本发明总体涉及猪健康领域。猪易于受许多致病性微生物影响。通常通过稳定和饲料管理、用药物诸如抗病毒药物和抗生素治疗，或使用疫苗的预防性治疗进行感染的控制。具体而言，本发明涉及针对猪环状病毒2型(pcv-2)和prrs(猪繁殖与呼吸综合征)病毒的疫苗，以及使用该疫苗针对此类感染保护动物的方法。
背景技术：
：pcv2和prrs病毒是两种在养猪业中引起显著经济损失的病毒。pcv-2与在幼猪中观察到的断奶后多系统衰竭综合征(pmws)有关。在1991年在加拿大首次遇到该疾病。临床体征和病理学发表于1996年，并且包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促和偶尔的黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。nayar等人,can.vet.j.volume38,june1997在具有pmws的临床症状的猪中检测到猪环状病毒，并得出结论认为，一种不同于被认为是pk-15细胞的天然栖息者的已知pcv的pcv可与pmws相关。后来的出版物(hamel等人,j.virol.,72(6),5262-5267,1998;meehan等人,j.gen.virol.,79,2171-2179,1998)证实了这些发现，并且提出(meehan等人，同上)将新的致病性pcv称为pcv-2，而原始的pk-15细胞培养分离物(tischer等人,nature295,64-66,1982)应被称为pcv-1。pcv-2是一种小的(17-22nm)二十面体无包膜病毒，其含有环状单链dna基因组。pcv-2基因组的长度为约1768bp。源自世界不同地区的pcv-2分离物似乎彼此密切相关，并展现95％至99％核苷酸序列同一性(fenaux等人,j.clin.micorbiol.,38(7),2494-2503,2000)。pcv的orf-2编码病毒的衣壳蛋白。pcv2的orf2编码约233个氨基酸的蛋白。所有pcv-2分离物的orf2共享91-100％核苷酸序列同一性和90-100％推导的氨基酸序列同一性。在1987年首次在北美和中欧报道了prrs病毒。prrs病毒是一种小的包膜rna病毒。其含有单链、正义的rna基因组，其大小为约15千碱基。所述基因组包含九个开放阅读框。该病毒是网巢病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员。prrsv的两种原型毒株是北美毒株vr-2332和欧洲毒株lelystad病毒(lv)。欧洲和北美prrsv毒株引起类似的临床症状。在2000年代早期，在中国出现了北美基因型的高致病性毒株。该毒株hp-prrsv比所有其它毒株毒性更大，并且在全世界的亚洲国家中引起巨大损失。对于任何prrs病毒，亚临床感染是常见的，其中临床体征仅偶尔发生在畜群中。临床体征包括母猪的繁殖失败，诸如流产和产下死胎或木乃伊胎儿，以及耳和外阴的紫绀。在新生猪中，该疾病引起呼吸窘迫，其中对呼吸道感染诸如格雷舍氏病的易感性增加。针对上述鉴定的病原体的疫苗是众所周知的。用于针对pcv2感染预防性治疗动物(特别是猪)的常规疫苗可以基于作为(非复制型)免疫原的完整灭活的pcv-2病毒。此外，在本领域中已经显示orf2编码的衣壳蛋白(例如当重组表达时)适合作为猪环状病毒2型的亚单位免疫原用于适当的疫苗中。这是可以理解的，因为该亚单位在循环系统中以与病毒本身相同的方式显现，基本上不同之处在于衣壳内不存在dna和非结构蛋白的事实。在本领域中，几种针对pcv2的疫苗是商购可得的。porcilis®pcv(可得自msdanimalhealth,boxmeer，荷兰)是一种用于针对猪环状病毒2型保护猪的疫苗，其用于3周和更大的猪。