本发明涉及包含流感病毒抗原的口腔内给药用疫苗药物组合物。特别是本发明涉及流感病毒抗原的稳定性优异、贮藏和操作等的便利性优异的口腔内给药用疫苗药物组合物及其制造方法。
背景技术：
流感是由流感病毒导致的急性感染症的一种。感染流感病毒直到流感发病为止的潜伏期通常为1～2天。发病时除了出现38度以上的发热、全身倦怠感、头痛、关节痛、肌肉痛等的全身症状之外，还会出现喉咙疼痛、咳嗽、流鼻涕等的症状。通常在1周之内恢复。当高龄者、婴幼儿、孕妇、呼吸器官系统、循环器官系统具有慢性疾病的患者、糖尿病患者、慢性肾功能衰竭患者等发病时，有时会引起肺炎、支气管炎等的并发症，有时严重的还会导致死亡。另外，流感在短期集中地流行，因此有时具有社会影响、产生经济损失。
为了防止流感的重症化，流感疫苗的给药是最有效的方法。流感疫苗制剂通常是以注射剂、滴鼻剂的形式使用的液体制剂。
然而，在将流感疫苗液体制剂流通时，为了防止流感疫苗的失活，需要在流通和保存的所有工序中进行低温管理(所谓的冷链：coldchain)。流感根据地区不同而时期不同，在全世界流行，在低温管理困难的国家、地区维持流感病毒抗原的活性的同时使其流通是很困难的。
另外，目前可以利用的流感疫苗大致分为活的弱毒化流感疫苗和灭活流感疫苗。进而，灭活流感疫苗分为如下3种：(1)用福尔马林等灭活的全粒子病毒、(2)使用有机溶剂、表面活性剂将病毒粒子粉碎，使脂质包膜可溶化的片段疫苗、(3)使血凝素(ha)和神经氨酸苷酶(na)纯化而得到的的亚单位疫苗。其中，目前市售的流感疫苗有片段疫苗和亚单位疫苗这2种。任意的疫苗通常均使用有机溶剂、表面活性剂将病毒粒子粉碎，根据种类对病毒蛋白进行分离或纯化来制备。
然而，流感病毒粒子的甾醇含量高，通常是稳定的，但将病毒粒子粉碎，去除病毒粒子的脂质物质，对病毒蛋白进行分离或纯化时，会出现在保存期内效价经时降低等问题。由此可认为片段疫苗和亚单位疫苗未必是稳定的，因此为了维持流感病毒抗原的活性，需要在流通和保存的全部工序中进行低温管理。
作为用于克服这样的流感疫苗液体制剂的缺点的方法，尝试制成干燥制剂的形态。
专利文献1中公开了将流感病毒与增稠剂一起进行喷雾干燥来制造颗粒。专利文献2中公开了将抗原与各种添加剂一起进行喷雾干燥来制造粉体。专利文献3中提出了：通过对包含作为稳定化剂的蔗糖、作为粘结剂的葡聚糖、作为赋形剂的黄原胶的溶液进行冷冻干燥，而使作为流感活疫苗的弱毒化流感病毒的活性稳定化的药物组合物。
专利文献4中提出了：通过对包含疏水性氨基酸(苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)和精氨酸盐酸盐作为稳定化剂的溶液进行冷冻干燥，而使流感ha疫苗的活性稳定化的药物组合物。
季节性流感疫苗是每年变更流行型的疫苗，含有3价(a型2种和b型1种)或者4价(a型2种和b型2种)的流感病毒抗原的混合型是主流。然而，根据病毒型不同氨基酸序列、立体结构不同，因此在现有的疫苗制剂化技术中，难以将多个流感病毒抗原以1个药物组合物的形式稳定地贮藏。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/058156号
专利文献2：国际公开第2002/101412号
专利文献3：国际公开第2002/013858号
专利文献4：日本专利第5388842号公报
技术实现要素：
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供能够稳定地贮藏流感病毒抗原的口腔内给药用疫苗药物组合物、以及该药物组合物的制造方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过组合特定的赋形剂、二糖和氨基酸，从而使流感病毒抗原在药物组合物中能够稳定地贮藏，以至完成了本发明。
本说明书中“能够稳定地贮藏”是指：在干燥制剂的制造工序中，不会发生干燥制剂中所含的流感病毒抗原的活性降低而发挥高的活性，而且即使在不严密地进行低温管理的情况下保存，也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性。
即，本发明为一种口腔内给药用疫苗药物组合物，其特征在于，其含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖和氨基酸。
上述赋形剂优选为选自由葡聚糖、羟丙基纤维素和羟丙甲基纤维素组成的组中的至少1种。
上述二糖优选为选自由海藻糖、异麦芽酮糖醇、蔗糖、麦芽糖、蜜二糖、帕拉金糖和乳果糖组成的组中的至少1种。
上述氨基酸优选为选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、甘氨酸和它们的盐组成的组中的至少1种。
上述口腔内给药用疫苗药物组合物优选为干燥制剂的形态，干燥制剂优选为片剂。
另外，上述赋形剂优选包含葡聚糖，相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，葡聚糖的含量优选为30～95质量％。
上述氨基酸优选包含选自由精氨酸和它们的盐组成的组中至少1种，相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，选自由精氨酸和它们的盐组成的组中至少1种的含量优选为1～19质量％。
另外，上述氨基酸的盐优选为无机盐，无机盐优选为盐酸盐。
本发明的口腔内给药用疫苗组合物中，流感病毒抗原优选为灭活抗原，上述灭活抗原优选为片段疫苗抗原或亚单位疫苗抗原。
另外，上述流感病毒抗原优选为包含多个抗原的多价抗原。
另外，本发明还是一种口腔内给药用疫苗药物组合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括如下工序：得到含疫苗制剂溶液的工序，所述含疫苗制剂溶液包含流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂；以及、干燥工序：使上述含疫苗制剂溶液干燥。
而且，本发明还是一种口腔内给药用疫苗药物组合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括如下工序：得到包含流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液的工序；使上述含疫苗制剂溶液干燥的工序，上述含疫苗制剂溶液利用冷冻干燥法进行干燥，上述含疫苗制剂溶液被调节成：相对于该含疫苗制剂溶液的质量含有5质量％以上上述赋形剂，并且相对于固体成分的质量上述赋形剂为30质量％以上。
