450‑490nmLED‑蓝光联合三氧化二砷在骨肉瘤治疗中的应用的制作方法

本发明涉及450-490nmled-蓝光联合三氧化二砷(arsenictrioxide,as2o3)在骨肉瘤治疗中的应用。本发明属于医学技术领域。

背景技术：

骨肉瘤是一种好发于儿童及青少年时期的原发恶性骨组织肿瘤，其侵袭能力强，病情发展迅速，患者致死率极高。目前，临床针对骨肉瘤患者的治疗方法主要有外科手术，化疗，放疗，介入治疗等多种综合治疗手段，但外科手术会造成截肢的风险，患者对放化疗药物的耐药性以及骨肉瘤预后效果极差仍是治疗骨肉瘤和改善骨肉瘤患者生活水平的巨大难题。由于各种治疗方法都给患者带来不可逆的生理和心理创伤，所以急需寻找和开发治疗骨肉瘤的新手段就显得迫在眉睫。

as2o3虽是最古老的毒物之一，也是最具商业价值的砷化物，亦称砒霜。我国学者早于20世纪70年代便将as2o3应用于白血病的治疗。大量文献表明，as2o3对多种恶性肿瘤如肝癌、肺癌、宫颈癌和食管癌的治疗皆有明显的效果。但是as2o3的治疗是一把双刃剑，会产生严重的应激反应，同时也会引起心脏和肝脏等多种重要器官的系统病变。因此是否可以通过联合应用其他的技术在降低as2o3副作用的同时，可以增加其疗效。

光疗是近年来出现的一种新的治疗方法，本发明发明人从众多不同波长的光源中筛选出波长为450-490nm的led-蓝色光源，发现强功率的led-蓝光对于骨肉瘤细胞生长具有显著的抑制作用，同时发明人发现较低强度的led-蓝光光照作用可增加as2o3抑制骨肉瘤细胞生长的作用。进一步探究发现450-490nmled-蓝光与as2o3的联合应用具有抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导骨肉瘤细胞细胞核损伤的作用。

本发明临床应用简单易行，能够降低医疗成本，减轻患者接受手术切除及放化疗时所产生的痛苦，为骨肉瘤的治疗提供了一种新的技术手段。

技术实现要素：

本发明的目的是探究450-490nm波长led-蓝光光照在提高低剂量的as2o3对骨肉瘤细胞生长、增殖、迁移、侵袭的抑制效果以及诱导细胞核损伤中的作用，以在降低as2o3副作用的同时，增加其疗效。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过离体培养骨肉瘤细胞系u2os，首先筛选as2o3合适的处理剂量，即采用不同剂量的as2o3处理骨肉瘤细胞，分组为0μm，0.1μm，0.3μm，1μm，3μm和10μm，24h后应用台盼蓝染色、计数，检测as2o3对细胞增殖的影响。选取0.3μm的as2o3处理2h后的骨肉瘤细胞，利用450-490nm波长的led-蓝光光源进行光照实验，光照功率为100mw/cm²光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²，24h后应用台盼蓝染色、细胞计数和edu染色检测骨肉瘤细胞生长增殖的情况；应用划痕实验和transwell实验检细胞的迁移以及侵袭的能力；应用γ-h2ax免疫荧光染色检测细胞核损伤情况。实验结果表明，450-490nm波长led-蓝光联合as2o3用于骨肉瘤的治疗，相较于单独使用，具有增强的抑制骨肉瘤细胞生长、增殖、迁移、侵袭以及诱导细胞核损伤的效果，且能够降低as2o3的使用量，从而减少毒副作用。

因此，基于上述研究基础，本发明提出了具有450-490nm波长的led-蓝光光源在制备采用as2o3治疗骨肉瘤的辅助器械中的应用。

其中，具有450-490nm波长的led-蓝光光源与as2o3联用，具有增强as2o3抑制骨肉瘤细胞生长、增殖、迁移以及侵袭的作用。

其中，具有450-490nm波长的led-蓝光光源与as2o3联用，具有降低as2o3的毒性的作用。

其中，具有450-490nm波长的led-蓝光光源与as2o3联用，具有增强as2o3诱导骨肉瘤细胞细胞核损伤的作用。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

as2o3和具有450-490nm波长的led-蓝光光照联合应用不仅降低as2o3对机体所带来的副作用，光照疗法在一定程度上，减轻了患者由于外科手术切除和放化疗所带来的严重的身体和精神上的损伤，而且在抑制骨肉瘤细胞的生长、增殖、迁移，侵袭以及诱导细胞核损伤方面效果显著，因此本发明的提出为骨肉瘤的治疗提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为不同剂量的as2o3对u2os细胞生长的影响；

在u2os骨肉瘤细胞中，分别应用0μm，0.1μm，0.3μm，1μm，3μm和10μm的as2o3处理24h后，进行台盼蓝染色，细胞计数；(a)显微镜下拍照；(b)活细胞总数；(c)死细胞百分率；

图2为0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光单独以及联用对u2os细胞生长、增殖的影响；

采用0.3μm的as2o3和led-蓝光单独或联合作用骨肉瘤细胞，24h后，进行台盼蓝染色和edu染色；(a)显微镜下拍照；(b)活细胞总数；(c)死细胞百分率；(d)荧光显微镜下拍照；(e)edu阳性率统计图；

图3为0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光单独以及联用对u2os细胞迁移、侵袭的影响；

应用划痕实验和transwell实验，实验分为以下四组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组和联合应用组，分别在处理24h，48h和72h镜下观察并拍照检测细胞的迁移能力的同时处理24h后进行结晶紫染色；(a)显微镜下拍照；(b)细胞迁移距离的统计图；(c)显微镜下拍照；(d)结晶紫吸光度统计图；

