高转导HSV载体的制作方法

本申请要求于2016年3月25日提交的美国临时申请号62/313,391的优先权，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。

序列表

根据37cfr1.52(e)(5)，本说明书参考序列表(以电子方式提交的命名为“2017-03-24sl2012073-0004_st25”的.txt文件)。该.txt文件创建于2017年3月24日，并且大小为224,294字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术：

对于具有弱药代动力学和/或脱靶不利效应的风险的试剂，某些治疗剂的全身递送可能是有问题的。在特定靶部位处的局部注射可能要求高度侵入性技术或者可能是不可行的。通过病毒载体递送试剂允许特异性靶向细胞群的能力，以提供试剂的局部产生和/或递送。

技术实现要素：

本公开提供了用于将试剂病毒载体递送至靶细胞的组合物和方法。

在一些实施例中，本公开提供了单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株的变体，其基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。

在一些实施例中，本公开提供了单纯疱疹病毒mckrae株的变体，其具有总体尺寸小于约150,000个碱基对的截短基因组，并且包括在对应于seqidno:1的残基126049至130014的元件内的一个或多个残基的缺失。

在一些实施例中，本公开提供了包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体，所述基因组含有改变，使得所述变体不能表达由seqidno:2的氨基酸序列表征的功能性蛋白质。在一些实施例中，载体包含神经元特异性启动子。在一些实施例中，启动子是降钙素基因相关肽(cgrp)启动子。

在一些实施例中，载体包含人巨细胞病毒(hcmv)增强子。在一些实施例中，载体包含牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号。在一些实施例中，载体包含编码治疗性多肽的核酸。

在一些实施例中，本公开提供了用如本文所述的hsvmckrae株病毒载体转导的细胞。

在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的hsvmckrae株病毒载体和药学可接受的载体。

在一些实施例中，本公开提供了繁殖包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，所述方法包括以下步骤：(i)用载体感染含有编码hsv蛋白icp4的dna的经培养的icp4互补细胞，和(ii)从步骤(i)的培养物中分离上清液。

在一些实施例中，该方法包括通过色谱纯化上清液中的载体的步骤。在一些实施例中，该方法包括浓缩纯化的载体的步骤。在一些实施例中，通过切向流过滤来浓缩纯化的载体。

在一些实施例中，本公开提供了制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达标记物元件，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

(a)第一核酸分子：

(i)包含hsvmckrae株基因组的一部分，但不编码由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质；和

(ii)包含第一同源区(hr1)和第二同源区(hr2)，以及

(b)第二核酸分子，其包含编码标记物元件的序列，其中所述序列侧面为第一同源区(hr1')和第二同源区(hr2')，其中hr1与hr1'同源且hr2与hr2'同源，使得编码第二核酸分子中的标记物元件的序列经由同源重组而整合到第一核酸分子内。

在一些实施例中，细胞是icp4互补细胞。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种其它病毒基因。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种立即早期基因。在一些实施例中，细胞是icp4、icp27和ul55互补细胞。在一些实施例中，细胞是icp4、icp22和icp47互补细胞。

在一些实施例中，标记物元件是多肽。在一些实施例中，多肽通过荧光是可检测的。在一些实施例中，标记物元件是绿色荧光肽。在一些实施例中，该方法包括纯化表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

在一些实施例中，本公开提供了制备包含变体单纯疱疹病毒(hsv)mckrae株基因组的载体的方法，所述基因组包含改变，使得所述变体不能表达由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质，并且其中所述载体表达目的试剂，所述方法包括温育用以下转染的细胞：

a)第一核酸分子：

(i)包含hsvmckrae株基因组的一部分，但不编码由seqidno:16的氨基酸序列表征的功能性蛋白质；和

(ii)包含编码标记物元件的序列，其中所述编码标记物元件的序列侧面为第一同源区(hr1)和第二同源区(hr2)；以及

(b)第二核酸分子，其包含编码目的试剂的序列，其中所述编码目的试剂的序列侧面为第一同源区(hr1')和第二同源区(hr2')，其中hr1与hr1'同源且hr2与hr2'同源，使得编码目的试剂的序列经由同源重组整合到第一核酸分子内。