当作为两次注射(双剂量)疫苗给予时，免疫的持续时间(doi)为22周，几乎完全覆盖了猪的育肥期。ingelvaccicroflex®(可得自boehringeringelheim,ingelheim)是一种用于针对猪环状病毒2型保护猪的疫苗，其用于2周和更大的猪。其仅作为一次注射(一个剂量)疫苗注册。circovac®(可得自merial，法国里昂)是一种用于针对猪环状病毒2型保护猪的疫苗，其用于3周和更大的猪。suvaxyn®pcv(可得自zoeitis,capellea/dijssel，荷兰)是一种用于针对猪环状病毒2型保护猪的疫苗，其用于3周和更大的猪。其它pcv2疫苗描述于例如wo2007/028823、wo2007/094893和wo2008/076915中。关于prrs病毒，尽管灭活病毒疫苗已经被描述并且是商购可得的，但包含欧洲型(i型)或北美型(ii型)的活减毒形式的修饰的活疫苗(mlv)疫苗是用于其控制的主要免疫学工具。几种疫苗在本领域中是商购可得的。porcilis®prrs(可得自msdanimalhealth,boxmeer，荷兰)是包含活减毒prrs病毒i型的疫苗，并且注册为减少由prrs病毒感染引起的感染(病毒血症)。ingelvacprrs®mlv(可得自boehringeringelheim,ingelheim)是一种有助于减少由prrs病毒引起的疾病的疫苗，并且该疫苗提供针对不同类型的毒株的交叉保护。fostera®prrs(可得自zoeitis,florhampark,newjersey,usa)也是mlv疫苗，并且注册用于针对由prrs病毒引起的呼吸和生殖形式的疾病进行保护。其它prrs疫苗描述于例如wo2006/074986、us8728487和wo2014/048955中。发明目标对于方便、安全和有效的管理猪健康的方式存在持续需求。本发明的目标是提供满足这种需求、特别是对于新型pcv2/prrs病毒组合疫苗的需求的疫苗。发明概述为了实现本发明的目标，已经设计了新疫苗，所述疫苗包含组合的猪环状病毒2型的非复制型免疫原和活减毒prrs病毒，其中所述疫苗除了所述免疫原以外还包含白蛋白(即水溶性、可热变性、非糖基化的球状蛋白中的任一种，尤其在血清和蛋清中发现)。尽管两种病毒疫苗都是已知且商购可得的，并且甚至这些免疫原的组合已经在本领域中显示，但仍存在持续的改进需求，特别是导致有效且同时对于年幼动物中的使用安全的疫苗。申请人认识到pcv亚单位疫苗可能干扰活prrs病毒以抑制其活力。这可以导致prrs病毒组分在组合疫苗中的效力降低。通过向组合疫苗中添加白蛋白，看起来降低prrs病毒活力的抑制。如众所周知，并非所有设想或建议的抗原组合都可以产生安全且最佳有效的组合疫苗。事实上，即使当单一(单价)疫苗安全且有效时，关于任何组合疫苗的安全性和有效性也存在高度不确定性。欧洲药物产品评价机构(emea)的兽药产品委员会在其出版物“noteforguidance:requirementsforcombinedveterinaryproducts”(emea,2000,cvmp/iwp/52/97-final)中指出(第2/6页)，“组合疫苗的开发并不简单。应当在质量、安全性和有效性方面单独开发和研究每种组合”。该委员会进一步表明，寻找良好组合疫苗通常包括组合疫苗中单个组分(包括例如防腐剂、赋形剂和稳定剂、灭活剂和佐剂)之间的相容性。在第3页，顶部段落，指出“在组合疫苗中，与当单独施用特定组分时相比，多于一种组分的存在经常可以引起相互作用，导致对单个组分的反应减弱或增加……此类相互作用性质上经常是免疫学的，但也可以由对免疫系统的直接影响较小的其它因素引起”，并且还指出“当一种佐剂用于增强对组合疫苗的免疫反应时，可出现特殊问题”。