灵仙新苷在制备治疗或预防炎性肠病的药物中的应用的制作方法

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种灵仙新苷在制备治疗或预防炎性肠病的药物中的应用。

背景技术：

炎性肠病简称IBD，是一种特殊的慢性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。临床上，炎性肠病患者表现为反复的腹痛、腹泻、粘液血便，甚至出现各种全身并发症如视物模糊、关节疼痛、皮疹等。本病经治疗可好转，也可自行缓解。但多数患者反复发作，迁延不愈，其中相当部分患者因出现并发症而需要手术治疗。

灵仙新苷是一种集抗炎、镇痛和免疫调节作用于一体的安全、高效、稳定的新型天然药物，具有成药性好和产业化前景广阔的特点；并且灵仙新苷还具有显著的调血脂、抗动脉粥样硬化和抗心肌缺血作用，抗类风湿性关节炎作用。但是其口服生物利用度低，而且口服后在肠道黏膜分布较多，目前其抗炎性肠病的作用还未开发。

技术实现要素：

本发明的目的是提供灵仙新苷在制备治疗或预防炎性肠病的药物中的应用。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

以灵仙新苷为药物活性成分在制备治疗或预防炎性肠病的药物中的应用。

灵仙新苷添加药学上可接受的辅料制备成适合临床使用的剂型。所述的剂型为口服制剂或注射剂，优选所述的辅料为崩解剂、稀释剂、黏合剂、润滑剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、填充剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、等渗调节剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、阻滞剂、抗氧剂、抑菌剂。

在制备治疗或预防炎性肠病的药物时，灵仙新苷可以作为唯一活性成分或者与其他有效成分组合使用。

本发明所述的灵仙新苷可以通过市售获得或通过以下方法制备得到：

取威灵仙药材(东北铁线莲)，用药材10倍重量水加热回流提取3次，每次2小时，合并水提液，将水提液室温冷却、过滤后上预先处理好的大孔树脂D101(流速2BV/h)，依次用水和20％乙醇洗脱至流出液澄清后，再用50％乙醇洗脱至流出液无色，收集50％乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥，得威灵仙总皂苷干粉，将该总皂苷干粉加入其50倍重量无水乙醇加热回流2小时后趁热过滤，滤液室温放置过夜，滤取沉淀，干燥后得粗品，粗品用20％乙醇溶解后上预先处理好的ODS柱(流速1BV/h)，依次用30％，40％，90％乙醇分别洗脱至无色，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥后，即得淡黄色灵仙新苷，含量：＞90％。

本发明通过灵仙新苷对炎症性肠炎大鼠克罗恩病(Crohn’s disease，CD)的防治实验，采用SD大鼠TNBS/乙醇法构建模型，评价了灵仙新苷32、16、8mg/kg抗大鼠炎症性结肠炎的作用。结果表明，灵仙新苷具有显著抗大鼠炎症性肠炎克罗恩病的作用，可利用此开发出一种抗炎性肠病(包括免疫炎性肠病和其他原因引起的炎性肠病)的疗效好而安全性高的一类中药新药。

附图说明

图1为大鼠炎症性肠病克罗恩模型组织病理学图。

图中，C空白对照组，M模型对照组，AC美沙拉嗪组，AR-H灵仙新苷高剂量组，AR-M灵仙新苷中剂量组，AR-L灵仙新苷低剂量组，×400

图2为大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织TNF-α表达(免疫组化)图。

图中，C空白对照组，M模型对照组，AC美沙拉嗪组，AR-H灵仙新苷高剂量组，AR-M灵仙新苷中剂量组，AR-L灵仙新苷低剂量组，×400

图3为大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织TLR4表达(免疫组化)图。

图中，C空白对照组，M模型对照组，AC美沙拉嗪组，AR-H灵仙新苷高剂量组，AR-M灵仙新苷中剂量组，AR-L灵仙新苷低剂量组，×400

图4为大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织NF-κBp65表达(免疫组化)图。

图中，C空白对照组，M模型对照组，AC美沙拉嗪组，AR-H灵仙新苷高剂量组，AR-M灵仙新苷中剂量组，AR-L灵仙新苷低剂量组，×400

图5为大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织TLR4、NF-κBp65表达(Western blot)图。

图中，C空白对照组，M模型对照组，AC美沙拉嗪组，AR-H灵仙新苷高剂量组，AR-M灵仙新苷中剂量组，AR-L灵仙新苷低剂量组。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步描述，但本发明并不限于实施例所述的范围。

