本发明属于生物医药领域，具体涉及3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的用途。
背景技术：
：组蛋白的乙酰化/去乙酰化修饰在基因表达调控中起重要作用。参与去乙酰化的酶除了经典的ⅰ类和ⅱ类hdac(组蛋白去乙酰化酶)外，还有ⅲ类hdac，即沉默信息调节因子2蛋白(silentinformationregulator2protein)或称sirtuin蛋白家族。sirtuin蛋白家族是一类依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、核心区域高度保守的蛋白去乙酰化酶和adp核糖基转移酶。哺乳动物有七种sirtuin蛋白，即sirt1、sirt2、sirt3、sirt4、sirt5、sirt6和sirt7，它们都具有高度保守的nad+结合域和催化功能域。这些sirtuin蛋白具有不同的亚细胞定位，其中，sirt1、sirt6和sirt7主要位于细胞核内；sirt3、sirt4和sirt5定位在线粒体中；而sirt2主要分布在细胞浆中。这些蛋白的亚细胞定位还取决于细胞类型、状态和分子间相互作用等，如sirt1和sirt2可在细胞核和细胞浆之间穿梭，并且与细胞核和细胞浆中的蛋白相互作用。在所有的sirtuin蛋白中，以sirt1和sirt3研究最为广泛。近年来，sirt2正成为一个新的研究热点。目前已鉴定出了sirt2的多种底物，包括组蛋白底物和非组蛋白底物。其中，组蛋白底物主要包括组蛋白h4k16、h3k18和h3k56，非组蛋白底物包括各种转录因子(如p300、foxo3、foxo1、hif-1α、nf-κb和pgc-1α)、细胞周期相关酶(如bubr1、cdk9和cdh1/cdc20)、代谢酶(如ldh-a、pepck、acly、g6pd和pgam)、细胞信号相关底物(如prlr、k-ras、par-3和tiam1)和结构蛋白(如角蛋白8、α-微管蛋白)等。随着多种底物的发现及研究，表明sirt2在调节相关生物过程中发挥着重要作用，也意味着sirt2的异常可能会引发多种疾病。事实上，一系列的研究已证明，sirt2与多种癌症(包括胶质瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、伯基特淋巴瘤和结肠癌和乳腺癌等)和神经系统疾病(包括亨廷顿病和帕金森氏病等)等的发生发展密切相关。因此，sirt2被认为是治疗这些疾病的一个潜在靶标，研发具有高选择性直接靶向sirt2的小分子抑制剂，是一条治疗这些疾病的有效途径。技术实现要素：本发明提供了3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的用途，具体为3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物及其盐或水合物，或含有它们的药物组合物在制备sirt2抑制剂、治疗或预防癌症的药物、治疗或预防神经变性疾病的药物中的用途。所述的3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的结构如式ⅰ所示：其中，r1为-h、苄基、c1～c8烷基、c1～c8烯基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基或卤素；r2为-h、c1～c10烷基、c1～c8烯基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、卤素、取代的c6～c12芳基或取代的5～12元不饱和杂环；所述的不饱和杂环含有1～4个杂原子，所述的杂原子为n、o或s；所述取代c6～c12芳基的取代基为-h、c1～c8烷基、c1～c8烯基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；所述取代的5～12元不饱和杂环的取代基为-h、c1～c8烷基、-cn、c1～c8烯基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、卤素、苯基、对硝基苯基、-cf3、-no2、或-nhr9；r8为-h、c3～c8环烷基、卤素、苯基、r9为c1～c8烯基、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、对硝基苯基或m＝0～4；n＝0～4；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。作为本发明优选的方案，r1为-h、苄基、c1～c8烷基、c1～c8烯基或c1～c8烷氧基；r2为-h、c1～c10烷基、c3～c8环烷基、卤素、取代的c6～c12芳基或取代的5～12元不饱和杂环；所述的不饱和杂环含有1～4个杂原子，所述的杂原子为n、o或s；所述取代c6～c12芳基的取代基为-h、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；所述取代的5～12元不饱和杂环的取代基为-h、c1～c8烷基、-cn、c1～c8烷氧基、c3～c8环烷基、卤素、苯基、对硝基苯基、-no2、或-nhr9；r8为-h、c3～c8环烷基、r9为c1～c8烷氧基、对硝基苯基或m＝0～4；n＝0～4；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。