美国健康与人类服务部，食品和药物管理局，生物制剂评估和研究中心在1997年4月出版了“guidanceforindustry,fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases:production,testingandclinicalstudies”，在该指南中指出(第3页，“组分的相容性”的下文中)，“经验已显示，将单价疫苗组合可以导致一种新的组合，其安全性或有效性低于所需。有时，灭活疫苗的组分可不利地作用于一种或多种活性组分”，表明特别是灭活疫苗可能负面影响活疫苗的效力，诸如例如当将活百日咳疫苗和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗组合时所发生，其产生百日咳效力降低的疫苗。表明当与单个的疫苗相比时，疫苗中的任何额外组分可能使最终产品的安全性和效力复杂化。世界卫生组织(who)已经公开了称为“疫苗安全基础”的电子学习课程，其在模块2中考虑了组合疫苗。该模块开始于“经许可的组合疫苗在由国家主管部门批准前经历广泛测试，以确保产品是安全、有效并具有可接受的质量”。还指出，“因此，对于所有组合，制造商必须评估每种抗原组分的效力，在组合时疫苗组分诱导免疫的有效性，可能恢复为毒性的风险，以及与其它疫苗组分的反应”。总而言之，众所周知，组合疫苗的开发，并不简单，并且需要实验来确定安全性和有效性。本发明还涉及用于针对猪环状病毒2型(pcv2)感染和prrs病毒感染预防性治疗动物的疫苗，所述疫苗包含组合的猪环状病毒2型的非复制型免疫原和活减毒prrs病毒，其中所述疫苗包含白蛋白。此外，本发明还涉及用于通过向动物施用包含组合的猪环状病毒2型(pcv2)的非复制性免疫原、活减毒prrs病毒和白蛋白的疫苗而针对pcv2感染和prrs病毒感染预防性治疗动物的方法。本发明还涉及猪环状病毒2型(pcv2)的非复制型免疫原和活减毒prrs病毒用于制备疫苗中的用途，所述疫苗包含组合的pcv2的免疫原、活减毒prrs病毒和白蛋白，其用于施用于动物以针对pcv2感染和prrs病毒感染预防性治疗动物。应注意，在疫苗中，免疫原(也称为抗原)通常与药学上可接受的载体组合，所述药学上可接受的载体即生物相容性介质，即，在施用后不在受试动物中诱导显著的不良反应、能够在施用疫苗后将免疫原呈递给宿主动物的免疫系统的介质，诸如含有水和/或任何其它生物相容性溶剂的液体，或固体载体，诸如通常用于获得冷冻干燥的疫苗(基于糖和/或蛋白)，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)，其在施用于动物后诱导免疫反应用于针对野生型微生物感染治疗动物，即用于帮助预防、改善或治愈这种感染或由此引起的病症。任选地，根据疫苗的预期用途或所需特性，添加其它物质诸如稳定剂、粘度调节剂或其它组分。定义疫苗是这样的药物组合物，其对施用于受试动物安全，并且能够在该动物中诱导针对致病性微生物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗，如下文所定义。病原体的非复制型免疫原是除了作为整体的活的复制型病原体(呈野生型或减毒形式)以外的对应于病原体的任何物质或化合物，针对所述病原体诱发免疫反应，使得相应的毒性病原体或其毒力因子中的一种或多种将由于这种免疫反应而被宿主的免疫系统识别，并最终至少部分被中和。非复制型免疫原的典型实例是杀死的全病原体和这些病原体的亚单位，诸如衣壳蛋白和表面表达的蛋白，例如重组表达的蛋白。针对病原体感染的预防性治疗有助于预防或改善该病原体感染或由该感染引起的病症(其由致病性病原体的治疗后攻击导致)，特别是在这种攻击后减少其在宿主中的载量，并且任选地有助于预防或改善由病原体的治疗后感染导致的一种或多种临床表现。活减毒病原体是具有降低毒力的病原体的活的能够复制的(存活的)形式。