白头翁皂苷B5在制备预防和/或治疗肠病毒感染的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，特别涉及化合物的应用。

背景技术：

肠病毒在病毒学上的分类是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒群(enterovirus)。ev71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。其它同属于肠病毒群之病毒尚包括小儿麻痹病毒(polioviruses；具3种型别)、柯萨奇病毒(coxsackieviruses；a型具23种型别、b型具6种型别)、伊科病毒(echoviruses；具31种型别)及肠病毒(enteroviruses68～72型)。

肠病毒的流行与季节转换、环境变异有着极大的关联性，肠病毒只在夏季及初秋流行，每年六～九月为高峰期，气温过低的地区并不利于肠病毒生存。根据流行病学调查，肠病毒之传染途径主为粪--口传染(stool-oral)，感染肠病毒的患者会经由粪便排出病毒，这些含有高浓度肠病毒的粪便会污染环境甚至地下水源，在公共卫生条件不佳的地区，极易经由污染的水源而散播该病毒。由于肠病毒除了在肠道外亦可在扁桃腺增殖，因此病患的唾液或口鼻分泌物也会带有高浓度的病毒，所以不排除经由空气或接触等传染途径。因此防治肠病毒之流行除了重视个人卫生外，公共卫生及环境卫生亦不容忽视。

肠道病毒71型是引起婴幼儿手足口病(hand-footandmouthdisease；hfmd)主要病原体之一。肠病毒在病毒学上的分类是属于微小病毒科(picornaviridae)中的肠病毒群(enterovirus)。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesusmonkeykidneycell；rhmk)及人胚二倍体细胞(humanfetaldiploidcell)中。ev71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒，其感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。

由于ev71对于中枢神经系统有极高的感染性，故临床上出现之症状包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(asepticmeningitis)、急性无力肢体麻痹(acuteflaccidparalysis)、手足口症(hand-foot-mouthdisease)、泡疹性咽峡炎(herpangina)、急性出血性结膜炎(acutehemorrhagicconjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonicjerk)、头痛(headache)、发烧(fever)及呕吐(vomiting)等，而其中以手足口症及泡疹性咽峡炎最为常见。一般而言，感染肠病毒多为无症状(约50～80％)或出现轻微类似感冒的症状，病人会自然痊愈而产生抗体，但因感染肠病毒且转成重症之患者却有极高的机率死于心肺衰竭及广泛性的脑干伤害，因此，提供一种有效预防或治疗肠病毒感染的药物具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种化合物的应用。本发明试验表明，白头翁皂苷b5能够预防和/或治疗肠病毒感染，其中，肠病毒为ev71。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了白头翁皂苷b5在制备预防和/或治疗肠病毒感染的药物中的应用。

白头翁皂苷b5的结构如式i所示：

本发明还提供了白头翁皂苷b5在制备肠病毒rd细胞凋亡的抑制剂中的应用。

本发明还提供了白头翁皂苷b5在制备肠病毒cleavedparp、3c-pro或vp-1蛋白表达的抑制剂中的应用。

本发明还提供了白头翁皂苷b5在制备肠病毒mavs、p-irf3、ifn-β或bcl-2蛋白表达的激活剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述肠病毒为ev71。

在本发明的一些具体实施方案中，白头翁皂苷b5的有效剂量为25～100mg/kg小鼠体重。

在本发明的一些具体实施方案中，白头翁皂苷b5的有效剂量为0.6～200μmol/(1×10⁵个cell)。

本发明还提供了cleavedparp、3c-pro、vp-1、mavs、p-irf3、ifn-β或bcl-2蛋白作为肠病毒治疗的靶标的用途。

本发明提供了白头翁皂苷b5在制备预防和/或治疗肠病毒感染的药物中的应用。具体的，肠病毒为ev71。

体内药效学实验结果显示，病毒感染后模型组小鼠多数出现一侧或双侧后肢明显僵直，爬行困难，生长变慢并死亡；b5给药组小鼠上述症状明显减轻，且b5给药组存活率均比造模组高，其中b5低剂量组的存活率达到100％。上述结果表明，白头翁皂苷b5对ev71感染小鼠具有明显的保护作用，可防止或缓解ev71病毒感染所导致的小鼠肢体僵直、甚至瘫痪等症状，提高小鼠存活率。