在一些实施例中，细胞是icp4互补细胞。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种其它病毒基因。在一些实施例中，细胞补充icp4和至少一种立即早期基因。在一些实施例中，细胞是icp4、icp27和ul55互补细胞。在一些实施例中，细胞是icp4、icp22和icp47互补细胞。

在一些实施例中，该方法包括纯化不表达标记物元件的病毒噬斑的步骤。

在一些实施例中，本公开提供了在受试者的背根神经节(drg)中表达多肽的方法，其包括向受试者施用如本文所述的hsvmckrae株载体。在一些实施例中，载体在体内施用。在一些实施例中，载体通过与皮肤接触来施用。在一些实施例中，载体通过皮内注射来施用。

在一些实施例中，本公开提供了测量hsvmckrae株病毒载体在背根神经节(drg)中的转导效率的方法，其包括(a)使动物的皮肤与hsvmckrae株病毒载体接触，(b)从动物中取出drg组织，和(c)测定drg中转导的hsv基因组的数目。在一些实施例中，通过扩增技术测量基因组的数目。在一些实施例中，通过定量聚合酶链反应(pcr)测量基因组的数目。

在一些实施例中，本公开提供了测量hsvmckrae株病毒载体在背根神经节(drg)中的转导效率的方法，所述病毒载体含有包含多肽有效负载的表达盒，所述方法包括以下步骤：(a)使动物的皮肤与hsvmckrae株病毒载体接触，(b)从动物中取出drg组织，和(c)测定由表达盒的核酸编码的多肽的量。在一些实施例中，通过免疫测定来测量多肽的量。在一些实施例中，通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测量多肽的量。

附图说明

附图仅用于说明性目的，而不是限制。

图1描绘了示例性图，其显示了由于注射到足垫内的不同剂量的复制缺陷型病毒载体，在qpcr测定中检测到的每个l4-l6背根神经节(drg)的hsv基因组的数目。

图2描绘了示例性图，其显示了在施用具有hcmv启动子的hsv病毒载体后5、14、47、77和131天时，l4-l6drg中的有效负载的转录物的总数目。

图3描绘了示例性图，其显示了在施用具有hcmv启动子的hsv病毒载体后5、14、47、77和131天时，l4-l6drg中每个基因组的有效负载的转录物的数目。

图4描绘了示例图，其显示了由于施用具有不同启动子的病毒载体，每个基因组的gfp转录物的数目和每个l4-l6drg的hsv-1基因组的数目。

图5描绘了示例图，其显示了在施用具有组织特异性启动子的hsv病毒载体后经过18天，l4-l6drg中每个基因组的gfp转录物和总转录物的总数目。

图6描绘了示例性图，其显示了在施用具有组织特异性启动子的hsv病毒载体后经过8周，l4-l6drg中的总gfp转录物的数目。

图7描绘了示例性图，其显示了在施用具有组织特异性启动子的hsv病毒载体后经过8周，l4-l6drg中的gfp转录物的总数目。

图8描绘了示例性图，其显示了与具有嵌合降钙素基因相关肽(cgrp)启动子与hcmv增强子的hsv病毒载体相比，在施用具有人巨细胞病毒(hcmv)启动子的hsv病毒载体后，l4-l6drg中每个基因组的有效负载的转录物的总数目。