以下对本发明进行详细说明。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物含有流感病毒抗原。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中，对于上述流感病毒抗原中使用的流感病毒没有特别限定，例如可列举出：a型流感病毒株、b型流感病毒株等。上述流感病毒抗原优选包含a型1种以上和b型1种以上的2种以上的流感病毒抗原。特别优选包含a/h1n1型、a/h3n2型、b型(山形系统)、b型(维多利亚系统)和b型(布里斯班系统)中任一种以上的流感病毒抗原。
作为上述流感病毒抗原没有特别限定，可以使用活病毒或灭活抗原。其中，上述流感病毒抗原优选为灭活抗原，作为上述灭活抗原，可以使用灭活全粒子病毒、片段疫苗抗原或亚单位疫苗抗原，优选为片段疫苗抗原或亚单位疫苗抗原、更优选为片段疫苗抗原。
作为上述片段疫苗抗原或亚单位疫苗抗原的制备方法没有特别限定，例如可列举出：利用鸡胚胎卵使病毒粒子增殖后，使用有机溶剂、表面活性剂将病毒粒子粉碎，根据种类不同对病毒蛋白进行分离或纯化来制备的方法等。
片段疫苗抗原的种类没有特别限定，例如可列举出：血凝素(ha)抗原、神经氨酸苷酶(na)抗原、基质(m1)抗原、基质(m2)抗原、核蛋白(np)抗原等。其中，从通过给予口腔内给药用疫苗药物组合物来获得有效的免疫以预防病毒感染的观点出发，优选包含作为病毒表面抗原的血凝素(ha)抗原。
本发明的口腔内给药用疫苗组合物中，流感病毒抗原优选为包含多个抗原的多价抗原。由于为多价抗原，从而能够对应于更多种类的流感病毒。
制造流感病毒抗原的方法没有特别限定，可以使用现有公知的方法。例如可以使鸡卵、细胞等感染从流感患者或流感感染动物中分离的流感病毒株并进行培养，由纯化的病毒原液来制造流感病毒抗原。另外，还可以将在各种细胞中产生重组病毒、特定的抗原的物质作为材料，基因工程地制造流感病毒抗原。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中，只要含有有效量的流感病毒抗原即可，例如，在本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中，作为有效成分的ha抗原的总量(质量)，优选在每次给药量0.01μg～1.0mg的范围内含有。低于0.01μg时，有时作为感染症的预防或治疗剂的功能不充分，超过1.0mg时，有时安全性成为问题。上述抗原含量的更优选的下限为0.1μg、更优选的上限为500μg。
本说明书中所谓的“抗原的质量”除了特别记载的情况之外，是指疫苗药物组合物中的抗原中所含的ha抗原蛋白的总质量。因此，抗原为来源于病毒等生物体的物质时，是指该抗原中所含的ha抗原蛋白的质量。另外，包含多种抗原时，是指其总质量。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物含有赋形剂、二糖和氨基酸。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物由于含有这些成分，因此即使在不严密地进行温度、湿度的管理的情况下来保存，也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性。
作为上述赋形剂，例如优选选自由葡聚糖、羟丙基纤维素和羟丙甲基纤维素组成的组中至少1种以上。
上述赋形剂是使上述流感病毒抗原的活性稳定化的物质，另外，从在干燥后发挥优异的成型效果以及具有流感病毒抗原活性的稳定化效果方面考虑，更优选葡聚糖。
相对于含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液的总质量，上述赋形剂的含量以总量的形式优选为1～30质量％、更优选2～20质量％、进一步优选5～20质量％。
上述赋形剂的总含量低于1质量％时，有可能在干燥后无法以药品的形式形成充分的剂型，另一方面，上述赋形剂的总含量超过30质量％时，有无法均匀地分散或者溶解在制剂溶液中而在制造上成为问题的担心。特别是，通过将上述赋形剂的含量的下限设为5质量％，从而能够以片剂的形式适宜地使用本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物。
另外，相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，上述赋形剂的总含量优选为30～95质量％、更优选40～85质量％。低于30质量％时有可能无法形成充分的剂型。
需要说明的是，上述赋形剂为葡聚糖时，相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，该葡聚糖的含量优选为30～95质量％。低于30质量％时，以片剂形式使用时有可能出现问题；超过95质量％时，由于稳定化剂的配混量相对降低，因此有可能无法得到充分的疫苗稳定性。
作为上述二糖，优选选自由海藻糖、异麦芽酮糖醇、蔗糖、麦芽糖、蜜二糖、帕拉金糖和乳果糖组成的组中至少1种以上。
上述二糖更优选为选自由海藻糖、异麦芽酮糖醇和蔗糖组成的组中的至少1种。这些二糖是使上述流感病毒抗原的活性稳定化的物质，另外，为了更好地溶解于溶剂中，可容易地添加至含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液中。
从吸湿性的观点出发，上述二糖进一步优选为选自由海藻糖和异麦芽酮糖醇组成的组中1种以上。
上述二糖特别优选为海藻糖。
相对于含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液的总质量，上述二糖的总含量优选为0.1～20质量％、更优选为0.5～10质量％。
上述二糖的总含量低于0.1质量％时，有可能在干燥后无法得到充分的疫苗稳定性。另一方面，上述二糖的总含量超过20质量％时，制剂溶液的粘性变得非常高，有在制造上成为问题的担心。另外，有时药物组合物的吸湿性变高、若在不严密地进行湿度管理的情况下保存则使流感抗原的活性降低。
相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，上述二糖的总含量优选为10～70质量％、更优选12～68质量％。
上述二糖的总含量低于10质量％时有可能无法得到充分的疫苗稳定性，超过70质量％时，有可能在片剂的成型性和使用方面出现问题。
上述氨基酸优选为选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、鸟氨酸、甘氨酸和它们的盐组成的组中的至少1种。这些氨基酸是使上述流感病毒抗原的活性稳定化的物质，另外，为了更好地溶解于溶剂中，可容易地添加至含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液中。
上述氨基酸更优选为l-型。
从不易黄变方面考虑，上述氨基酸进一步优选为选自由精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸、鸟氨酸和它们的盐组成的组中1种以上。