实施例1

通过药效试验证明灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型的防治作用：

1.1试验方法：

(1)动物分组：SPF级雄性SD大鼠48只，按体重随机均分为6组，分别设为正常对照组(Normal control group，NC组)、克罗恩病模型组(Model group，MC组)、灵仙新苷低剂量组(Low dose AR group，AR-L组，16mg·kg^-1)、灵仙新苷中剂量组(Moddel dose AR group，AR-M组，32mg·kg^-1)、灵仙新苷高剂量组(High dose AR group，AR-H组，64mg·kg^-1)和阳性药组(美沙拉嗪，5-Aminosalicylic acid group，AC组，500mg·kg^-1)。

(2)模型建立：参照国际公认的Morris方法，采用TNBS/乙醇法构建模型，大鼠先适应性饲养1周，造模前禁食不禁水24小时，称重，腹腔注射10％水合氯醛1ml/kg，麻醉后，倒悬位，将大鼠灌胃针自肛门缓慢插入直肠约8cm，正常对照组灌入同体积生理盐水，其他5组大鼠灌入5％TNBS0.4ml+50％乙醇0.2ml(2：1＝v：v)混合溶液用lml注射器缓慢把药液推入肠内[2]，倒悬位持续30s后，取头低尾高位20-30度，放置观察笼中，清醒后放回饲养笼。

(3)给药方法：造模后24h开始灌胃，正常组与模型组给予0.9％的氯化钠溶液2mL/只灌胃；AC组按100mg/kg灌胃；AR-H组、AR-M组、AR-L组分别给予32mg、16mg和8mg/kg.，给药容积为0.5ml/100g，每天灌胃一次，连续给药28d。除空白组外，其余5组每隔6d重复造模一次，共造模4次。

实验中采用的灵仙新苷(Clematichinenoside，AR)为淡黄色粉末，含量＞90％。

临用前用蒸馏水溶解配制成所需浓度的澄清溶液。

美沙拉嗪肠溶包衣片为葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司产品，规格：0.25g/片，临用前用0.5％CMC-Na研磨配制成浓度为50mg/ml的均匀混悬液。

(4)指标测定与评价：

A.标本采集及结肠黏膜组织学损伤评分

颈总动脉取血处死大鼠，游离结肠组织，沿肠系膜纵轴剖开，冰生理盐水清洗，肉眼观察黏膜损伤情况，并行结肠组织大体形态损伤评分，评分标准采用结肠组织大体形态损伤指数(colon marcroscopic damage index，CMDI)标准如下：

0分：结肠黏膜无损伤

1分：局部结肠黏膜充血水肿但无糜烂、溃疡形成

2分：有溃疡形成但无显著炎症发生

3分：在一个部位上有线性溃疡形成并且有炎症

4分：在两个或以上的部位有溃疡形成和/或炎症

5分：沿结肠长轴有两个或以上部位有溃疡形成和炎症，长度超过1cm

6～8分：溃疡形成超过2cm

B.病理组织切片HE染色及观察

固定标本：选取大鼠结肠组织病变最明显的位置约2cm，放在10％中性甲醛中固定，这里甲醛容量取为组织标本的2-3倍即可。

切片：在10％中性甲醛中固定24h后取出大鼠组织，逐级用酒精脱水，然后用二甲苯透明、浸蜡，再石蜡包埋，做常规切片4μm，45℃水浴后捞片，在80℃烤箱烤片约40min。

染色：把切片放入二甲苯中浸泡，时间为5-10min/次，共泡3次；然后用无水乙醇浸泡，1min/次共2次，接着用95％乙醇浸泡，1-2min/次，2次，再用80％乙醇浸泡约1min，最后自来水漂洗4-5次；使用苏木素染色(染细胞核)5-6min，然后自来水漂洗4-5次；再浸于1％盐酸，染色5sec，用自来水冲洗返蓝；用1％的伊红染色(染细胞浆)30sec；用95％的乙醇脱水2次，1-2min/次；用无水乙醇脱水，2次，1-2min；用二甲苯脱水透明3次，2min/次；最终用中性树胶封片、镜检。

C.组织学损伤指数(tissues damage index，TDI)

