经半胱氨酸取代的免疫球蛋白的制作方法
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背景技术：
单克隆抗体(mab)由于它们对靶抗原的高特异性和亲和力而在研究和疗法中是必不可少的工具。自二十世纪九十年代以来，治疗性mab已经对包括炎性病症和癌症的各种疾病的医疗保健产生重大影响。mab的一个关键特征是其以高度特异性的方式结合靶抗原，将其标记以通过宿主免疫清除法(诸如补体依赖性细胞毒性(cdc)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc))去除的能力。还可通过结合靶抗原并抑制其功能来赋予抗体治疗性益处，如在曲妥珠单抗(herceptin
cll-1是一种主要在血液恶性肿瘤，诸如白血病(如急性髓性白血病(aml))中存在的髓性细胞中表达的细胞表面糖蛋白。目前可用的血液恶性肿瘤疗法有不良且往往是严重的副作用。例如，由
与细胞毒性药物或放射性核素缀合可以扩大mab的效用并改善其效力和有效性。这是因为抗体特异性地靶向并递送细胞毒性有效载荷至患病组织而实现的。抗体已通过多种接头化合物缀合至多种细胞毒性药物，且这些抗体药物缀合物(adc)具有选择性且有效地杀灭抗原-表达性肿瘤细胞的能力。adc经证实已在临床上取得成功，且有两种此类药物，ado-曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumabemtansine)
adc的成功开发取决于对抗体选择性、接头稳定性、细胞毒性药物效力以及接头-药物缀合至抗体的模式的优化。
在常规adc中，药物缀合产生异质性产物，其含有具有不同药物与抗体摩尔比的种类的混合物。抗体的缀合位点存在于溶剂可及的反应性氨基酸残基诸如赖氨酸或半胱氨酸处。异质性以两个水平存在，因为每个adc种类在药物载量和缀合位点上都不同。panowski等人,mabs6:1,31-45(2014)。因此，每个种类可能具有不同的性质，导致广泛的体内药代动力学(pk)性质以及批次间变异。此外，可变的药物与抗体比(dar)导致高药物载量、高疏水性、快速清除、较低的耐受性和狭窄的治疗窗口。junutula等人,nat.biotech.26(8),925-932(2008)。
位点-特异性缀合(其中已知数量的接头-药物始终缀合至确定的位点)是克服这些挑战的一种方式。异质性被最小化，并且adc性质更具可预测性，产生批次间一致的缀合物。
氨基酸半胱氨酸提供反应性硫醇基团。该基团长久以来一直被用作定位以标记蛋白以及用于产生adc。虽然半胱氨酸可以工程化成蛋白，但这种方法并非没有挑战。例如，经工程化的游离半胱氨酸可与其它分子上的半胱氨酸共轭以形成蛋白-二聚体。它也可以与天然半胱氨酸残基分子内配对以产生不适当的折叠而损害或抑制蛋白功能。因此，成功使用引入的半胱氨酸残基作为位点-特异性缀合是依赖于选择合适位点的能力，其中引入半胱氨酸的取代不改变抗体结构或功能。junutula等人,nat.biotech.30(2):184-191(2012)。
另一个复杂之处是取代位点处的溶剂可及性和电荷对于adc稳定性是重要的。在经半胱氨酸工程化的抗-her2/neu马来酰亚胺接头adc的稳定性研究中，高溶剂可及性由于马来酰亚胺与白蛋白中的反应性硫醇、游离半胱氨酸或谷胱甘肽的交换而丧失血浆中的缀合的硫醇-反应性接头。shen等人,nat.biotech.30(2):184-191(2012)。因此，仍然有很大需求来鉴定具有一致的药物载量、低疏水性、缓慢清除、高耐受性和较好的治疗指数的稳定的位点特异性adc。此外，甚至还更需要创造靶向cll-1的稳定的位点特异性adc。
本背景中的陈述既不是对现有技术的承认，也不是对所引用参考文献的认可。
发明概述
本公开提供了经半胱氨酸取代的免疫球蛋白，其包括多肽、抗体、编码此类多肽和抗体的核酸，用于制备其的宿主细胞、载体和方法，抗体的经缀合的衍生物，制备此类抗体和经缀合的衍生物的组合物和方法，以及使用抗体和经缀合的变体检测和治疗癌症以及杀灭患病细胞的方法。
在一个实施方案中，本公开提供了经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：v266c、h285c、r301c、v303c、t307c、g316c、y436c和l441c(eu编号)。在一方面，免疫球蛋白多肽源自人igg重链恒定区。在另一方面，igg是同种型igg1、igg2、igg3或igg4。
在另一个实施方案中，本公开提供了编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的分离的核酸序列，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：v266c、h285c、r301c、v303c、t307c、g316c、y436c和l441c(eu编号)。在一方面，核酸与表达控制序列可操作地连接。在另一方面，可操作地连接的核酸进一步包含在表达载体中。在另一方面，本公开提供了包含表达载体的宿主细胞。
在另一个实施方案中，本公开提供了用于制备经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的方法，其包括培养包含核酸分子(还包括编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的核苷酸序列)的重组细胞，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：v266c、h285c、r301c、v303c、t307c、g316c、y436c和l441c(eu编号)。
在另一个实施方案中，本公开提供了经半胱氨酸取代的抗体，所述抗体包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，所述多肽进一步包含选自如下的经取代的氨基酸残基：重链恒定区中的v266c、h285c、r301c、v303c、t307c、g316c、y436c和l441c(eu编号)。在一方面，重链恒定区源自人igg同种型，所述人igg同种型选自igg1、igg2、igg3和igg4。
在另一方面，抗体还包含轻链。在另一方面，轻链选自κ和λ。
在另一方面，抗体能结合cll-1、gpr114、il1rap、tim-3、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd123/il3ra、c-met、psma、前列腺酸性磷酸酶(pap)、cea、ca-125、muc-1、afp、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、酪氨酸酶、trpi/gp75、gp100/pmel-17、melan-a/mart-1、her2/neu、wt1、epha3、端粒酶、hpve6、hpve7、ebna1、bage、gage和magea3tcrslitrk6、enpp3、连接蛋白-4、cd27、slc44a4、caix、cripto、cd30、muc16、gpnmb、bcma、trop-2、组织因子(tf)、canag、egfr、αv-整联蛋白、cd37、叶酸受体、cd138、ceacam5、cd56、cd70、cd74、gcc、5t4、cd79b、steap1、napi2b、lewisy抗原、liv、c-ret、dll3、efna4或内皮唾酸蛋白/cd248。在另一方面，抗体能结合cll-1且包含可变轻链和可变重链，其中：
(a)可变轻链进一步包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：
a.cdr-l1是esvdsygnsf(seqidno:1)
b.cdr-l2是las(seqidno:2)
c.cdr-l3是qqnnydpwt(seqidno:3)，以及
(b)可变重链还包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中：
a.cdr-h1是gytftsyv(seqidno:4)
b.cdr-h2是inpyndgt(seqidno:5)，和
c.cdr-h3是arpiyfdndyfdy(seqidno:6)。
在另一方面，抗体能结合cll-1且包含可变轻链和可变重链，其中：
(c)可变轻链进一步包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：
a.cdr-l1是ratqelsgyls(seqidno:13)
b.cdr-l2是aastlds(seqidno:14)
c.cdr-l3是lqyaiypyt(seqidno:15)，以及
(d)可变重链进一步包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，其中：
a.cdr-h1是gytftsyfih(seqidno:16)
b.cdr-h2是finpyndgsk(seqidno:17)，和
c.cdr-h3是ddgyygyamdy(seqidno:18)
在一些实施方案中，抗cll-1抗体包含轻链可变区序列，其包含diqmtqspsslsasvgdrvtltcratqelsgylswlqqkpgkaikrliyaastldsgvpsrfsgnragtdytltisslqpedfatyyclqyaiypytfgqgtkleik(seqidno:19)，重链可变区序列，其包含evqlvqsgaevkkpgasvkmsckasgytftsyfihwvrqapgqglewigfinpyndgskyaqkfqgratltsdkststvymelsslrsedtavyyctrddgyygyamdywgqgtlvtvss(seqidno:20)或上述轻链和重链序列两者。
在另一方面，本公开提供了编码经半胱氨酸取代的抗体的经分离的核酸序列。在一方面，核酸与表达控制序列可操作地连接。在另一方面，可操作地连接的核酸还包含表达载体。在另一方面，本公开提供了包含表达载体的宿主细胞，及包括培养此类细胞的制备抗体的方法。在另一方面，本公开提供了分离抗体。
在另一个实施方案中，本公开提供了经半胱氨酸取代的抗体，其中将取代的半胱氨酸通过接头连接至缀合的部分。在一方面，缀合的部分选自：药物、放射性核苷酸、荧光团、生物素、rna、抗生素、蛋白和可检测的部分。
在另一方面，缀合的部分是药物、生物素(bmcc或hpdp)或荧光团(alexa488)。在另一方面，药物选自：苯二氮
在另一方面，将接头共价键合至药物。在另一方面，将接头通过硫醇和硫醇反应性基团(如马来酰亚胺、卤化物和磺酰基)之间的反应附接至药物。在另一方面，将接头经由二硫键连接至药物。在另一方面，二硫键是吡啶基二硫化物部分。在另一方面，接头在靶标的微环境中是可切割的。
在另一方面，缀合的部分是可检测的部分。在另一方面，可检测的部分是荧光团诸如a488或生物素(如bmcc-生物素或hpdp-生物素)。
在另一个实施方案中，本公开提供了包含经半胱氨酸取代的抗体和佐剂的组合物。在一方面，佐剂是药学上可接受的载剂或稀释剂。
在另一个实施方案中，本公开提供了检测目标细胞的存在的方法，其包括使细胞接触能够结合细胞的至少有效量的经半胱氨酸取代的抗体，以及检测抗体与细胞的结合，其中所述结合指示目标细胞。在一方面，目标细胞是表达cll-1的细胞。在另一方面，将经半胱氨酸取代的抗体缀合至可检测的部分。
在另一个实施方案中，本公开提供了诊断疾病的方法，其包括：(i)使来自个体的生物样品与能够结合患病细胞的至少有效量的经半胱氨酸取代的抗体接触，以及(ii)检测抗体与患病细胞的结合，其中结合指示疾病的存在。在一方面，将经取代的半胱氨酸抗体(cysmab)缀合至可检测的部分。在另一方面，疾病是癌症，且抗体能结合肿瘤相关抗原或癌症干细胞相关抗原。在又一方面，疾病是骨髓增生性病症。在另一方面，骨髓增生性病症选自：aml、cml、cmml、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。在另一方面，肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原是cll-1、gpr114、il1rap、tim-3、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd123/il3ra、c-met、psma、前列腺酸性磷酸酶(pap)、cea、ca-125、muc-1、afp、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、酪氨酸酶、trpi/gp75、gp100/pmel-17、melan-a/mart-1、her2/neu、wt1、epha3、端粒酶、hpve6、hpve7、ebna1、bage、gage和magea3tcrslitrk6、enpp3、连接蛋白-4、cd27、slc44a4、caix、cripto、cd30、muc16、gpnmb、bcma、trop-2、组织因子(tf)、canag、egfr、αv-整联蛋白、cd37、叶酸受体、cd138、ceacam5、cd56、cd70、cd74、gcc、5t4、cd79b、steap1、napi2b、lewisy抗原、liv、c-ret、dll3、efna4或内皮唾酸蛋白/cd248。
在另一个实施方案中，本公开提供了抑制细胞分裂的方法，其包括使细胞与能够结合细胞且缀合至对细胞有细胞毒性的药物的至少有效量的经半胱氨酸取代的缀合物(cysmab)接触。在一方面，细胞分裂的抑制导致细胞死亡。在另一方面，细胞是肿瘤或癌症干细胞，且抗体能结合肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原。在另一方面，肿瘤或癌症干细胞来自骨髓增生性病症。在又一方面，骨髓增生性病症选自：aml、cml、cmml、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。在另一方面，肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原是cll-1、gpr114、il1rap、tim-3、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd123/il3ra、c-met、psma、前列腺酸性磷酸酶(pap)、cea、ca-125、muc-1、afp、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、酪氨酸酶、trpi/gp75、gp100/pmel-17、melan-a/mart-1、her2/neu、wt1、epha3、端粒酶、hpve6、hpve7、ebna1、bage、gage和magea3tcrslitrk6、enpp3、连接蛋白-4、cd27、slc44a4、caix、cripto、cd30、muc16、gpnmb、bcma、trop-2、组织因子(tf)、canag、egfr、αv-整联蛋白、cd37、叶酸受体、cd138、ceacam5、cd56、cd70、cd74、gcc、5t4、cd79b、steap1、napi2b、lewisy抗原、liv、c-ret、dll3、efna4或内皮唾酸蛋白/cd248。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的经半胱氨酸取代的抗体缀合物(如使用经半胱氨酸取代的抗体产生的抗体-药物缀合物(adc))，其中抗体缀合物能够结合肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原。在一方面，癌症是骨髓增生性病症。在另一方面，骨髓增生性病症选自：aml、cml、cmml、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维化。在另一方面，肿瘤相关抗原或癌症干细胞抗原是cll-1、gpr114、il1rap、tim-3、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd123/il3ra、c-met、psma、前列腺酸性磷酸酶(pap)、cea、ca-125、muc-1、afp、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、酪氨酸酶、trpi/gp75、gp100/pmel-17、melan-a/mart-1、her2/neu、wt1、epha3、端粒酶、hpve6、hpve7、ebna1、bage、gage和magea3tcrslitrk6、enpp3、连接蛋白-4、cd27、slc44a4、caix、cripto、cd30、muc16、gpnmb、bcma、trop-2、组织因子(tf)、canag、egfr、αv-整联蛋白、cd37、叶酸受体、cd138、ceacam5、cd56、cd70、cd74、gcc、5t4、cd79b、steap1、napi2b、lewisy抗原、liv、c-ret、dll3、efna4或内皮唾酸蛋白/cd248。