图9描绘了示例性hsvmckrae株核苷酸序列(seqidno:1)，其被鉴定为登录号jq730035.1。

图10描绘了示例性hsvmckrae株icp4氨基酸序列(seqidno:2)。

图11描绘了示例性hsvmckrae株icp22氨基酸序列(seqidno:3)。

图12描绘了示例性hsvmckrae株icp47氨基酸序列(seqidno:4)。

图13描绘了示例性hsvmckrae株icp4核苷酸序列(seqidno:5)。

图14描绘了示例性hsvmckrae株icp22核苷酸序列(seqidno:6)。

图15描绘了示例性hsvmckrae株icp47核苷酸序列(seqidno:7)。

图16描绘了示例性人巨细胞病毒增强子核苷酸序列(seqidno:8)。

图17描绘了示例性降钙素基因相关肽核苷酸序列(seqidno:9)。

图18描绘了示例性牛生长激素多腺苷酸化信号(seqidno:10)。

定义

在本申请中，除非另外从上下文明确，否则(i)术语“一个/种”可理解为意指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可理解为意指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是连同一个或多个另外组分或步骤一起呈现；并且(iv)术语“约”和“大约”可理解为允许如由本领域普通技术人员理解的标准变化；并且(v)当提供范围时，包括端点。

施用：如本文使用的，术语“施用”指将组合物施用于受试者或系统。对动物受试者(例如，对人)的施用可通过任何适当的途径。例如，在一些实施例中，施用可为支气管(包括通过支气管滴注)、颊、肠、皮间(interdermal)、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、在特定器官内(例如肝内)、粘膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、透皮、阴道和玻璃体。在一些实施例中，施用可涉及间歇给药。在一些实施例中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少所选择的时间段。

试剂：如本文使用的，术语“试剂”指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子或其组合。在一些实施例中，试剂是或包含天然产物，因为它在自然界中发现和/或从自然界获得。在一些实施例中，试剂是或包含一种或多种人造实体，因为它通过人的手的作用而设计、设计和/或产生，和/或在自然界中未发现。可根据本发明利用的试剂的一些具体实施例包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如sirna、shrna、dna/rna杂合体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。

改善：如本文使用的，术语“改善”指状态的预防、减少或缓和，或受试者状态的改进。改善包括但不要求疾病、病症或状况的完全恢复或完全预防。

动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”指具有任一性别且处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、遗传改造的动物和/或克隆。

大约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向上(大于或小于)落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非当这种数目超过可能值的100％时)。

特征序列：如本文使用的，术语“特征序列”指在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，并且因此可由本领域普通技术人员用于定义家族成员。

组合疗法：本文使用的，术语“组合疗法”指其中受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施例中，两种或更多种试剂或可同时施用；在一些实施例中，此类试剂可序贯施用；在一些实施例中，此类试剂以重叠给药方案施用。

组合物：如本文使用的，术语“组合物”或“药物组合物”指如本文所述的两种或更多种试剂的组合，用于共施用或作为相同方案的部分施用。在所有实施例中都不要求试剂的组合导致物理混合物，即组合物的每种组分作为分开的共试剂施用是可能的；然而，本领域的许多患者或从业者可能发现制备组合物是有利的，所述组合物是药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂中两种或更多种成分的混合物，使得能够同时施用组合的组分成分。

经改造的：如本文使用的，术语“经改造的”指已通过人的手而操纵的方面。例如，当在自然界中未以该次序连接在一起的两个或更多个序列被人的手操纵以在经改造的多核苷酸中彼此直接连接时，多核苷酸视为“经改造的”。例如，在本公开的一些实施例中，经改造的多核苷酸包含在自然界中发现与第一编码序列可操作地结合，但不与第二编码序列可操作地结合的调控序列，通过人的手连接，使得它与第二编码序列可操作地结合。可比较地，如果细胞或生物已被操纵使得它的遗传信息被改变(例如，先前不存在的新遗传材料已例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制被引入，或者先前存在的遗传材料例如通过取代或缺失突变、或通过交配方案被改变或去除)，则它可视为“经改造的”。如通常的实践并且本领域技术人员理解的，即使实际操作对先前实体执行的，经改造的多核苷酸或细胞的后代通常仍被称为“经改造的”。