组织切片HE染色后，在显微镜下观察溃疡、炎性细胞浸润等变化。并采用组织学损伤指数(tissues damage index，TDI)^[3]进行评分。标准如下：

0分：没有损伤

1分：黏膜和/或黏膜下轻度炎症浸润和充血水肿，黏膜轻度糜烂，伴随有毛细血管增生，而黏膜肌层保持完整

2分：在1分的基础上，范围达标本的50％以上

3分：显著地炎症浸润和充血水肿，有溃疡形成并延伸到黏膜固有层，较少的炎症细胞浸润黏膜固有层，肌层无坏死

4分：在3分的基础上，范围达标本的50％及以上

5分：溃疡广泛形成，伴有黏膜糜烂，有数量众多的中性粒细胞浸润，细胞坏死及溃疡面可达到黏膜固有肌层

6分：在5分的基础上，范围达标本的50％及以上

D.脾脏指数测定：

大鼠处死后取出脾脏，使用电子天平称重，以脾脏的重量(g)与大鼠每100g体重之比作为脾脏指数。

E.ELISA法检测结肠组织中的IL-10和TNF-α含量

在酶标板上包裹抗大鼠细胞因子(TNF-α和IL-10)的单抗；样品和标准品里的大鼠细胞因子与单抗结合后，再加上生物素化过的抗大鼠细胞因子抗体，这样就形成了免疫复合物连接在板上面；用辣根过氧化物酶标记的亲和素会与生物素特异性结合，加入显色剂则出现蓝色，再加入终止液，颜色变黄，在450nm处测量吸光度值。因为细胞因子浓度与吸光度值成正比关系，通过绘制标准曲线，最终可以求出标本中的大鼠结肠组织中的细胞因子的浓度。

F.免疫组化法检测肠组织TLR4、TNF-α、NF-kBp65阳性细胞数表达

采用免疫组织化学法检测大鼠结肠组织中TLR4、TNF-α、NF-kBp65的表达。主要染色过程如下：

①.石蜡切片脱蜡水化，微波中档抗原修复10min。自然冷却，用PBS液(0.01mol/L

PH7.4)冲洗3次×2min。

②正常山羊血清封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加即用型一抗，37℃孵育1小时。

②PBS冲洗，2min×3次。

③滴加即用型快速免疫组化MaxVision^TM二抗，37℃或室温孵育10-15min。

④PBS冲洗，2min×3次。

⑤滴加新鲜配制的显色剂(DAB)3-5min，显微镜下观察。

⑦自来水充分冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝。

⑧梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

G.Western blot法检测肠组织TLR4、NF-kBp65蛋白表达

称取100mg肠组织置于冰板上表面皿中剪成碎片，在破碎的组织中加入1ml预冷蛋白裂解液(RIPA：PMSF＝9：1)，用4℃玻璃匀浆器匀浆至95％细胞被破碎并静置于冰浴下30min，将组织匀浆4℃18000rpm离心15min，取上清肠组织蛋白转移至新的离心管中。各样品取5μl进行蛋白定量，其余样本加入总体积1/5的loading buffer(5×)，100℃煮沸5min后放于-20℃冰箱中保存。

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA protein Assay Kit)，按照50：1的比例将50体积BCA试剂A和BCA试剂B充分混合配制工作液；蛋白标准溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/孔加入200μl BCA工作液后再562nm下比色，记录吸光值，测定绘制标准曲线；将待测样品稀释至20μl，测定吸光值，代入标准曲线得到样品实际浓度(单位：μg/μl)。

配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)，将配好的分离胶用移液枪加入电泳槽4.5ml并加水封液面。分离胶凝固后用滤纸将水吸干。加入配制的浓缩胶1.5ml。从左至右分别在电泳槽中加入Marker、NC组、MC组、AC组、AR-H组、AR-M组、AR-L组蛋白，两侧各加loading buffer压边。Marker上样量2μl，其余各组按照测定的样品蛋白含量保持上样量一致。电泳分离时浓缩胶保持60V电压20min左右，分离胶保持100V电压60min左右至Marker跑开即可终止。按照海绵、3张滤纸、PAGE胶、NC膜、3张滤纸、海绵制成膜/滤纸三明治将胶上蛋白转至硝酸纤维素膜(NC膜)上，保持100mA电流电转2h左右。转膜结束配制脱脂奶粉封闭液(1g奶粉+20ml TBST)对膜进行封闭，室温下摇床封闭1h。TBST洗涤干净封闭液封，将膜加一抗并塑封于摇床上孵育室温过夜。取出膜TBST缓冲液洗涤三次，每次10min，摇床震荡。二抗孵育2h，同样TBST缓冲液洗涤三次，每次10min，摇床震荡。加入显色剂放入凝胶图像分析系统显影^[5]。该实验重复三次。