组织病理切片结果表明，白头翁皂苷b5给药组小鼠肌肉组织有明显改善。

对病毒外壳蛋白的影响：从小鼠肌肉组织免疫组化结果图3看来，造模组小鼠肌肉组织中vp-1的表达量增多，而b5给药组小鼠肌肉组织中vp-1的表达量呈显著性减少。

病毒滴度测定结果如图4所示，b5给药组病毒总颗粒数比ev71感染组少，且有统计学差异(p<0.05)。

对细胞凋亡的影响：白头翁皂苷b5对ev71引起rd细胞凋亡起抑制作用(p<0.05)。

对相关蛋白表达的影响：白头翁皂苷b5(200μmol·l^-1)给药组显著下调rd细胞中的cleavedparp、3c-pro、vp-1蛋白的表达并上调bcl-2蛋白的表达(p＜0.05)，说明白头翁皂苷d可以抑制rd细胞的凋亡。此外，白头翁皂b5可激活rd细胞的天然免疫信号通路相关蛋白mavs、p-irf3、ifn-β的表达，与对照组比较，差异均有统计学意义(p＜0.05)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示药效学评价结果；其中，图1(a)示体重变化；图1(b)示存活率的变化；

图2示对组织病理学的影响；在400倍镜下拍摄的肌肉组织；

图3示对病毒外壳蛋白的影响；其中，图3(a)示小鼠肌肉组织免疫组化结果；图3(b)示光密度的结果；

图4示对病毒滴度的影响；

图5示对细胞凋亡的影响；

图6示对相关蛋白表达的影响。

具体实施方式

本发明公开了一种化合物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的化合物的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

实验动物：2日龄icr小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司)，平均体重在1.6-1.8克。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1体内药效学评价

将2日龄小鼠分为6组：阴性组：不感染病毒；模型组：腹腔注射感染病毒，病毒滴度为10⁶pfu，感染剂量为10μl/g，感染病毒24h后，每天腹腔注射10μl/g生理盐水；阳性对照组：感染病毒24小时后，每天腹腔注射利巴韦林(ribavirin)治疗，剂量为100mg/kg；实验组：感染病毒24小时后，每天腹腔注射白头翁皂苷b51次，剂量分别为25，50,100mg/kg，每组实验动物为12只。将小鼠禁食5h后腹腔注射ev71病毒(以腹腔注射感染ev71病毒当天记为第0天)，感染ev71病毒之后，每天纪录小鼠的死亡情况，运动能力，前后肢僵直小鼠只数，饮食情况并称取小鼠体重。病毒感染第5天对小鼠进行断头取血处理。

体内药效学实验结果显示，病毒感染后模型组小鼠多数出现一侧或双侧后肢明显僵直，爬行困难，生长变慢并死亡；b5给药组小鼠上述症状明显减轻，且b5给药组存活率均比造模组高，其中b5低剂量组的存活率达到100％。上述结果表明，白头翁皂苷b5对ev71感染小鼠具有明显的保护作用，可防止或缓解ev71病毒感染所导致的小鼠肢体僵直、甚至瘫痪等症状，提高小鼠存活率。造模组和给药组小鼠体重均比正常组小鼠体重轻，但没有统计学差异。结果见图1(a)、图1(b)。

实施例2组织病理切片

将各组小鼠肌肉组织放入4％多聚甲醛中固定24h后，石蜡包埋，切片并进行苏木精—伊红染色法(he)染色，光学显微镜下观察并拍照。

对组织病理学的影响：造模组小鼠肌肉组织呈现纤维断裂，萎缩现象，白头翁皂苷b5给药组小鼠肌肉组织有明显改善。图2为在400倍镜下拍摄的肌肉组织。

实施例3免疫组化

将小鼠肌肉组织用4％多聚甲醛固定后，用脱水石蜡包埋，4μm连续切片，将组织切片浸泡于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇(无水乙醇→95％乙醇→90％乙醇→80％乙醇→70％乙醇→蒸馏水)浸泡水化，每个梯度浸泡5min，蒸馏水洗3次，每次5min，3％h2o2消除内源性过氧化物酶；行抗原微波热修复；滴加5％bsa(牛血清白蛋白)封闭液，室温15min，甩去多余液体；滴加一抗(500倍稀释的鼠抗人vp-1抗体)；4℃过夜，室温平衡后，pbs洗3次，每次2min。滴加生物素化二抗，37℃20min，pbs洗3次，每次2min；滴加链霉素化亲和素试剂，37℃20min，pbs洗4次，每次5min，dab显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检，每张片随机观察6个高倍视野(400x)，拍照，用imageproplus6.0软件分析计算每张相片的积分光密度值(integratedoptiondensity,iod)。阳性判断以胞浆和或胞膜着咖啡色，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为vp-1阳性细胞。