还提供了包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的抗体缀合物，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含在抗体重链(具有重链和轻链的抗体部分)中根据kabat编号的s156(157，根据eu编号)处的经取代的氨基酸残基并经由半胱氨酸连接至吲哚啉并苯二氮
还提供了包含含有经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的抗体缀合物和佐剂的组合物，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含在抗体重链中根据kabat编号的s156(根据eu编号的157)处的经取代的氨基酸残基并经由半胱氨酸连接至吲哚啉并苯二氮
还提供了抑制细胞分裂的方法，其包括使细胞与至少有效量的包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的抗体缀合物接触，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含抗体重链中根据kabat编号的s156(根据eu编号的157)处的经取代的氨基酸残基并经由半胱氨酸连接至吲哚啉并苯二氮
还提供了治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的抗体缀合物，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含在抗体重链中根据kabat编号的s156(根据eu编号的157)处的经取代的氨基酸残基并经由半胱氨酸连接至吲哚啉并苯二氮
在阅读以下说明书和权利要求后，本公开的其它目的对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
图1显示了比较本公开的抗体-荧光团缀合物(afc)的特异性的3种不同的elisa测定。形式1是直接的elisa，其中将cll-1胞外结构域(ecd)固定(afc结合其上)，然后通过抗-荧光团抗体(兔抗-a488)和检测试剂(抗-兔fc-hrp)检测。形式2是elisa，其中抗-荧光团抗体(抗-a488ab)被结合，且afc和生物素化的cll-1ecd夹在检测试剂(sa-hrp)之间。形式3是可替代的elisa，其中抗-cll-1ab被固定化且夹有cll-1ecd和afc以及抗-a488ab和检测试剂(抗-兔fc-hrp)。
图2a-2b展示了测定elisa特异性测定形式1。图2a显示了相对于igg、曲妥珠单抗、裸hum31及对照标记的igg，对标记的afc和wt抗-荧光团抗体的类似的特异性测定。结果显示标记的hum31与wt之间类似的特异性。图2b描绘了人血浆和pbs的干扰作用。
图3是显示稳定性elisa测定形式的动画图。在此形式下，afc夹在经固定的cll-1ecd和检测试剂之间。(sa-hrp)。
图4a-4e显示了hum31重链抗体恒定链与其它igg1、igg2、igg3和igg4同种型的比对，其中残基用kabat、eu索引和顺序编号鉴定。轻链序列(图4a)：m31(seqidno:7)、hum31(seqidno:8)、κ(seqidno:9)和λ(seqidno:10)。重链序列(图4b)：m31(seqidno:11)和hum31(seqidno:12)。
图5说明了各种抗体缀合物的荧光-与-抗体(far)比。
图6说明了各种抗体缀合物的药物-与-抗体(dar)比。
图7提供了缀合的结果，包括氨基酸残基和各种抗体缀合物的荧光团-与-抗体比(“far”)。
图8提供了缀合的结果，包括氨基酸残基和各种抗体缀合物的荧光团-与-抗体比(“far”)。
图9提供了缀合的结果，包括氨基酸残基和各种抗体缀合物的荧光团-与-抗体比(“far”)。
图10提供了缀合的结果，包括氨基酸残基和各种抗体缀合物的荧光团-与-抗体比(“far”)。
图11说明了各种抗体缀合物的稳定性。
图12a-c提供了c6-cysmab-adc的facs结合数据的图。圆形，c6-s156c-d202；方形，c6-a118c-d202；三角形，c6-g316c-d202；空心圆形，c6-v266c-d202；空心方形，c6-s239c-d202；空心三角形，c0-d202。
发明详述
本申请不限于所描述的具体方法或特定组合物，因为它们可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而不意在是限制性的，因为本申请的范围将仅由所附的权利要求及其等同物来限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。下文描述了建议的方法和材料，然而在本申请的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料。
i.定义
如本文所用的“免疫球蛋白”是指免疫球蛋白多肽或抗体。
术语“免疫球蛋白多肽”是指基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽。
术语“抗体”是指具有抗原结合活性的蛋白和来自或来源于产生抗体的动物的免疫球蛋白编码基因的框架区的氨基酸序列。术语包括但不限于来源于人或其它哺乳动物细胞的同种型类别iga、igd、ige、igg和igm的多克隆或单克隆抗体，其包括天然或遗传修饰形式，诸如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外生成的抗体。术语涵盖缀合物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(如嵌合或双特异性抗体或scfv')及片段，诸如fab、f(ab′)2、fv、scfv、fd、单结构域(dab)和其它组合物。
如本文所用的术语“经半胱氨酸取代的免疫球蛋白”是指经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽或经半胱氨酸取代的抗体。
如本文所用的术语“经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽”是指经半胱氨酸取代的包含至少一种非天然存在的恒定区免疫球蛋白氨基酸残基的多肽。非天然存在的取代是并非同种型的取代。在一个实施方案中，经取代的残基是重链恒定区残基v266c、h285c、r301c、v303c、t307c、g316c、y436c和l441c。在另一个实施方案中，恒定区是同种型igg1、igg2、igg3或igg4的恒定区。
术语“经半胱氨酸取代的抗体”(“cysmab”)是指包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的抗体。
如本文所用的术语“免疫球蛋白缀合物”是指缀合至功能部分的免疫球蛋白多肽或抗体或“抗体缀合物”。
如本文所用的术语“免疫球蛋白药物缀合物”是指缀合至功能部分(诸如药物部分或放射标记物或检测试剂)的免疫球蛋白多肽或抗体(“抗体药物缀合物”(“adc”))。
术语“经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物”或者是指已缀合至药物部分的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽或经半胱氨酸取代的抗体(“cysmab”)，如经半胱氨酸取代的抗体药物缀合物(“cysmabadc”)。
示例性抗体免疫球蛋白结构单元包括四聚体。每个四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50-70kd)。每条链的n-末端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(vl)和可变重链(vh)分别是指这些轻链和重链。可变区含有抗体(或其功能等效物)的抗原结合区，且在结合的特异性和亲和力方面是关键的。参见paul,fundamentalimmunology(2003)。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白存在，或作为包含特定抗原-结合活性的许多被充分表征的片段中的任一种存在。为了清楚起见，具有重链和轻链的四聚体抗体在本文中被称为“完整免疫球蛋白”，并且可以是天然存在的、多克隆的、单克隆的或重组产生的。可以通过各种肽酶消化来产生片段。胃蛋白酶消化在铰链区中的二硫键下的抗体以产生f(ab)′2，即fab的二聚体，其本身是通过二硫键与vh-ch1连结的轻链。在温和条件下，f(ab)′2可以被还原以断裂铰链区中的二硫键，由此将f(ab)′2二聚体转化为fab'单体。fab'单体实质上是具有部分铰链区的fab。尽管根据完整抗体的消化来定义各种抗体片段，但是技术人员将会理解，此类片段可以通过化学方法或通过使用重组dna方法从头合成。因此，术语抗体，如本文所用，还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段，或者使用重组dna方法从头合成的那些抗体片段，或者使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如mccafferty等人,nature348:552-554(1990))。
如本文所用，术语“fv”是指单价或二价可变区片段，并且可以仅涵盖可变区(如vl和/或vh)，以及更长的片段，如fab、fab′或f(ab′)2，其还包括cl和/或ch1。除非另有说明，否则术语“fc”是指包含ch2和ch3区域的重链单体或二聚体。
单链fv(scfv)是指包含通过接头(如肽接头)连结的vl和vh的多肽。scfv还可用于形成串联(或二价)scfv或双链抗体。串联scfv和双链抗体的产生和性质描述于如asano等人(2011)jbiol.chem.286:1812；kenanova等人(2010)protengdesignsel23:789；asano等人(2008)protengdesignsel21:597中。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指对抗原上给定表位具有单一的结合特异性和亲和力的抗体的克隆制备物。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生的、但具有不同的结合特异性和亲和力的抗体制备物。
如本文所用，“可变区”或“v-区”是指抗体可变区结构域，其包含框架1(cdr1)、框架2(cdr2)和框架3(包括cdr3和框架4)的区段，所述区段作为在b细胞分化期间重链和轻链v-区基因的重排的结果被添加到v-区段。
如本文所用的术语“框架”或“fr”是指除高变区(hvr)残基外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1、fr2、fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常出现在vh(或vl)中的以下序列中：fr1-hvr1(l1)-fr2-hvr2(l2)-fr3-hvr3(l3)-fr4。
如本文所用，“互补决定区(cdr)”是指每条链中的中断了由轻链和重链可变区所建立的四个“框架”区的三个高变区。cdr主要负责与抗原的表位结合。每条链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3，其从n-末端开始顺序编号，并且也通常由特定cdr所处的链来标识。因此，vhcdr3位于其存在的抗体的重链的可变结构域中，而vlcdr1是来自其存在的抗体的轻链的可变结构域的cdr1。
cdr和框架区的氨基酸序列可使用本领域熟知的定义测定，如kabat,chothia,国际immunogenetics数据库(imgt)和abm(参见，如johnson等人，同上；chothia&lesk,(1987)j.mol.biol.196,901-917；chothia等人(1989)nature342,877-883；chothia等人(1992)j.mol.biol.227,799-817；al-lazikani等人,j.mol.biol.1997,273(4))。有关使用kabat系统定位cdr的有用指南，可见于bioinf.org.uk/abs可获得的网站。抗原组合位点的定义也描述如下：ruiz等人nucleicacidsres.,28,219-221(2000)；和lefrancnucleicacidsres.1月1日；29(1):207-9(2001)；maccallum等人,j.mol.biol.,262:732-745(1996)；和martin等人,proc.natl.acad.sci.usa,86,9268-9272(1989)；martin,等人,methodsenzymol.,203:121-153,(1991)；pedersen等人,immunomethods,1,126,(1992)；和rees等人,insternbergm.j.e.(编),proteinstructureprediction.oxforduniversitypress,oxford,141-1721996)。示例性cdr描述为us2013/0295118的图7的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3。
