本发明属于畜牧兽医领域，具体涉一种用于保护鸡红细胞的酸奶乳清及其制备方法与用途。
背景技术：
1993年yamaguchit[1]等人就有相关研究，正常情况下，hb在红细胞内主要以游离状态存在，也有小部分与红细胞膜结合，当hb异常或者膜脂异常暴露以及药物作用时，均可引起hb不可逆地与脂质层结合而导致细胞膜变形扭曲，红细胞膜脂质过氧化是最常见的红细胞损伤，导致细胞溶血，因此一定浓度的氧化物如过氧化氢处理红细胞后hb释放增加。
同时，也有大量研究表明，无论是体内还是体外，过多的氧自由基可引发红细胞膜脂质过氧化，导致细胞氧化损伤，继而导致细胞氧化溶血，是发生溶血性疾病的重要原因之一。2003年刘慧明等基于此做了相关实验[2]，研究槲皮素对过氧化氢诱导的人红细胞氧化损伤的影响，实验结果表明槲皮素对h2o2引发的红细胞氧化损伤有明显的保护作用。
“藏灵菇”又名“西藏雪莲”，是源自西藏藏南的林芝地区和新疆天山天池以上海拔山区的特有珍稀菌种，是西藏林芝和新疆天山土生土长的有生命的菌类[3]。藏灵菇是一种非水溶性的呈乳白色、胶质状的颗粒，直径0.3～3.5cm，其外形酷似米粒[4，5]，不同来源的藏灵菇颗粒的菌群和组成成分有所不同，通常含有乳酸菌和酵母菌，少数含有由蛋白脂质多糖复合体固体基质包裹的乙酸菌，是一个微型共生菌落体[6]。
乳清(whey)是酸奶制作过程中，牛奶凝固成乳块后析出的浅绿色、透明液体状物质。乳清的组成成分与母乳及其相似，其含有的营养成分基本上都为可溶性成分，如乳清卵白、乳糖、磷脂、矿物质和维生素等，因此人体可以对乳清进行吸收利用。乳清粉即为新鲜乳清经巴氏消毒之后，再利用冷冻干燥技术制成的粉末[7,8]。乳清粉中除水分以外的其他成分的比例与新鲜的乳清一致。在某些国家，大部分的乳清会被用来乳清浓缩液或直接喷雾干燥制成乳清粉，另外有少数的乳清会被进一步加工成其他的乳清产品，如脱盐乳清粉、高乳糖乳清粉、低乳糖乳清粉、乳糖、乳清浓缩蛋白(wpc)和乳清分离蛋白(wpl)等。
自由基过量时会与细胞中的蛋白，脂质和dna等生物大分子反应，产生毒害效应，加速细胞的氧化衰老，缩短机体寿命等[10]，虽然正常细胞内存在清除自由基的防御系统，一定程度上可降低自由基对细胞的损伤，但这些系统不能完全有效的防止伤害。已有研究表明用抗氧化剂处理细胞则会减少细胞在代谢过程中自由基的形成，从而延缓细胞的衰老，所以通过适当的补充抗氧化剂可以减少机体氧化损伤。
正常情况下，生物体中的自由基能保护生物体避免有害微生物、细菌等侵害[7-9]，但自由基过量时会与细胞中的蛋白，脂质和dna等生物大分子反应，产生毒害效应，加速细胞的氧化衰老，缩短机体寿命[10]，虽然正常细胞内存在清除自由基的防御系统，一定程度上可降低自由基对细胞的损伤，但这些系统不能完全有效的防止伤害。已有研究表明用抗氧化剂处理细胞则会减少细胞在代谢过程中自由基的形成，从而延缓细胞的衰老，所以通过适当的补充抗氧化剂可以减少机体氧化损伤，gsh-px(谷胱甘肽过氧化物酶)是体内产生的常见的抗氧化物质。口服、静脉滴注化学药品谷胱甘肽在临床上都有应用，但很难起到抗氧化的作用，唯一可行的方法是：食用含gsh前体的食品(如乳清蛋白质粉)，然后在细胞内转化为gsh从而起到良好的抗氧化作用，防止细胞受到损伤。但这些前体物质在体外也较为容易失活，存在不容易失活的抗氧化药物的需求。
未见藏灵菇发酵所得乳清在抗氧化，特别是在对鸡红细胞的氧化损伤的保护方面的报道。
参考文献
[1]yamaguchit,kuranoshitak,haranot,etal.effectsofdrugs,salts,anhphospholipidvesiclesonhemoglobinreleasefromhydrostaticpressure-treatedhumanerythrocytes[j].jbiochem,1993,113(4):513-518.
