本pct国际申请要求2015年10月30日递交的美国临时申请62/248,760以及2016年3月1日递交的美国临时申请62/301,759优先权及其权益，两者均通过引用的方式全部并入本文。
本发明涉及新的异维甲酸制剂。更加具体地，本发明提供一种用于药物异维甲酸的增强靶向经皮递送系统，该系统存在极少的全身性渗透，或不存在全身性渗透，以及改善的热动力学活性，不使用乙醇或使用相对于现有异维甲酸凝胶产品而言少量的乙醇。本发明还提供使用该增强靶向经皮递送系统治疗鱼鳞病和其他皮肤疾病的方法。
背景技术：
本发明背景的以下讨论仅仅提供用来帮助读者理解本发明而不是将现有技术描述为或构成为本发明。本pct国际申请提及很多公开物和公众可得的产品，这些公开物和产品的公开内容通过引用的方式全部并入本文。
鱼鳞病是一组混杂有至少28种基本为遗传皮肤病的统称，其特征为干燥、增厚的鳞片状或薄片状皮肤，由角质细胞的过度聚集(不正常角质化)而来。鱼鳞病和相关皮肤类疾病包括发病(先天性或成人发病)、病因(遗传性或获得性)、强度程度(中等到严重)、以及牵涉度(仅限皮肤还是多器官)不同的广谱性疾病。在大部分情况下，皮肤的屏障功能由于异常的表皮成熟/分化过程、角质层的数量和质量、以及角化细胞增殖动力学而变得异常。据美国骨疗皮肤病学会预计，250人中有1个受到寻常型鱼鳞病，较为常见的鱼鳞病类型之一，的困扰。尽管已经知道了多种类型，大多数鱼鳞病的形式被认为是先天性的。这些类型包括，但不限于，寻常型鱼鳞病、x-连锁鱼鳞病、板层状鱼鳞病、先天性鱼鳞癣样红皮病、表皮松解性鱼鳞病、可变性红斑角化症、先天性厚甲症、掌跖角皮病、斑色鱼鳞癣、雷弗素姆氏病、conradi-hunermann-happle综合症、child综合症、纸屑鱼鳞病(ichthyosisenconfettis)、表皮松懈痣(epidermolyticnevus)、兜甲蛋白角皮病、voihwinkel病和sjógren-larsson综合症。当前的终身治疗由润肤剂和角质溶解剂组成，润肤剂包括大多数对于严重鱼鳞病疗效很差的标准润肤剂，角质溶解剂为例如α羟酸，造成灼烧感，尤其是在孩子身上。然而，对于先天性鱼鳞病，目前没有fda批准的疗法。
异维甲酸是fda批准用于严重顽固性结节性痤疮的类维生素a。从化学上讲，异维甲酸是13-顺视黄酸，是维生素a的衍生物。异维甲酸最初在1982年研制出来并批准用于痤疮的治疗。目前仍有大量进行之中的研究是关于异维甲酸在治疗骨骼肌和结缔组织炎症、肺气肿、溃疡性疾病、和多种癌症(即，治疗hiv阳性女性的宫颈肿瘤)，以及在吸烟者中预防肺癌、和预防皮肤癌的用途。近来已经完成或正在进行中的研究也有关于异维甲酸(通常联合其他药物)在治疗成神经细胞瘤、复发的前列腺癌、白血病、恶性胶质瘤、头颈癌以及多发性骨髓瘤中的作用。异维甲酸也已证实可用于治疗某些皮肤病证，例如革兰氏阴性毛囊炎、顽固性酒糟鼻、面部脓皮病、泛发性扁平苔藓、牛皮藓、皮肤型红斑狼疮、爆发性痤疮、和鳞状细胞癌。其也可以用于治疗皮肤光老化。此外，异维甲酸已经用于治疗鱼鳞病患者；然而，该用途限制于经由口服给药的全身性递送，对患者存在急性和慢性副作用，包括出生缺陷、早产、升高的胆固醇和甘油三酯量、皮肤干燥或粘性、以及假性脑瘤。参见，例如，ohnj.digiovannaetal.，“systemicretinoidsinthemanagementofichthyosesandrelatedskintypes，”dermatol.ther.，vol.26(1)：26-38(jan-feb.2013)。
异维甲酸最初批准的时候为胶囊，目前在美国仅能购买到这种形式。异维甲酸的凝胶剂或霜剂在口服制剂后研制出，目前在美国之外的一些国家可购买到。此外，称为“isotrexin”且包含异维甲酸和红霉素的制剂，已经在美国之外销售。然而，很多局部制剂包含高浓度作为溶剂和渗透促进剂的乙醇。大量的乙醇，在帮助药物渗透的同时，可能造成严重的皮肤刺激和干燥，从而使得很多现有的异维甲酸制剂不适用于皮肤症状例如鱼鳞病的治疗。
因此，需要一种新的能够安全用于经皮给药而没有现有局部制剂的刺激性但保持药物靶向给药的异维甲酸局部递送系统。此外，还需要新的异维甲酸局部递送系统来减少或消除与异维甲酸给药相关联的全身性副作用的风险。
技术实现要素：
本发明基于对异维甲酸新制剂的惊人发现，其不含乙醇或含有比现有市售异维甲酸产品显著更低的乙醇量，但具有异维甲酸对表皮和真皮的强化靶向局部递送。此外，该异维甲酸新制剂表现出极少或无的全身性渗透。
在一个方面，本发明包含药物组合物，其包含：异维甲酸；至少一种渗透促进剂；至少一种溶剂；至少一种粘度调节剂；至少一种防腐剂；和水。在另一方面，也可以包含抗氧化剂。在另一个方面，药物组合物选自凝胶剂、软膏剂、乳液剂、乳剂、霜剂、泡沫剂、摩丝剂、液剂、喷雾剂、混悬剂、分散剂、和气雾剂。在另一方面，至少一种渗透促进剂可以选自乙醇、卡必醇(transcutol)、和丙二醇，或其组合，其中渗透促进剂的浓度为0％w/w-12.5％w/w。在另一个方面，抗氧化剂可以是bht、n-乙酰半胱氨酸(“nac”)，或其组合。在另一个方面，抗氧化剂可以以0.1％-30％w/w的浓度存在。在另一个方面，粘度调节剂可以包括鲸蜡醇、丙三醇、聚乙二醇(“peg”)，或其组合。在另一个方面，至少一种防腐剂可以选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、bht、及其组合。在另一个方面，溶剂可以选自peg、丙二醇、二乙二醇单乙基醚(transcutolp)、乙醇、及其组合。渗透促进剂，在一些方面，浓度可以为0％w/w、2％w/w、5％w/w、或10％w/w，或在0％w/w-2％w/w的范围内。在另一个方面，异维甲酸以选自0.025％w/w、0.05％w/w、0.10％w/w、0.15％w/w和0.2％w/w中的浓度存在。关于peg，peg可以是领域内已知的多种分子量的任何peg，例如在peg200至peg4000范围内的那些。在另一个方面，peg可以是peg(例如，peg3350；peg4000)、或peg的组合(例如，peg1450&peg3350)。在另一个方面，至少一种润湿剂，包括但不限于尿素等。在另一个方面，至少一种润湿剂可以以1％-40％w/w的浓度存在。在另一个方面，可以包括抗炎化合物。在另一个方面，抗炎化合物可以是nac、类固醇、非类固醇化合物、或其组合。在另一个方面，抗炎化合物可以以0.003％-10％w/w的浓度存在。