术语“高变区”、“hvr”当在本文中使用时是指抗体可变结构域的在序列中高变的和/或形成在结构上限定的环的区域。一般而言，抗体包含六个高变区；vh中的三个(h1、h2、h3)和vl中的三个(l1、l2、l3)。许多高变区的描述正在使用并涵盖在本文中。kabat互补决定区(cdr)是基于序列可变性的并且是最常用的(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))，而chothia是指结构环的位置(chothia和lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917)。“完整”高变区基于对可用的复杂晶体结构的分析。下面示出了来自这些高变区中的各个的残基。除非另有说明，否则将采用根据蛋白的比对序列的kabat数据库的kabat编号(wu和kabat(1970)j.exp.med.132:211-250；johnson和wu(2000)nuc.acidsres.28(1):214-218)。高变区位置一般如下：氨基酸24-34(hvr-l1)、氨基酸49-56(hvr-l2)、氨基酸89-97(hvr-l3)、氨基酸26-35a(hvr-h1)、氨基酸49-65(hvr-l2)和氨基酸93-102(hvr-h3)。高变区还可包括如下的“扩展高变区”：vl中的氨基酸24-36(l1)和氨基酸46-56(l2)。可变结构域残基根据kabat等人，同上，进行编号用于这些定义中的各个。用于本文目的的“改变的高变区”是在其中包含一个或多个(如1个至约16个)氨基酸取代的高变区。用于本文目的的“未经修饰的高变区”是具有与其来源的非-人类抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中缺少一个或多个氨基酸取代的高变区。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中(a)改变、替代或交换恒定区或其一部分，使得抗原结合位点(可变区、cdr或其部分)连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区；或(b)用具有不同或改变的抗原特异性的可变区(如不同物种的cdr和框架区)改变、替代或交换可变区或其一部分。嵌合抗体可包括可变区片段，如包含两个fab或fv区或scfv的重组抗体。如上所指示，嵌合也可以包括来自与所附接的fv区不同来源的fc区。在一些情况下，嵌合抗体包括fv区域内的嵌合体。此类嵌合抗体的实例是人源化抗体，其中fr和cdr来自不同来源。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指其中使从非人抗体的vh和vl区获得的抗原结合环即cdr移植到人框架序列的抗体。人源化，即将非人cdr序列取代为相应的人抗体序列，可按照以下文献中描述的方法进行，如美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,633,425号；第5,661,016号；riechmann等人,nature332:323-327(1988)；marks等人,bio/technology10:779-783(1992)；morrison,nature368:812-13(1994)；fishwild等人,naturebiotechnology14:845-51(1996)。转基因小鼠或其它生物体，诸如其它哺乳动物，也可用于表达人源化或人抗体，如美国专利第6,673,986号所公开。
术语“对……具有特异性”、“特异性结合”及类似术语是指以比非靶标化合物高至少2倍的亲和力(如高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍亲和力中的任一种)结合靶标的分子(如抗体或抗体片段)。例如，特异性结合首要靶标的抗体将通常以比非首要抗体靶标(如来自不同物种的或不同同种型的抗体，或非抗体靶标)高至少2倍的亲和力结合首要靶标。
术语“结合”就抗体靶标(如抗原、分析物、免疫复合物)而言，通常指抗体结合纯群体中大多数抗体靶标(假定适当的摩尔比)。例如，结合给定抗体靶标的抗体通常结合溶液中至少2/3的抗体靶标(如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％中的至少任一种)。技术人员将认识到根据确定结合的方法和/或阈值，会出现一些可变性。
术语“标记物”、“可检测的部分”及类似术语是指通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如32p、3h)、电子致密试剂、酶(如通常用于elisa)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白或其它实体(如通过将放射性标记物掺入与靶标分析物特异性反应的肽或抗体中而变得可检测)。可以采用本领域已知的将抗体缀合至标记物的任何方法，如使用hermanson,bioconjugatetechniques1996,academicpress,inc.,sandiego中所述的方法。术语“标签”可以与术语“标记物”同义使用，但通常是指基于亲和力的部分，如用于纯化的“his标签”或与生物素相互作用的“链霉亲和素标签”。
如本文所用的术语“标记的”分子(如核酸、蛋白质或抗体)是通过接头或化学键共价结合或通过离子键、范德华键、静电键或氢键非共价键结合到标记物，使得分子的存在可以通过检测与分子结合的标记物的存在来检测的分子。
术语“c型凝集素样分子1(cll-1)”，也被称为clec12a、dcal-2和micl，是ii型膜蛋白(itim结构域—tm结构域-茎结构域-凝集素样结构域)。cll-1的胞外结构域是高度糖基化的，并且仅在髓系细胞中表达。cll-1也于aml、mds和cml细胞表达。cll-1表达可用来区分不表达cll-1的正常造血干细胞(hsc)和表达cll-1的白血病干细胞(lsc)。lsc是白血病患者中的cd34+细胞，其导致癌细胞产生和癌症复发。参见bakker等人(2004)cancerres.64:8443。
cll-1的核苷酸和氨基酸序列对于许多物种是已知的。例如，人序列可作为us2013/0295118中的seqidno:2和genbank登录号af247788.1和uniprot登录号q5qgz9(seqidno:2)存在。对于如seqidno:2所示的人cll-1蛋白，胞外结构域包含大约氨基酸65-265，跨膜结构域包含大约氨基酸44-64，且细胞质结构域包含大约氨基酸1-43。人cll-1的茎结构域跨越氨基酸65-139，且c凝集素结构域跨越氨基酸140-249。
如本文所用的术语“cll-1相关的病症”是指与同标准对照(如正常、非疾病、非癌细胞)中的cll-1表达相比的非致病性水平(如cll-1的升高或降低的细胞表面表达)相关的病况和疾病。升高的cll-1水平与癌细胞相关，特别是白血病诸如aml(急性骨髓性白血病)、mds(骨髓增生异常综合征)和cml(慢性骨髓性白血病)和造血csc(如lsc)。
“癌症干细胞”假说认为，由“癌症干细胞”代表的一小部分肿瘤使得肿瘤增殖和自我更新，并最终分化成表型多样性和异质性的肿瘤细胞群(bjerkvig等人,nat.rev.cancer,5:899-904,2005)。癌症干细胞可以从任何类型的癌症中分离出来，如白血病、乳腺癌、结肠癌和脑癌、结肠癌。癌症干细胞的特征在于其自我更新和增殖的能力，并通过从亲本肿瘤分化而重现。示例性癌症干细胞抗原包括cd133、bmi-1、notch、音猬因子(sonichedgehog)和wnt。此外，神经癌症干细胞的示例性分子标记物包括cd90、cd44、cxcr4、巢蛋白、musashi-1(msi1)、母系胚胎亮氨酸拉链蛋白激酶(melk)、gli1、ptch1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酶(psp)、snail、oct4、bcrp1、mgmt、bcl-2、flip、bcl-xl、xiap、ciap1、ciap2、naip和存活素。一种有用的癌症干细胞抗原是cll-1。
术语“细胞毒性”是指药剂对细胞的抑制作用，如坏死(由于细胞裂解导致的细胞膜完整性丧失和快速死亡)；存活力降低(其中细胞停止增殖)和细胞凋亡(受控的细胞死亡的遗传程序)。
细胞毒性还可以使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四唑鎓溴化物(mtt)或mts测定来监测。这种测定使用比色反应来测量细胞的还原电位。存活细胞将mts试剂还原成有色的甲臜产物。也使用荧光染料刃天青来开发类似的基于氧化还原的测定。除了使用染料来指示细胞的氧化还原电位以监测它们的存活力之外，研究人员还开发了使用三磷酸腺苷(atp)含量作为存活力标记物的测定。这种基于atp的测定包括生物发光测定，其中atp是萤光素酶反应的限制试剂(如celltiter-glo发光细胞存活力测定，promega)。细胞毒性也可以通过磺酰罗丹明b(srb)测定、wst测定和发色测定(chronogenicassay)来测量。实时追踪粘附动物细胞的细胞毒性响应的无标记物方法是基于细胞在金膜电极上生长时的电阻抗测量。这种技术被称为电子细胞基质阻抗判断(electriccell-substrateimpedancesensing,ecis)。无标记物实时技术提供了细胞毒性响应的动力学，而不仅仅是许多比色终点测定的快照。
术语“cll-1特异性抗体”、“抗cll-1抗体”、“cll-1抗体”和“抗cll-1”在本文中同义地使用，以指代特异性结合cll-1(包括各种糖基化形式的cll-1)的抗体。本文所述的cll-1抗体特异性结合例如在某些癌细胞表面上表达的cll-1多肽，而不是结合造血干细胞(hsc)。如下文更详细讨论的，本发明抗-cll-1抗体可以结合cll-1表达细胞，与其它aml-靶向抗体相比，结合更大百分比的aml细胞，抑制aml细胞增殖并介导它们的破坏。适合用作本公开的经半胱氨酸取代的抗体(cysmab)的抗cll抗体的实例描述于2013年11月7日公布的us2013/0295118。抗cll-1抗体可具有如此出版物中所公开的cdr，特别是抗体m31和m26的cdr。
术语“差异表达的”或“差异调控的”通常是指在一个样品中与至少一个其它样品相比，过表达(上调)或低表达(下调)的蛋白或核酸生物标志物。在本公开的上下文中，术语通常是指与正常的非癌细胞相比，癌细胞(如aml细胞或amlcsc)上cll-1的过表达。
例如，术语“过表达的”或“上调控的”可互换地指代以可检测的高于对照的水平转录或翻译的蛋白或核酸，通常是生物标记物。术语包括由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(如细胞器、细胞质、核、细胞表面)以及rna和蛋白质稳定性而导致的过表达。过表达可以使用用于检测生物标记物的常规技术来检测，无论是mrna(即rt-pcr，杂交)还是蛋白(即流式细胞术、成像、elisa、免疫组织化学技术)。与正常细胞相比，过表达可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的任一种。
如本文所用的术语“对照”样品或值是指，用作参考、通常是已知的参考以用于与测试样品进行比较的样品。例如，测试样品可以取自测试条件，如在测试化合物的存在下，并与来自已知条件的样品比较，如在不存在测试化合物(阴性对照)下，或在已知的化合物(阳性对照)的存在下。在本公开的上下文中，阴性对照的实例是来自已知健康(非癌症)个体的生物样品，并且阳性对照的实例是来自已知aml患者的生物样品。对照也可以代表从多个测试或结果中收集的平均值或范围。本领域的技术人员将认识到，可以将对照设计用于评估任何数量的参数。例如，可以设计对照来比较基于药理学数据(如半衰期)或治疗措施(如比较益处和/或副作用)的治疗性益处。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的重要性也是有价值的。例如，如果给定参数的值在对照中变化很大，则测试样本的变化不会被认为是显著的。
术语“诊断”是指受试者患有诸如癌症的疾病的相对概率。类似地，术语“预后”是指受试者中可能发生某种未来结果的相对概率。例如，在本公开的上下文中，预后可以指个体将发展癌症、具有复发或疾病的可能严重程度(如症状的严重程度、功能衰退速率、存活率等)的可能性。术语并非旨在是绝对的，正如医学诊断领域的技术人员所理解的那样。
如本文所用的“活检组织”或“来自受试者的生物样品”是指从患有或怀疑患有疾病、如cll-1相关的病症的受试者获得的样品。样品也可以是血液样品或血液级分，如白细胞级分、血清或血浆。在一些实施方案中，样品可以是组织的活检组织，诸如针活检组织、细针活检组织、手术活检组织等。样品可以包括携带有病变或疑似病变的组织样品，然而生物样品也可来源于另一个部位，如疑似转移的部位、淋巴结或血液。在某些情况下，生物样品也可能来自邻近病变或疑似病变的区域。
“生物样品”可以从受试者(如活检组织)、动物(诸如动物模型)或培养的细胞(如从受试者中取出并培养生长以观察的细胞系或细胞)获得。生物样品包括组织和体液，如血液、血液级分、淋巴、唾液、尿液、粪便等。
eu编号体系是指美国抗体的编号(edelman等人,proc.natl.acad.sci.usa63:78-85(1969))。kabat互补决定区(cdr)是基于序列可变性，并且是最常用的(kabat等人sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版，publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。如本文所用，eu编号是指本文所述的抗体的恒定链命名法，而kabat则用于获得可变区的cdr和hvr。
“可操作地连接的”是指两个或多个组分并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期的方式起作用的关系。例如，如果启动子以顺式方式作用以控制或调节连接序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列。通常但不一定，“可操作地连接的”dna序列是连续的，并且必要时连结两个蛋白编码区或在分泌型前导序列的情况下是连续的且在阅读框中。然而，尽管可操作地连接的启动子一般位于编码序列的上游，但它不一定与其相邻。
如本文所用的术语“启动子”是指控制其可操作地连接的基因或序列的转录的多核苷酸序列。启动子包括rna聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在宿主细胞的预期所选序列在其中表达的细胞类型中起作用。
如本文所用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是"质粒"，其是指可以连接附加dna区段于其中的环状双链dna环。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在所引入它们的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为"重组表达载体"(或简称为"表达载体")。
如本文所用的术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)意指已被遗传改变，或能够通过引入外源多核苷酸诸如用重组质粒或载体来遗传改变的细胞。应该理解，此类术语不仅是指特定的受试者细胞，而且还是指其后代。
术语“疗法”、“治疗”和“改善”是指症状的严重程度减轻。在治疗癌症(如aml)的情况下，治疗可以是指如减小肿瘤大小、癌细胞数量、生长速率、转移活性，减少非癌细胞的细胞死亡，减少恶心和其它化疗或放疗副作用等。术语“治疗”和“预防”并非意在为绝对的术语。治疗和预防可以是指任何发作延迟、症状改善、患者存活提高、存活时间或存活率增加等。治疗和预防可以是完全的(不可检测的肿瘤细胞水平)或部分的，使得(相比于没有本发明时所发生的情况而言)较少的肿瘤细胞存在于患者体内。治疗的效果可以与未接受治疗的个体或个体库，或治疗前或治疗期间的不同时间点的相同患者相比较。在一些方面，疾病的严重程度相较于如施用前的个体或不经历治疗的对照个体减少至少10％。在一些方面，疾病的严重程度减少了至少25％、50％、75％、80％或90％，或在一些情况下，使用标准诊断技术不再是可检测的。