[2]liuhm(刘慧明),dingh(丁航),houg(侯敢).quercetinonoxidativedamageinducedbyhydrogenperoxideinhumanerythrocytesinhibited[j].journalofguangdongmedicalcollege(广东医学院学报),2003,(04):317-318.
[3]e.r.farnworth,kefiracomplexprobiotic,foodscience&technologybulletinfunctionalfoods,2(2005)1-17.
[4]zhoujz(周剑忠),dongms(董明盛),jinghh(江汉湖).studyonmicrobialpopulationstructureofthemolecularpropertiesoftibetankefir,microorganism,33(2006)31-31.
[5]g.papavasiliou,y.kourkoutas,a.rapti,v.sipsas,m.soupioni,a.a.koutinas,productionoffreeze-driedkefircultureusingwhey,internationaldairyjournal,18(2008)247-254.
[6]j.z.zhou,x.l.liu,h.h.jiang,m.s.dong,analysisofthemicrofloraintibetankefirgrainsusingdenaturinggradientgelelectrophoresis,foodmicrobiology,26(2009)770.
[7]d.wu,a.i.cederbaum,alcohol,oxidativestressandfreeradicaldamage,proceedingsofthenutritionsociety,65(2006)278-290.
[8]j.r.speakman,c.selman,thefree-radicaldamagetheory:accumulatingevidenceagainstasimplelinkofoxidativestresstoageingandlifespan,bioessaysnews&reviewsinmolecularcellular&developmentalbiology,33(2011)255-259.
[9]d.gems,r.doonan,antioxidantdefenseandagingin:istheoxidativedamagetheoryofagingwrong？,cellcycle,8(2009)1681.
[10]j.r.speakman,c.selman,thefree-radicaldamagetheory:accumulatingevidenceagainstasimplelinkofoxidativestresstoageingandlifespan,bioessaysnews&reviewsinmolecularcellular&developmentalbiology,33(2011)255-259.
[11]韩立伟，李锦莲.紫外分光光度法测定吐温80对人红细胞和兔红细胞的溶血度[j].西南国防医药，2004，14(3):255-256.
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本申请通过过氧化氢处理的鸡红细胞作为红细胞氧化损伤的模型，并测试了藏灵菇发酵酸奶乳清对鸡红细胞的保护作用。
本发明创造性的在乳清蛋白生产过程中加入了藏灵菇，其在发酵过程中产生的代谢产物具有良好的抗氧化性，能有效的减轻自由基对细胞危害，提高乳清蛋白对细胞的保护作用。
较具体地，本申请提供了一种用于保护鸡红细胞的酸奶乳清的制备方法，所述酸奶的发酵菌为藏灵菇菌。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤为：
将藏灵菇菌放置于牛奶中，发酵，滤出藏灵菇菌；
将滤出液水浴，待所述滤出液呈现上下两层后，过滤取下清液倒入容器中；
将所述容器急冻；
将所述容器内的所述下清液进行真空冷冻干燥，收集冻干的乳清。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤为：
将藏灵菇菌放置于2-4％(w/v)纯牛奶中，35-39℃条件下发酵12-36h，滤出藏灵菇菌；
将滤出液于50-60℃水浴15-45min，待所述滤出液呈现上下两层后，过滤取下清液倒入容器中；
将所述容器在-90--70℃下急冻5-10h；