在另一个方面，提供的药物组合物包含异维甲酸、peg400、水、乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、peg4000和bht，其中，乙醇的含量为0％w/w-10％w/w。异维甲酸，在某些方面，可以以0.025％w/w、0.05％w/w、0.10％w/w、0.15％w/w、和0.2％w/w的浓度存在；在优选的方面，可以以0.2％w/w的浓度存在。
在另一方面，提供的药物组合物包含约0.05％w/w-约0.5％w/w的异维甲酸、约60％w/w-约65％w/w的peg400、约6％w/w-约12％w/w的水、约5％w/w-约10％w/w的乙醇、约0.05％w/w-约0.5％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.01％w/w-约0.05％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约15％w/w-约20％w/w的peg4000、以及约0.05％w/w-约0.2％w/w的bht。
在另一方面，本发明提供的药物组合物包含约0.2％w/w的异维甲酸、约63.4％w/w的peg400、约9％w/w的水、约10％w/w的乙醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。
在另一方面，本发明提供的药物组合物包含约0.2％w/w的异维甲酸、约62.4％w/w的peg400、约10％w/w的水、约5％w/w的乙醇、约5％w/w的卡必醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。
在另一方面，本发明提供的药物组合物包含约0.1％w/w的异维甲酸、约62.4％w/w的peg400、约10％w/w的水、约5％w/w的乙醇、约5％w/w的卡必醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。
另一方面，本发明提供治疗先天性鱼鳞病的方法，包括向有其需求的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含异维甲酸、至少一种渗透促进剂、至少一种溶剂、至少一种防腐剂、和水，其中乙醇的含量为0％w/w-10％w/w。在一些方面，药物组合物还可以包括至少一种选自抗氧化剂、润肤剂、粘度调节剂、及其组合中的组分。在某些方面，给药可以是经皮给药。在其他方面，先天性鱼鳞病选自寻常型鱼鳞病、x-连锁鱼鳞病、板层状鱼鳞病、先天性鱼鳞癣样红皮病、表皮松解性鱼鳞病、可变性红斑角化症、先天性厚甲症、掌跖角皮病、斑色鱼鳞癣、雷弗素姆氏病、conradi-hunermann-happle综合症、child综合症、纸屑鱼鳞病(ichthyosisenconfettis)、表皮松懈痣(epidermolyticnevus)、兜甲蛋白角皮病、voihwinkel病和sjógren-larsson综合症。在某些方面，药物组合物包含约0.01％w/w-约0.5％w/w的异维甲酸、约60％w/w-约65％w/w的peg400、约6％w/w-约12％w/w的水、约5％w/w-约12.5％w/w的乙醇、约0.05％w/w-约0.5％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.01％w/w-约0.05％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约15％w/w-约20％w/w的peg4000、以及约0.05％w/w-约0.2％w/w的bht。在其他方面，药物组合物包含约0.2％w/w的异维甲酸、约63.4％w/w的peg400、约9％w/w的水、约10％w/w的乙醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。在另一方面，药物组合物包含约0.2％w/w的异维甲酸、约62.4％w/w的peg400、约10％w/w的水、约5％w/w的乙醇、约5％w/w的卡必醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。在另一方面，药物组合物包含约0.1％w/w的异维甲酸、约62.4％w/w的peg400、约10％w/w的水、约5％w/w的乙醇、约5％w/w的卡必醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约17.08％w/w的peg4000、以及约0.1％w/w的bht。在另一方面，受试者是人。
在另一方面，药物组合物包含异维甲酸、和至少一种溶剂。在另一方面，药物组合物还包含至少一种渗透促进剂。在其他方面，至少一种渗透促进剂选自乙醇、卡必醇、丙二醇，及其组合。在其他方面，至少一种渗透促进剂是乙醇，且乙醇的浓度不高于2％w/w。在其他方面，药物组合物还包含0％w/w的乙醇和/或0％w/w的水。在其他方面，药物组合物还包含至少一种防腐剂。在其他方面，至少一种防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、bht、及其组合。在另一方面，至少一种溶剂选自聚乙二醇(peg)、丙二醇及其组合。在另一方面，药物组合物配置为凝胶剂、软膏剂、乳液剂、乳剂、霜剂、泡沫剂、摩丝剂、液剂、喷雾剂、混悬剂、分散剂、或气雾剂。
在另一方面，药物组合物还包含至少一种抗氧化物。至少一种抗氧化剂可以是nac、bht、或其组合。在另一方面，nac的浓度为至少0.1％w/w但不高于30％w/w。在其他方面，还可以包含炎化合物，其中抗炎化合物可以是nac、类固醇、非类固醇类抗炎化合物、或其组合。在另一方面，抗炎化合物可以以0.003％-10％w/w的浓度存在。
在其他方面，药物组合物还包含至少一种润湿剂。至少一种润湿剂可以是尿素，且尿素的浓度可以为至少1％w/w但不高于40％w/w。在其他方面，药物组合物还包含至少一种粘度调节剂。至少一种粘度调节剂可以是丙三醇、peg、或其组合。