“有效量”的药剂，如药物制剂，是指在获得所需的细胞响应、治疗性或预防性结果所必需的剂量下和时间段内有效的量。例如，在抑制细胞增殖的方法中，有效量的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物(如cysmabadc)是相对于对照细胞显著减弱、抑制或防止细胞中细胞分裂的浓度。
短语“治疗有效量”意指本发明的化合物发挥以下作用的量：(i)治疗或预防特定疾病、病况或病症，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病况或病症中的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病况或病症中的一种或多种症状的发作。在一个实施方案中，治疗性有效量是足以减小或减轻对cll-1的调节有响应的病症的症状的量。在癌症的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤的大小；抑制(即在一定程度上减缓，且优选停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即在一定程度上减缓，且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。在药物可防止和/或杀灭存在的癌细胞的程度上，其可能是细胞生长抑制和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，效力可以通过评估疾病进展时间(ttp)和/或确定响应率(rr)来测量。在一个实施方案中，治疗有效量是足以减少或减轻对cll-1的调节有响应的病症的症状的量。在免疫病症的情况下，治疗有效量是足以减少或减轻过敏性病症、自身免疫性和/或炎性疾病的症状或急性炎性反应的症状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是本文所述的化学实体足以显著降低骨髓增生性癌症干细胞的活性或数量的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”与生理上可接受的和药理学上可接受的同义使用。药物组合物通常将包含用于缓冲和储存保护的试剂，并且可根据施用途径包含用于适合递送的缓冲剂和载剂。
如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指adc的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可能包括纳入另一种分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是使化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可能具有多于一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
“药学上可接受的溶剂化物”是指一种或多种溶剂分子与adc的缔合。形成药学上可接受的溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
如本文所用的“载剂”包括在以采用的剂量和浓度暴露于细胞或哺乳动物时对细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。通常生理上可接受的载剂是ph缓冲水溶液。生理上可接受的载剂的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如
“受试者”、“患者”、“个体”及类似术语可互换使用，并且除非另有说明，否则是指哺乳动物诸如人和非人灵长类，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其它哺乳动物物种。术语并不一定指示受试者已经被诊断出患有特定疾病。术语“患者”是指处于医疗监督下的受试者。患者可以是寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。“癌症患者”或“aml患者”可以是指被诊断为患有癌症、目前正在接受治疗性方案或者如在去除肿瘤手术后处于复发风险的个体。在一些实施方案中，癌症患者已经被诊断为患有癌症并且是疗法的候选人。癌症患者可以包括未接受治疗、目前正在接受治疗、已经进行手术的个体及已经停止治疗的那些个体。
在治疗癌症的上下文中，需要治疗的受试者可以是指患有癌症或癌前病况、已经患有癌症且处于复发风险、疑似患有癌症、正在经历标准癌症治疗诸如放疗或化疗等的个体。
“癌症”、“肿瘤”及类似术语包括癌前、赘生性和癌性细胞，并且可以是指实体瘤或非实体癌(参见，如edge等人ajcccancerstagingmanual(第7版，2009)；cibas和ducatmancytology:diagnosticprinciplesandclinicalcorrelates(第3版，2009))。癌症包括良性和恶性赘生物(异常生长)。
术语“癌症”可以是指白血病、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、实体瘤和淋巴癌等。不同类型的癌症的实例包括但不限于急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、b-细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma)、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞性白血病、骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、肺癌(如非小细胞肺癌或nsclc)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(livercancer)(即肝癌(hepatocarcinoma))、肾癌(即肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸腔癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胰腺癌、胆管癌、胃肠道类癌肿瘤、食管癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、绒毛膜癌；头颈癌、骨原性肉瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和黑素瘤。
“癌症靶标”或“癌症标记物”是在癌症中、如在癌细胞上或在癌症环境中差异表达或加工的分子。示例性癌症靶标是细胞表面蛋白，诸如cll-1(如也是细胞粘附分子和受体)、细胞内受体、激素和分子，诸如由细胞分泌到癌症环境中的蛋白酶。用于特定癌症的标记物在本领域中是已知的，如用于aml的cd45，用于amlcsc的cd34+cd38-，结肠和结肠直肠癌上的muc1表达，肺癌中的铃蟾肽受体，及前列腺癌上的前列腺特异性膜抗原(psma)。
在一些实施方案中，癌症靶标可以与某种类型的癌细胞有关，如aml、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、非小细胞肺癌细胞、前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌或卵巢癌。细胞类型特异性靶标通常在此细胞类型中以比在参考细胞群体中高至少2倍的水平表达。在一些实施方案中，细胞类型特异性标记物的存在水平比其在参考群体中的平均表达高至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100或1000倍中的任一个。因此，可以检测或测量靶标以区分细胞类型或目标类型与其它细胞。例如，aml癌症靶标包括cll-1、ly86、lilra1和cd180。
癌症干细胞(csc)是在肿瘤或血液癌症中存在的细胞，其可以产生构成大部分癌症的细胞。csc还可以自我更新，类似于正常(非癌症)干细胞。因此，csc可以通过迁移到个体中的非肿瘤组织并开始“新”肿瘤来介导转移。根据检测到癌症的阶段，csc占任何给定癌症的非常小的百分比。例如，aml细胞样本中csc的平均频率据信约为1:10,000。造血csc可被鉴定为cd34+，与正常的造血干细胞(hsc)类似。
“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，经保守修饰的变体是指那些编码相同氨基酸序列的核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码大部分蛋白。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置处，密码子可以被改变为所述相应密码子中的另一个，而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，这是一种经保守修饰的变异。本文中编码多肽的每条核酸序列也描述了核酸的沉默变异。技术人员将认识到，在某些上下文中，核酸中的每个密码子(除了通常为甲硫氨酸的唯一密码子的aug和通常为色氨酸的唯一密码子的tgg外)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变异隐含在就表达产物而不是就实际探针序列而言的所述序列中。
术语“重组”当涉及如细胞或核酸、蛋白或载体使用时，表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源的核酸或蛋白或者改变的天然核酸或蛋白来修饰，或者细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达另外异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
术语“异源的”当涉及多核苷酸或多肽时，表示多核苷酸或多肽包含在自然界中不存在彼此处于同一关系的两条或多条子序列。例如，异源的多核苷酸或多肽通常是重组产生的，具有来自不相关基因的两条或多条序列排列成新的功能单元，如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白包含在自然界中未发现彼此处于同一关系的两条或多条子序列(如融合蛋白)。
“硫醇反应性试剂”是具有与硫醇反应形成共价键的部分的试剂。硫醇反应性试剂可具有选自卤化物、马来酰亚胺和磺酰基的基团。非限制性实例包括生物素-peo-马来酰亚胺((+)-生物素基-3-马来酰亚胺基丙酰胺基-3,6-二氧杂辛二胺，oda等人(2001)naturebiotechnology19:379-382,piercebiotechnology,inc.)、生物素-bmcc、peo-碘代乙酰基生物素、碘代乙酰基-lc-生物素和生物素-hpdp(piercebiotechnology,inc.)以及nα-(3-马来酰亚胺基丙酰基)生物胞素(mpb,molecularprobes,eugene,or)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来源包括molecularprobes,eugene,oreg.和sigma,st.louis,mo。
ii.编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白(如cysmab)的多核苷酸
本文还提供了编码本文所述的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白或其具有经半胱氨酸取代的恒定结构域的多核苷酸(如dna)。编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白的多核苷酸可通过编码免疫球蛋白多肽的多核苷酸上的定点突变来制备。用于进行定点突变的试剂盒可从多个来源商购获得。这些包括例如，可从lifetechnologies获得的phusion，可从agilenttechnologies获得的quikchange，及可从newenglandbiolabs获得的q5。通常，定点突变涉及使用在所需位点处包含突变插入cys密码子的引物进行的靶标免疫球蛋白-编码多核苷酸的引物延伸。
本文还提供了表达盒，其包含可操作连接至编码本文所述的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白或其具有经半胱氨酸取代的恒定结构域的多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，启动子是异源的，即并非天然存在的可操作地连接至编码序列。在一些实施方案中，包含编码本文所述的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白或其具有经半胱氨酸取代的恒定结构域的多核苷酸的载体(包括但不限于表达载体或穿梭载体)。本文还提供了细胞，其包含且任选地表达编码本文所述的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白或其具有经半胱氨酸取代的恒定结构域的多核苷酸。示例性细胞包括原核细胞(包括但不限于大肠埃希氏杆菌(e.coli))和真核细胞(包括但不限于哺乳动物(如人、仓鼠、大鼠、小鼠等)细胞、真菌(如真菌)或植物细胞)。
iii.制备抗体的方法
为了制备本文所述的免疫球蛋白，如重组、单克隆或多克隆抗体，可使用本领域已知的许多技术(参见，如kohler&milstein,nature256:495-497(1975)；kozbor等人,immunologytoday4:72(1983)；cole等,第77-96页，inmonoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.(1985)；coligan,currentprotocolsinimmunology(1991)；harlow&lane,antibodies,alaboratorymanual(1988)；以及goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice(第2版，1986))。编码目标抗体的重链和轻链的基因可以从细胞中克隆，如编码单克隆抗体的基因可以从杂交瘤中克隆并用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制成。重链和轻链基因产物的随机组合产生具有不同抗原特异性的大型抗体库(参见，如kuby,immunology(第3版，1997))。用于单链抗体或重组抗体产生的技术(美国专利第4,946,778号，美国专利第4,816,567号)可经调整以产生针对本公开的多肽的抗体。此外，转基因小鼠或其它生物体，诸如其它哺乳动物，可用于表达人源化或人抗体(参见，如美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号，marks等人,bio/technology10:779-783(1992)；lonberg等人,nature368:856-859(1994)；morrison,nature368:812-13(1994)；fishwild等人,naturebiotechnology14:845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14:826(1996)；以及lonberg&huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995))。可替代地，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异聚fab片段(参见，如mccafferty等人,nature348:552-554(1990)；marks等人,biotechnology10:779-783(1992))。抗体也可以制成双特异性的，即能识别两种不同的抗原(参见，如wo93/08829,traunecker等人,emboj.10:3655-3659(1991)；以及suresh等人,methodsinenzymology121:210(1986))。抗体也可以是异源缀合物，如两个共价连接的抗体或免疫毒素(参见，如美国专利第4,676,980号，wo91/00360；wo92/200373；和ep03089)。