减毒的过程采用感染性病原体并将其改变，以使其变得无害或毒性较小，通常通过使病原体通过细胞系统多次传代或通过遗传修饰病原体。用于预防性治疗的疫苗的单剂量施用意味着为了获得保护性免疫，不需要用疫苗的第二次施用来加强疫苗接种。在两次注射方案中，第一次(引发)疫苗接种通常在第一次施用起6周内加强，通常在第一次施用起3周或甚至2周内加强，并且仅在第二次(加强)施用后，才可以获得保护性免疫，即成功的预防性治疗，如上文所定义。本发明的实施方案在根据本发明的疫苗本身的第一个实施方案中，所述疫苗包含卵清蛋白。卵清蛋白(即来自蛋白的白蛋白)看起来适合于抑制prrs病毒活力的降低，并且与例如牛白蛋白相反，涉及较少的安全性问题(具体而言不存在与牛海绵状脑病相关的朊病毒蛋白)。在第二个实施方案中，白蛋白浓度为1至10%(w/w)。在实验上，发现0.3％、1％和3％白蛋白的量实际上是可行的。基于注意到的白蛋白的效果和溶解度，据信最佳浓度为0.1至10％(白蛋白重量占总疫苗重量)。具体而言，可以在该实施方案中使用0.1、0.2、0.3、0.4、……1、2、3、4、5、6、7、8、9或10%w/w的任何量(和任何中间量)。在另一个实施方案中，pcv2的非复制型免疫原是重组表达的pcv2的orf2蛋白。已证明这种重组蛋白适合应用于本发明中。具体而言，orf2蛋白可以在杆状病毒表达系统中表达，诸如wo2007/028823、wo2007/094893或wo2008/076915中所述。在又另一个实施方案中，所述疫苗另外包含猪肺炎支原体(m.hyo)的非复制型免疫原。在该实施方案中，所述疫苗能够通过仅使用一种疫苗来提供针对三种主要猪病原体的保护。存在针对m.hyo的许多商业疫苗，并且这些通常用于大多数商业猪养殖操作中。通常，这些疫苗包含非复制型免疫原，诸如亚单位蛋白和/或菌苗(即一种组合物，其包含杀死的细菌(作为完整细胞、(部分)裂解、均质化，弗氏压碎(frenchpressed)，这种组合)，或包含另一种形式的杀死的细菌，只要该组合物源自杀死的细菌培养物)，其通常通过肠胃外注射来施用。一些实例为：respisure®(zoetis)、ingelvac®m.hyo和mycoflex®(boehringeringelheim)、hyoresp®(merial)、stellamune®mycoplasma(elancoanimalhealth)、fostera®pcvmh(zoetis)和m+pac®(msdanimalhealth)。在根据本发明的疫苗的特定用途的第一个实施方案中，所述疫苗用于施用至动物的真皮中。尽管设计新的组合疫苗本身已经不容易，设计用于特定的施用部位的组合疫苗甚至更不简单。例如，世界卫生组织(who)已公开了称为“疫苗安全基础”的电子学习课程，在该课程中在第53页报道了“施用途径是使疫苗(或药物)与身体接触的途径。这是免疫成功的关键因素。必须将物质从进入部位转运至需要其发挥作用的身体部分。然而，使用身体的转运机制用于此目的，不是轻而易举的”。在这方面，加利福尼亚州健康服务部的免疫分部已出版了用于正确免疫的指南(http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/d/vacc_admin.pdf)。关于施用部位，在第7页，第一个完整段落中指出“每种疫苗的推荐途径和部位基于临床试验、实践经验和理论考量。对于每种疫苗，该信息包括在制造商的产品信息中。有五种途径用于疫苗的施用。违背推荐途径可以降低疫苗效力或增加局部不良反应”。在第14页，提及了唯一的美国许可的皮内疫苗：“fluzoneintradermal是唯一的美国许可的通过皮内途径施用的疫苗。它仅被批准用于年龄18至64岁的人。该fluzone制剂与灭活流感疫苗(tiv)的肌内制剂不同。