在另一方面，药物组合物包含异维甲酸、peg400、peg3350、和bht。在其他方面，药物组合物还包含对羟基苯甲酸甲酯、和/或对羟基苯甲酸丙酯。在其他方面，异维甲酸以约0.01-约0.2％w/w的浓度存在。在另一方面，异维甲酸以约0.025％-约0.2％w/w的浓度存在。在其他方面，药物组合物还包含乙醇，其中乙醇的浓度不高于2％w/w。或者，在其他方面，药物组合物包含0％w/w的乙醇。在其他方面，药物组合物还包含nac。
在另一方面，药物组合物包含异维甲酸、peg400、peg3350、peg1450、和bht。在其他方面，药物组合物还包含对羟基苯甲酸甲酯、和/或对羟基苯甲酸丙酯。在其他方面，异维甲酸以约0.01％-约0.2％w/w的浓度存在。在另一方面，异维甲酸以约0.025％-约0.2％w/w的浓度存在。在其他方面，药物组合物还包含乙醇，其中乙醇的浓度不高于2％w/w。或者，在其他方面，药物组合物包含0％w/w的乙醇。在其他方面，药物组合物还包含nac。
另一方面，药物组合物包含约0.01％w/w-约0.6％w/w的异维甲酸、约67％w/w-约70％w/w的peg400、约0％w/w-约2％w/w的乙醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约14％w/w-约30％w/w的peg3350、约0％-约15％w/w的peg1450、以及约0.1％w/w的bht。在其他方面，其中异维甲酸的量为约0.025％-约0.6％。
另一方面，药物组合物包含约0.01％w/w-约0.6％w/w的异维甲酸、约67％w/w-约70％w/w的peg400、0％w/w-约2％w/w的乙醇、约14％w/w-约30％w/w的peg3350、约0％-约15％w/w的peg1450、以及约0.1％w/w的bht。在其他方面，其中异维甲酸的量为约0.025％-约0.6％。
另一方面，治疗先天性鱼鳞病的方法，包括向有其需求的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含异维甲酸、和至少一种溶剂。在其他方面，至少一种溶剂为0％w/w-2％w/w的乙醇和/或peg。在其他方面，药物组合物还包含至少一种抗氧化剂，其中至少一种抗氧化剂为bht、nac或其组合。在其他方面，给药可以是经皮。在其他方面，先天性鱼鳞病选自寻常型鱼鳞病、x-连锁鱼鳞病、板层状鱼鳞病、先天性鱼鳞癣样红皮病、表皮松解性鱼鳞病、可变性红斑角化症、先天性厚甲症、掌跖角皮病、斑色鱼鳞癣、雷弗素姆氏病、conradi-hunermann-happle综合症、child综合症、纸屑鱼鳞病、表皮松懈痣、兜甲蛋白角皮病、voihwinkel病和sjógren-larsson综合症。在另一方面，受试者是人。
另一方面，治疗先天性鱼鳞病的方法，包括向有其需求的受试者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含约0.01％w/w-约0.6％w/w的异维甲酸、约67％w/w-约70％w/w的peg400、约0％w/w-约2％w/w的乙醇、约0.2％w/w的对羟基苯甲酸甲酯、约0.02％w/w的对羟基苯甲酸丙酯、约14％w/w-约30％w/w的peg3350、约0％-约15％w/w的peg1450、以及约0.1％w/w的bht。在另一方面，其中异维甲酸的量为约0.025％-约0.6％。在另一方面，其中异维甲酸的量为约0.025％-约0.2％。在另一方面，受试者为人。
本文所用的“穿皮(transdermal)”给药表示药物通过皮肤或通过皮肤的方式运送，以引入到全身循环。
本文所用的“经皮(dermal)”给药是指药物的运送经角质层到达真皮和/或表皮，响应于药物的局部、非全身性施用而治疗局部皮肤病症(例如先天性鱼鳞病)。将意识到的是，意在用于经皮疗法的一些药物可以穿皮施用，然而通常不以治疗有效量施用。
本文所用的“治疗有效量”是指足以防止或减少与疾病或病症(例如先天性鱼鳞病)相关联的症状，和/或减轻疾病或病症的严重程度。治疗有效量应在正在被治疗的病症的背景下进行理解，本领域技术人员可以较为容易地知道其实际的有效量。
本文所用的“异维甲酸”是指游离酸或其药物可接受盐，例如碱金属盐，形式的异维甲酸。异维甲酸是13-顺式-视黄酸。维甲酸(所有反式视黄酸)和异维甲酸是几何异构体，在体内显示出可逆的相互转化。一种异构体的施用可以产生另一种。异维甲酸的其他主要代谢物例如4-氧-异维甲酸及其几何异构体4-氧-维甲酸也包含在术语“异维甲酸”中。
本文所用的“渗透速率”是指药物经由皮肤的通行速率。渗透速率被计算为每平方厘米渗透的药物累计量随时间而变的直线部分的斜率。
本文所用的“运送速率”是指根据菲克扩散定律的经由人皮肤的被动药物运输的速率。物质运送公式如下所示：j＝1/a(dm/dt)＝pδcdt，j是流量(μgcm2/hr)，a是皮肤膜的截面积(cm2)，p是表观渗透系数(cmhr)，δc是跨膜的浓度梯度，且(dm/dt)是物质运送速率。
附图说明
图1是示出用于本文中体外药物运送实验中的franz室的示意图，其包含供体隔间、受体隔间、和取样侧臂。
图2是线图，示出与isotrex凝胶0.05％(批次：f1311和f0892)相比的、本发明组合物(“patpo3an”)经硅酮膜递送的异维甲酸在2-8h的平均累计量(μg/cm2)(时间表示为√时间，均值±se，5≤n≤6)。
图3是线图，示出所施用异维甲酸剂量从patpo3an以及对比产品isotrex凝胶0.05％(批次：f1311和f0892)经硅酮膜递送的在2-8h的百分比(时间表示为√时间，均值±se，5≤n≤6)。
图4是柱状图，示出施用patpo3an以及对比产品isotrex凝胶0.05％(批次：f0892)后，在最后的取样点(48h)后从皮肤层(角质层、表皮、真皮)以及接收液回收的所施用异维甲酸剂量的百分比(均值±se，n＝12)。
图5是线图，示出，在24h实验期间，与isotrex凝胶0.05％的两个批次相比，从包含0.10％异维甲酸的peg软膏剂和凝胶剂经硅酮膜递送的每单位面积异维甲酸的平均累计量(μg/cm2)(均值±se，n≥5)。
图6是线图，示出，在1-8h间(时间表示为√时间)，与isotrex凝胶0.05％的两个批次相比，从包含0.10％异维甲酸的peg软膏剂和凝胶剂经硅酮膜递送的每单位面积异维甲酸的平均累计量(μg/cm2)(均值±se，n≥5)。
