醇合物。水合物是其中所使用的惰性溶剂是水的溶剂合物。溶剂合物可以是单、二或三水合物。

在本发明的上下文中，术语“互变异构体”意指本发明所述的化合物的任何组成异构体，其可通过称为互变异构的可逆化学反应相互转化。在大多数情况下，反应由氢原子的迁移伴随着双键位置的变化而产生。在能够互变异构的化合物的溶液中，两种互变异构体之间建立了平衡。互变异构体之间的比例是溶剂、温度和ph的函数。互变异构因此是一个官能团向另一个官能团的转化，通常伴随氢原子和π键(双键或三键)的置换。常见的互变异构体是，例如醛/酮-醇对，或更确切地，烯醇对、酰胺-亚胺酸、内酰胺-内酰亚胺、亚胺-烯胺、烯胺-烯胺。特别地，互变异构可以包括环-链互变异构；在质子的运动伴随有开放结构向环的转变时，发生所述环-链互变异构。

本发明所述的衍生物可以以含有药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式给予。

可配置用于给予哺乳动物(包括人)的这些组合物。剂量学根据所考虑的治疗和病状而多样化。这些药物组合物适于通过任何合适的途径给予，例如口服给予(包括口腔和舌下途径)、直肠给予、经鼻给予、局部给予(包括透皮给予)、阴道给予、眼内给予或肠胃外给予(包括皮下给予、肌内给予或静脉内给予)。优选地，药物组合物适于口服给予。可以使用本领域技术人员已知的任何方法，通过将活性成分与合适的药学上可接受的赋形剂组合，来制备此类制剂。

合适的口服给予的单位形式包括片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂和处于水性或非水性液体中的口服溶液剂或混悬剂、可食用的泡沫剂、或液体水包水乳剂或油剂或水包油剂。当制备处于片剂形式的固体组合物时，将主要活性成分(优选处于散剂形式)与合适的药物赋形剂(例如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯树胶等)混合。可以用蔗糖或其它合适的材料对片剂进行包覆，或者可以以使得所述片剂具有延长或延迟的活性并持续释放预定量活性成分的方式对片剂进行处理。

通过将活性成分(优选处于散剂形式)与稀释剂混合，并将所得混合物倒入软或硬胶囊、特别是明胶胶囊中，来获得胶囊制剂。可在填充到胶囊剂中之前，将润滑剂(例如固体型聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙)添加到组合物中。还可以加入崩解剂或增溶剂(例如碳酸钙或碳酸钠)，以便改善胶囊剂被服用后药物的可用性。

此外，如果需要，可以向混合物中加入合适的粘合剂、润滑剂和崩解剂以及着色剂。合适的粘合剂可以是例如淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、由玉米制成的甜味剂、合成或天然橡胶(例如阿拉伯树胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。可用于此类剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。例如通过如下来对片剂进行配制：制备粉末混合物，对混合物进行制粒或干压，加入润滑剂和崩解剂并对混合物进行压制，以得到片剂。通过将活性成分与适当添加的稀释剂或碱以及任选地如下成分混合来制备粉末混合物：粘合剂(例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶解阻滞剂(例如石蜡)、吸收促进剂(例如季盐)和/或吸收剂(例如膨润土、高岭土或磷酸二钙)。粉末混合物可以通过用粘合剂(例如糖浆、淀粉糊、阿拉伯树胶胶浆或纤维素溶液或聚合物材料)润湿并将它们加压过筛而制粒。可以通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油来润滑颗粒，以便防止它们粘附在用于制造片剂的模具上。然后对经润滑的混合物进行压制以生产片剂。可任选地存在由虫胶层、糖层或聚合物材料层组成的不透明或透明保护层。可将染料加入到此类涂层中以使其与其它片剂区分开来。

糖浆制剂或酏制剂可以含有活性成分以及甜味剂、防腐剂以及调味剂和合适的着色剂。一般来说，糖浆制剂是通过将化合物溶于水性溶液(含有给予适当味道的试剂)中而获得的，而酏剂是使用无毒酒精载体来制备的。