上述氨基酸进一步更优选为选自由精氨酸、精氨酸的盐、赖氨酸盐酸盐、脯氨酸、苏氨酸和鸟氨酸盐酸盐组成的组中的至少1种。原因在于：在干燥制剂的制造工序中不会发生干燥制剂中所含的流感病毒抗原的活性降低、而发挥高的活性，而且即使在不严密地进行湿度管理的情况下保存也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性。
上述氨基酸特别优选为选自由精氨酸、精氨酸的盐、脯氨酸、苏氨酸和赖氨酸盐酸盐组成的组中的至少1种。
而且，上述氨基酸特别优选为选自由精氨酸、精氨酸的盐和赖氨酸盐酸盐组成的组中至少1种，最优选为选自由精氨酸及其盐组成的组中的至少1种。通过使用精氨酸盐酸盐和/或赖氨酸盐酸盐、特别是精氨酸盐酸盐，从而能够使h1n1型和h3n2型的活性更有效地稳定化。由此，通过使用精氨酸盐酸盐作为上述氨基酸，从而能够稳定地维持稳定性不同的多种流感病毒抗原。
需要说明的是，本说明书中所谓的盐可以是任意的有机酸或无机酸的盐，优选为药学上允许的无机盐，其中，优选盐酸盐。
相对于含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液的总质量，上述氨基酸的含量优选为0.01～4质量％、更优选0.05～2质量％。
上述氨基酸的含量低于0.01质量％时，有可能在干燥后无法得到充分的疫苗稳定性。另一方面，上述氨基酸的含量超过4质量％时，有无法均匀地分散或者溶解在制剂溶液中而在制造上成为问题的担心。另外，有时药物组合物的吸湿性变高、若在不严密地进行湿度管理的情况下保存则使流感抗原的活性降低。
相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分的质量，上述氨基酸的含量优选为1～19质量％、更优选为1.5～18.5质量％。上述氨基酸的含量低于1质量％时有可能无法得到充分的疫苗稳定性。超过19质量％时，有可能在片剂的成型性和使用方面出现问题。
另外，上述氨基酸为选自由精氨酸及其盐组成的组中至少1种时，相对于口腔内给药用疫苗药物组合物的总质量，其含量优选为1～19质量％。低于1质量％时，有可能在干燥后无法得到充分的疫苗稳定性。另一方面，上述选自由精氨酸及其盐组成的组中至少1种的含量超过19质量％时，有无法均匀地分散或者溶解在制剂溶液中而在制造上成为问题的担心。另外，有时药物组合物的吸湿性变高、若在不严密地进行湿度管理的情况下保存则使流感抗原的活性降低。
需要说明的是，上述“含量”是指：在口腔内给药用疫苗药物组合物的固体成分中上述氨基酸为选自由精氨酸及其盐组成的组中至少1种所占的含量。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物优选含有免疫活化剂(佐剂)。
作为佐剂，例如可列举出选自由toll样受体4(tlr4)激动剂、toll样受体2/6(tlr2/6)激动剂以及环状二核苷酸或其衍生物或者盐组成的组中的至少1种。其中，优选tlr4激动剂。
作为上述tlr4激动剂，可适宜地列举出脂多糖或其盐。需要说明的是，本说明书中所谓的脂多糖除了脂多糖其本身之外，只要具有其性质就还可以是其衍生物或者改性体。
另外，上述脂多糖可以是从革兰氏阴性菌细胞壁中提取的提取物或其改性体，也可以是合成品。
作为上述革兰氏阴性菌，例如可列举出：醋酸杆菌(acetobacter)属、无色杆菌(achromobacter)属、嗜热酸菌(acidicaldus)属、嗜酸菌(acidiphilium)属、酸球形菌(acidisphaera)属、酸胞菌(acidocella)属、酸单胞菌(acidomonas)属、土壤杆菌(agrobacterium)属、亚细亚菌(asaia)属、芽孢杆菌(bacillus)属、别尔纳普氏菌(belnapia)属、布鲁菌(brucella)属、多形杆状菌(bacteroides)属、百日咳杆菌(bordetella)属、梭菌(clostridium)属、脆弱球菌(craurococcus)属、披衣菌(chlamydia)属、肠杆菌(enterobacter)属、埃希氏菌(escherichia)属、黄杆菌(flavobacterium)属、弗朗西斯菌(francisella)属、葡糖醋杆菌(gluconacetobacter)属、葡糖杆菌(gluconobacter)属、嗜血杆菌(haemophilus)属、柯扎克氏菌(kozakia)属、克雷白氏杆菌(klebsiella)属、利亚杆菌(leahibacter)属、勒克菌(leclercia)属、军团杆菌(legionella)属、甲烷袋状菌(methanoculleus)属、甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、微球菌(micrococcus)属、鼠球菌(muricoccus)属、奈瑟氏菌(neisseria)属、新亚细亚菌(neoasaia)属、嗜油单胞菌(oleomonas)属、泛菌(pantoea)属、邻单胞菌(plesiomonas)属、副脆弱球菌(paracraurococcus)属、假单胞菌(pseudomonas)属、卟啉单胞菌(prophyromonas)属、变形杆菌(proteus)属、拉恩菌(rahnella)属、红球状菌(rhodopila)属、玫瑰球菌(roseococcus)属、如比特皮达(rubritepida)属、沙门氏菌(salmonella)属、志贺氏菌(shigella)属、寡养单胞菌(stenortophomonas)属、糖杆菌(saccharibacter)属、沙雷氏菌(serratia)属、星状菌(stella)属、斯瓦米纳坦氏菌(swaminathania)属、弧菌(vibrio)属、副溶血弧菌(vparahaemolyticus)属、替考球菌(teichococcus)属、黄单胞菌(xanthomonas)属、耶尔森氏鼠疫杆菌(yersinia)属、发酵单胞菌(zymomonas)属、扎瓦尔金氏菌属(zavarzinia)属等。作为上述革兰氏阴性菌，优选列举出：埃希氏菌(escherichia)属、志贺氏菌(shigella)属、沙门氏菌(salmonella)属、克雷白氏杆菌(klebsiella)属、变形杆菌(proteus)属、耶尔森氏鼠疫杆菌(yersinia)属、弧菌(vibrio)属、副溶血弧菌(vparahaemolyticus)属、嗜血杆菌(haemophilus)属、假单胞菌(pseudomonas)属、军团杆菌(legionella)属、百日咳杆菌(bordetella)属、布鲁菌(brucella)属、弗朗西斯菌(francisella)属、多形杆状菌(bacteroides)属、奈瑟氏菌(neisseria)属、披衣菌(chlamydia)属、邻单胞菌(plesiomonas)属、卟啉单胞菌(prophyromonas)属、泛菌(pantoea)属、土壤杆菌(agrobacterium)属、寡养单胞菌(stenortophomonas)属、肠杆菌(enterobacter)属、醋酸杆菌(acetobacter)属、黄单胞菌(xanthomonas)属、发酵单胞菌(zymomonas)属等。