优选的，r1为-h、苄基、c1～c8烷基或c1～c8烯基；r2为-h、c1～c10烷基、c3～c8环烷基、取代的c6～c12芳基或取代的5～12元不饱和杂环；所述的不饱和杂环含有1～4个杂原子，所述的杂原子为n、o或s；所述取代c6～c12芳基的取代基为-h、c1～c8烷氧基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；所述取代的5～12元不饱和杂环的取代基为-h、c1～c8烷基、-cn、c1～c8烷氧基、卤素、苯基、对硝基苯基、-no2、或-nhr9；r8为-h、r9为对硝基苯基或m＝0～4；n＝0～4；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。进一步优选的，r1为-h、苄基、c1～c4烷基或c1～c4烯基；r2为-h、c1～c8烷基、c3～c8环烷基、或取代的5～10元不饱和杂环；所述的不饱和杂环含有1～4个杂原子，所述的杂原子为n、o或s；r3～r7为-h、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；所述取代的5～10元不饱和杂环的取代基为-h、c1～c4烷基、-cn、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、对硝基苯基、-no2、或-nhr9；r8为-h、r9为对硝基苯基或m＝0～2；n＝0～2；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。更进一步优选的，r1为-h、苄基、c1～c4烷基或c1～c4烯基；r2为-h、c1～c8烷基、c3～c8环烷基、r3～r7为-h、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；r10～r21为-h、c1～c4烷基、-cn、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、对硝基苯基、-no2、或-nhr9；r8为-h、r9为对硝基苯基或m＝0～2；n＝0～2；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。最优的，r1为-h、苄基、c1～c4烷基或c1～c4烯基；r2为-h、c1～c8烷基、c3～c8环烷基、r3～r7为-h、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、-cf3、-no2、-ocf3、或-nhr9；r10～r21为-h、c1～c4烷基、-cn、c1～c4烷氧基、卤素、苯基、对硝基苯基、-no2、或-nhr9；r8为-h、r9为对硝基苯基或m＝0～2；n＝0～2；p＝1～4；q＝0～4；r＝1～4。所述3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的结构式为：上述3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的用途中，所述的癌症包括：胶质瘤、膀胱癌、非小细胞肺癌、伯基特淋巴瘤、结肠癌或乳腺癌。上述3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的用途中，所述的神经变性疾病包括：亨廷顿病或帕金森氏病。上述3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物及其盐或水合物，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用。所述药物组合物为含有0.1～99％的3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的化合物及其盐或水合物，其余为药学上可接受的，对人和动物无毒、无惰性的药用载体和/或赋形剂。所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的化合物及其盐或水合物的药物组合物，采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型：喷剂、气雾剂、液体制剂或固体制剂；所述的液体制剂包括注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂或糖浆剂；所述的固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂。所述3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的化合物及其盐或水合物的药物组合物的给药途径为口服、舌下给药或粘膜透析；所述的注射包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。本发明所述化合物为首次发现针对去乙酰化酶家族的抑制剂，特别针对sirt家族中的亚型sirt2具有高选择性。本发明3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的化合物及其盐或水合物的药物组合物，治疗或预防癌症、治疗或预防神经变性疾病均有作用，为本领域中的sirt2抑制剂的开发、抗肿瘤和抗精神性疾病的开发提供了新的选择，具有很好的应用前景。附图说明图1化合物12针对sirt2、以及sirt1和sirt3的活性-剂量关系。其中％inhibition代表抑制百分比，log[cpd]代表化合物浓度的对数值。