快速修复仿刺参体壁化皮组织的复方中草药制剂的制作方法

本发明涉及一种复方中草药制剂，尤其是一种可应用于刺参人工养殖，快速修复仿刺参体壁化皮组织的复方中草药制剂。

背景技术：

刺参（apostichopusjaponicus）属于棘皮动物门，游走亚门，海参纲，盾手目，刺参科，仿刺参属，是我国北方沿海地区的重要经济养殖品种之一。但随着养殖的过速发展和不规范运作而造成的病害问题日趋突出，出现了多种明显症状和大规模死亡现象，给广大刺参养殖业者造成了惨重的经济损失，其中“化皮病”就是目前最为流行和影响最为严重的疾病。“化皮病”发病初期是在刺参体壁出现小面积溃烂，之后溃烂处逐渐增大，以至最终溶解成鼻涕状。迄今的研究结果证明刺参“化皮病”主要为细菌感染所致，病原菌主要有灿烂弧菌、溶藻弧菌、假交替单胞菌、假单胞菌和希瓦氏菌等。以往针对这种疾病的防治主要采用抗生素药物，可抗生素药物只能起到杀灭病菌的作用，并不能帮助刺参修复已经溃烂的组织，而且大量抗生素的使用势必造成耐药菌株的出现，所产生的药物残留和在环境中的扩散问题也已经严重影响了食品安全和环境公共卫生安全。中国专利号为200810012641.3的发明专利，公开了一种“治疗刺参细菌性化皮病的复方中草药制剂”，是由乌梅和五倍子按比例配伍后的水煎制剂。虽然对刺参体内的病原菌杀灭效果相当显著并能彻底修复化皮组织，但是修复期过长，影响刺参的生长。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的化皮组织修复期长的技术问题，提供一种可应用于刺参人工养殖，快速修复仿刺参体壁化皮组织的复方中草药制剂。

本发明的技术解决方案是：一种快速修复仿刺参体壁化皮组织的复方中草药制剂，其特征是由五倍子粉、白芷粉、地龙粉、蒲公英粉及乌梅粉混合制成，各组分的质量配比为五倍子粉1，白芷粉10，地龙粉10，蒲公英粉10，乌梅粉10。

本发明具有如下优点：

（1）原料按照中草药的配方原则，在增强药效的同时，对刺参没有毒性，不会影响刺参的正常生活，对刺参体内的病原菌杀灭效果显著，可快速彻底修复溃烂组织；（2）在自然条件下可降解，无毒副作用，在刺参体内无残留；（3）添加量小，使用方便；（4）组成简单，所用原料来源稳定，价格低廉，生产工艺简单。

附图说明

图1是本发明实施例中实验例1的a组刺参1~4天用药修复效果图。

图2是本发明实施例中实验例1的b组刺参1~4天用药修复效果图。

图3是本发明实施例中实验例2的a组用药第1，3，5，7，10，14天仿刺参体壁组织切片图。

图4是本发明实施例中实验例2的b组用药第1，3，5，7，10，14天仿刺参体壁组织切片图。

具体实施方式

利用超微粉碎机将五倍子、白芷、地龙、蒲公英及乌梅分别粉碎成粉，并通过200目筛网过滤后，按照质量配比为五倍子粉1kg，白芷粉10kg，地龙粉10kg，蒲公英粉10kg，乌梅粉10kg的比例，将五倍子粉、白芷粉、地龙粉、蒲公英粉及乌梅粉混合即可，使用时按照0.1g/l的浓度投入水中。

实验：

实验例1：

取仿刺参20头，随机分为a、b两组，每组10只，其中a组为对照组，是取五倍子和乌梅（质量比1:4）的水煎制剂；b组为本发明实施例组。取仿刺参于冰上麻醉30min，无菌刀片横向割取刺参棘刺及棘刺下部分体壁组织，形成面积约1㎝×0.5㎝的创伤面，深度不伤至体腔膜。a、b两组均按照0.1g/l浓度浸浴给药，1周内每日定点投喂饲料、换水，换水后补充中药确保浸浴浓度。