其中，更优选为埃希氏菌(escherichia)属来源、沙门氏菌(salmonella)属来源、泛菌(pantoea)属来源、醋酸杆菌(acetobacter)属来源、发酵单胞菌(zymomonas)属来源、黄单胞菌(xanthomonas)属来源或肠杆菌(enterobacter)属来源的菌。这些菌自古以来包含在多种食品、中药中，可确保对生物体的安全性，特别是泛菌(pantoea)属来源目前作为健康食品被使用，可认为是更有效的。还可以直接使用这些菌来源的提取物或其改性体。
作为脂多糖，在使用从上述革兰氏阴性菌细胞壁中提取的提取物或纯化的脂多糖时，通常需要考量对生物体的安全性，还可以作为对它们进行解毒而成的改性体来使用。另一方面，醋酸杆菌(acetobacter)属(醋酸杆菌：acetobacteraceti、木酸杆菌：acetobacterxylinum、东方醋酸菌：acetobacterorientalis等)、发酵单胞菌(zymomonas)属(运动发酵单胞菌：zymomonasmobilis等)、黄单胞菌(xanthomonas)属(野油菜黄单胞菌：xanthomonascampestris等)、肠杆菌(enterobacter)属(阴沟肠杆菌：enterobactercloacae等)、泛菌(pantoea)属(成团泛菌：pantoeaagglomerans等)自古以来包含在多种食品、中药中，可确保对生物体的安全性，还可以直接使用这些菌来源的提取物或其改性体。
作为脂多糖的衍生物，例如可列举出去除了其多糖部分的衍生物，具体而言，可列举出脂质a、单磷酰基脂质(monophosphoryllipid)a、3-脱酰化单磷酰基脂质a(3d-mpl)等。
作为去除了脂多糖的多糖部分的脂质a，还可以使用：上述革兰氏阴性菌来源的分离物、或者以与这些革兰氏阴性菌来源的分离物具有相同结构的方式合成的物质。
另外，作为脂质a的改性体，还可以适宜地使用进行了脱磷酸化的单磷酰基脂质或其盐或者衍生物。单磷酰基脂质的衍生物只要具有作为佐剂的性质就可以用于本发明中。特别是在医疗用途中作为免疫活化剂具有实际效果的3d-mpl、或美国专利申请公开第2010/0310602号说明书中公开的未经脱酰化的合成吡喃葡萄糖基脂质(glucopyranosyllipid)从对生物体的安全性的观点出发优选。
另外，作为上述单磷酰基脂质，还可以适宜地使用安全性和具有使用前例的沙门氏菌来源的单磷酰基脂质。
作为上述环状二核苷酸，优选环状二嘌呤核苷酸，只要具有其特性，就还可以是其盐或者衍生物。作为环状二嘌呤核苷酸，例如，从安全性方面考虑，可优选使用环状二鸟苷单磷酸的c-di-gmp、环状二腺苷单磷酸的c-di-amp。
对于上述佐剂的含量，例如为了对1个体进行1次给药，优选在本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中以0.1μg～100mg的范围含有上述佐剂。低于0.1μg时，有时无法得到充分的作为感染症的预防或治疗剂的效果；超过100mg时，有安全性的担心。上述免疫活化剂含量的更优选的下限为0.3μg、更优选的上限为50mg。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物除了上述赋形剂之外，在不损害本发明的效果的范围内还可以适量组合使用可食性高分子。
上述可食性高分子的配混量以本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物的总质量基准计优选为0.1～10质量％。
对于本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物，在其制造过程中即将进行干燥之前的含疫苗制剂水溶液的ph优选为5.0～9.0。通过使ph在该范围内，从而能够适宜地防止本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物的物理化学稳定性显著减少，确保安全性。更优选上述含疫苗制剂水溶液的ph为6.0～8.0。
为了适宜地发挥本发明的效果，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物优选为干燥制剂的形态。
本说明书中，干燥制剂是指含水率为15质量％以下。可认为，超过15质量％的情况下，在不严密地进行低温管理的情况下保存时，会出现变色、变形这样的性状的恶化、或者流感病毒抗原活性的降低。上述干燥制剂中，尤其将含水率为10质量％以下的干燥制剂称为低含水率干燥制剂。为了进一步适宜地发挥本发明的效果，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物优选为低含水率干燥制剂的形态。
需要说明的是，此处所谓的“含水率”是依据第十六版日本药典、通常试验法、干燥减重试验法(以下称为干燥减量试验法)求出的。即，利用在105℃、3小时的条件下对本发明的流感疫苗干燥制剂的试验片进行加热时的质量减少比例求出。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物即便在干燥制剂的制造工序中也不会发生干燥制剂中所含的流感病毒抗原的活性降低、而能够发挥活性，因此作为流感疫苗制剂是有用的，与现有的液体制剂相比，能够容易地操作。
而且，由于即使在不严密地进行低温管理的情况下保存也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性，因此与现有的液体制剂相比，能够容易地流通和保存。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物即使在例如0～50℃下保存也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性。上述保存温度的更优选的下限为2℃、更优选的上限为40℃。
作为制造本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物的方法，可列举出：对含有流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂的含疫苗制剂溶液进行干燥的方法。本方法中，在干燥工序中不会发生流感病毒抗原的活性降低，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物能够发挥流感病毒抗原的高活性。