图7是线图，示出，在24h实验期间，与isotrex凝胶0.05％的两个批次相比，从包含0.20％异维甲酸的peg软膏剂和凝胶剂经硅酮膜递送的每单位面积异维甲酸的平均累计量(μg/cm2)(均值±se，n≥5)。
图8是线图，示出，在1-8h间(时间表示为√时间)，与isotrex凝胶0.05％的两个批次相比，从包含0.20％w/w异维甲酸的peg软膏剂和凝胶剂经硅酮膜递送的每单位面积异维甲酸的平均累计量(μg/cm2)(均值±se，n≥5)。
图9是柱状图，示出，在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，经皮肤渗透到接收液中的异维甲酸的平均累计量(μg/cm2)(均值±se，10≤n≤12)。
图10是柱状图，突出示出在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，在最后的取样点(48h)后从皮肤层(角质层、表皮、真皮)以及接收液回收的异维甲酸(μg)(均值±se，10≤n≤12)，sc表示角质层。
图11是2-17分钟与patpo3an安慰剂重叠后的色谱图，示出含有0.2％w/w异维甲酸的异维甲酸制剂patpo3an在40℃存储后t＝0周时的稳定性。
图12是2-17分钟与patpo3an安慰剂重叠后的色谱图，示出含有0.2％w/w异维甲酸的异维甲酸制剂patpo3an在40℃存储后t＝4周时的稳定性。
图13是柱状图，示出在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，在最后的取样点(48h)后，从表面(残留制剂)、皮肤层(角质层、表皮和真皮)回收异维甲酸(μg)(mean±se，10≤n≤12)，sc表示角质层。
图14是柱状图，示出在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，在最后的取样点(24h)后，异维甲酸跨皮肤渗透到接收液中的累计量(μg/cm2)(mean±se，10≤n≤12)。
图15是柱状图，示出在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，在最后的取样点(48h)后，表面(残留制剂)、皮肤层(角质层、表皮和真皮)以及接收液中跨皮肤渗入的异维甲酸的量(μg)(mean±se，10≤n≤12)，sc表示角质层。
图16是柱状图，示出在施用某些测试制剂和对比产品isotrex凝胶0.05％后，在最后的取样点(48h)后，皮肤层(角质层、表皮和真皮)(除去表面)以及接收液中跨皮肤渗入的异维甲酸的量(μg)(mean±se，10≤n≤12)，sc表示角质层。
图17是柱状图，示出在分别施用所有patpo3an(0.2％)(左边第一和第二数据组)和对比产品isotrex凝胶0.05％(左边第三和第四数据组)后，在最后的取样点(48h)后，皮肤层(角质层、表皮和真皮)以及接收液中跨皮肤渗入的异维甲酸的量(μg)(mean±se，10≤n≤12)。sc表示角质层。左边的第一(patpo3an)和第三(isotrex(0.05％))数据组基于第四皮肤供体，而左边的第二(patpo3an)和第四(isotrexfo892(0.05％))数据组基于前三个皮肤供体。
具体实施方式
本发明涉及新的异维甲酸靶向制剂，其引起对真皮层的渗透增强，全身性渗透极少或无，且相对于现有市售产品，不增加乙醇的浓度(或完全地不含乙醇)。本发明还涉及施用该异维甲酸靶向制剂治疗鱼鳞病的方法。
药物的经皮递送有很多优点。首先，这样的递送方式是舒适、方便且非侵入式的给药途径。可以避免在口服治疗中遇到的多变的吸收和代谢率，同时也可消除其他固有的不便性，例如肠道刺激等。此外，避免了与递送至其他区域(例如，皮下或其他皮组织和/或皮肤以外的组织)相关的显著副作用。
然而，皮肤是结构复杂的膜。从环境移动到完整的皮肤中以及跨完整的皮肤移动的分子首先必须穿透角质层以及在其表面的任何物质。之后，它们必须渗透有活力的表皮、真皮层、以及毛细血管壁，进入血流或淋巴道。为了吸收，分子必须克服各类组织中不同的渗透抗力。因此，跨皮肤膜的运送是复杂的情况。然而，角质层细胞是局部组合物或穿皮施用药物吸收的第一道屏障。角质层是致密的高度角质化细胞的薄层，约10-15微米厚，遍布身体的大部分区域。对于很多药物，在不使用加强皮肤渗透的一些方法的情况下，经由皮肤的渗透速率相当低。
很多化学药物已经作为增加药物渗透通过皮肤的速率的一种方式而进行了研究。正如本领域技术人员所能意识到的，化学促进剂是与药物一起给药的化合物(在一些情况下，皮肤可以用化学促进剂渗透)，以增加角质层的渗透性，从而提供药物经皮肤的渗透。理想状况下，这样的化学渗透促进剂或“渗透促进剂”，正如本文中提及的化合物，是无害且仅仅起到促进药物经角质层的扩散作用的化合物。很多具有不同物化特性的治疗药物的渗透性可以使用这些化学促进方式来增强。然而，存在着与高含量的某些促进剂例如乙醇相关的皮肤刺激、干燥和致敏问题。
本文的新制剂在本文中令人惊讶地显示出，其相比于当前可得的异维甲酸局部凝胶制剂具有改善的热力学活性，而完全没有刺激性乙醇剂或具有更低含量的刺激性乙醇剂。通常而言，乙醇对于药物渗透的影响是浓度依赖型的，经皮吸收在高于50％w/w的乙醇含量下为最佳。实际上，现有的isotrex凝胶产品含有高于95％w/w的乙醇。异维甲酸软膏制剂的方面，其三种代表性配方在以下表1中示出，各个含有少于10％w/w的乙醇。因此，这些新制剂增强异维甲酸对表皮和真皮的递送，引起皮肤刺激和干燥的几率几乎为零。
表1
本文所述的新制剂，在某些方面，配置为凝胶剂、软膏剂、乳液剂、乳剂、霜剂、泡沫剂、摩丝剂、液剂、喷雾剂、混悬剂、分散剂、或气雾剂，或任何其他本领域技术人员已知的媒介种类。在优选的方面，该制剂配制成凝胶剂、软膏剂、泡沫剂或霜剂。
乳液剂可以通过使用混悬剂和分散剂而包含不溶于分散介质的细微颗粒物。或者，乳液剂可以具有与介质不相容且经常通过乳化剂或其他适当的稳定剂的方式而分散的分散相液体物质。在一些方面，液体剂处于粘度100-1000厘斯的乳液的形式。乳液剂的流动性使得可以快速而均匀地在大的表面区域上施用。乳液剂通常设计为在皮肤上干燥，在皮肤表面上留下医用组分薄层。
霜剂可以包含乳化剂和/或稳定剂。在一个方面，制剂处于粘度高于1000厘斯，通常在20,000-50,000厘斯范围内，的霜剂的形式。