1.2试验结果：

(1)结肠黏膜组织学损伤评分(CMDI)

结肠黏膜组织学损伤评分表明：与正常对照组比较，模型组肠壁增厚，肠管增粗，与外周组织粘连，部分大鼠可见肠梗阻表现，糜烂及溃疡形成，具有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，阳性药组和AR各剂量组均有不同程度的改善，显著性恢复肠管增粗与肠壁增厚，与外周组织粘连少，黏膜充血水肿减轻，糜烂及溃疡形成不明显(P<0.01，P<0.05)。

(2)病理组织检查和组织学损伤指数评分(TDI)

光学显微镜下观察，空白对照组大鼠结肠结构清晰，其隐窝结构完整，腺体未见破坏。模型组大鼠结肠组织中局部溃疡形成，结肠黏膜上皮坏死脱落，并见大量炎症细胞浸润，黏膜及黏膜下层出现严重的水肿，并伴有大量炎症细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，黏膜下层出现严重的水肿，杯状细胞被破坏且结构紊乱，其中1只表现为多量炎症细胞浸润到黏膜固有层，局部见粘膜糜烂。与空白组比较，模型组大鼠组织学损伤指数极显著升高(P<0.01)；阳性药组、AR高剂量组大鼠局部见浅溃疡形成，少量散在炎性细胞浸润固有腺周围，固有腺结构改善，充血水肿减轻，有增生的边缘上皮细胞覆盖溃疡面，与模型组比较，阳性药组、AR高剂量组组织学损伤指数极显著降低(P<0.01)；AR中剂量组大鼠肠组织中多量炎症细胞浸润到隐窝和黏膜固有层，肉芽组织纤维化改善，黏膜及黏膜下炎症细胞浸润减少，与模型组比较，AR中剂量组组织学损伤指数显著降低(P<0.05)。结果见表1：

表1灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型组织学损伤指数评分(TDI)与结肠黏膜组织学损伤评分(CMDI)(n＝8)

^**P<0.01，与空白对照组比较，^*P<0.05，与空白对照组比较；^##P<0.01，与模型对照组比较，^#P<0.05，与模型对照组比较；^ΔΔP<0.01，与美沙拉嗪组比较，^ΔP<0.05，与美沙拉嗪组比较

(3)免疫组化法检测大鼠结肠组织TLR4、TNF-α和NF-kBp65的阳性细胞表达

TNF-α蛋白表达定位于肠上皮细胞浆内，空白对照组可见少量棕黄色染色，模型组胞浆内大量棕黄色细胞染色，与空白组比较，模型组TNF-α阳性细胞表达极显著增强(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、AR高、中剂量组TNF-α阳性细胞表达极显著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低剂量组TNF-α阳性细胞表达呈现一定剂量依赖性；与阳性药比较，AR高剂量组TNF-α阳性细胞表达无明显差异。

TLR4蛋白表达定位在肠上皮细胞胞浆及少部分胞膜上，空白对照组可见颜色较浅的棕黄色染色，模型组胞浆内可观察到明显且大量棕黄色染色，与空白组比较，阳性药组、AR高、中剂量组TLR4阳性细胞表达极显著降低(P<0.01)，AR低剂量组TLR4阳性细胞表达显著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低剂量组TLR4阳性细胞表达呈现一定剂量依赖性；与阳性药比较，AR高剂量组TLR4阳性细胞表达无明显差异。

NF-kBp65蛋白表达定位在肠上皮细胞胞浆和胞核内，空白对照组可见少量棕黄色染色，模型组可见大量棕黄色细胞染色，与空白组比较，模型组NF-kBp65阳性细胞表达极显著增强(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、AR高、中剂量组NF-kBp65阳性细胞表达极显著降低(P<0.01)，并且AR高、中、低剂量组NF-kBp65阳性细胞表达呈现一定剂量依赖性；与阳性药比较，AR高剂量组NF-kBp65阳性细胞表达无明显差异。结果见表2：

表2灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织TNF-α，TLR4及NF-κBp65表达(免疫组化)的影响(n＝8)