本发明为口腔内给药用疫苗药物组合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括如下工序：得到含疫苗制剂溶液的工序，所述含疫苗制剂溶液包含流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂；以及、干燥工序：使上述含疫苗制剂溶液干燥。对于上述溶剂没有特别限定，可以使用水和任意的有机溶剂，但从安全性的观点出发优选水。
作为上述含疫苗制剂溶液中的上述流感病毒抗原的总含量，例如为0.01μgha/ml以上。上述含量低于0.01μgha/ml时，有时使流感疫苗干燥制剂的有效性降低。上述含量的更优选的下限为0.1μgha/ml。
上述含疫苗制剂溶液中的上述流感病毒抗原的含量的上限没有特别限定，从抗原的稳定性的观点出发优选为500μgha/ml以下。
对于使上述流感病毒抗原干燥的方法没有特别限定，流感病毒抗原对热不稳定，因此优选在非加热下进行干燥。
在上述非加热下进行干燥的方法没有特别限定，优选减压干燥法或冷冻干燥法、特别优选冷冻干燥法。对于冷冻干燥法没有特别限定，可以使用利用了现有公知的冷冻干燥装置的方法。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物还可以利用冷冻干燥法使上述含疫苗制剂溶液干燥，以片剂、膜剂或颗粒状制剂的形式使用，还可以使上述含疫苗制剂溶液减压干燥，以膜状制剂使用，还可以使上述含疫苗制剂溶液干燥后，进行混合、压片来以片剂的形式使用。其中，从稳定性方面考虑，优选为利用冷冻干燥法干燥的干燥制剂，从容易用于口腔内且操作性优异方面考虑，特别优选为片剂或膜剂。
通过上述冷冻干燥使上述含疫苗制剂溶液干燥的利用冷冻干燥法的方法也是本发明之一。
即，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物的制造方法的特征在于，所述方法包括如下工序：得到含疫苗制剂溶液的工序，所述含疫苗制剂溶液包含流感病毒抗原、赋形剂、二糖、氨基酸和溶剂；以及、干燥工序：使上述含疫苗制剂溶液干燥，上述含疫苗制剂溶液利用冷冻干燥法进行干燥，上述含疫苗制剂溶液被调节成：相对于该含疫苗制剂溶液的质量含有5质量％以上上述赋形剂；并且相对于固体成分的质量上述赋形剂为30质量％以上。
上述含疫苗制剂溶液的质量中的上述赋形剂低于5质量％时，有可能在干燥后无法得到充分的疫苗稳定性；有可能在以片剂的形式使用时出现问题；相对于固体成分的质量，上述赋形剂低于30质量％时，有可能在以片剂的形式使用时出现问题。
本说明书中“对象”是指人或动物(哺乳类、鸟类等)。
对于本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物，在向对象中的流感病毒抗原进行口腔内给药时发挥高的体液性免疫诱导效果。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物的给药路径包括任意的口腔内、例如舌下、舌上、舌后、颊侧，优选为舌下。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中，用于保存的容器没有特别限定，优选能密封的容器。例如可列举出：铝包装材料、发泡容器、冷冻干燥用小瓶等。
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物中，体液性免疫诱导效果可以通过使用了免疫评价用模型动物的免疫诱导实验和elisa法(抗原特异性igg和iga抗体)来测定。作为用于利用上述elisa法来测定体液性免疫的样品，可列举出免疫评价用模型动物的血清和鼻腔清洗液等。
发明的效果
本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物能够使流感病毒抗原稳定地贮藏在药物组合物中。优选的实施方式中，能够将热稳定性不同的多个流感病毒抗原稳定地贮藏在1个药物组合物中。
即，在干燥制剂的制造工序中不会出现干燥制剂中所含的热稳定性不同的多个流感病毒抗原的活性降低而发挥高的活性，而且，即使在不严密地进行低温管理的情况下保存，也能够稳定地维持热稳定性不同的多个流感病毒抗原的活性。
另外，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物还可以直接使用，或者在使用时溶解或分散在生理盐水、注射水等可以进行生物体给药的溶剂中来使用。
而且，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物在向对象中的流感病毒抗原进行口腔内给药时发挥高的体液性免疫诱导效果，因此通过以进行口腔内给药的剂型使用，从而具有如下优点：优异的应变性、例如非侵入式地给药、无痛、免受注射带来的恐惧、给药简便，因而患者可以自行给药，也能避免医疗从事者针刺感染事故的风险，进行反复给药时也能减少去医院看病的频率，从而能够提高患者的生活质量，不会产生注射针之类的特殊废弃所需要的医疗废弃物。而且，本发明的口腔内给药用疫苗药物组合物还具有如下优点：与注射给药相比能够诱导较强的粘膜免疫(iga抗体)。
附图说明
图1是示出实施例61～70的流感疫苗干燥制剂的小鼠鼻腔清洗液中抗原特异性iga效价的测定结果的图。
图2是示出实施例61～70的流感疫苗干燥制剂的小鼠血清中抗原特异性igg效价的测定结果的图。
图3是示出实施例71～80的流感疫苗干燥制剂的小鼠鼻腔清洗液中抗原特异性iga效价的测定结果的图。
图4是示出实施例71～80的流感疫苗干燥制剂的小鼠血清中抗原特异性igg效价的测定结果的图。
具体实施方式
利用以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于这些实施例。需要说明的是，本说明书中没有特别记载时，“质量％”是指以材料的总质量为基准的各材料的质量百分率(质量/质量％)。
制备用于稀释疫苗原液的磷酸缓冲液。具体而言，用900ml左右的纯化水溶解磷酸氢钠水合物(太平化学产业公司制)3.53g、磷酸二氢钠(太平化学产业公司制)0.54g和氯化钠(富田制药公司制)8.5g，然后，定容至1l而得到溶液。
使用表1所示的流感ha疫苗的系列株(均为阪大微生物病研究会制)制作了四价的混合疫苗溶液。混合各ha疫苗原液，用疫苗用磷酸缓冲液进行稀释以使各ha抗原的最终浓度分别为120μg/ml。将2012-2013系列株的疫苗溶液作为四价疫苗溶液a，将2013-2014系列株的疫苗溶液作为四价疫苗溶液b。
[表1]
＜各种添加剂的流感ha抗原的活性的稳定性评价＞
(试验例1)
如表2所示，向45质量％的纯化水中加入葡聚糖(dextran70、名糖产业公司制)5质量％，适宜搅拌并使其溶解。在其中加入50质量％四价疫苗溶液a，进行充分地混合，在室温下使其溶解。将得到的制剂溶液分注在冷冻干燥用小瓶中各0.25g，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。利用下述所示的方法对得到的流感疫苗干燥制剂刚制备后的活性进行了测定。