霜剂和乳液剂之间的最基本的差异是粘度，其取决于用于制备该制剂的多种油的含量/施用与否以及水的百分比。霜剂通常比乳液剂要更厚重，能够具有多种用途，且一种霜剂通常取决于所需的皮肤效果而使用多种不同的油/缓冲剂。在霜剂中，水性百分比约为总量的60-75％，且油类为约20-30％，其他百分比为乳化剂、防腐剂和构成100％总量的其他添加剂。
合适的软膏剂基底的实例包括烃类基底(例如，石油、白凡士林、黄色软膏、和矿物油)；吸收基底(吸水性软石蜡、无水羊毛脂、羊毛脂、和冷霜)；水可移除性基底(例如亲水性软膏)和水溶性基底(例如，peg软膏)。浆剂与软膏剂的不同之处通常在于，浆剂包含更高百分比的固体。相比于相同组分制备的软膏剂，浆剂通常更加容易吸收，且更不油腻。
一些乳剂可以是凝胶或包含凝胶组分。然而，一些凝胶剂却不是乳剂，因为它们不包含不相容组分的均匀混合物。合适的凝胶剂包括，但不限于，改性纤维素，例如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素；卡波普均聚物和共聚物；及其组合。液体介质中的合适溶剂包括，但不限于，乙二醇乙醚；亚烃基二醇(alkleneglycol)，例如丙二醇；二甲基异山梨醇酯；醇类，例如异丙醇和乙醇。溶剂通常根据它们溶解药物的能力进行选择。其他添加剂，用于改进制剂的皮肤感和/或润滑性，也可以加入进来。这些添加剂的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、c12-c15烷基苯甲酸酯、矿物油、角鲨烷、环甲硅油、辛酸/癸酸甘油三酯、及其组合。
泡沫剂可以包含与气态推进剂一起的乳剂。气态推进剂可以主要包含氟烷(hydrofluoroalkane，hfa)。适当的推进剂包括hfa，例如1，1，1，2-四氟乙烷(hfa134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(hfa227)，但是这些hfa和其他已经批准或可能被批准药用的hfa的混合物是合适的。推进剂优选不是在喷雾期间会产生可燃性或爆炸性水汽的烃类推进剂气体。此外，组合物优选包含非挥发性醇类，其会在使用过程中产生可燃性或爆炸性水汽。
在特别优选的方面，新制剂配制为软膏剂。软膏剂是通常以石油或其他石油衍生物为基底的半固体制剂。要使用的特定的软膏剂基底，正如本领域技术人员将意识到的，是能够提供最优药物递送的那种，优选地，这种基底还将提供其他所需的特性，例如润滑性等。与其他载体或媒介物一起，软膏剂基底应当是惰性的、稳定的、非刺激性的且非致敏的。如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，20thedition(lippincottwilliams&wilkins，2000)中所解释的，软膏剂基底可分为四类：油质的、可乳化的、乳化和水溶性的。油质的软膏剂基底包括但不限于植物油、动物脂肪、和从石油中获得的半固体烃类。可乳化的软膏剂基底，也称为吸收性软膏剂基底，几乎不包含或不包含水，且包含例如硫酸羟基甘油三硬脂酸酯、无水羊毛脂、和吸水性软石蜡。乳化软膏剂基底是油包水(w/o)或水包油(o/w)乳化剂，且包括例如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏剂基底由多种分子量的peg制备而来。
在一些方面，本领域技术人员所知的多种添加剂可以包括在软膏剂中。例如，包括少量醇的溶剂可以用于溶解某些药物。其他可选的添加剂包括遮光剂、抗氧化剂、香料、着色剂、凝胶剂、增稠剂、稳定剂、表面活性剂等。也可以添加其他试剂，例如抗微生物剂，以防止存储时的腐败，即抑制微生物例如酵母和霉菌的生长。合适的抗微生物剂通常选自对羟基苯甲酸的甲酯和丙酯(即，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、苯甲酸钠、山梨酸、咪脲、及其组合。
在一些方面，软膏剂还可以包含渗透促进剂。促进剂的类型实例包括但不限于，脂肪酸，饱和及不饱和的；脂肪醇；胆汁酸；非离子表面活性剂，包括脂肪酸酯，一元醇、二元醇和多元醇的用脂肪酸酯化且经聚氧化烯取代的脂肪酸(长链烷基或烯基)酯，聚氧化烯脂肪酸酯、聚氧化烯脂肪醚、聚氧化烯脂肪醚、和聚甘油脂肪酸酯；胺类；酰胺类；n-烷基-氮杂环烷酮和n-烷基-氮杂环烯酮；烃类溶剂；萜烯；低级烷基酯；环糊精促进剂；含氮杂环；亚砜；以及尿素和其衍生物。
合适的促进剂的特定实例包括醚，例如二乙二醇单乙醚(市售可得的，
实施例
以上大体描述的本发明，将通过参考以下实施例而更好地理解，实施例通过示意的方式提供而不意在限制本文所讨论的本发明示例性制剂和方法。
实施例1：体外药物运送评估
为评估某些制剂(包括在表1中所描述的那些)的异维甲酸的运送情况，进行跨合成膜的体外药物运送研究。所选制剂的药物运送使用以fda的supac-ss指南[fda(cder)，1997，guidanceforindustry-supac-ssnon-sterilesemisoliddosageform，scale-upandpostapprovalchanges：chemistry，manufacturingandcontrols；invitrodrugtransporttestingandinvivobioequivalencedocumentation]原则为基础的方法进行比较。
评估了总共六种制剂，各制剂均具有五个异维甲酸浓度(0.025、0.05、0.10、0.15和0.20％w/w)(各条件n＝6)，并与对比产品isotrex凝胶0.05％的结果进行比较。在本实验中共使用了两个批次的isotrex凝胶，两者均为六组重复。此外，一个批次的isotrex凝胶0.05％同时在一个亚组的室(n＝3)中作为对照测试，来评估批次方法变化性。采用以下参数：接收液：2％bruj于含0.01％bha的20％乙醇：80％pbs中；合成膜：硅酮；时间点：t＝0、1、2、3、4、6、7、8和24h；剂量：大于0.3g。
图5和图7示出，与isotrex凝胶0.05％(两个批次，f0892和f1311)相比的、各种异维甲酸浓度的本发明制剂中药物的运送。对于评估的所有制剂，在给药后1h观察到异维甲酸跨硅酮膜的稳态运送。图6和图8重点示出，与isotrex凝胶0.05％相比，各异维甲酸浓度的所测试原型制剂在1-8h(表示为√时间，如supac指南中推荐的)的稳态药物运送。所计算的所有制剂中异维甲酸跨硅酮运送的速率(μg/cm2/√h)示于表2和表3。