将所述容器内的所述下清液进行真空冷冻干燥6-24h，收集冻干的乳清。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤为：
将藏灵菇菌放置于3％(w/v)纯牛奶中，37℃条件下发酵24h，滤出藏灵菇菌；
将滤出液于55℃水浴30min，待所述滤出液呈现上下两层后，过滤取下清液倒入容器中；
将所述容器在-80℃下急冻8h；
将所述容器内的所述下清液进行真空冷冻干燥12h，收集冻干的乳清。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤还包括：
将冻干样品打粉。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤还包括：
用粉碎机将冻干样品打粉30s。
在一些实施方案中，所述乳清的制备步骤还包括：
乳清粉真空包装。
本申请还提供了上述任何实施方案或其任意组合所述的用于保护鸡红细胞的酸奶乳清的制备方法制备的用于保护鸡红细胞的酸奶乳清。
本申请还提供了上述实施方案的用于保护鸡红细胞的酸奶乳清在治疗或预防过氧化氢对鸡红细胞的损伤中的用途。
本申请还提供了上述实施方案的用于保护鸡红细胞的酸奶乳清在治疗或预防鸡红细胞的溶血中的用途。
本申请研究了藏灵菇发酵酸奶乳清蛋白质粉对鸡血细胞的保护作用。由本实验可以看出，与生理盐水对照组相比较，当乳清浓度为1、3、5mg/ml时，鸡血细胞损伤均有不同程度的降低，但3mg/ml的乳清对细胞的保护作用更为显著，由此说明一定浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清对氧化损伤的细胞具有保护作用。
通过实验发现，藏灵菇发酵酸奶乳清是一种很好的抗氧化剂，一定浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清能够有效的清除细胞内的氧自由基，降低细胞的损伤，进一步证明了乳清对细胞抗氧化具有一定的增强效果。
附图说明
图1示出了不同浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清对h2o2损伤的保护作用。
图2示出了不同浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清对h2o2损伤的保护作用。
图3示出了不同浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清对抗h2o2诱导的氧化活性。
具体实施方式
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的各个实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。
材料与试剂
藏灵菇菌种,由抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心保存；伊利纯牛奶(购于超市)；鸡血样本，清晨于菜市场采取新鲜三黄鸡公鸡血，置于4℃冰箱中保藏。dmem高糖培养基(美国hyclone公司)；dmso(美国sigma-aldrich公司)；氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠(西陇化工有限公司)。
实施例1：藏灵菇酸奶乳清粉的制备
将藏灵菇放置于3％(w/v)纯牛奶中，37℃条件下发酵24h，滤出藏灵菇菌，滤出液即为用于提取乳清的酸奶。将滤出液于55℃水浴30min，呈现出上层酪蛋白与下层黄绿色乳清鲜明的两层，过滤取下清液倒入培养皿内，保证高度不超过1cm，-80℃急冻8h之后，转移至真空冷冻干燥箱内，进行真空冷冻干燥12h，收集冻干的乳清，用粉碎机将冻干样品打粉30s，收集乳清粉用真空包装，放在通风干燥环境中保存。
实施例2：鸡红细胞悬液的制备实验
取2ml新鲜鸡血于事先加有肝素的离心管中，1500rpm离心5min(离心后去上清液，加0.85％生理盐水，混匀，再弃去上清液后再离心，可重复这个操作，不超过3次，直至离心后上清液透亮)制备压积红细胞，然后取100μl加入到9.9ml的生理盐水中，缓慢吹打混匀，即是1％的红细胞悬液。
实施例3：藏灵菇发酵酸奶乳清对鸡红细胞存活率的影响实验1
取200μl、0.5％的h2o2，加入到等体积的1％的红细胞悬液中，并设置无h2o2的对照组混匀，室温条件下保温30min。分别取400μl的不同浓度的乳清溶液和生理盐水，加入到等体积的红细胞处理液中混匀，室温条件下保温30min后，2000rpm，5min离心两次。向沉淀中加入500μl、0.85％生理盐水，轻轻吹打几次，制成细胞悬液。分别向每组悬液中加入2-3滴0.4％的台盼蓝染液，混合，染色2min后镜检拍照。