^**P<0.01，与空白对照组比较，^*P<0.05，与空白对照组比较；^##P<0.01，与模型对照组比较，^#P<0.05，与模型对照组比较；^ΔΔP<0.01，与美沙拉嗪组比较，^ΔP<0.05，与美沙拉嗪组比较

(4)灵仙新苷对大鼠脾脏指数的影响：

与空白组大鼠比较，模型组大鼠脾脏指数极显著升高(p<0.01)；与模型组比较，阳性药组、AR高剂量组极显著降低大鼠脾脏指(p<0.01)；与模型组比较，AR中、低剂量组显著降低大鼠脾脏指数(p<0.05)；与阳性药比较，AR高、中剂量组无显著性差异。结果见表3：

表3灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型脾脏指数的影响(n＝8)

^**P<0.01，与空白对照组比较，^*P<0.05，与空白对照组比较；^##P<0.01，与模型对照组比较，^#P<0.05，与模型对照组比较；^ΔΔP<0.01，与美沙拉嗪组比较，^ΔP<0.05，与美沙拉嗪组比较

(5)大鼠结肠组织细胞因子表达

与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠结肠组织TNF-a的含量显著增高，差异有显著性；与模型组大鼠进行比较，5-ASA组大鼠结肠组织TNF-a的含量明显降低；与模型组大鼠进行比较，AR高、中剂量组大鼠结肠组织TNF-a的含量明显降低；5-ASA组与AR高剂量组大鼠结肠组织TNF-a的含量进行比较，无显著性差异。与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠结肠组织IL-10的含量显著降低，差异有显著性；与模型组大鼠进行比较，5-ASA组大鼠结肠组织IL-10的含量明显升高；与模型组大鼠进行比较，AR高、中剂量组大鼠结肠组织IL-10的含量明显升高；5-ASA组与AR高剂量组大鼠结肠组织IL-10的含量进行比较，无显著性差异。AR高剂量组大鼠结肠组织IL-10的含量显著高于AR低剂量组大鼠结肠组织IL-10含量。结果见表4：

表4灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织IL-10及TNF-α含量的影响(n＝8)

^**P<0.01，与空白对照组比较，^*P<0.05，与空白对照组比较；^##P<0.01，与模型对照组比较，^#P<0.05，与模型对照组比较；^ΔΔP<0.01，与美沙拉嗪组比较，^ΔP<0.05，与美沙拉嗪组比较

(6)Western blot检测肠组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达

与空白对照组比较，模型组极显著增加细胞核中NF-κBp65亚基蛋白的表达(P<0.01)；与模型组比较，阳性药组、AR高剂量组极显著抑制细胞核中NF-κBp65亚基蛋白表达(P<0.01)，与模型组比较，AR中剂量组显著抑制细胞核中NF-κBp65亚基蛋白表达(P<0.05)，AR各剂量组均可不同程度地抑制细胞核中NF-κBp65亚基蛋白表达并呈现一定剂量相关性。结果见表5：

表5灵仙新苷对大鼠炎症性肠病克罗恩模型肠组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达(Western blot)的影响(n＝8)

^**P<0.01，与空白对照组比较，^*P<0.05，与空白对照组比较；^##P<0.01，与模型对照组比较，^#P<0.05，与模型对照组比较；^ΔΔP<0.01，与美沙拉嗪组比较，^ΔP<0.05，与美沙拉嗪组比较

上述研究结果表明，灵仙新苷具有显著抗大鼠炎症性肠炎克罗恩病的作用。

上述灵仙新苷是通过以下方法制备得到：取威灵仙药材(东北铁线莲)，用药材10倍重量水加热回流提取3次，每次2小时，合并水提液，将水提液室温冷却、过滤后上预先处理好的大孔树脂D101(流速2BV/h)，依次用水和20％乙醇洗脱至流出液澄清后，再用50％乙醇洗脱至流出液无色，收集50％乙醇洗脱液，浓缩，微波干燥，得威灵仙总皂苷干粉，将该总皂苷干粉加入其50倍重量无水乙醇加热回流2小时后趁热过滤，滤液室温放置过夜，滤取沉淀，干燥后得粗品，粗品用20％乙醇溶解后上预先处理好的ODS柱(流速1BV/h)，依次用30％，40％，90％乙醇分别洗脱至无色，收集40％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥后，得淡黄色灵仙新苷，含量：＞90％。