表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”指下述事件中的一个或多个：(1)从dna序列产生rna模板(例如通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3’末端形成)；(3)rna翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

同源性：如本文使用的，术语“同源性”指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则聚合物分子被视为彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，则聚合物分子被视为彼此“同源”。

分离的：如本文使用的，术语“分离的”指在最初生产时(无论在自然界中和/或在实验环境中)，已(1)与它结合的至少一些组分分开，和/或(2)通过人的手而设计、产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们最初结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的其他组分分开。在一些实施例中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。在一些实施例中，如本领域技术人员将理解的，在已与某些其它组分例如一种或多种载体或赋形剂(如缓冲液、溶剂、水等)组合后，物质仍可视为“分离的”或甚至“纯的”；在这样的实施例中，不包括这样的载体或赋形剂计算物质的百分比分离或纯度。仅举一个例子，在一些实施例中，在以下情况下，生物聚合物例如在自然界中出现的多肽或多核苷酸视为“分离的”：a)由于其起源或衍生源不结合在自然界中以其自然状态伴随其的某些或所有组分；b)它基本上不含来自在自然界中产生其的物种的相同物种的其它多肽或核酸；c)由细胞或其它表达系统表达或者以其它方式与来自细胞或其它表达系统的组分组合，所述细胞或其它表达系统不是在自然界中产生其的物种。因此，例如，在一些实施例中，化学合成或在与在自然界中产生其的那种不同的细胞系统中合成的多肽视为“分离的”多肽。可替代地或另外地，在一些实施例中，已经受一种或多种纯化技术的多肽可视为“分离的”多肽至它已与其它组分分开的程度：a)它在自然界中与所述其它组分结合；和/或b)在最初生产时它与所述其它组分结合。

标记物元件：如本文使用的，术语“标记物元件”指可检测或可选择试剂。在一些实施例中，“标记物元件”是可检测的或可选择的核酸序列。在一些实施例中，“标记物元件”是表达产物(例如，rna或蛋白质)，其存在或不存在在细胞中是可检测的和/或可选择的。在一些实施例中，表达产物是或包含酶。在一些实施例中，表达产物是荧光团。

核酸：如本文使用的，术语“核酸”指掺入或可掺入寡核苷酸链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是经由磷酸二酯键掺入或可掺入寡核苷酸链内的化合物和/或物质。由上下文明确的是，在一些实施例中，“核酸”指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含rna；在一些实施例中，“核酸”是或包含dna。在一些实施例中，核酸是一种或多种天然核酸残基、包含一种或多种天然核酸残基、或者由一种或多种天然核酸残基组成。在一些实施例中，核酸是一种或多种核酸类似物、包含一种或多种核酸类似物、或者由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，“核酸”是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”、或者由一个或多个“肽核酸”组成，所述“肽核酸”是本领域已知的，并且在主链中具有肽键代替磷酸二酯键，视为在本公开的范围。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是一种或多种天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包含一种或多种天然核苷，或者由一种或多种天然核苷组成。一些实施例中，核酸是一种或多种核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基及其组合)，包含一种或多种核苷类似物，或者由一种或多种核苷类似物组成。在一些实施例中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的那些糖相比被修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物(例如rna或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，核酸通过以下方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中复制，以及化学合成。在一些实施例中，核酸长至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施例中，核酸是单链的；在一些实施例中，核酸是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中，核酸具有酶促活性。

患者：如本文使用的，术语“患者”指所提供的组合物施用于其施用或可施用于其的任何生物，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施例中，患者是人。在一些实施例中，患者患有或易患一种或多种病症或状况。在一些实施例中，患者展示出病症或状况的一种或多种症状。在一些实施例中，患者已被诊断有一种或多种病症或状况。在一些实施例中，患者正在接受或已经接受某些疗法，以诊断和/或治疗疾病、病症或状况。