表2
表3
这些结果的统计分析表明，与isotrex凝胶0.05％相比，所有的原型凝胶制剂均表现出令人惊讶的且显著的(p≤0.05)的更好的异维甲酸运送速率，除ssa37(0.025％)外。对于包含0.1、0.15和0.2％异维甲酸的peg软膏而言，药物的运送与使用isotrex凝胶0.05％相似(p＞0.05)。相对而言，相比于包含0.025和0.05％异维甲酸的peg软膏剂，发现isotrex凝胶提供更好的运送，如果考虑到isotrex凝胶主要包含乙醇，乙醇的蒸发引起药物热动力活性，从而流量在实验期间增加，上述结果并没有令人惊讶。
实施例2：体外渗入和穿透评估
在完成运送实验后，按照以下进行皮肤表面和皮肤层异维甲酸的定量。
通常而言，体外皮肤渗入实验会涉及扩散室的使用，扩散室设计成模拟皮肤的原位生理和解剖条件。在本实验中用到的模型是图1中提及的franz扩散室(其中合成膜替代为人的取皮得到的皮肤)。皮下脂肪机械性地移除，皮肤用nouvagtcm3000切割机取皮，取皮厚度为400±100μm。人的取皮皮肤放置在franz室的供体和受体隔间之间，角质层向上(图1)。对于每种活性制剂，每皮肤供体(3个供体)每制剂最多进行4组重复；然而，安慰剂制剂仅进行一组重复(n＝1)。
表4列出peg软膏制剂，相对于各个选用于最初渗透研究的可能的渗透促进剂选择渗透促进剂组成，以peg软膏剂的％w/w表达，以圆圈示出，表明选择用于体外渗入和渗透实验的渗透促进剂。
表4
在体外皮肤渗透实验中采用以下参数：
·接收液：2％bruj于含0.01％bha的20％乙醇：80％pbs中；
·时间点：t＝0、6、24和48h；
·膜：厚度为400±100μm的人的取皮皮肤(来自三个不同供体)；
·剂量：～10mg/cm2。
采用以下程序：采用franz扩散室，平均表面积为约0.6cm2，体积为约2.0ml。首先，在给药前，皮肤的完整性评估如下：(a)将取皮皮肤(来自三个供体)放置在供体隔间和接收隔间之间，且多个室用
第二，在皮肤完整性测试之后，从各个隔间中除去pbs溶液，且向可接收的接收隔间注入接收液(2％bruj于含0.01％bha的20％乙醇：80％pbs中)。之后，各个室在给药前平衡至少30分钟，确保膜温度为32℃(水浴温度37℃)。第三，使用正替换(positivedisplacement)移液枪将制剂(～8mg)施加到1ml注射器的活塞。将制剂(6-7mg)施加到皮肤表面，并用活塞在扩散区域铺开。在施加前和后，记录活塞的重量，计算每个室的量。第四，在以下时间点t＝0、6、24和48h除去接收液(200μl)，并转移到hplc瓶中，使用hplc分析。第五，使用新鲜预热的接收液(200μl)来替换各个时间点除去的接收液。第六，在最后的时间点(48h)后，拆开franz室，从皮肤回收药物。
皮肤表面的异维甲酸回收如下：(i)在从franz室拆开供体隔间后，用一个干的棉拭子来除去皮肤表面任何的残余制剂，并将拭子放置在7ml管中；(ii)将第二个拭子浸到提取稀释剂(90∶10-乙醇∶水)中并用于擦拭皮肤表面；该拭子在之后放置到含有第一个拭子的管中；(iii)使用最后一个干拭子来擦拭皮肤表面，并放置到包含另两个拭子的玻璃管中；(iv)皮肤表面的最初的胶带条(tapestrip)(使用
使用以下程序从角质层回收异维甲酸：(i)取得总共五个来自皮肤表面的胶带条(使用
如以下详细说明的，留下的表皮和真皮处理如下：(i)通过60摄氏度干热2分钟，将余下的表皮(在使用5个胶带条除去角质层后)从真皮热分离；(ii)将表皮和真皮层放置在各个玻璃管中，并向这些管加入2ml的提取稀释剂(90∶10-乙醇∶水)；(iii)将步骤(ii)的管在定轨摇床上于常温震荡至少16-20h；(iv)在提取步骤(步骤(iii))后，提取稀释剂从管中移除，并于13,000rpm离心10min，以除去所有未溶解的材料和颗粒；以及(v)上清液放置在hplc管中，用于hplc分析。
数据解读如下：(i)数据手动录入excel表格中。在接收液以及皮肤层中检测到的异维甲酸含量由各个校准标准计算得出；(ii)计算每取样体积的异维甲酸总量(μg)(总量/取样体积＝μg/mlx取样体积)；(iii)之后计算在各个时间点回收的异维甲酸的总量(总量＝μg/mlx各个franz室的总体积)；(iv)通过将各个时间点的总量(μg，步骤(iii))与各个之前时间点的总回收量(步骤(ii))相加，来计算异维甲酸的累计量(μg)；(v)通过将累计量(μg，步骤(iv))除以扩散面积来计算每单位面积的异维甲酸累计量(μg/cm2)(μg/cm2＝累计量(μg)/扩散面积)；(vi)根据内部过程拒绝任何异常值；(vii)所有制剂的异维甲酸跨硅酮膜的运送速率计算为图表“每cm2药物渗透累计量vs.√t(根据supac指南所建议的)”的线性部分的斜率；以及(viii)计算在各皮肤基质中的异维甲酸总量(总量＝μg/mlx提取稀释液)。
使用社会科学统计包(spss)版本19.0(spssinc.，usa)来进行数据统计分析。进行该类分析来确定从各测试制剂以及对比产品释放的异维甲酸量的任何显著差异。此外，还进行统计分析来分辨在48h时，与isotrex凝胶0.05％相比，从各测试制剂的表面、角质层、表皮和真皮以及接收液回收的药物量的显著差异。
除对比产品(isotrex凝胶0.05％)外，选择共15种制剂进行渗入和渗透分析。图9示出在t＝0h向皮肤表面施用所有制剂后，在6、24和48h时跨皮肤渗透到接收液中的药物量。图13示出，与isotrex凝胶0.05％(批次f0892)相比，所有测试的原型制剂在五种异维甲酸浓度的药物渗透情况(使用三个供体的人皮肤)。图10突出了渗透到皮肤层和接收液中的异维甲酸量，不包括从皮肤表面回收的药物量(残留的制剂)。渗入数据的分析示出，对于大部分的测试制剂，在6和24h时，接收液中回收的药物量低于loq。当药物配制为patpo3af0.025％、patpo3h0.10％、patpo50.15％、patpo3ag0.15％、patpo3ao0.20％、ssa360.05％、ssa310.15％和ssa240.20％时，观察到上述趋势的例外，在这些制剂中，在接收液中检测到的异维甲酸量高于loq(图9)。在施用制剂后48h后在接收液中回收药物，不包括patpo3n0.05％、patpo3ai0.10％。