对病毒外壳蛋白的影响：ev71的基因分型主要基于其基因组的4个区域：vp1、vp2、vp4、5’utr或全基因。vp1位于病毒胞膜蛋白外，且病毒的主要抗原决定簇位于vp1上，因此vp-1的表达与病毒数目有着密切的关系。从小鼠肌肉组织免疫组化结果图3(a)、图3(b)看来，造模组小鼠肌肉组织中vp-1的表达量增多，而b5给药组小鼠肌肉组织中vp-1的表达量呈显著性减少。

实施例4测定病毒滴度

取对数生长的rd细胞(横纹肌瘤细胞)，用含10％胎牛血清(fbs)的dmem完全培养基将细胞数调整至1×10⁵个/ml，接种于60mm²培养皿，3ml/皿，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。次日，将完全培养基吸走，加入饥饿培养基(含2％fbs的dmem培养基)并分组给药，给药组给予30μl的200μmol·l^－1白头翁皂苷b5，造模组给予相同体积的饥饿培养基，给药1h后造模，给药组和造模组分别给予30μlev71病毒原液，ev71造模24小时后收集上清液，并冻于-80℃冰箱。

取对数生长的rd细胞，用含10％fbs的dmem培养基将细胞数调整至1×10⁵个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。次日，在ep管中做10倍梯度稀释收集的ev71组和b5(200μm)组病毒保存液，连续7个稀释度。稀释方法如下：准备7个1.5mlep管，第一管加入0.9ml培养液(含2％fbs的dmem培养基)，其余的管加入1.8ml培养液，往第一个管中加入100μl病毒保存液，混匀后，吸取200μl加入第二个管混匀。依此类推，做7个稀释度(10～10-7)。吸取96孔板中原有的培养基，加入稀释好的病毒液，每孔100μl，做好标记后将细胞置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。培养结束后，在倒置显微镜下观察，计算每一病毒稀释度培养液培养的细胞出现致细胞病变效应(cpe)的孔数，只要有一小点或一些细胞出现cpe，即为阳性，如无法判断，可与阴性对照比较。

对病毒滴度的影响：病毒滴度测定结果如图4所示，b5给药组病毒总颗粒数比ev71感染组少，且有统计学差异(p<0.05)。

实施例5细胞活力检测

取对数生长的rd细胞，用含10％fbs的dmem培养基调整细胞悬液浓度至1×10⁵个·ml^-1，接种于96孔板中，每孔100μl，置培养箱中培养过夜。次日分组给药，每组均设3个复孔，给药组白头翁皂苷b5终浓度为200μmol·l^－1，对照组和造模组加入等体积的含2％fbs的饥饿培养基；给药1h后，造模组和给药组分别给予ev71病毒原液1μl，对照组加入等体积的饥饿培养基。ev71感染24h后，每孔加入10μlmtt(5mg·ml^-1)，置于培养箱中继续培养4h。培养结束后弃去上层液体，每孔加入100μldmso溶液，于摇床上振摇20min，使结晶完全溶解，酶标仪检测490nm处各孔吸光度值(a值)，重复实验3次。

对细胞凋亡的影响：从mtt实验结果得到，白头翁皂苷b5对ev71引起rd细胞凋亡起抑制作用(p<0.05)，结果如图5所示。

实施例6westernblot实验

取对数生长的rd细胞，用含10％胎牛血清(fbs)的dmem完全培养基将细胞数调整至1×10⁵个/ml，接种于60mm²培养皿，3ml/皿，置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。次日，将完全培养基吸走，加入饥饿培养基(含2％fbs的dmem培养基)并分组给药，给药组给予30μl的200μmol·l^－1白头翁皂苷b5，造模组给予相同体积的饥饿培养基，给药1h后造模，给药组和造模组分别给予30μlev71病毒原液，ev71感染24小时后，收集皿底细胞，提取蛋白。用bca法测定蛋白浓度后，将蛋白原液稀释成最终蛋白样品。蛋白样品经电泳、转膜、封闭、一抗4℃孵育过夜、tbst漂洗、二抗室温孵育1.5h、tbst漂洗后用ecl化学发光显色法检测，使用imagej软件分析图片中条带灰度值。实验重复3次。

对相关蛋白表达的影响：与对照组相比，白头翁皂苷b5(200μmol·l^-1)给药组显著下调rd细胞中的cleavedparp、3c-pro、vp-1蛋白的表达并上调bcl-2蛋白的表达(p＜0.05)，说明白头翁皂苷b5可以抑制rd细胞的凋亡。此外，白头翁皂b5可激活rd细胞的天然免疫信号通路相关蛋白mavs、p-irf3、ifn-β的表达，与对照组比较，差异均有统计学意义(p＜0.05)。结果见图6。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。