图2化合物63针对sirt2、以及sirt1和sirt3的活性-剂量关系。其中％inhibition代表抑制百分比，log[cpd]代表化合物浓度的对数值。图3化合物12对人乳腺癌细胞株mcf-7的体外细胞生存活力抑制和对细胞内底物蛋白的抑制作用。(a)化合物12对mcf-7的体外细胞生存活力抑制作用；(b)化合物12对mcf-7细胞内底物的乙酰化水平的影响。其中viability代表细胞活力，α-tubulin代表α-微管蛋白，ac-α-tubulin代表乙酰化的α-微管蛋白。具体实施方式实施例1化合物的酶活性抑制实验本实验的目的是检测化合物在体外对去乙酰化酶的抑制活性。本实验采用荧光强度检测方法，对sirt2进行体外活性抑制测试。ak-7为参考分子(或称为阳性对照)。受试化合物的去乙酰化酶抑制活性用ic50(半数抑制浓度)或受试化合物在100μm和10μm浓度下对去乙酰化酶sirt2活性的抑制率来表示。ic50值可通过受试化合物在一系列不同浓度下对去乙酰化酶活性的抑制率计算获得。1.1实验材料人源sirt2酶(bps生物科技有限公司，货号50013)、缓冲液为改进的tris-buffer(tris标记的缓冲液)、100％dmso(二甲基亚砜)、nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、乙酰化的多肽底物、胰蛋白酶和酶标仪(synergymx)，以上原料及仪器由上海睿智化学有限公司(中国)提供。所有的受试3-位有取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物购自specs(荷兰)和chemdiv(俄罗斯)公司。化合物ak-7购自medchemexpress(美国)公司。ak-7的结构式为：体外实验时用100％dmso配制成10mm储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。1.2测试方法人源sirt2酶与测试缓冲溶液混合，并加入用％100dmso溶解的不同浓度的小分子化合物，振荡，混匀。然后把上述混合物在室温下孵育15分钟。再加入含有nad和乙酰化的多肽底物促使反应进行。在室温孵育240分钟后，加入胰蛋白酶溶液后在室温条件下继续孵育90分钟。然后用酶标仪在激发波长(λex)为360nm，发射波长(λem)为460nm检测荧光强度。通过以下公式进行计算：其中，y是抑制率，x是化合物的浓度，max是阴性对照信号值(完全没有抑制)，min是阳性对照信号值(完全抑制)，signal是相应孔的信号值，inh％是抑制百分率，公式中的ic50是抑制率为50％时对应的化合物的浓度(以摩尔浓度m来表示，为了与x单位一致，公式中计算为logic50)。1.3化合物的抑制能力测试结果通过以上所述的测试方法，测试了本发明中的化合物针对sirt2抑制效果，具体部分化合物的抑制率值见表1。表1部分受试化合物对sirt2的双浓度抑制率由表1可以看出，上述化合物显示了较好的结构与活性对应关系，共有29个受试化合物在100μm的测试浓度时，显示出较好的抑制效果(>50％)。3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物的结构ⅰ所示，取代基r1和r2的替换，对活性有较大的影响。当r1无取代基时，该系列化合物靶向sirt2的抑制效果较差；然而，当r1有取代基时，该系列化合物靶向sirt2的抑制效果明显增强；取代基r2的替换，对活性也有较大的影响，特别是疏水性基团的引进，可显著改善该系列化合物靶向sirt2的活性。表2部分化合物在体外对sirt2的ic50值化合物id号码分子摩尔质量ic50(μm)ak-7ak-7437.351212ag-205/37150065475.571.3468010-5857434.545.8503698-0126434.544.6514249-0012489.6216635471-0050438.572.1645471-0051436.556.378d026-0012535.635.4本发明3位取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物中，发现了7个化合物的ic50小于10μm，其中化合物12靶向sirt2的ic50为1.3μm，显示出较好抑制活性。实施例2化合物12和63体外酶水平针对同一家族sirt1和sirt3的亚型选择性测试实验本实验的目的是检测化合物对体外去乙酰化酶sirt1、sirt2和sirt3的抑制活性。受试化合物的去乙酰化酶抑制活性用ic50(半数抑制浓度)来表示。ic50值可通过受试化合物在一系列不同浓度下对去乙酰化酶活性的抑制率计算获得。2.1实验材料人源sirt1酶(bps生物科技有限公司，货号50012)、人源sirt2酶(bps生物科技有限公司，货号50013)、人源sirt3酶(cayman公司，货号10011194)、缓冲液为改进的tris-buffer(tris标记的缓冲液)、100％dmso(二甲基亚砜)、nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、乙酰化的多肽底物、胰蛋白酶和酶标仪(synergymx)，以上原料及仪器由上海睿智化学有限公司(中国)提供。所有的受试3-位有取代的5h-[1,2,4]三嗪[5,6-b]吲哚衍生物购自specs(荷兰)和chemdiv(俄罗斯)公司。