渗透数据的分析示出，作为大体的趋势，施用所有测试制剂后从皮肤表面回收到最高量的异维甲酸，回收的异维甲酸的最高量为4.78±0.66μg(ssa24，0.20％)。异维甲酸到表皮层(药物的作用部位)的最高递送在施用patpo50.15％(0.29±0.10μg)、patpo60.20％(0.29±0.09μg和patpo3an0.20％(0.28±0.10μg)时观察到，与isotrex凝胶0.05％(0.03±0.01μg)相比，这些制剂提供的异维甲酸量为将近10倍且显著更高(p≤0.05)。
与真皮回收的异维甲酸量相关的数据分析表明，进入皮肤层药物最高量的制剂为patpo3an0.20％(0.54±0.15μg)和patpo3ao0.20％(0.47±0.12μg)，再次发现其与isotrex凝胶0.05％(0.0±0.01μg)相比，提供的异维甲酸量为将近10倍且显著更高(p≤0.05)。角质层回收的最高异维甲酸量在施用对比产品isotrexgel(0.64±0.25μg)后观察到，其次为ssa24(0.58±0.09μg)和patpo60.20％(0.44±0.10μg)。
有趣的是，在实施例1提及的，异维甲酸跨硅酮从patpo3an和isotrex凝胶运送的差异(图3)，与图4所示的到皮肤的运送，并没有呈现出相似的关系，其中在施用patpo3an后观察到渗透入皮肤层(表皮和真皮)的异维甲酸百分比(当表达为％施用剂量时)有2-3倍的增加。当数据表达为渗入到皮肤或跨皮肤渗透的累计量时(μg/cm2)，与isotrex凝胶相比，从patpo3an到表皮和真皮层的异维甲酸递送的增强为将近10倍。patpo3an的药物递送模式似乎是独特的，即药物的递送似乎靶向病理部位(表皮/真皮)(尽管乙醇量很低)，不像isotrex凝胶具有更加典型的模式，即递送集中于角质层(图3)。因此，patpo3an提供独特的靶向真皮递送系统，尽管其阻止全身性递送。
实施例3：稳定性评估
在完成渗入/渗透实验后，在含有0.025％和0.2％w/w异维甲酸的patpo3an制剂上进行加速稳定测试，如表5中列出的，x＝异维甲酸检测和相关物质、视觉外观、显微观察和显现的ph，a＝备份。
表5
将密封容器中含有0.2％w/w异维甲酸的patpo3an代表性批次于2-8℃(在此温度下的异维甲酸稳定性仅在4周时测试)、25℃和40℃储存4周，并然后在t＝2周和t＝4周时用hplc测试，n＝3个重复。对patpo3an安慰剂进行测试，以用作基线对比。结果显示在图11和图12中，其分别提供与安慰剂比对的在t＝0和t＝4周时2-17分钟的含有0.2％w/w异维甲酸的patpo3an的代表性色谱图。
此外，基于物理稳定性实验(例如，在制备后评估前于25℃存储最多5周(在2-8℃和25℃之间有两个冻融循环)；离心测试范围为2-16分钟的离心)，相比于含更高乙醇含量的相当制剂，含有0％-2％w/w乙醇的制剂在离心测试期间显示出惊人的改善的物理稳定性(对脱水收缩的易感性降低)。同时，相比于用peg4000制备的相当制剂，具有peg3350的制剂显示出改进的物理稳定性(对脱水收缩的易感性降低)。
在8％丙三醇和15％丙三醇制剂的对比中，丙三醇似乎会改善物理稳定性而含有丙二醇的制剂的脱水收缩发生的程度更高。在此，在离心12-15分钟后，仅观察到很小的液滴，且可以通过在制剂表面放置玻璃移液管而从主制剂上区分出来。
实施例4：体内评估
为评估本文制剂的毒性，对小型猪(susscrofa)每天施用三个浓度的patpo3an，作为局部软膏剂，持续90天，之后为28天的恢复期。此外，评估patpo3an的毒性动力学(“tk”)特征。
四十八(48)只hanford小型猪分成5组，在主组中，每组每个性别4只，在载体组和高剂量组还有每组每个性别两只额外的动物用于恢复组。组1-5分别为模拟处理(sham)、载体、低剂量(0.1mg/kg)、中剂量(0.2mg/kg)和高剂量(0.4mg/kg)组。将0.2g/kg的剂量施用于各动物的单一部位，且足以以patpo3an薄层来均匀覆盖整个10％体表面积。位点的尺寸大小(对于每只动物为约10％的总体表面积)是基于以下公式：
10％总体表面积(cm2)＝9.5x[bw(克)]2/3x0.10
用各性别的平均体表面积来确定各实验动物的约10％体表面积。在-3至-1天，给药部位用电动剪毛器剪毛(40号或更细的刀片)，且至少给药部位的角落用永久性记号笔标记。在实验期间，根据需要，给药部位再剪毛和再标记。给药部位的尺寸大小在实验期间根据需要调整。在各次给药之前，用水浸泡的纱布清洗给药部位，并用干纱布擦干。在每天给药前，含有当天要用的测试件和载体的管子震荡至少5分钟。每天用合适的载体或测试件对动物给药(按照体重)，载体或测试件原位保持24±2小时。
动物每天进行局部处理，持续90天，之后为28天的恢复期。在指定的时间点，收集血样进行毒性动力学(“tk”)分析。在第91天，主组中的动物进行尸检，并收集组织，之后在第118天对恢复组动物进行相似处理。
通过物理检查、临床观察、体重、体重变化、给药部位draize评分、临床病理(血液学、凝结物、血清化学物和尿分析)、心电图、眼科学、肉眼病理学、器官重量和组织病理学来分析动物的毒性症状。毒性动力学特征在实验的第1天和第90天评估。
实验设计、评估参数和tk样本收集方案分别列在表6、7和8中。
表6：实验设计
实验第1天对应于给药第一天
a制剂密度＝1.068g/ml
表7：评估参数和时间间隔
表8：tk血液收集方案
将血液样本收集在含有抗凝剂k2-edta的管中。通过于4℃在～3000rpm离心约15分钟来制备血浆样本。所有的血浆样本全部放入一个容器内并在干冰上冷冻。血浆样本在约-70℃冰箱中储存直至用干冰运送到分析实验室进行分析。所有动物的所有样本根据表8在第1天和第90天收集。组1和组2仅给药后2小时的样本用于第1天和第90天的异维甲酸和维甲酸分析。组3-5的所有样本都用于第1天和第90天的异维甲酸和维甲酸分析。
用于该评估的动物、动物房和环境条件列于表9。
表9：动物、动物房和环境条件