作为得到的流感疫苗干燥制剂的保管稳定性试验，利用下述所示的方法测定在40±2℃下保管2个月的各流感ha抗原的活性。将其结果示于表4。
＜单向辐射免疫扩散法(srid法)＞
以成为1质量％的方式将琼脂糖(amresco公司制)加入上述磷酸缓冲液中，加热并使其完全溶解。然后，温度降低至60℃左右后适量添加对应于流感ha抗原的抗血清并进行搅拌，倒入直径10cm的耐热性容器中，在室温下冷却使其固形化。用专用的穿孔机打开4×4个直径4mm的孔作为srid解析用凝胶。
用上述磷酸缓冲液溶解试验例、比较试验例、实施例和比较例的流感疫苗干燥制剂后稀释至期望的浓度，进而以成为最终浓度1％的方式加入表面活性剂(calbiochem公司制、商品名：zwittergent3-14detergent)，使其完全溶解。将其作为试样溶液。
作为标准溶液，使用流感疫苗原液制作了30μg/ml的流感ha抗原溶液。此时，以与上述试样溶液中所含的添加剂(制剂中使用的配混剂和表面活性剂)的最终浓度相同的方式加入至疫苗原液中，用上述磷酸缓冲液进行适宜稀释，使其完全溶解。同样地也制作了22.5μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml的流感ha抗原溶液。
将4个梯度的浓度的标准溶液和试样溶液以10μl/孔进行进样，在25℃的湿润的条件下使之反应18小时～24小时。
用滤纸夹住、进而用吸收性良好的纸夹住从容器中取出的srid凝胶，放上重石进行脱水。进而进行风干使其完全干燥。放入考马斯亮蓝(bio-rad公司制)染色液中进行适当时间的染色，移至脱色液中进行脱色直至得到适合的染色像为止。然后，在gelbondfilm(lonza公司制)上扩展srid凝胶，使其完全干燥。用imagej软件测量得到的沉淀圈(precipitatering)的面积。
基于标准溶液的浓度和得到的沉淀圈的面积值制作了校正曲线。测定试样溶液的沉淀圈的面积，基于校正曲线计算出流感ha抗原量。计算出得到的流感ha抗原量相对于基于表中所示的配混量计算出的理论流感ha抗原量的％，将得到的％以下述基准对流感ha抗原的活性进行了评分化。
5：90％以上～低于105％
4：75％以上～低于90％
3：60％以上～低于75％
2：45％以上～低于60％
1：30％以上～低于45％
0：低于30％
(性状评价法)
关于得到的流感疫苗干燥制剂，通过以下所示的基准进行了评价。评价了刚制备后的性状，然后利用与上述稳定性评价同样的方法在40±2℃下保管，在保管后再次进行了性状评价。
良好：使用上没有问题
不良：使用上有问题
(试验例2～8、比较试验例1～8)
按与试验例1同样的步骤，以表2和表3所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。需要说明的是，试验例2中使用海藻糖(海藻糖g、asahikaseichemicalsco.,ltd.制)、试验例3中使用异麦芽酮糖醇(galen801、beneopalatinit,inc.制)、试验例4中使用蔗糖(和光纯药工业公司制)、试验例5中使用精氨酸盐酸盐(kyowahakkobioco.,ltd.制)、试验例6中使用脯氨酸(kyowahakkobioco.,ltd.制)、试验例7中使用苏氨酸(kyowahakkobioco.,ltd.制)、试验例8中使用赖氨酸盐酸盐(kyowahakkobioco.,ltd.制)、比较试验例2中使用葡萄糖(和光纯药工业公司制)、比较试验例3中使用半乳糖(和光纯药工业公司制)、比较试验例4中使用果糖(和光纯药工业公司制)、比较试验例5中使用丙氨酸(和光纯药工业公司制)、比较试验例6中使用缬氨酸(和光纯药工业公司制)、比较试验例7中使用异亮氨酸(和光纯药工业公司制)、比较试验例8中使用亮氨酸(和光纯药工业公司制)。作为得到的流感疫苗干燥制剂的保管稳定性试验，在40±2℃下保管2个月，利用srid法测定各流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表4。
(试验例9)
向45质量％的纯化水中加入葡聚糖5质量％，适宜搅拌并使其溶解。向其中加入50质量％四价疫苗溶液b，进行充分地混合。将得到的制剂溶液0.25g分注在冷冻干燥用小瓶中，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。作为得到的流感疫苗干燥制剂的保管稳定性试验，在40±2℃下保管2个月，利用srid法测定了各流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表5。
(试验例10～16、比较试验例9～16)
按与试验例1同样的步骤，以表2和表3所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。作为得到的流感疫苗干燥制剂的保管稳定性试验，在40±2℃下保管2个月，利用srid法测定了各流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表5。
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
如表4和表5所示，试验例中所使用的添加剂，作为流感疫苗干燥制剂中的流感ha抗原的稳定化剂，显示出对于特定的流感ha抗原的稳定化效果，但并没有使全部流感ha抗原稳定化。
另外，在使用了含有赋形剂的添加剂的试验例中，赋形剂仅能使b/b型以评分4水平稳定化，但对于其它型的流感ha抗原仅能以评分2～3程度稳定化。
另一方面，在使用了含有二糖的添加剂的试验例中，二糖能使h1n1型、b型以评分4水平稳定化，但未能使h3n2型充分地稳定化。另一方面，在使用了含有氨基酸的添加剂的试验例中，精氨酸盐酸盐和赖氨酸盐酸盐能使h1n1型和h3n2型以评分4以上的水平稳定化，但未能使b型充分地稳定化。苏氨酸能使h3n2型以评分4的水平稳定化，但未能使h1n1型和b型充分地稳定化。脯氨酸未能使任意的流感ha抗原充分地稳定化。
而且，关于流感疫苗干燥制剂的性状，使用了含有赋形剂的添加剂的情况在使用上没有问题，但仅含有二糖、氨基酸的情况没有成型性，作为制剂使用时出现问题。
另一方面，比较试验例中所使用的二糖、氨基酸的添加剂作为流感ha抗原的稳定化剂表现出完全没有效果。
此外，作为二糖含有海藻糖的试验例2和试验例10中，与含有异麦芽酮糖醇或蔗糖的其它试验例相比，分别地，h3n2/v型和h3n2/t型的稳定性优异。
＜四价ha疫苗冷冻干燥制剂的稳定性评价＞
(实施例1)
向34质量％的纯化水中加入葡聚糖10质量％、海藻糖5质量％和精氨酸盐酸盐1质量％，适宜搅拌并使其溶解。向得到的溶液中加入50质量％四价疫苗溶液a，充分地进行混合。将得到的含疫苗制剂溶液分注在冷冻干燥用小瓶中各0.25g，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表8。