结果如图1、2所示，图1中1~4分别是a组刺参用药1~4天的修复效果图，图2中1~4分别是b组刺参用药1~4天的修复效果图。

从图1、图2中可以看出：

用药1天后，a组刺参伤口边缘开始缩小，轻微附有一层白色黏膜，隐约可见；b组刺参伤口明显收缩，伤口表面出现一层白色黏膜，清晰可见。

用药2天后，a组刺参伤口面积减小，出现一定附着力；b组刺参伤口大面积缩小，创口边界模糊不清，附着力大幅提升；

用药3天后，a组伤口趋向闭合，但尚有缝隙，体壁色素开始分布；b组伤口已闭合成缝隙状，体壁色素趋于正常；

用药4天后，a组伤口几近闭合，尚有伤口愈合痕迹可见；b组伤口完全不可见，附着力良好，体壁颜色均一，刺参恢复正常状态。

实验例2：

取仿刺参20头，随机分为a、b两组，每组10只，其中a组为对照组，是取五倍子和乌梅（质量比1:4）的水煎制剂；b组为本发明实施例组。取仿刺参于冰上麻醉30min，无菌刀片横向割取刺参棘刺及棘刺下部分体壁组织，形成面积约1㎝×0.5㎝的创伤面，深度不伤至体腔膜。a、b两组均按照0.1g/l浓度浸浴给药，每日定点投喂饲料、换水，换水后补充中药确保浸浴浓度。

分别于创伤后1，3，5，7，10，14天每组取1头刺参，用0.54mol/l的mgso4海水溶液麻醉半小时，麻醉后解剖取其创伤后修复的体壁组织经波恩氏液固定24h。

将固定的组织经酒精梯度脱水、透明、透蜡、石蜡包埋后，使用laica2315切片机切片，厚度为5μm。切片经苏木精-伊红染色，中性树胶封片，在moticimagesadvanced3.2病理图像采集系统下观察、拍照。具体操作步骤详见以下介绍：

（1）脱水：将固定的组织取出后，依次经过：70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精（两次），每级酒精脱水30min。

（2）透明：无水乙醇＋二甲苯（1:1）30min→二甲苯（透明时间根据不同的组织适当调整）

（3）透蜡：二甲苯＋石蜡（1:1）30min→石蜡1h。透蜡的整个过程在恒温箱中进行（保持温度在58～60℃）

（4）包埋：将熔化了的石蜡倾入包埋框内，随即迅速将组织块用加温了的镊子送置于框内，平置底面。注意组织切面，放入冷水，冷固后晾干，标明组织名称、包埋方向及日期。

（5）切片：在莱卡-rm2135切片机上进行切片，切片厚度5μm。

（6）贴片：将切好的蜡片移到涂有蛋白甘油粘片剂的载玻片上，在烘片台上展片后放入50℃的干燥箱中烘干备用。

（7）he染色：二甲苯(ⅰ)(5min)→二甲苯(ⅱ)(5min)→无水酒精(ⅰ)(5min)→无水酒精(ⅱ)(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→70％酒精(1min)→自来水(2min)→蒸馏水(1min)→苏木精染液(20～24min)→自来水冲洗(1min)→酸性分化液（在其中蘸取3下后自来水洗几秒）→自来水返蓝（2～3min）→蒸馏水(2min)→70％酒精(2min)→80％酒精(2min)→0.5～1%的伊红染液复染(1-2min)→95％酒精(ⅰ)(分色1min左右)→95％酒精(ⅱ)(1min)→无水酒精(ⅰ)(5min)→无水酒精(ⅱ)(5min)→无水酒精(ⅲ)(5min)→无水酒精：二甲苯=1:1(5min)→二甲苯(ⅰ)(5min)→二甲苯(ⅱ)(5min)→二甲苯(ⅲ)(5min)。

（8）封固：中性树胶封片，斜面放置晾干。

（9）观察和照相：在olympus显微镜下观察，采用病理图像采集系统对典型的组织变化进行拍照。

结果如图3、4所示，图3中1~6分别是a组用药第1，3，5，7，10，14天仿刺参体壁组织切片图。图4中1~6分别是b组用药第1，3，5，7，10，14天仿刺参体壁组织切片图。

从图3、4中可以看出：

用药1天后，a组创面边缘不齐，存在空隙；b组创面边缘恢复整齐，深蓝色细胞聚集成细胞团；

用药3天后，a组靠近表皮层部位细胞核增多，深蓝色细胞聚集成细胞团；b组表皮层出现，清晰可见，结缔组织与表皮层之间存在空隙；

用药5天后，a组新增表皮层开始出现，细胞分裂增值活动依然活跃；b组结缔组织内部细胞密集向外排列有序迁移至空隙处；

用药7天后，a组新增表皮层基本恢复，结缔组织与表皮层之间存在空隙；b组空隙进一步减小，表皮层与结缔组织间出现空白间隙带；

用药10天后，a组表皮层与结缔组织间出现空白间隙带；b组成纤维细胞排列有序，间隙带基本消失，表皮层逐渐恢复；

用药14后，a组间隙带消失，表皮层基本恢复；b组色素分布均匀，表皮层完全恢复，同正常刺参体壁结构一致。

实验结果表明，a、b组复方制剂虽然均能有效治疗刺参的体壁损伤，但应用本发明实施例的b组修复效果更快，能明显缩短刺参组织修复时间，使刺参创口提前恢复完全，从而利于刺参的生长。