其它tiv制剂不应通过皮内途径施用”。关于皮内施用，尽管皮内施用经常使用无针疫苗接种装置诸如idal®疫苗接种器(可得自msdanimalhealth,boxmeer，荷兰)进行，但“皮内”施用本身不应与“无针”施用等同。世界卫生组织在其2009年8月27日的题为“intradermaldeliveryofvaccines;areviewoftheliteratureandthepotentialfordevelopmentforuseinlow-andmiddle-incomecountries”的论文确实清楚地表明“无针”疫苗接种不一定意指“皮内”疫苗接种(参见综述的表1，第3页)。只有当无针装置“配置用于皮内疫苗接种”时，疫苗才可以确实(至少部分地)递送至真皮中。此外，所述疫苗可以以其整体皮下或肌内递送。在根据本发明的疫苗的特定用途的第二个实施方案中，通过单剂量施用所述疫苗。发现单剂量施用产生有效的疫苗。这提供了一种非常方便和经济的方式来针对两种致病性病毒保护动物。在根据本发明的疫苗的特定用途的下一个实施方案中，所述疫苗使用无针疫苗接种装置施用，其使用疫苗的喷射流，以通过动物的皮肤到达真皮。在该实施方案中，通过使用疫苗的液体喷射流(高压流体流)的无针疫苗接种装置来提供至真皮中的疫苗接种，通常使用0.05-0.2ml范围内的非常低体积的疫苗。这进一步增加了疫苗和施用方法的安全性。在根据本发明的疫苗的特定用途的又另一个实施方案中，将pcv2的免疫原和活减毒prrs病毒在施用前24小时内、优选6小时内组合在疫苗中。在临施用前将抗原组合提供了更多选择赋形剂的自由度，因为疫苗的稳定性可能仍然无法直接实现，至少不是任何和所有药学上可接受的载体组合物都是如此。在根据本发明的疫苗的特定用途的又另一个实施方案中，在组合免疫原之前，白蛋白与prrs病毒的免疫原组合存在。现在将使用以下实施例进一步解释本发明。实施例实验1在第一个实验中，确定了在最终疫苗中存在或不存在牛血清白蛋白的情况下，添加pcv2orf2亚单位疫苗对活减毒prrs病毒疫苗的活力的影响。为此，在组合疫苗后1小时，在ma-104细胞(非洲绿猴肾细胞)上稀释测量prrs病毒滴度(log10tcid50/ml)。作为对照，在不添加pcv2疫苗的情况下测量相同prrs病毒疫苗的活力。下表1中显示了对于其中prrs病毒的(目标)起始滴度为4(log10)的疫苗的结果。在所述组合疫苗中，添加0.3％(每升疫苗3克)血清白蛋白。表2给出了对于其中prrs病毒的(目标)起始滴度为5(log10)的疫苗的相同结果。在这后一种组合疫苗中，也添加0.3％(每升疫苗3克)血清白蛋白。结果表明白蛋白对组合疫苗中prrs病毒的活力具有显著影响。表1：pcv2疫苗对prrs病毒活力的影响样品(prrs起始滴度4log10)prrs病毒活力对照(prrs病毒疫苗)3.3pcv/prrs，无白蛋白0pcv/prrs，0.3%白蛋白3.0表2：pcv2疫苗对prrs病毒活力的影响样品(prrs起始滴度5log10)prrs病毒活力对照(prrs病毒疫苗)4.5pcv/prrs，无白蛋白2.2pcv/prrs，0.3%白蛋白4.8实验2在第二个实验中，测试了不同蛋白对pcv2/prrs病毒组合疫苗中prrs病毒的活力的影响。在该实验中，测试具有1%(w/w)的(据称的)prrs病毒稳定剂的最终浓度的组合的pcv2/prrs病毒样品的prrs活力(5log10的起始滴度)，如实验1下所述。为此，将稳定剂与prrs病毒疫苗混合，并且其后添加pcv2疫苗。