台盼蓝为无毒染料，其氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力所以可以将蓝色的台盼蓝还原成无色状态，因此镜检时可见死细胞被染成蓝色。
用不同浓度的乳清对0.5％h2o2处理的红细胞的保护作用的结果如图1所示(a-d为生理盐水对照组，其乳清样液浓度依次为0mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml；e-h为h2o2处理组，其乳清样液浓度依次为0mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml)，蓝色细胞所占比例越小说明细胞受损伤死亡越少。图中结果显示在不同处理下细胞均有死亡而当乳清浓度为3mg/ml时，不论是在生理盐水处理组还是在0.5％h2o2处理蓝色比例均小于其他实验组，表明一定浓度的乳清对鸡血细胞的成活具有保护作用。
在图2中，不同浓度的乳清对h2o2损伤的保护作用。a,生理盐水组；b,1mg/ml乳清组；c,3mg/ml乳清组；d,5mg/ml乳清组；比例尺，100μm。
根据比例尺可见，四个视野的面积相同，其中可见未染成蓝色的活细胞数量分别依次为：7、25、27、29个，这说明乳清处理后的细胞，活细胞数量多，从一定程度上可以说明乳清可以减轻h2o2对红细胞的损伤。
实施例4：藏灵菇发酵酸奶乳清对鸡红细胞存活率的影响实验2mtt比色法测定鸡红细胞成活率
取200μl、0.5％的h2o2，加入到等体积的1％的红细胞悬液中，并设置无h2o2的对照组混匀，室温条件下保温30min。分别取400μl的1mg/ml、3mg/ml和5mg/ml的乳清溶液和等体积的生理盐水，加入到等体积的红细胞处理液中混匀，室温条件下保温30min后，2000rpm，5min离心两次。最后使用微量吸样器，在96孔酶标板中，在含有样品的各孔中加入20μl的mtt(3-(4,5-二甲基噻
用不同浓度的乳清对0.5％h2o2预处理的红细胞在490nm处测光吸收值(od值)。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的od值，来判断活细胞数量，od值越大，细胞活性越强，受损伤程度越低，结果如图3所示，在过氧化氢氧化损伤的情况下，不同浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清均能抑制过氧化氢对鸡红细胞的氧化损伤作用。
实施例5：藏灵菇发酵酸奶乳清对鸡红细胞溶血度的影响实验
将配成浓度为1％的红细胞悬液，于37℃温育5min，然后加入终浓度为5％的h2o2引发溶血，再置37℃温育30min。取反应混合液1ml，用1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml的乳清2ml稀释，2000rpm，离心10min，取上清液于紫外分光光度计(上海谱元仪器有限公司)540nm处测吸光值a；同样取1ml反应混合液，用蒸馏水2ml稀释使红细胞完全溶血，同样条件下离心后在540nm处测吸光值b，按公式(a/b)×100％计算百分溶血度[11]。
溶血表明红细胞损伤破裂，血红蛋白逸出，而od值即吸光值越大表明红细胞损伤越严重。由表1可以看出，经浓度1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml藏灵菇发酵酸奶乳清处理的鸡血细胞的吸光值分别为0.791、0.623、和0.699，3mg/ml组的细胞溶血度较生理盐水组有显著性差异，而1mg/ml组与5mg/ml的藏灵菇发酵酸奶乳清处理组则差异不显著。
表1不同乳清浓度对细胞溶血度的影响
有上面表1的数据可知，3mg/ml乳清对红细胞溶血度的抑制效果更好。
讨论
我们研究了藏灵菇发酵酸奶乳清对鸡血细胞的保护作用。由实验可以看出，与生理盐水对照组相比较，当乳清浓度为1、3、5mg/ml时，鸡血细胞损伤均有不同程度的降低，但3mg/ml的乳清对细胞的保护作用更为显著，由此说明一定浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清对氧化损伤的细胞具有保护作用。
藏灵菇发酵酸奶乳清是一种很好的抗氧化剂，一定浓度的藏灵菇发酵酸奶乳清能够有效的清除细胞内的氧自由基，降低细胞的损伤，进一步证明了乳清对细胞抗氧化具有一定的增强效果。
以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。