可以使用任何数量的表达系统来产生抗体，这包括原核和真核表达系统。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，诸如杂交瘤或cho细胞表达系统。许多此类系统可普遍获得自商业供应商。在抗体包含vh和vl区两者的实施方案中，可以使用单一载体，例如在双顺反子表达单元中，或者在不同的启动子的控制下表达vh和vl。在其它实施方案中，vh和vl区可以使用分开的载体来表达。如本文所述的vh和vl区可以任选地在n-末端处包含甲硫氨酸。
本公开的抗体还可以以各种形式产生，包括fab、fab′、f(ab′)2、scfv或dab。抗体片段可以通过多种方法获得，包括用酶(如胃蛋白酶)消化完整抗体(以产生(fab′)2片段)或木瓜蛋白酶消化完整抗体(以产生fab片段)；或者从头合成。抗体片段也可以使用重组dna方法来合成。在一些实施方案中，cll-1抗体包含特异性结合cll-1的f(ab′)2片段。本公开的抗体还可以包含人恒定区。参见，如fundamentalimmunology(paul编，第4版，1999)；bird,等人,science242:423(1988)；以及huston,等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879(1988)。
用于人源化非人抗体(即，使用来自非人抗体的cdr)的方法也是本领域已知的。通常，人源化抗体具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人的氨基酸残基通常被称为导入残基，其通常取自导入可变结构域。人源化基本上可以按照winter和同事的方法通过将啮齿类动物cdr或cdr序列取代为相应的人抗体序列进行(参见，如jones等人,nature321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science239:1534-1536(1988)以及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992))。此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上小于一个完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些fr残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基取代。
在一些情况下，抗体或抗体片段可以缀合至另一分子，如聚乙二醇(peg化)或血清白蛋白，以提供延长的体内半衰期。抗体片段的peg化的实例提供于knight等人platelets15:409,2004(对于阿昔单抗)；pedley等人,br.j.cancer70:1126,1994(对于抗-cea抗体)；chapman等人,naturebiotech.17:780,1999；以及humphreys,等人,proteineng.des.20:2272007中。抗体或抗体片段还可如下所述标记至或缀合至治疗剂。
iv.经半胱氨酸取代的免疫球蛋白(如cysmab)药物缀合物的制备
由本公开的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白(cysmab)制备的抗体-药物缀合物可以采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂通过几种途径制备，包括：(1)经半胱氨酸工程化的抗体的半胱氨酸基团与接头试剂反应，以经由共价键形成抗体-接头中间体ab-l，然后与激活的药物部分d反应；和(2)药物部分的亲核基团与接头试剂反应，以经由共价键形成药物-接头中间体d-l，然后与经半胱氨酸工程化的抗体(cysmab)的半胱氨酸基团反应。缀合方法(1)和(2)可与多种经半胱氨酸工程化的抗体(cysmab)、药物部分和接头一起使用来制备抗体-药物缀合物(adc)。
抗体半胱氨酸硫醇基团是亲核性的并且能够与接头试剂和药物-接头中间体上的亲电子基团反应以形成共价键，包括：(i)活性酯，诸如nhs酯、hobt酯、卤代甲酸酯和酸性卤化物；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团；和(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，经由硫化物交换。药物部分上的亲核基团包括但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团。
通过用还原剂诸如dtt(克莱兰氏试剂(cleland'sreagent)，二硫苏糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；getz等(1999)anal.biochem.第273卷:73-80；soltecventures,beverly,mass.)处理可使经半胱氨酸工程化的抗体具有反应性以与接头试剂缀合，然后如用dhaa再氧化以重新形成链间和链内二硫键(实施例2)。
a.接头
“接头”、“接头单元”或“连接物”意指包含将抗体共价附接至药物部分的共价键或原子链的化学部分。在各种实施方案中，接头被指定为l。“接头”(l)是双功能部分或多功能部分，其可用于连接一个或多个药物部分(d)和抗体单元(ab)以形成抗体-药物缀合物(adc)。抗体-药物缀合物(adc)可以使用具有用于与药物和抗体结合的反应性官能团的接头来方便地制备。经半胱氨酸工程化的抗体(cysmab)的半胱氨酸硫醇可以与接头试剂、药物部分或药物-接头中间体的亲电子官能团形成键。
在一方面，接头具有反应性位点，其具有与存在于抗体上的亲核半胱氨酸反应的亲电子基团。抗体的半胱氨酸硫醇与接头上的亲电子基团反应并与接头形成共价键。有用的亲电子基团包括但不限于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
接头包括二价基团，诸如烷基二基、亚芳基、亚杂芳基、诸如—(cr2)no(cr2)n—的部分、烷基氧基的重复单元(如聚乙烯氧基、peg、聚亚甲基氧基)和烷基氨基的重复单元(如聚乙烯氨基、jeffaminetm)；以及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。
根据klussman,等人(2004),bioconjugatechemistry15(4):765-773的第766页的缀合方法，使经半胱氨酸工程化的抗体(cysmab)与具有亲电子官能团诸如马来酰亚胺或α-卤代羰基的接头试剂或药物-接头中间体反应。
接头可由一种或多种接头组分组成。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“mc”)、马来酰亚胺基丙酰基(“mp”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基苯甲基氧羰基(“pab”)、n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“spp”)、n-琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯(“smcc”)、n-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“siab”)、乙烯氧基—ch2ch2o—作为一个或多个重复单元(“eo”或“peo”)。另外的接头组分是本领域已知的且一些描述于本文中。
在另一个实施方案中，接头具有反应性官能团，其具有对存在于抗体上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。抗体上有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基基团。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了用于附接至接头的方便的位点。
通常，肽型接头可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。可以例如根据肽化学领域熟知的液相合成方法(e.
在另一个实施方案中，接头可能被调节溶解度或反应性的基团所取代。例如，带电取代基诸如磺酸根(—so3-)或铵可以增加试剂的水溶性，并促进接头试剂与抗体或药物部分的偶联反应，或促进ab-l(抗体-接头中间体)与d的偶联反应或者d-l(药物-接头中间体)与ab的偶联反应，这取决于用于制备adc的合成路线。
可根据dubowchik,等人(1997)tetrahedronletters,38:5257-60制备包含马来酰亚胺部分和pab自分解性部分的示例性phe-lys(mtr，单-4-甲氧基三苯甲基)二肽接头试剂。
b.接头试剂
抗体和阿里他汀的缀合物可使用多种双功能接头试剂来制备，诸如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、亚胺硫醇烷(it)、亚胺酯的双功能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双-叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
可用于本公开的抗体药物缀合物(adc)的接头试剂包括但不限于：bmpeo、bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb以及svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，并且包括双-马来酰亚胺试剂：dtme、bmb、bmdb、bmh、bmoe、1,8-双-马来酰亚胺基二乙二醇(bm(peo)2)和1,11-双-马来酰亚胺基三乙二醇(bm(peo)3)，其可从piercebiotechnology,inc.,thermoscientific,rockford,ill.和其它试剂供应商处商购获得。双马来酰亚胺试剂允许将抗体的半胱氨酸残基的游离硫醇基团以依序或同时形式附接至含巯基的药物部分、标记物或接头中间体。除马来酰亚胺之外的与抗体的硫醇基团、奈莫柔比星代谢物和类似物药物部分或接头中间体反应的其它官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
v.使用方法
本公开的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白尤其用于制备经半胱氨酸取代的免疫球蛋白缀合物，包括缀合至可检测部分或药物(诸如细胞毒性剂)的分子。
a.疾病治疗
经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物(如cysmabadc)可用于治疗可通过靶向此类缀合物结合的细胞来治疗的任何疾病。这包括任何形式的癌症。
经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物可用于治疗例如特征为肿瘤抗原的过表达的各种疾病或病症。示例性病况或过度增生性病症包括良性或恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤。其它包括神经元病症、神经胶质病症、星形胶质细胞病症、下丘脑病症、腺体病症、巨噬细胞病症、上皮细胞病症、间质细胞病症、囊胚腔病症、炎性病症、血管生成病症和免疫性病症，包括自身免疫性病症。
经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物可在携带肿瘤的高等灵长类动物和人类临床试验中进一步检测。人临床试验可经设计为类似于测试已经接受广泛的前期抗癌疗法的过表达her2的转移性乳腺癌患者中抗-her2单克隆抗体
通常，待治疗的疾病或病症是过度增殖疾病，诸如癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌腺癌和肺鳞癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠癌的胃部(gastric)癌或胃(stomach)癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾(kidney)癌或肾部(renal)癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。
癌症可以包含her2-表达细胞，使得本发明的adc能够结合癌细胞。为了确定癌症中的erbb2表达，可以使用各种诊断/预后测定。在一个实施方案中，可通过ihc例如使用herceptest(dako)分析erbb2过表达。可使来自肿瘤活检组织的石蜡包埋的组织切片经受ihc测定，并赋予如下的erbb2蛋白染色强度标准：评分0，未观察到染色或在小于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色；评分1+，在超过10％的肿瘤细胞中检测到微弱/几乎不可察觉的膜染色，细胞仅在其部分膜中染色；评分2+，在超过10％的肿瘤细胞中观察到弱至中度完全膜染色；评分3+，在超过10％的肿瘤细胞中观察到中度至强度的完全膜染色。那些erbb2过表达评估评分为0或1+的肿瘤可被表征为不过表达erbb2，而具有2+或3+评分的那些肿瘤可被表征为过表达erbb2。
可替代地或此外，fish测定诸如informtm(ventanaco.,ariz.)或pathvisiontm(vysis,ill.)可以在福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织上进行以确定erbb2过表达在肿瘤中的程度(如果有的话)。
adc化合物可用于治疗的自身免疫性疾病包括类风湿性病症(诸如，例如，类风湿性关节炎、舍格伦氏综合征(