测试以下蛋白质性病毒稳定剂(牛血清白蛋白之后)：-植物蛋白胨(sigmaaldrich18332-500g-f)-植物蛋白胨no.1(sigmaaldrich61854-500g-f)-植物蛋白胨no.2(sigmaaldrich19942-500g-f)-大豆蛋白胨(sigmaaldrich70178-100g)-脱脂乳(campina，荷兰)-卵清蛋白(sigmaaldrich,a5253-250g)-nz-胺(酪蛋白水解物；实验室产物)。结果如下表3中所示。表3pcv2疫苗对prrs病毒活力的影响样品prrs病毒滴度对照(prrs病毒疫苗)6.4牛血清白蛋白6.4植物蛋白胨4.2植物蛋白胨no14.3植物蛋白胨no24.0大豆蛋白胨4.0脱脂乳4.8卵清蛋白6.1nz-胺4.3看起来只有用(牛或鸡蛋来源的)白蛋白，可以(几乎完全)防止prrs病毒滴度降低。实验3目标该研究的目标是评估pcv2/mhyo/prrs组合疫苗的效力和安全性，且尤其是显示白蛋白的添加对prrs效力的影响。通过评价抗orf2血清学来评估针对pcv2感染保护的效力。通过比较血清学反应与商购可得的mhyo疫苗porcilis®mhyo(msdanimalhealth,boxmeer，荷兰)的血清学反应，来评估针对猪肺炎支原体感染的效力。通过在疫苗接种后4周用致病性prrs毒株攻击后评价血清学和prrs病毒血症，来评估针对prrs病毒感染的效力。实验设计10只母猪的后代可用于本研究。将总共40只动物分配至4组，每组10只仔猪。将所有动物当它们约4周龄时转移至动物设施。使用idal®疫苗接种器，对第1至4组进行皮内疫苗接种至颈部右侧。第1组和第2组各自接受基于orf2蛋白的pcv2疫苗，其另外包含mhyo菌苗(与商购可得的产品porcilis®mhyo中相同的抗原)和3%卵清蛋白(第1组)或无卵清蛋白(第2组)。在这些组合疫苗中，重构活prrs病毒疫苗(porcilisprrs)。所述疫苗使用可得自法国seppic的montanideims251作为佐剂。每种疫苗含有9μg/剂量的orf2蛋白，以及商购可得的疫苗porcilis®mhyoidonce中mhyo抗原浓度的1-2倍的mhyo抗原。prrs疫苗是冷冻干燥的疫苗，并且在临施用前使用适当的pcv2疫苗或稀释剂重构，以含有104.5tcid50的病毒/200μl剂量。第3组仅接受prrs疫苗，且第4组保持未进行疫苗接种并充当(攻击)对照。每天观察所有仔猪的临床体征。当动物为约8周龄(第28天)时，用致病性prrs病毒(i型)对它们攻击感染。攻击材料在2ml中含有(计算剂量的)5.3log10tcid50的病毒。鼻内施用所述材料，每个鼻孔1ml。在观察期结束时(疫苗接种后49天，对应于攻击后21天)，将所有猪处死。在第0、14、28(临攻击前)、31、35、38、42和49天分别从所有动物采集血液样品(经由颈静脉)并测试prrs病毒的存在、针对prrsv、pcv2和mhyo的抗体。结果由于疫苗接种，没有动物显示任何临床体征，并且直肠温度保持在距对照1.5℃内。因此，疫苗被认为是安全的。关于mhyo，组合疫苗的血清学反应看起来与用商购可得的疫苗porcilismhyo可获得的血清学反应相当(图中没有描绘数值结果)。因此可以认为疫苗针对mhyo感染进行保护。pcv2血清学反应的结果在图1中给出。看起来两种组合疫苗诱导阳性抗orf2抗体反应，这意味着所述疫苗诱导针对野生型pcv2感染的保护。prrs血清学反应的结果在图2中给出。看起来两种组合疫苗，如商购可得的prrs疫苗一样，在攻击前诱导阳性抗prrs抗体反应。这表明所述疫苗提供针对prrs病毒感染的保护。还可以看到在包含白蛋白的疫苗中的血清学得到改进。在图3中给出了病毒血症数据。这些结果与图2的结果一致。看起来所有三种疫苗都提供针对prrs病毒感染的保护，因为病毒血症水平在每个时间点都低于对照动物(第4组)中的水平。仍然，与没有白蛋白的组合疫苗相比，包含白蛋白的组合疫苗提供了更好的针对攻击的保护。当前第1页12当前第1页12