(实施例2～12、比较例1～11)
按与实施例1同样的步骤，以表6所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表8。
(实施例13)
向34质量％的纯化水中加入葡聚糖10质量％、海藻糖5质量％和精氨酸盐酸盐1质量％，适宜搅拌并使其溶解。向得到的溶液中加入四价疫苗溶液b50质量％，充分地进行混合。将得到的含疫苗制剂溶液分注在冷冻干燥用小瓶中各0.25g，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表9。
(实施例14～24、比较例12～22)
按与实施例1同样的步骤，以表7所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表9。
(实施例25～32、比较例23～32)
按与实施例1同样的步骤，作为赋形剂代替葡聚糖使用羟丙基纤维素(日本曹达公司制、商品名：日曹hpcssl)或羟丙甲基纤维素(信越化学工业公司制、商品名：tc-5e)，除此以外以表10所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表12。
(实施例33～40、比较例33～42)
按与实施例13同样的步骤，作为赋形剂代替葡聚糖使用羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素，除此以外以表11所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管6个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表13。
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
含有赋形剂、二糖和氨基酸的实施例1～40中，流感疫苗干燥制剂的性状和流感ha抗原的活性的稳定性良好。
另一方面，未使用赋形剂的比较例9～11和比较例20～22中，流感疫苗干燥制剂的性状不良，对于任意的型而言，保管2个月时观察到有流感ha抗原的活性的稳定性降低的倾向。
另外，未使用氨基酸的比较例2～4和比较例13～15中，流感疫苗干燥制剂的性状良好，但对于任意的型而言，保管2个月时观察到有流感ha抗原的活性的稳定性降低的倾向。
而且，未使用二糖的比较例5～8和比较例16～19中，性状良好，但对于任意的型而言，保管2个月时观察到有流感ha抗原的活性的稳定性降低的倾向。
由这些结果可知：赋形剂用于对流感疫苗干燥制剂赋予良好的性状是必须的；赋形剂有助于流感ha抗原的活性的稳定化；通过同时使用氨基酸和二糖而使流感ha抗原的活性的稳定性提高。
使用了赋形剂的实施例1～24中，与使用了其它二糖的实施例5～12和实施例17～24相比，作为二糖使用了海藻糖的实施例1～4和实施例13～16，保管4～6个月时的流感ha抗原的活性的稳定性特别良好。
另外，作为二糖使用了海藻糖的实施例中，使用了精氨酸盐酸盐的实施例1和实施例13与使用了其它氨基酸的实施例2～4和实施例14～16相比，使用h3n2型保管6个月时的流感ha抗原的活性的稳定性特别良好。
由这些结果可知：通过使用赋形剂、作为氨基酸的精氨酸盐酸盐、作为二糖的海藻糖，从而使流感ha抗原的活性的稳定性显著提高。
作为赋形剂，使用了羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素的实施例25～32和比较例23～32、以及实施例33～40和比较例33～42中也观察到同样的倾向。即，不使用氨基酸或二糖的这些比较例中，保管2个月时观察到有流感ha抗原的活性的稳定性降低的倾向。
另外，对于作为赋形剂使用了羟丙基纤维素或羟丙甲基纤维素的实施例25～32和实施例33～40，保管6个月时观察到有流感ha抗原的活性的稳定性降低的倾向。
与此相对，对于作为赋形剂使用葡聚糖、作为二糖使用海藻糖、作为氨基酸使用了精氨酸或赖氨酸的实施例1和实施例4、以及实施例13和实施例16，使用h1n1型、b/w型、b/b型保管6个月时，使其活性充分地稳定化。
特别是，对于作为氨基酸使用了精氨酸盐酸盐的实施例1和实施例13，使用h3n2型保管6个月时，也使其活性充分地稳定化。
由这些结果可知：通过使用作为赋形剂的葡聚糖、作为氨基酸的精氨酸盐酸盐、作为二糖的海藻糖，从而能使所有型的活性充分地稳定化。
实施例1～40和比较例1～42的流感疫苗干燥制剂均是利用干燥减重试验法测定的含水率为10质量％以下的低含水率干燥制剂。
(比较例43～48和实施例41～48)
按与实施例1同样的步骤，以表14所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表15和表16。
[表14]
[表15]
[表16]
＜添加剂的配混比研究＞
(实施例49～54)
按与实施例1同样的步骤，以表17所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表19。
(实施例55～60)
按与实施例1同样的步骤，以表18所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表20。
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
如表19和表20所示，制剂溶液中作为赋形剂的葡聚糖为5～20质量％时，冷冻干燥后得到的流感疫苗干燥制剂的成型性良好，流感ha抗原的活性的稳定性也良好。另外，稳定化剂的配混比相对于作为主要基材的葡聚糖，二糖为20％以上且氨基酸为2％以上时，流感病毒抗原的活性的稳定性良好。
实施例49～60的流感疫苗干燥制剂均是利用干燥减重试验法测定的含水率为10质量％以下的低含水率干燥制剂。
＜配混佐剂的四价ha疫苗冷冻干燥制剂的稳定性和免疫诱导评价＞
(实施例61)
向33.94质量％的纯化水中加入葡聚糖10质量％、海藻糖5质量％、精氨酸盐酸盐1质量％以及作为佐剂的、来源于成团泛菌(pantoeaagglomerans)的lpsnd002(日东电工公司制)0.06质量％，适宜搅拌并使其溶解。向得到的溶液中加入50质量％四价疫苗溶液a，充分地进行混合。将得到的含疫苗制剂溶液分注在铝包装材料中各0.25g，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表23。
而且，利用以下所示的方法实施了利用免疫评价用模型动物的免疫诱导试验，将其结果示于图1和图2。
通过口腔内给药的小鼠免疫试验
使用如上述那样制造的流感疫苗干燥制剂，进行了利用作为模型动物的小鼠的免疫诱导试验。首先，将流感疫苗干燥制剂溶解于纯化水3ml中，得到疫苗制剂溶液(流感ha抗原浓度：各抗原各5μg/ml)。接着，对预先准备的小鼠(balb/c小鼠、雌性7周龄)进行麻醉处理，然后将得到的疫苗制剂溶液20μl给药至小鼠舌下。另外，作为阳性比较例(pc)，制备与疫苗制剂溶液相同流感ha抗原和佐剂nd002浓度的溶液；作为阴性比较例(nc)，制备与疫苗制剂溶液相同流感ha抗原浓度的溶液，同样地进行了给药。