本文所述的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白缀合物可用于检测和治疗cll-1相关的病症，即与标准对照(如正常、非疾病、非癌细胞)中的cll-1表达相比，cll-1的细胞表面表达升高或降低相关的疾病。cll-1表达通常限于髓系细胞，如外周血和脾中的树突细胞、粒细胞和单核细胞。升高的cll-1水平与癌症相关，尤其是在造血csc(如lsc)和骨髓增生性病症中，包括白血病诸如aml(急性骨髓性或骨髓增生性白血病)、mds(骨髓增生异常综合征)、骨髓纤维化、cmml(慢性骨髓单核细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和cml(慢性骨髓性或骨髓增生性白血病)。参见bakker等人(2004)cancerres.64:8443；vanrhenen等(2007)blood110:2659-66；zhao等人(2010)haematologica(2010)95:71；vanrhenen等人(2007)leukemia21:1700；以及herrmann等人(2012)haematologica97:219。
aml细胞可通过检测细胞表面标记物表达来表征和区别于其它细胞。除了cll-1+之外，aml细胞可以是cd33+(虽然有些是cd33-)、cd45+和cdw52+。aml胚细胞(包括lsc)通常是cd34+cd38-。hsc和lsc可通过表达cd34来表征，但前者不表达cll-1。mds细胞可以通过表达cd5、cd7、cd13和cd34来表征。cml细胞可通过表达7-add、cd33、cd34和cd38来表征。
骨髓增生异常综合征(mds)包括一组密切相关的血液形成病症，其中骨髓显示出定性和定量的改变，指示白血病前期过程但具有不一定终止为急性白血病的慢性过程。多个术语，包括白血病、难治性贫血、难治性骨髓细胞生成障碍性贫血、郁积性或亚急性白血病、骨髓细胞生成障碍综合征(dmps)和脊髓发育不良都被用来描述mds。这些病况的特征都是细胞骨髓成熟受损(骨髓细胞生成障碍)和血细胞数量减少。dmps的特征是存在巨型母细胞样细胞(megablastoids)、巨核细胞发育异常和异常的母细胞数量增加，反映出增强的粒细胞成熟过程。dmps患者显示出与急性髓性白血病中发现的染色体异常相似的染色体异常，并且在一定比例的患病患者中进展为急性髓性白血病。
慢性骨髓增生性病症是以成熟和未成熟粒细胞、红细胞和血小板数量增加为特征的一组病况。慢性骨髓增生性病症可以在这一组内转变为其它形式，倾向于终止于急性髓性白血病。该组中的特定疾病包括真性红细胞增多症、慢性髓性白血病、原因不明的髓性白血病、原发性血小板增多症和慢性嗜中性粒细胞性白血病。
骨髓纤维化的特征在于骨髓瘢痕形成，导致红细胞和白细胞以及血小板的数量减少。骨髓纤维化瘢痕形成可由白血病引起，但也可有其它原因，诸如血小板增多症或不良药物作用。
b.cdc、adcc和adc测定
可通过表达靶标抗原的细胞(诸如cll-1)的补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(adcc)测定评价本公开的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白药物缀合物(如cysmabadc)的效果。表达cll-1的示例性细胞包括表达异源的重组cll-1(如人cll-1)的细胞系；人aml细胞系，诸如hl60、thp1、tf1-α、u937和ociaml-5(其中前四种可从atcc获得)；来自一个或多个aml患者的原代细胞(如pbmc或移植的肿瘤细胞)；人cml细胞系，诸如k562和ku812(可从atcc获得)；以及来自一个或多个cml或mds患者的原代细胞。
将抗体描述为具有cdc活性，并且如果其导致表达抗体靶标的细胞的补体依赖性杀灭，则介导cdc。cdc测定在本领域是已知的，且描述于如gazzano-santoro等人(1997)j.immunol.methods202:163；idusogie等人(2000)j.immunol.164:4178；和以下实施例6中。cdc试剂盒和服务可例如从
简言之，测定通常在体外进行，并且包括抗体结合在细胞表面上表达抗体靶标的细胞。添加补体组分，包括结合抗体的ch区的c1q,22。然后，补体组分相互作用以杀灭所靶向的细胞。通常在4至24小时之间的孵育时间段后，例如通过测定已知存在于所靶向的细胞中的胞内酶或颗粒的释放，通过比较起始和终止靶标细胞群等来测量cdc。
如果抗体导致效应细胞杀灭抗体-结合的细胞(如cll-1表达细胞)，则将抗体描述为具有adcc活性并介导adcc。效应细胞通常是自然杀伤细胞，但也可以是巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
经遗传工程化的效应细胞系也被开发用于adcc测定(参见，如schnueriger等人(2011)mol.immunol.48:1512)。adcc测定在本领域是已知的，并且描述于如perussia和loza(2000)methodsinmol.biol.121:179；bretaudeau和bonnaudet(2011)bmcproceedings5(增刊8):p63；adcc试剂盒和服务可例如从
简言之，测定通常在体外进行，并且包括抗体结合在细胞表面上表达抗体靶标的细胞。添加效应细胞，其通常通过fc受体诸如cd16识别抗体-结合的细胞。效应细胞杀灭抗体结合的细胞，如通过释放导致细胞凋亡的细胞毒素。通过释放靶细胞内的可检测元素(如cr51)或通过检测参与细胞介导的毒性的元素(如效应细胞中nfat信号传导的激活)来检测细胞死亡。
当抗体与细胞毒性剂(药物)缀合，导致杀灭(抑制存活)表达抗体靶标的细胞(此情况下是cll-1)时，抗体被描述为具有抗体-药物缀合物(adc)活性(或介导adc)。适当的细胞毒性剂是本领域已知的，如皂草素(saporin)、阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、长春花生物碱、紫杉烷类、微管蛋白剂(如美登新(maytansin)、阿里他汀)和dna剂(如卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吡咯并苯二氮
c.诊断性应用
因此，经半胱氨酸取代的免疫球蛋白缀合物可用于体外和体内诊断性测定以检测癌细胞。这包括本文所述的对cll-1具有特异性的抗体特异性结合cll-1-表达细胞(“cll-1抗体”–仅用于本节)以用于检测cll-1表达细胞(如aml细胞和amlcsc)。例如，可以从患者获得样品(如血液样品或组织活检组织)并使其与cll-1抗体接触，并且患者样品中cll-1-表达细胞的存在可以通过检测抗体结合来确定。可以直接(如当标记抗体本身时)或通过使用第二种检测剂诸如二级抗体来检测抗体结合。可检测的标记物可以直接或间接地如经由螯合剂或接头与本公开的抗体缔合。
在一些实施方案中，将cll-1抗体与来自患有或疑似患有cll-1相关的病症的个体的生物样品接触，并且确定样品中结合细胞的抗体，其中高于或低于正常的抗体结合表明个体患有cll-1相关的病症。在一些实施方案中，生物样品是血液样品或血液级分(如血清、血浆、血小板、红细胞、白细胞、pbmc)。在一些实施方案中，生物样品是组织样品(活检组织)，如来自疑似的肿瘤位点或来自已知受感染的组织，以例如确定已知肿瘤的边界。
通常进行活检以从组织中获得样品，即非流体细胞类型。应用的活检技术将取决于待评价的组织类型(如乳房、皮肤、结肠、前列腺、肾、肺、膀胱、淋巴结、肝、骨髓、气道或肺)。在癌症的情况下，该技术还将取决于肿瘤的大小和类型(如实体、混悬的或血液)等因素。代表性活检技术包括但不限于切除活检、切开活检、针活检、手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指去除具有围绕其的正常组织的小边缘的整个肿瘤块。“切开活检”是指去除包含横截面直径的肿瘤的楔形组织。通过内窥镜检查或荧光镜检查进行的诊断或预后可能需要肿瘤块的“核心-针活检”或通常从肿瘤块内获得细胞混悬液的“细针抽吸活检”。在例如harrison’sprinciplesofinternalmedicine,kasper,等人编,第16版,2005,第70章以及第五部分全文中讨论了活检技术。
检测样品中结合细胞的抗体的任何方法都可以用于本诊断性测定。检测抗体结合的方法在本领域是公知的，如流式细胞术、荧光显微术、elisa等。在一些实施方案中，该方法包括在确定步骤之前制备用于检测的生物样品。例如，细胞(如白细胞、cd34+细胞、cd45+细胞等)亚群可以从来自个体的样品的其余部分(如其它血液组分)中分离出来，或者可混悬组织中的细胞以用于更容易的检测。
在一些实施方案中，确定样品中cll-1-表达细胞的百分比并将其与对照比较，如来自已知患有cll-1相关的病症的个体或个体组的样品(阳性对照)或来自已知不患有cll-1相关的病症的个体或个体组(正常、健康、非疾病或阴性对照)。在一些实施方案中，对照是针对给定组织建立的cll-1表达的标准范围。高于或低于cll-1表达细胞的正常百分比，或更高或更低的表达水平，指示该个体患有cll-1相关的病症。
在一些实施方案中，经标记的cll-1抗体可以被提供(施用)给个体以确定预期疗法的适用性。例如，经标记的抗体可用于检测患病区域内的cll-1密度，其中所述密度相对于未患病组织通常较高。经标记的抗体也可以指示病变区域是可用于治疗的。因此，可根据成像结果选择用于治疗的患者。可以使用标准成像技术(如ct扫描、mri、pet扫描等)来完成解剖学表征，诸如确定癌症的精确边界。
在一些实施方案中，如本文所述的经标记的cll-1抗体可以进一步与治疗性化合物缔合，如以形成“治疗诊断”组合物。例如，cll-1抗体可(直接地或间接地)连接至可检测的标记物和治疗剂，如细胞毒性剂以杀灭cll-1-表达癌细胞。在一些实施方案中，将经标记的cll-1抗体用于表达cll-1的癌细胞的诊断和/或定位，然后用单独的治疗性cll-1特异性抗体靶向表达cll-1的癌细胞。在一些实施方案中，诊断性cll-1特异性抗体是不以高比率或高百分比内化到cll-1-表达细胞中的抗体。在一些实施方案中，治疗性cll-1抗体以高比率或高百分比内化到cll-1-表达细胞中。
1.标记物
包含能够结合靶标目标的抗体的诊断剂可包括本领域已知的任何诊断剂，例如，如在以下参考文献中提供：armstrong等人,diagnosticimaging,第5版，blackwellpublishing(2004)；torchilin,v.p.,编,targeteddeliveryofimagingagents,crcpress(1995)；vallabhajosula,s.,molecularimaging:radiopharmaceuticalsforpetandspect,springer(2009)。可通过多种方式检测诊断剂，包括作为提供和/或增强可检测信号的试剂。可检测的信号包括但不限于γ-发射信号、放射性信号、回声信号、光学信号、荧光信号、吸收信号、磁性信号或断层摄影信号。用于对诊断剂成像的技术可包括但不限于单光子发射计算机断层摄影(spect)、磁共振成像(mri)、光学成像、正电子发射断层摄影(pet)、计算机断层摄影(ct)、x射线成像、伽马射线成像等。术语“可检测试剂”、“可检测部分”、“标记物”、“成像剂”和类似术语在本文中同义使用。
在一些实施方案中，标记物可以包括光学剂，诸如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。许多试剂(如染料、探针、标记物或指示剂)是本领域已知的并且可用于本公开。(参见如invitrogen,thehandbook—aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies,第十版(2005))。荧光剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可以包括但不限于菁、酞菁、卟啉、吲哚菁、罗丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、罗丹明、吖啶、蒽醌、硫属元素的吡喃盐(chalcogenopyrylium)类似物、二氢卟酚、萘酞菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青和bodipytm衍生物。荧光染料讨论于例如，美国专利第4,452,720号、美国专利第5,227,487号和美国专利第5,543,295号中。
标记物还可为放射性同位素，如发射γ射线、正电子、β和α颗粒及x-射线的放射性核素。适合的放射性核素包括但不限于225ac、72as、211at、11b、128ba、212bi、75br、77br、14c、109cd、2cu、64cu、67cu、18f、67ga、68ga、3h、166ho、123i、124i、125i、130i、131i、111in、177lu、13n、15o、32p、33p、212pb、103pd、186re、188re、47sc、153sm、89sr、99mtc、88y和90y。在一些实施方案中，放射活性剂可包括111in-dtpa、99mtc(co)3-dtpa、99mtc(co)3-enpy2、62/64/67cu-teta、99mtc(co)3-ida和99mtc(co)3-三胺(环形或线性)。在一些实施方案中，该剂可包括具有111in、177lu、153sm、62/64/67cu或67/68ga的dota及其各种类似物。在一些实施方案中，纳米颗粒可以通过掺入附接至螯合物的脂质(诸如dtpa-脂质)而被标记，如在以下参考文献中提供：phillips等人,wileyinterdisciplinaryreviews:nanomedicineandnanobiotechnology,1(1):69-83(2008)；torchilin,v.p.&weissig,v.,编liposomes第2版:oxforduniv.press(2003)；elbayoumi,t.a.&torchilin,v.p.,eur.j.nucl.med.mol.imaging.33:1196-1205(2006)；mougin-degraef,m.等人,int'lj.pharmaceutics344:110-117(2007)。
在一些实施方案中，诊断剂可以与次级结合配体或与在与发色底物接触后将会产生有色产物的酶(酶标签)缔合。适合的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。次级结合配体包括例如如本领域已知的生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素化合物。
在一些实施方案中，经标记的抗体可以进一步与改善体内稳定性的组合物，例如peg或纳米颗粒诸如脂质体缔合，如下面更详细所描述。
2.标记方法
用于缀合可检测剂和治疗剂至抗体的技术是熟知的(参见，如amon等人,“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”于monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人(编),第243-56页(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等人,“antibodiesfordrugdelivery”于controlleddrugdelivery(第2版),robinson等人(编),第623-53页(marceldekker,inc.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”于monoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人(编),第475-506页(1985)；以及thorpe等人,“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates”,immunol.rev.,62:119-58(1982))。