体外实验时用100％dmso配制成10mm储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。2.2测试方法人源sirt1、sirt2和sirt3分别与测试缓冲溶液混合，并加入用100％dmso溶解的不同浓度的小分子化合物，振荡，混匀。然后，把上述混合物在室温下孵育15分钟。然后加入含有nad和乙酰化的多肽底物促使反应进行。在室温孵育240分钟后，加入胰蛋白酶溶液后在室温继续孵育90分钟。然后用酶标仪在激发波长(λex)为360nm，发射波长(λem)为460nm检测荧光强度。通过以下公式进行计算：其中，y是抑制率，x是化合物的浓度，max是阴性对照信号值(完全没有抑制)，min是阳性对照信号值(完全抑制)，signal是相应孔的信号值，inh％是抑制百分率，公式中的ic50是抑制率为50％时对应的化合物的浓度(以摩尔浓度m来表示，为了与x单位一致，公式中计算为logic50)。2.3测试结果图1和图2表明，化合物12和化合物63可以很强地抑制sirt2。活性测试结果表明，化合物12和化合物63几乎没有靶向sirt1和sirt3的活性(ic50>300μm)。结果表明化合物12和化合物63对于srit2具有较好的活性-剂量依赖关系，对于sirt1和sirt3具有较好的选择性。实施例3化合物12对人乳腺癌细胞株mcf-7的体外细胞生存活力抑制和对细胞内底物蛋白的抑制作用本实验的目的是检测化合物12在体外细胞上的抗恶性细胞增殖性能和细胞内底物α-微管蛋白的水平。本实验采用实验室培养的人乳腺癌mcf-7细胞，加药处理一定时间后，用mtt(四甲基偶氮唑盐)比色法和westernblot(蛋白质印迹)的方法检测。3.1实验材料3.1.1mtt比色法主要试剂：dmem购自gibcobrl公司(invitrogencorporation，usa)，胎牛血清购自gibcobrl公司(invitrogencorporation，usa)，青、链霉素双抗购自hyclone公司(thermoscientific,american)，四甲基偶氮唑盐(mtt)与十二烷基磺酸钠(sds)购自sigma公司(usa)。3.1.2westernblot(蛋白质印迹)主要试剂：dmem购自gibcobrl公司(invitrogencorporation，usa)，胎牛血清购自gibcobrl公司(invitrogencorporation，usa)，青、链霉素双抗购自hyclone(thermoscientific,american)，α-tubulin、乙酰化的α-tubulin抗体均购自sigma公司(american),辣根过氧化酶标记的二抗购自北京中山金桥公司，显影底物购自millipore公司。3.1.3细胞系及培养本实验所用的细胞系人乳腺癌mcf-7细胞购于美国atcc(americantypeculturecollection)，由本实验室保存。mcf-7细胞用含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem完全培养基在5％co2、37℃条件下培养。3.2实验方法3.2.1细胞系及培养用完全细胞培养液把细胞浓度调整为1×105个/ml的细胞悬液，以每孔200μl细胞悬液规格接种于96孔板中，培养过夜。次日，把悬浮细胞离心后弃去上清，然后分别用梯度浓度的受试化合物处理细胞。同时设不含药物的阴性对照组和等体积的溶剂对照组，dmso浓度为0.1％，每个剂量组设3个复孔，在37℃，5％co2条件下培养。72小时后，每孔加入浓度为5mg/ml的mtt试剂20μl，再培养2～4h后，弃除上清，每孔再加入50μl的20％sds(m：v)溶液，在37℃条件下孵育过夜，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(a)值(a值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率＝(对照组a570-实验组a570)/对照组a570×100％。以上所述实验均重复3次。实验数据用均数表示，数据统计资料采用t检验，p<0.05为差异，有统计学意义。以下各化合物对细胞增殖抑制作用均用ic50或抑制率表示。3.2.2westernblot(蛋白质印迹)用平皿培养待测细胞，扩增到合适的细胞密度。将不同浓度的受试化合物加到含有40nm曲古抑菌素a的细胞培养基中，同时设等体积的溶剂作为空白对照组、化合物ak-7作为阳性对照组和化合物65作为阴性对照组，在37℃，5％co2条件下培养6个小时。6小时后，收集细胞，并用预冷的pbs清洗细胞。然后加入细胞裂解液裂解细胞。将裂解后得到的蛋白悬液用bca法检测蛋白浓度，加入合适的蛋白上样缓冲液，混匀后，在100℃条件下加热10min使蛋白充分变性。将样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，转膜后将pvdf膜与抗体一起在4℃孵育过夜。之后在37℃条件下，用具有辣根过氧化酶标记的二抗孵育1h。用辣根过氧化物酶的底物进行曝光检测蛋白的表达。3.3实验结果采用以上实验方法，对人乳腺癌mcf-7进行了增殖抑制活性测试和westernblot(蛋白质印迹)。图3a显示出化合物12在不同浓度下对mcf-7的增殖抑制活性，化合物12可以剂量依赖的方式杀死mcf-7细胞，抑制人乳腺癌mcf-7的增值。westernblot(蛋白质印迹)结果如图3b所示，化合物12以剂量依赖的方式显著的增加α-tubulin(α-微管蛋白)的乙酰化水平。当前第1页12