自该给药起1周后，再次对小鼠实施麻醉，分别同样地进行了给药。自第2次给药起再1周后，采集小鼠血清和鼻腔清洗液。血液在4℃下以3000g进行10分钟离心分离，向上清液20μl中加入磷酸缓冲液(nacalaitesque,inc.制)300μl作为血清样品。对于鼻腔清洗液，在小鼠的气管下部插入至切口，流入200μl的磷酸缓冲液(nacalaitesque,inc.制)，回收从鼻腔流出的样品，作为鼻腔清洗液样品。
通过测定小鼠血清中抗原特异性igg抗体，评价了全身性免疫应答。另外，通过测定小鼠鼻腔清洗液中抗原特异性iga效价，评价了粘膜免疫应答。
小鼠血清中抗原特异性igg效价测定方法(elisa法)
向elisa用96孔板中、将用碳酸缓冲液稀释的含流感ha抗原溶液(1.0μg/ml)以各抗原各100μl地分别添加至各自的孔板中，放置一夜。
接着，制作清洗液。具体而言，每1l蒸馏水加入9.6g的磷酸缓冲生理盐粉末(日水制药公司制、商品名：dulbecco'spbs(-)“nissui”)和0.5ml的聚氧亚乙基(20)单月桂酸酯(和光纯药工业公司制)并进行搅拌，使其充分地溶解。使用该清洗液对孔进行3次清洗，每孔各添加200μl用纯化水将封闭剂(blockace、大日本住友制药社制)稀释至4g/100ml而成的封闭溶液，在室温下放置2小时。然后，用清洗液对孔进行3次清洗。
将预先从小鼠中采集的血清以4℃、3000g进行10分钟离心分离，回收了上清液。使用用磷酸缓冲液(nacalaitesque,inc.制)将封闭剂稀释至0.4g/100ml而成的溶液，以每次2倍稀释的方式对前述上清液或者鼻腔清洗液进行梯度稀释，将该溶液分别以每孔50μl添加，在室温下放置2小时。
然后，用清洗液对孔进行3次清洗，通过用磷酸缓冲液(nacalaitesque,inc.制)将封闭剂稀释至0.4g/100ml而成的溶液将hrp标识抗小鼠igg抗体(羊抗小鼠iggfchrp、bethyl公司制)稀释至10000倍，每孔添加100μl，在室温下放置1小时。
然后，用清洗液对孔进行3次清洗，每孔添加100μltmb溶液(elisapodtmb试剂盒、nacalaitesque,inc.制)，在暗处放置30分钟。
然后，每孔添加100μl1m硫酸用液体，用微孔板读取器(spectramaxm2e、moleculardevices公司制)测定了该96孔板在450nm下的吸光度。以进行梯度稀释时的吸光度为基准，用log2求出小鼠血清中的igg抗体效价。
小鼠鼻腔清洗液中抗原特异性iga效价测定方法(elisa法)
基本上与抗原特异性igg效价测定方法同样，但测定样品为鼻腔清洗液，另外，代替hrp标识抗小鼠igg抗体使用了hrp标识抗小鼠iga抗体(羊抗小鼠igaαhrp、bethyl公司制)。除此以外的操作全部相同。
(实施例62～70)
按与实施例61同样的步骤，以表21所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的流感ha抗原的活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表23。
而且，利用elisa法实施了利用免疫评价用模型动物的免疫诱导试验，将其结果示于图1和图2。
(实施例71～80)
按与实施例61同样的步骤，以表22所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。其中，使用四价疫苗溶液b。将得到的流感疫苗干燥制剂在40±2℃下保管4个月，利用srid法测定了保管后的疫苗活性。另外，依据性状评价法对流感疫苗干燥制剂进行了评价。将它们用评分表示，将其结果示于表24。
而且，利用elisa法实施了利用免疫评价用模型动物的免疫诱导试验。将其结果示于图3和图4。
[表21]
[表22]
[表23]
[表24]
如表23和表24所示，含有赋形剂、二糖和氨基酸的本发明的流感疫苗干燥制剂即使在含有佐剂的情况下也能使四价的流感ha抗原的活性均稳定化。
实施例61～80的流感疫苗干燥制剂均是利用干燥减重试验法测定的含水率为10质量％以下的低含水率干燥制剂。
而且，如图1～4所示，发现：实施例61～80的流感疫苗干燥制剂即使为口腔内给药，也能够有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。
＜片剂制造时的添加剂的配混比研究＞
(实施例81～116)
按与实施例1同样的步骤，以表25所示的配混量制备溶液，进行冷冻干燥，得到流感疫苗干燥制剂。对得到的流感疫苗干燥制剂的触感和残留性进行了感官评价。将其结果示于表26。
表25中，“hpc-ssl”是羟丙基纤维素(日本曹达公司制、商品名：日曹hpcssl)，“hpmc”是羟丙甲基纤维素(信越化学工业公司制、商品名：tc-5e)。
需要说明的是，“触感”是指用手捏流感干燥制剂时的感触，另外，“残留性”是指在取出流感干燥制剂后目视观察附着于包装材料上的残留物时有无固体成分。触感“硬”时，流感干燥制剂的物理强度高，在作为干燥疫苗制剂的操作性方面而优选。另外，残留性“无”时，是指流感干燥制剂的固体成分全部保持固体制剂的形式，有效成分不会残留于包装材料。需要说明的是，关于各表的固体成分质量％，残留部分如上所述是缓冲液等的固体成分。
[表25]
[表26]
如表25和表26所示，赋形剂的含量在冷冻干燥前的溶剂(含疫苗制剂水溶液)的状态下为2质量％和4质量％的实施例81～86、93～98和105～110中，干燥制剂的触感为“柔软”或“非常柔软”；相对于此，赋形剂的含量在冷冻干燥前的溶剂(含疫苗制剂水溶液)的状态下为5质量％和7质量％的实施例87～92、99～104和111～116中，干燥制剂的触感为“硬”。另外，冷冻干燥制剂中的赋形剂的含量超过30质量％的实施例83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113和116没有附着，上述冷冻干燥制剂中的组成不在上述范围内的实施例81、82、84、85、87、88、90、91、93、94、96、97、99、100、102、103、105、106、108、109、111、112、114和115观察到附着。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种口腔内给药用疫苗药物组合物，其在干燥制剂的制造工序中不会发生干燥制剂中所含的流感病毒抗原的活性降低、而发挥高的活性，而且，即使在不严密地进行低温管理的情况下保存，也能够稳定地维持流感病毒抗原的活性。另外，根据本发明，提供能够该药物组合物的制造方法。