通常，抗体附接至不干扰表位结合的区域中的可检测部分。因此，在一些情况下，将可检测部分附接至恒定区，或在可变区中的cdr之外。本领域技术人员将认识到，可检测部分可位于抗体上的其它位置，并且可检测部分的位置可以相应地调整。在一些实施方案中，比较附接至可检测部分之前和之后的抗体与表位缔合的能力，以确保附接不会不适当地干扰结合。
在一些实施方案中，抗体可以与另外的靶向部分缔合。例如，结合靶标分子或靶标细胞上不同位点的抗体片段、肽或适配体可缀合至抗体以优化靶标结合，例如结合癌细胞。
d.治疗性应用
可使用本文所述的经半胱氨酸取代的cll-1adc抗体(“cll-1抗体”–仅用于本节)靶向cll-1-表达细胞，如aml细胞。cll-1表达在aml细胞和csc(如amlcsc)上升高。cll-1在正常cd34+造血干细胞(hsc)上不显著表达，因此可使用本发明的cll-1抗体将csc与hsc区分。识别aml细胞共有的cll-1表位并因此能够普遍结合aml细胞的高亲和力cll-1抗体是特别有价值的，因为aml具有非常高的复发率。如上所述，包含cll-1抗体的治疗性组合物还可包含可检测的标记物以形成治疗诊断组合物，例如用于cll-1表达细胞的检测和定位，以及监测治疗效果。在2015年11月24日提交的ussn62/259,100(jiang等人,“humanizedanti-”)和2013年11月7日公开的us2013/0295118(jiang等人,“antibodiesspecificforcll-1)中描述了抗体的结合cll-1的序列，其通过引用将其整体并入本文。
结合除cll-1之外的靶标的抗体还可用于本文所述的经半胱氨酸取代的抗体和抗体缀合物中。在一些实施方案中，抗体靶标可选自gpr114、cll-1、il1rap、tim-3、cd19、cd20、cd22、ror1、间皮素、cd33、cd123/il3ra、c-met、psma、前列腺酸性磷酸酶(pap)、cea、ca-125、muc-1、afp、糖脂f77、egfrviii、gd-2、ny-eso-1tcr、酪氨酸酶、trpi/gp75、gp100/pmel-17、melan-a/mart-1、her2/neu、wt1、epha3、端粒酶、hpve6、hpve7、ebna1、bage、gage和magea3tcrslitrk6、enpp3、连接蛋白-4、cd27、slc44a4、caix、cripto、cd30、muc16、gpnmb、bcma、trop-2、组织因子(tf)、canag、egfr、αv-整联蛋白、cd37、叶酸受体、cd138、ceacam5、cd56、cd70、cd74、gcc、5t4、cd79b、steap1、napi2b、lewisy抗原、liv、c-ret、dll3、efna4或内皮唾酸蛋白/cd248。
如本文所证明，本发明的cll-1抗体可以抑制癌细胞生长(增殖和/或移植)，并因此可以被认为是单独的化疗剂。以下公开提供了可与cll-1抗体连接以用于对cll-1-表达细胞的额外作用的化疗剂和细胞毒性剂的实例。
化疗(抗-癌)剂可以是能够减少癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀伤癌细胞、减少转移、减少肿瘤血液供应等的任何试剂。因此，化疗剂包括细胞毒素剂。细胞毒素剂包括但不限于皂草素、紫杉烷、长春花生物碱、蒽环霉素和铂基剂。化疗剂的种类包括但不限于烷化剂，抗代谢物如甲氨蝶呤，植物生物碱如长春新碱以及抗生素如阿霉素，以及不属于特定类别的其它药物如羟基脲。以顺铂和奥沙利铂为代表的铂基药物代表了一类主要的化疗剂。这些药物结合dna并干扰复制。以紫杉酚为代表的紫杉烷代表另一种主要的化疗剂。这些化合物通过干扰细胞骨架和纺锤体形成来抑制细胞分裂，从而防止迅速分裂的癌细胞的生长来起作用。其它化疗治疗药物包括荷尔蒙疗法。药物部分可包括细胞毒性剂，诸如单体的或二聚体的苯二氮
多于一种的治疗剂可在相同的组合物中或在分开的组合物中进行组合。治疗剂还可以与另外的治疗剂组合，以适合于特定个体。为癌症患者提供的常见治疗剂包括用于解决癌症患者常经历的疼痛、恶心、贫血、感染、炎症和其它症状的医药。
抗体可以使用各种已知的交联剂附接至治疗剂、可检测剂或纳米载体上。用于共价或非共价附接多肽的方法在本领域是公知的。此类方法可包括但不限于使用化学交联-接头、光活化交联-接头和/或双功能交联剂。用于交联分子的示例性方法公开于美国专利第5,603,872号和美国专利第5,401,511号中。交联试剂的非限制性实例包括戊二醛、双功能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚、碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺或二环己基碳二亚胺、双酰亚胺酯、二硝基苯、辛二酸的n-羟基琥珀酰亚胺酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、二甲基-3,3'-二硫代-双丙酰亚胺酸酯、叠氮基乙二醛、n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯和4-(溴代乙基氨基乙基)-2-硝基苯基叠氮化物。
在一些实施方案中，cll-1抗体与纳米载剂相缔合。对于缀合至纳米载剂(如脂质体)的抗体，表面上将会存在一定数量的抗体，即以给定的表面密度。在一些实施方案中，纳米载剂将具有每纳米载剂至少5个抗体，如每纳米载剂至少10、30、40、50、75、100或更高个的抗体。本领域技术人员将理解，表面密度代表平均范围，因为每纳米载剂的抗体数目对于所有群体成员不是绝对一致的。
纳米载剂包括囊泡如脂质体和胶束，以及聚合物纳米颗粒等。纳米载剂可用于递送治疗剂和诊断剂，但可特别用于屏蔽用于治疗癌症的细胞毒性剂。纳米载剂可以包含脂质(如磷脂)、亲水性聚合物、疏水性聚合物、两亲性化合物、交联聚合物和聚合物基质(参见，如wo2009/110939)。根据应用，纳米载剂可被设计成具有特定尺寸、半衰期、保质期和泄漏速率。
如在美国专利第6,465,188号、第7,122,202号、第7462603号和第7550441号中描述了纳米载剂如抗体靶向脂质体、聚合物纳米颗粒或延长保质期的脂质体的制备。
在一些实施方案中，使抗体连接到稳定部分如peg，或脂质体或其它纳米载剂。美国专利第4,732,863号和第7,892,554号及chattopadhyay等人(2010)molpharm7:2194描述了将选择的抗体附接至peg、peg衍生物和纳米颗粒(如脂质体)的方法。含有磷脂酰乙醇胺(pe)的脂质体可通过如本文所述的已建立的程序来制备。包含pe使提供了在脂质体表面用于附接的活性功能位点。
还可以配制抗体缀合物以提供多于一种的活性化合物，如另外的化疗剂或细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。活性成分还可以制备为持续释放的制剂(如半固体疏水性聚合物的半透性基质(如聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯。抗体和免疫缀合物可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的纳米颗粒(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳剂中。
本文所述的cll-1抗体可单独或与细胞毒剂组合杀伤cll-1-表达细胞。在一些实施方案中，治疗方法包括向个体施用有效量的治疗性cll-1抗体或cll-1抗体缀合物，如附接至治疗剂的cll-1抗体。在一些实施方案中，该个体被诊断为患有癌症，如aml。在一些实施方案中，该个体正在接受或已经接受癌症疗法，如手术、放疗或化疗。在一些实施方案中，该个体已被诊断，但是癌症已得到缓解。
在一些实施方案中，该方法进一步包括监测个体癌症的进展。在一些实施方案中，cll-1抗体或cll-1抗体缀合物用于每次施用的剂量基于个体的治疗进度来确定，例如，如果个体对疗法的响应不够，则施用更高剂量的化疗剂。
在一些实施方案中，本公开可以包括抗体或抗体靶向的组合物和生理上(即药学上)可接受的载剂。术语“载剂”通常是指用作稀释剂或媒介物以用于诊断剂或治疗剂的惰性物质。术语还涵盖赋予组合物粘附性的典型惰性物质。生理上可接受的载剂可以是液体，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、生理缓冲盐水(135-150mm的nacl)、水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、糖蛋白以提供增强的稳定性(如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)等。由于生理上可接受的载剂部分是由所施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法来确定，因此，存在本公开的药物组合物的各种适合的制剂(参见，如remington'spharmaceuticalsciences,第17版,1989)。
本公开的组合物可以通过常规的熟知的灭菌技术进行灭菌，或者可以在无菌条件下产生。可将水溶液包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水溶液合并。该组合物可以根据需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和三乙醇胺油酸酯。也可以包含糖用于稳定组合物，诸如用于冻干抗体组合物的稳定剂。
剂型可经制备用于经粘膜(如经鼻、经舌下、经阴道、经颊或经直肠)、肠胃外(如皮下、静脉内、肌内或动脉内的注射，推注或输注)、经口或经皮施用给患者。剂型的实例包括但不限于：分散剂；栓剂；软膏剂；糊剂(泥敷剂)；糊剂；粉剂；敷料剂；乳膏剂；硬膏剂；溶液；贴剂；气雾剂(如鼻腔喷雾剂或吸入剂)；凝胶剂；适用于经口或经粘膜施用给患者的液体剂型，包括混悬剂(如水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适用于肠胃外施用给患者的液体剂型；及无菌固体(如结晶或无定形固体)，其可复溶以提供适用于肠胃外施用给患者的液体剂型。
可注射(如静脉内)组合物可包括抗体或抗体靶向组合物混悬于可接受的载剂(诸如水性载剂)中的溶液。可以使用各种水性载剂中的任一种，如水、缓冲水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％右旋糖等，并且可以包括用于增强稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，将使用生理缓冲盐水(135-150mm的nacl)。该组合物可含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。在一些实施方案中，抗体靶向组合物可在用于静脉施用的试剂盒中配制。
适用于例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、肿瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径来肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者血液等渗的溶质，以及可包含混悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬液。
药物制剂可以以单位剂型包装或制备。在此类形式下，如根据治疗剂的剂量或抗体的浓度，制剂被细分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，所述包装含有在单位-剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中的分散量的制剂。如果需要，该组合物还可以含有其它相容的治疗剂。
抗体(或抗体靶向组合物)可通过注射或输注通过任何适合的途径施用，包括但不限于静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。施用药物组合物的实例包括在4℃下将抗体以10mg/ml储存于注射用无菌等渗盐水溶液中，并且在施用给患者前将其在100ml或200ml注射用0.9％氯化钠中稀释。在1小时的过程内通过以0.2至10mg/kg的剂量静脉内输注施用抗体。在其它实施方案中，抗体通过静脉内输注经15分钟至2小时的时间段施用。在其它的实施方案中，施用程序是经由皮下团注注射进行的。
选择抗体的剂量用以为患者提供有效的疗法，并且所述剂量在每位患者小于0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重的范围内或在1mg-2g范围内。在一些情况下，剂量在1-100mg/kg的范围内，或者约50mg-8000mg/患者。可根据抗体的药代动力学(如循环中抗体的半衰期)和药效动力学响应(如抗体的治疗性作用的持续时间)，以适当的频率重复剂量，所述频率在每天一次至每三个月一次的范围内。在一些实施方案中，约7天和约25天之间的体内半衰期以及抗体给药在每周一次和每三个月一次之间重复。
施用可以是周期性的。根据施用途径，可以施用剂量，例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或者更久施用一次(如每2、3、4或6个月施用一次)。在一些情况下，施用更频繁，如每天2次或3次。如本领域技术人员将认识到，可根据治疗进展和任何不良副作用监测患者以调整施用的剂量和频率。
因此，在一些实施方案中，额外的施用依赖于患者的进展，如患者在施用之间受到监测。例如，第一次施用或若干轮施用后，可监测患者的肿瘤生长速率、复发(如在手术后患者的情况下)或一般疾病相关症状诸如无力、疼痛、恶心等。
为了治疗癌症，可以每天以约0.001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量施用抗体或抗体靶向组合物(如包含治疗剂和/或诊断剂)，并随着时间的推移调整。可使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，约5至约10mg/kg或约10mg/kg至约50mg/kg的每日剂量范围。本文所述的体内异种移植结果表明，5-20mg抗体/kg体重之间的剂量对于肿瘤生长显著减少是有效的。
剂量根据患者的要求、所治疗病况的严重程度以及所使用的靶向组合物而变化。例如，考虑到在特定患者中诊断的癌症的类型和阶段，剂量可以凭经验确定。在本公开的上下文中施用给患者的剂量应该足以影响患者中随着时间推移的有益的治疗性响应。如技术人员将认识到，剂量的大小还将由与特定患者中的特定靶向组合物的施用所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且对于本领域技术人员表明了对其的各种修改或改变，并且将所述修改或改变包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的通过引用整体并入本文。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用整体明确地并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入本文。