水分散性散剂或颗粒剂可以含有活性成分，所述活性成分与分散剂、润湿剂或悬浮剂(例如乙氧基异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)以及矫味剂或甜味剂一起处于混合物中。

对于直肠给予，使用栓剂，所述栓剂用在直肠温度下融化的粘合剂(例如可可脂或聚乙二醇)制备。

对于肠胃外、鼻内或眼内给予，使用含有分散剂和/或药理学上相容的润湿剂的水性混悬剂、等渗盐溶液剂或无菌和可注射溶液剂。

还可以将活性成分配制成微胶囊剂，该微胶囊剂任选含有一种或多种添加剂。

可以将适合于局部给予的药物组合物配制成霜剂、膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

适于经鼻给予的药物组合物通过从容纳粉末并放置在鼻子附近的容器中吸入给予，该药物组合物中赋形剂处于固体状态并含有粉末，所述粉末具有例如20微米-500微米的粒径。

适于阴道给予的药物制剂可以以缓冲液、霜剂、凝胶剂、糊剂、摩丝或喷雾剂的形式给予。

在优选的实施方式中，本发明所述的药物组合物进一步包含另一活性成分，该活性成分优选地具有互补或协同效应。

这一第二活性成分可与本发明式(i)的衍生物在相同的药物组合物中给予。还可在同一时刻或随时间单独给予第二活性成分。

通过本领域技术人员熟知的方法制备本发明所述的衍生物，特别地，现有技术(wo2010011302)中描述了用于制备化合物1至化合物10的方法。

实施例

根据下面的附图和实施例的描述将更好地理解本发明，这些描述是以非限制性描述的方式给出的。

附图说明

图1形象化示出了在载体(对照：ctrl)以及浓度为10μm的化合物1、浓度为10μm的地塞米松(dex)和浓度为10ng/ml的igf1的存在下，肌纤维直径(μm)。

级联筛选

筛选测试的开展源于文献中的工作，并以肌肉减少症的病理学特征为基础。在病理生理学水平上，这一疾病的特征为蛋白质合成减少和蛋白水解增加。因此，借助允许评价化学分子对肌生成抑制蛋白的基因表达的抑制及其对肌细胞中蛋白质合成能力的提升的测试，筛选出上述化合物。此外，我们已经展示了，以上列出的一些产物增加了c2c12细胞中的肌管的直径。

方案：

c2c12细胞中肌生成抑制蛋白表达的测量：

将c2c12成肌细胞(atcccrl-1772)以每孔30,000个细胞的密度接种在24孔板中并培养在含有4.5g/l葡萄糖、补充有胎牛血清(10％)和抗生素(青霉素和链霉素)的dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)培养基中。48小时后，在部分剥夺血清(2％而不是10％)下对成肌细胞进行分化诱导5天。然后在测试分子或参照(igf-1浓度为100ng/ml)的存在下，将细胞放置于葡萄糖剥夺且无血清的培养基(含有1g/l葡萄糖的dmem)中6小时。在实验结束时，使用标准苯酚和氯仿方法提取信使rna(mrna)。简言之，在含有强酸和苯酚的三唑(sigmat9424)溶液中对细胞进行裂解。加入氯仿后离心，将mrna从蛋白质中分离。然后在异丙醇中将其沉淀，然后在不含rna和dna的超纯水中以1μg/μl的浓度悬浮。然后根据供应商给出的方案(appliedbiosystems4368814)，在引物和核苷酸混合物的存在下，借助amv酶通过逆转录将1μg的mrna转化成互补dna。通过聚合酶引发的链式反应和通常所称的定量条件下的pcr(因此确切名称为qpcr)对基因表达进行研究。qpcr是在7900ht快速实时pcr检测系统(appliedbiosystems)上进行的。程序条件为标准条件，并由如下组成：1个循环(95℃下15分钟)，接着40个循环(95℃下15秒、60℃下1分钟)，并在60℃和95℃下以熔解曲线步骤结束。所分析的样品均包含：100ng的cdna、含有所述酶的qpcr缓冲液、插入物(sybrgreen)和寡核苷酸混合物，以及所研究的基因的一对特异性引物，所述引物在两个外显子序列间的策略性选择，终浓度为200nm。荧光探针与双链dna结合，仅当附着于dna才发荧光。通过机器的程序来设立荧光阈值。当dna的量使得荧光探针超过该阈值时，获得针对“循环阈值”的pcr循环数(称为“ct”)。该值是以比例方式对dna进行定量计算的基础。将比值r设定为在样品中的起始dna的量和未经处理的对照的量之比(即，r＝2-^{(ctsample–ctcontrol)})，并将该测量结果与已知不被该处理所调控的管家基因的结果(或)进行比较。