图4为0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光单独以及联用诱导u2os细胞核损伤。

实验分为四组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组和联合应用组，分别在处理24h后进行γ-h2ax免疫荧光染色；(a)荧光显微镜下拍照；(b)γ-h2ax阳性率统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及的材料及其来源：

1.主要试剂：台盼蓝试剂(biosharp公司)；edu染色试剂盒(ribobio公司)γ-h2a.xphosphos139抗体(abcam公司)；transwell小室(corning公司)

2.主要仪器：countstar细胞计数仪；荧光倒置显微镜；倒置显微镜

实施例1：as2o3抑制骨肉瘤细胞生长、增殖

1实验方法

1.1台盼蓝染色检测骨肉瘤细胞存活率

1.2实验分组设计：

按照as2o3不同的处理浓度分为以下五组:0μm；0.1μm；0.3μm；1μm；3μm和10μm。

1.3实验检测项目：台盼蓝染色，细胞计数

在u2os骨肉瘤细胞中，分别应用0μm，0.1μm，0.3μm，1μm，3μm和10μm的as2o3处理24h后，进行台盼蓝染色，细胞计数。

1.4数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图1所示，与0μm组比，0.3μm组细胞状态开始改变，但细胞数量无明显变化，随as2o3剂量增加，细胞逐渐变圆，死细胞率显著增加。说明as2o3可显著抑制骨肉瘤细胞的生长增殖，随着as2o3的剂量增加，抑制细胞生长增殖的作用越强。

实施例20.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用抑制骨肉瘤细胞生长、增殖

1实验方法

1.1台盼蓝染色和edu染色检测骨肉瘤细胞存活率

1.2实验分组设计：

实验分为4组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组(光照功率为100mw/cm²，光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²)和联合应用组，联合应用组选取0.3μm的as2o3处理2h后的骨肉瘤细胞，利用450-490nm波长的led-蓝光光源进行光照实验，光照功率为100mw/cm²光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²。

1.3实验检测项目：台盼蓝染色，细胞计数和edu染色

在u2os骨肉瘤细胞中，每组分别处理24h后，进行台盼蓝染色，细胞计数和edu染色，统计活细胞数、死细胞率和edu阳性比率。

1.4数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图2所示，0.3μm的as2o3和led-蓝光单独应用组与对照组相比，细胞状态和细胞数无明显变化，但联合应用组活细胞数显著降低，细胞变圆变亮，死细胞率显著升高(图2a-c)。同时单独应用组edu阳性比率与对照组相比无明显变化，但联合应用组edu阳性比率显著降低(图2d-e)。说明0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用可显著抑制骨肉瘤细胞的生长和增殖。

实施例3：0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用抑制u2os细胞迁移

1实验方法

1.1划痕实验检测骨肉瘤细胞迁移能力

1.2实验分组设计：

实验分为4组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组(光照功率为100mw/cm²，光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²)和联合应用组，联合应用组选取0.3μm的as2o3处理2h后的骨肉瘤细胞，利用450-490nm波长的led-蓝光光源进行光照实验，光照功率为100mw/cm²光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²。

1.3划痕实验

利用200μl枪头在u2os骨肉瘤细胞表面进行划痕，使划痕宽度尽量保持一致，每组分别在处理后24h，48h和72h显微镜下观察并拍照记录两侧细胞迁移情况。

1.4数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图3a-b所示，对照组、0.3μm的as2o3处理组和led-蓝光光照180j/cm²组划痕距离随着时间的推移明显小于联合应用组。说明0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用能够显著抑制u2os细胞迁移。

实施例4：0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用抑制骨肉瘤细胞侵袭

1实验方法

1.1实验分组设计：

实验分为4组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组(光照功率为100mw/cm²，光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²)和联合应用组，联合应用组选取0.3μm的as2o3处理2h后的骨肉瘤细胞，利用450-490nm波长的led-蓝光光源进行光照实验，光照功率为100mw/cm²光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²。

1.2transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭能力

骨肉瘤细胞以2×10⁵个/ml的密度接种在上室，待细胞沉降后换为低血清的培养液，饥饿2h，下室换为正常完全培养液，上室换为低血清培养液后进行处理，每组分别在处理24h后进行结晶紫染色并检测其吸光度。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图3c-d所示，联合应用组结晶紫染色的颜色相较于对照组、0.3μm的as2o3处理组和led-蓝光光照180j/cm²组浅，且吸光度值显著降低。说明0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用能够显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭。

实施例5：0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用诱导骨肉瘤细胞核损伤

1实验方法

1.1实验分组设计：实验分为4组：对照组、0.3μm的as2o3处理组、led-蓝光光照180j/cm²组(光照功率为100mw/cm²，光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²)和联合应用组，联合应用组选取0.3μm的as2o3处理2h后的骨肉瘤细胞，利用450-490nm波长的led-蓝光光源进行光照实验，光照功率为100mw/cm²光照时间为30min，总光照强度为180j/cm²。

1.2γ-h2ax免疫荧光染色实验检测骨肉瘤细胞核损伤

每组处理24h后进行γ-h2ax免疫荧光染色：u2os骨肉瘤细胞以相同的密度接种在孔板中，待细胞沉降后荧光显微镜下观察并拍照。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图4所示，对照组、0.3μm的as2o3处理组和led-蓝光光照180j/cm²组的阳性率显著高于联合应用组。说明0.3μm的as2o3和450-490nmled-蓝光联用能够显著诱导骨肉瘤细胞核损伤。