从前述应当理解的是，虽然本文为了说明的目的已经描述了本发明的特定实施方案，但是可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。
以下实施例是以说明而非限制的方式提供的。
vi.实施例
使用quickchangeii定点突变试剂盒(agilent)，在cll-1抗体(hum31)重链的选定位置(eu编号)处将半胱氨酸残基工程化以产生相应的cysmab变体。通过dna测序验证了半胱氨酸取代的真实性。将cysmab轻链和重链构建体瞬时转染到hek-293细胞中。使用mabselectsure珠纯化表达的cysmab变体，并将其用各种cll-1功能测定进一步表征。
实施例1--缀合
为了证明在重链恒定区的所选残基处的缀合，建立了抗体-荧光团缀合物。使用以下程序：将经纯化的hum31或cysmab变体(各1.5mg)在4℃下对pbs透析过夜。将抗体与200μl的mabselectsure珠在室温下孵育1小时。每次用2mlpbs洗涤珠三次后，将在150mmnacl-50mmtris,ph8.0缓冲液中于2mmdtt中在室温下还原过夜。将珠洗涤三次，然后将抗体在1mm脱氢抗坏血酸(dhaa)中在室温下再氧化3小时。将抗体洗涤三次，并与10摩尔过量的alexa488-c5-马来酰亚胺在室温下缀合2小时。将珠洗涤三次，并用500μl的0.1m甘氨酸，ph2.7洗脱alexa488缀合的抗体。通过使用nanodrop2000测定抗体浓度和alexa488缀合效率(每个抗体alexa488的数量)。
为了证明缀合不随荧光团的日期或量而变化，在不同的日期和不同的浓度下重复缀合程序。结果(分别地，图5和图6)显示，任何缀合比(如dar、far)都在程序中都没有明显变化。
包括氨基酸残基和荧光团-与-抗体比(“far”)的缀合结果报道于图7-图9中。
图7显示了45种总缀合，21种(47％)展现出高缀合(>2)、7种(16％)中缀合(1-2)和17种(38％)低缀合(<1)。
图8显示了20种总缀合物，10种(50％)展现出高缀合(>2)、1种(5％)中缀合(1-2)和9种(45％)低缀合(<1)。
实施例2--特异性elisa
图1：开发了特异性检测缀合至hum31的alexa488(a488)(hum31-a488afc)的elisa测定。设计三种形式的elisa以检测缀合至人血浆中的hum31的a488。在这三种elisa方法中测试未经缀合的hum31、hum31-a488和igg-a488。结果显示了elisa形式#1具有最佳的信噪比。并且，形式#2和形式#3显示出更高的本底结合。进一步用形式#1elisa以检测hum31-a488。
图2a：elisa测定的特异性。形式#1将elisa方法用于特异性检测hum31-a488和位点-特异性cysmab-a488缀合物，而不是对照样品(相对于igg(同种型对照)、igg-a488afc、曲妥珠单抗和未经缀合的hum31)。结果证明这种elisa方法仅检测hum31-a488和位点-特异性cysmab-a488缀合物。相对之下，对照：同种型人igg、曲妥珠单抗、hum31或igg-a488缀合物显示无结合。
图2b：在elisa测定中测试人血浆干扰。在最佳的elisa条件下，1％人血浆的存在仅略微增强了hum31-a488缀合物与抗-a488抗体的结合。因此，elisa方法可用于分析先前暴露于人血浆的抗体缀合物样品。
实施例3--hum31-a488缀合物(afc)的稳定性
通过在人血浆中孵育来测试本公开的afc的在人血浆中的稳定性。将afc(50μg/ml)加入(spike)到pbs中的汇集的人血浆或0.5％bsa中。然后将各样品在37°7，5％co2下孵育，然后在0、24、48、72和96小时的时间点转移至-80°8。将样品在样品稀释液(含有0.5％bsa、0.05％tween20、5mmedta、0.35mnacl、0.25％chaps和0.2％bgg的pbs缓冲液)中以1:5000稀释。然后通过elisa测定不同时间点的样品。
elisa程序：将pbs(1μg/ml)中的cll-1胞外结构域蛋白在96孔板上包被并在4°在下孵育过夜。然后将板用0.1％tween20的pbs洗涤三次，然后在室温下用在0.1％tween20的pbs中的1％bsa封闭1小时。用0.1％tween20的pbs洗涤6次后，将连续稀释的alexa488缀合的人m31及其对照加入平板并在室温下孵育1小时。然后将板用0.1％tween20的pbs洗涤。将兔抗-alexa488二级抗体(1μg/ml)加入板并在室温孵育1小时。用0.1％tween20的pbs洗涤6次后，将板用以1:50,000稀释的hrp缀合的山羊抗-兔fc多克隆抗体检测。然后通过比较每个时间点与时间0的od值来评价百分比(％)值。
图9和10中显示了5天后测试样品的稳定性：
图9和10显示了样品58、64、73、81、86和206在孵育5天后具有>85％的稳定性。
实施例4--hum31-生物素缀合物的稳定性
通过将cysmab与hpdp-生物素和bmcc-生物素缀合产生hum31-生物素缀合物。
将经纯化的人m31或cysmab变体(各1.5mg)在4°g下对pbs透析过夜。将抗体与200μl的mabselectsure珠在室温下孵育1小时。每次用2ml的pbs洗涤珠三次后，将抗体在150mmnacl-50mmtris,ph8.0缓冲液中于2mmdtt中在室温下过夜还原。将珠洗涤三次，然后将抗体在1mmdhaa中在室温下再氧化3小时。将抗体洗涤三次，并与10摩尔过量的hpdp-生物素或bmcc生物素在室温下缀合2小时。将珠洗涤三次，并将生物素缀合的抗体用500μl的0.1m甘氨酸，ph2.7进行洗脱。使用nanodrop2000和基于elisa的测定分别确定抗体浓度和生物素缀合效率。
开发elisa测定以确定人血浆中的adc的稳定性：将pbs中的cll-1胞外结构域(1μg/ml)在96孔板上包被并在4°在下孵育过夜。将elisa平板用洗涤缓冲液(0.1％tween20于pbs中)洗涤三次，随后在室温下用在含有0.1％tween20的pbs溶液中的1％bsa封闭1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6次后，将连续稀释的hum31-生物素及其相应的对照样品添加至板并在室温下孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤6次，随后使用链霉亲和素-hrp缀合物(以1:100,000稀释度使用)检测。
图11报道了第5天后hpdp和bmcc连接的抗体缀合物的稳定性。
人血浆中生物素-bmcc缀合物样品的稳定性：
图11显示了样品v266、v303、t307、g316、y436、l441、h285、r301、q295在5天的孵育后具有>80％的稳定性。
实施例5--亲和力测试
针对与它们的裸露的未缀合的对应物的比较性结合亲和力，可测试经半胱氨酸取代的cll-1cysmab的结合亲和力。简言之，将经生物素化的cll-1(25μg/ml)在22°2下加载到链霉亲和素传感器尖端上2小时。使用整体1:1曲线拟合，通过fortebio或biacore分析(10、30和90μg/ml)，针对每种抗体在三种不同浓度下产生出ab-ag解离曲线。
实施例6–结合aml细胞系和aml患者样品
可测试经半胱氨酸取代的cysmab与表达人cll-1的重组293细胞和两种aml细胞系(hl60和ociaml-5)的比较性结合。具有抗体结合的活细胞的百分比可以通过任何合适的手段如facs来检测。也可以评估结合一致性，即患者之间的变异性。
实施例7--抗体-药物缀合物(adc)测定
抗体-药物缀合物(adc)测定可在适合的aml细胞系(如hl60和ociaml-5)以及表达cll-1的重组293细胞上进行。简言之，将细胞与不同浓度的adc在37°7下孵育72-120小时。通过celltiter-glo(promega)发光细胞存活力测定来确定细胞存活力以确定ic50值。
实施例8--aml肿瘤生长的体内抑制
可评价cll-1cysmabadc的体内效力。适合的研究包括(1)在小鼠中利用cll-1阳性hl60aml人细胞系的皮下(sc)肿瘤植入和生长模型，和(2)利用cll-1阳性hl60或ociaml-5人aml细胞系的原位(骨髓、血液、脾脏和淋巴结)肿瘤植入和赘疣模型。
可如下进行所建立的schl60研究。用5×106或107个hl60细胞接种动物(nu/nu小鼠)。将荷瘤小鼠随机分组，每组平均肿瘤体积为100-150mm3(8只动物/组)。将cll-1cysmabadc或igg对照adc以5-200μg/动物的剂量i.p.施用。将经一段时间(给药后)的平均肿瘤体积进行作图。
可如下进行ociaml-5细胞原位研究。将免疫缺陷的nsg小鼠分成5组，每组8只动物。将cll-1cysmabadc或igg对照adc在静脉内接种5×106或107个ociaml-5细胞后(第6天)以5-200μg/动物的剂量i.p.施用。然后使动物在后续2周内每周接受一次另外的抗体剂量。该研究在施用ociaml-5细胞后4周终止。
实施例9--adc测定中对aml干细胞的特异性
可以在adc测定中测试根据本公开制备的cll-1cysmabadc的特异性杀灭的特异性。将原代患者aml细胞或正常cd34阳性造血干细胞从人受试者的骨髓中分离出来，并接种到软琼脂集落形成测定(100,000个细胞/板)中。然后将细胞在cll-1cysmabadc的存在下孵育14天。adc可引起aml干细胞克隆形成生长的选择性、特异性抑制，而正常的hsc不应该受到影响。可将缀合的效果与裸露的亲本抗体相比较。将阴性对照未经处理或用不相关的igg-adc处理。
实施例10–各种药物缀合物的稳定性
多种抗体-药物缀合物如下制备：
用具有以下可变区的抗-cll-1抗体制备所有缀合物：：轻链可变区序列，其包含：diqmtqspsslsasvgdrvtltcratqelsgylswlqqkpgkaikrliyaastldsgvpsrfsgnragtdytltisslqpedfatyyclqyaiypytfgqgtkleik(seqidno:19)以及重链可变区序列，其包含：evqlvqsgaevkkpgasvkmsckasgytftsyfihwvrqapgqglewigfinpyndgskyaqkfqgratltsdkststvymelsslrsedtavyyctrddgyygyamdywgqgtlvtvss(seqidno:20)。如下将抗体经由至异喹啉烷并苯二氮
(被命名为“d202”)。
使用millipore,15ml,30kda装置，经由2轮的分子量截留过滤(mwco)将pbs中的人源化的经cys取代的抗-cll1抗体交换到硼酸盐缓冲液(50mm,ph8.5,1mm二乙烯三胺五乙酸(dtpa))中。向新的抗体溶液(5.0mg/ml，硼酸盐缓冲液(50mm,ph8.5,1mmdtpa))中加入二硫苏糖醇(dtt)溶液(33μl，50.0当量，50mm)，并将所得的溶液轻轻振摇过夜。
如前所述，通过rp-lcms证实链间二硫桥的完全还原以及去除经取代的半胱氨酸半胱氨酸/谷胱甘肽加合物(junutula等人,2008,naturebiotech,26,925-932)。然后使用millipore,15ml,30kda装置，使用pbs作为交换缓冲液，通过3轮的分子量截留过滤(mwco)从溶液中除去dtt。向完全还原的抗体的5mg/ml溶液中加入脱氢抗坏血酸(dhaa)溶液(33μl，50.0当量，50mm)。将所得的溶液轻轻振摇3小时。经由rp-lcms监测再氧化。一旦认为再氧化完全，用丙二醇将反应混合物稀释至50％v/v，并将d202作为dmso中的溶液(10.0当量，10mm于dmso中)进行添加。
使反应在环境温度下搅拌1小时。然后将混合物用活性炭在环境温度下处理1小时。然后经由过滤去除活性炭。然后使用millipore,15ml,30kda装置经由多轮的分子量截留过滤(mwco)将缀合物交换到pbs中。然后将溶液进行无菌过滤，得到所需的缀合物。
以30μg/ml开始，使用细胞结合缓冲液(pbs，含有2％胎牛血清)将c6-cysmab-d202adc和c0-d202进行8个点的、6倍的连续稀释。将hl60、oci-aml5和oci-aml5-cll1敲除细胞用染色培养基洗涤，并用5％正常小鼠血清在冰上孵育30分钟以阻断fcγ受体。然后将细胞以每孔0.1e6个细胞的密度分配到96孔板中，并通过离心去除培养基。将细胞板与100μladc样品稀释液一起在冰上孵育30分钟，然后洗涤3次并进一步用alexa-488缀合的山羊抗人igg作为二级抗体在冰上染色30分钟。然后将细胞洗涤三次并使用碘化丙啶作为细胞存活力染料重悬于100μl细胞结合缓冲液中。通过流式细胞术和flowjo数据分析来分析与细胞样品结合的adc。使用graphpadprizm6对fitc信号的mfi(几何平均值)进行作图。参见图12a-图12c。
如下测定缀合物的稳定性。在第0天，在人血浆中稀释c6-cysmab-d202adc样品至200mg/ml。使用人血浆作为稀释剂进行9-点，6倍连续稀释。密封样品稀释板并在37°7下在co2孵育箱中孵育5天，作为样品d5。通过在第2、4和5天重复该血浆稀释和37°7孵育程序来制备样品d3、d1和d0。在第5天，通过将5ml样品d0、d1、d3和d5添加到95ml的oci-aml2和hl60细胞中建立细胞杀灭测定，在37°7下孵育5天，并通过cell-titer-glo定量细胞存活力。
使用人血浆作为稀释剂在96孔板中进行c6-cysmab-d202adc样品稀释，并在37°7下在co2孵育箱中孵育以进行血浆稳定性研究。在第0天、第2天、第4天和第5天以200μg/mladc开始进行9点、6倍连续稀释，并且密封的样品稀释平板加上无adc仅血浆对照，在37°7，5％co2孵育箱内孵育5天、3天、1天和0天，，分别作为样品d5、d3、d1和d0。在第5天，将oci-aml2和hl60细胞以2,000个细胞的密度接种在96孔板内的补充有20％胎牛血清(fbs)的95μl的alpha-mem和imdm细胞培养基中，并用5μl来自d0、d1、d3、d5样品稀释板的样品以一式三份进行处理。然后将测定板在37°7，5％co2孵育箱中孵育5天。使用celltiter-glo试剂盒(promega)测定活细胞(活细胞的百分比)，并通过读板仪(moleculardevicespetramaxm5)测量发光。结果以相对于无adc仅血浆对照细胞的活细胞的百分比表示。通过使用graphpadprizm6的非线性回归推导出各个剂量响应曲线和抑制药物浓度(ic50)。
将c6-cysmab-d202adc对aml2,hl60细胞杀灭的稳定性测试示列于下表中：
序列表
<110>塞勒兰特治疗公司(celleranttherapeutics,inc.)
杰格塔·r·祖奴图拉(junutula,jagathr.)
蒋英萍(jiang,yingping)
黄姜清(huang,jianqing)
马德哈维·米什拉(mishra,madhavi)
<120>经半胱氨酸取代的免疫球蛋白
<130>1014170
<150>us62/193,531
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