下表记录了所使用的引物：

评价基因表达的改变所使用的引物

蛋白质合成

对细胞进行计数，并以20000个细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板的含有4.5g/l葡萄糖并补充有胎牛血清(10％)和抗生素(青霉素和链霉素)的dmem培养基中。48小时后，在部分剥夺血清(2％而不是10％)下对成肌细胞进行分化诱导5天。然后在37℃下，将细胞放置于不含葡萄糖或亮氨酸的培养基(krebs培养基)中1小时，然后在测试产品或参照(igf-1，100ng/ml)的存在下，在含有放射性标记的亮氨酸(2.5μci/ml)的无血清dmem培养基中孵育2小时30分钟。孵育结束时，除去上清液并在0.1nnaoh溶液中对细胞进行裂解30分钟。测量细胞部分中的放射性，并通过lowry测定法对总蛋白量进行确定。在至少n＝6下对各条件进行评价；igf-1(100ng/ml)是我们刺激蛋白质合成的对照。结果以孵育2.5小时后cpm/μg的蛋白质表示，或者以相对于对照条件的百分比表示。

肌纤维直径的评价

将c2c12成肌细胞(atcccrl-1772)以10,000细胞/孔的密度接种于甘油处理的8孔板中，并在含有4.5g/l葡萄糖并补充有胎牛血清(10％)和抗生素(青霉素和链霉素)的dmem培养基中培养。

48小时后，在部分剥夺血清(2％而不是10％)下对成肌细胞进行分化诱导3天。然后在测试分子或参照(浓度为10ng/ml的igf-1或地塞米松10μm)的存在下，将细胞在葡萄糖剥夺且无血清的培养基(含有1g/l葡萄糖的dmem)中放置3天。在培养结束时，对细胞进行洗涤并在室温下用2.5％戊二醛/0.1％triton溶液固定1小时。用dapi(细胞核的荧光标记物)包封细胞层。在黑暗中冷藏16小时后，在荧光显微镜(carlzeiss，axiovert200)下观察载玻片，使用axiovision4.1软件分析图像以测量纤维的直径。

结果：

对肌生成抑制蛋白表达的影响(表1)

就对肌生成抑制蛋白表达的影响而言，将结果表示为在与分子接触的细胞中肌生成抑制蛋白的基因表达相对于对照细胞中表达的百分比。如果该比值小于或接近70％，产品应该是阳性的，在此测试中，将100ng/ml的浓度下igf-1获得的平均值视为参照。

表1

化合物1和化合物3显著地抑制肌生成抑制蛋白的表达。

s6k1磷酸化对蛋白质合成的影响(表2)

就对蛋白质合成的影响而言，将结果表示为肌细胞中s6k磷酸化增加的百分比。当该比值大于120％时，认为这一百分比是显著的，在该测试中将100ng/ml的浓度下igf-1观察到的平均值视为参照。

表2

在0.5μm的浓度下，化合物1显著地提高了肌细胞中的蛋白质合成。

化合物1对肌纤维直径的影响(图1)

使得c2c12细胞分化，并在分化的最后三天用化合物1处理。结果示于图1。

正如所料，用igf-1处理显著地增加了肌管的直径，相反，地塞米松显著降低了这一参数。用化合物1处理后，肌管直径显著地增加(图1)。

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