在适应期、第1-90天的给药前，进行一次详细的临床观测，在第91-118天每天一次详细的临床观测。在适应期、第1-7天的每次给药前，对给药位点进行一次皮肤刺激性观察和评分，在之后每周进行一次上述观测和评分，直至实验结束。使用修改过的draize评分体系(表10)对给药位点的局部发现进行评分，来确定炎症程度(红斑和浮肿)。
表10：draize评分体系
在适应期(主组和恢复组)、主组实验结束前、以及恢复组实验结束前，进行眼科检查。有执业证书的兽医眼科医生进行所有眼部检查。检查包括但不限于，结膜、眼角膜；、前房、虹膜、水晶体、玻璃状液、视网膜、和眼底。在检查前施用合适的扩瞳剂。
在适应期(主组和恢复组)、主组实验结束前、以及恢复组实验结束前，在所有实验动物身上进行心电图(ecg)。将动物的附上电极的部分的毛剪掉并在放置电极前用凝胶润湿。根据心电图机器制造商的说明来附上合适的电极，设置与常用兽医程序一致。以25mm/sec和50mm/sec的纸速收集标准导联i、ii和iii的记录，对于每一记录，将三个波群最小化。ecg记录时间为20-60秒，25mm/sec，以评估心律不齐，并出于p-qrs-t波形测量的便利性，以50mm/sec进行简单追踪。ecg数据提交给有执业证书的兽医眼科医生，以解读定性参数(即，节率、导电的异常等)和定量数据，包括但不限于，hr、rr、pr、qrs、qt和qtc间隔。
对于临床病理，在适应期(主组和恢复组)、主组实验结束前、以及恢复组实验结束前(主组和恢复组)，由实验动物收集血样，以进行临床病例测试。
将血样(～2ml/动物)收集在含有抗凝剂k2-edta的管中。样本储存在湿冰或～4℃冰箱中，直至分析。血液学分析包括：
将血样(～1.8ml/动物)收集在含有柠檬酸钠(3.2％)的管中。通过4℃在～3000rpm离心～15分钟离心，制备血浆。血浆临时储存在湿冰或～4℃冰箱中，直至分析。凝结分析包括：
对于血浆化合物，将各动物的血样(～2ml/动物)收集在不含抗凝剂的管中。血在4℃在～3000rpm离心～15分钟离心前可以凝结，将血浆收集到聚丙烯冷冻管中。血浆临时储存在湿冰或～4℃冰箱中，直至分析。血浆化合物分析包括：
使用代谢笼室温过夜收集尿液(～2ml)。将样本放置在不含抗凝剂的无菌红顶管中，并存储在湿冰或～4℃冰箱中，直至分析。样本分析以下参数：
在预约解剖时，将以下器官(如果在的话)称重，成对的器官一起称重。计算相对的器官重量(器官-体重以及器官-脑重)比。
将所有动物的以下组织(如果在的话)保存在10％中性缓冲福尔马林(除非特别写明)中：
*眼睛和睾丸分别固定在davidson’s和修改的davidson’s中1-3天，然后存储在70％乙醇中
**收集大的损伤处；
***骨髓涂片固定在甲醇中，并保存用于评估，评估由实验主管进行，并与实验的病理学家和资助者磋商。
所有保存的组织递交给组织科学研究实验室(histo-scientificresearchlaboratories，hsrl)。主组和恢复组动物的保存组织包埋在石蜡中，切片，并用苏木精和伊红染色，并通过有执业证书的兽医病理学家进行显微镜检。对大的损伤处也进行显微镜检。在组织病理评估后，所有制备的切片、保持湿润的组织、基因片段和原始数据均返回存档。
向小型猪总体表面积的10％每天局部(经皮)施用一次patp03an，持续90天，最高剂量0.4mg/kg/天，在致死性、非经皮临床观测、体重增加、眼科或心电图检测、血液学、血浆化合物或尿液检测参数或器官重量方面没有引起明显毒性效果。对于任一动物均不存在意外的死亡或显著的致死性。观察到的经皮效果与局部施用类维a的已知特性一致。
血浆异维甲酸/维甲酸参数的分析示出，在单次patp03an施用后异维甲酸全身性暴露极少，维甲酸暴露大于异维甲酸暴露。在反复的patp03an经皮施用后，异维甲酸暴露在中等剂量水平(0.2mg/kg)进入停滞期。异维甲酸累积是明显的，但是没有相关的维甲酸暴露增加。识别出0.4mg/kg/天的全身性无明显损害作用水平(“noael”)(与44.3hr*ng.ml的第90天异维甲酸auc值相关)。
实施例5：其他制剂
表11列出四种异维甲酸为0.2％w/w的制剂和两种异维甲酸0.6％w/w的制剂，这些制剂在本文中评估，并于对比产品isotrex凝胶0.05％的结果比较。不像具有超过95％乙醇的isotrex凝胶，这六种制剂没有或含有低得多的乙醇浓度(例如，2％)。此外，六种制剂中的五种(etoh2％/peg3350；patpo3peg仅1450-b的；patpo3f-d，5％丙三醇，peg3350；etoh2％/peg3350；以及patpo3peg仅1450-b的)不包含水。
表11
图14和图15示出使用表11所列的六种制剂与对比产品isotrex凝胶0.05％相比的结果，使用与实施例2相同的体外皮肤渗入和渗透实验参数、过程和数据计算。然而，用于这些实验的取皮皮肤来自第四个供体。如图14所示，对于任一所测试制剂，在t＝0和6小时时间点，在接收液中没有发现异维甲酸。然而，在24小时后，对于测试制剂，包括isotrex和patpo3an，在接收液中发现极少量的异维甲酸。这些结果显示出与图9结果相比更高的渗透性，表明接收液在48小时前没有异维甲酸。这可能是因为第四供体的渗透性要高于之前评估(并讨论)中用的三个供体。同时参见图17，其分别示出patpo3an(0.2％)和isotrex(0.05％)的两组皮肤渗透数据的比较，基于第四供体的左边第一和第三数据组显示出比基于三个之前供体的左边第二和第四数据组更高的渗透性。
图16示出，以下的制剂相比于isotrex凝胶表现出未预料到的、极好的异维甲酸对表皮和真皮的递送，即patpo3an；etoh2％/peg3350；patpo3peg仅1450-b；和patpo3f-d，5％丙三醇，peg3350。这些制剂的乙醇浓度低得多，或没有乙醇，这与isotrex凝胶中超过95％的乙醇形成强烈对比。制备为0.6％w/w的制剂似乎并不比0.2％w/w的制剂递送更多的异维甲酸。因此，本文公开的新制剂对表皮和真皮显示出出乎预料的极好的异维甲酸递送，且这样的递送效率不是简单地为增加制剂中异维甲酸含量的结果。事实上，图15证实了，对于0.6％w/w异维甲酸制剂，大量的异维甲酸留存在皮肤表面(参见，例如图15：etoh2％peg3350(0.6％)和patpo3peg仅+peg1450b(0.6％))。
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