药物组合物：如本文使用的，术语“药物组合物”指连同一种或多种药学可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用于相关群体时，所述治疗方案显示实现预定疗效的统计学显著概率。在一些实施例中，可将药物组合物专门配制成用于按固体或液体形式施用，包括适合于以下的药物组合物：口服，例如灌服药(水性或非水溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊内、舌下和全身吸收的片剂、施加于舌部的大丸剂、粉末剂、颗粒剂、糊剂；肠胃外施用，例如作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制品，通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射施用；局部施用，例如作为乳膏、软膏或控制释放贴片或喷雾施加于皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；经舌下；经眼；经皮；或经鼻、经肺以及经其它粘膜表面。

药学可接受的：如本文使用的，应用于用于配制如本文公开的组合物的载体、稀释剂或赋形剂的术语“药学可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其它成分相容，并且对其接受者无害。

药学可接受的载体：如本文使用的，术语“药学可接受的载体”意指药学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从身体的一个器官或一部分携带或转运到身体的另一个器官或一部分。每种载体必须在与制剂的其它成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可充当药学可接受的载体的材料的一些例子包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如丙三醇、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及药物制剂中采用的其它无毒相容物质。

预防(prevent)或预防(prevention)：如本文使用的，当与疾病/病症和/或病症的发生一起使用时，术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”指减少发展疾病、病症和/或状况的风险，和/或延迟疾病、病症或状况的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或状况的发作已延迟预定的时间段时，预防可视为完全的。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”指哺乳动物(例如人，在一些实施例中包括出生前的人形式)。在一些实施例中，受试者患有相关疾病、病症或状况。在一些实施例中，受试者易患疾病、病症或状况。在一些实施例中，受试者展示出疾病、病症或状况的一种或多种症状或特征。在一些实施例中，受试者不展示出疾病、病症或状况的任何症状或特征。在一些实施例中，受试者是具有对疾病、病症或状况的易感性或风险特有的一种或多种特征的人。在一些实施例中，受试者是患者。在一些实施例中，受试者是诊断和/或治疗施用和/或已施用于其的个体。

治疗：如本文使用的，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指任何部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟以下的发作、减少以下的严重性和/或减少以下的发生率：特定疾病、病症和/或状况(例如，神经病变)的一种或多种症状、特征和/或原因。这种治疗可为并未显示出相关疾病、病症和/或状况的体征的受试者具有的，和/或仅显示出疾病、病症和/或状况的早期体征的受试者具有的。可替代地或另外地，此类治疗可为显示出相关疾病、病症和/或状况的一种或多种确定体征的受试者具有的。在一些实施例中，治疗可为已被诊断为患有相关疾病、病症和/或状况的受试者具有的。在一些实施例中，治疗可为已知具有一种或多种易感因子的受试者具有的，所述易感因子与相关疾病、病症和/或状况的发展风险增加在统计学上相关。

载体：如本文使用的，术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的dna区段可连接到其内的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的dna区段可连接到病毒基因组或其部分。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体、附加型哺乳动物载体、单纯疱疹病毒(hsv)载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们被操作性地连接到的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。

标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书，或者如本领域通常实现的或如本文所述的执行。前述技术和程序一般可根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述执行。参见例如sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))，所述参考文献以引用的方式并入本文用于任何目的。

具体实施方式

下述节段详细描述本发明的各个方面。节段的使用并不意味着限制本发明。每个节段可适用于本发明的任何方面。在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明或从上下文中明确为分离的。

本公开尤其提供了包含hsv载体的组合物及其使用和生产方法。特别地，本公开涉及用于将有效负载递送至神经元细胞的mckrae株载体。

病毒载体和hsv

病毒载体可用于促进核酸转移到细胞内。已知的病毒载体包括源自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(aav)、牛痘病毒和杆状病毒的载体。源自单纯疱疹病毒(hsv)，例如单纯疱疹病毒1(hsv-1)和单纯疱疹病毒-2(hsv-2)的载体，可特别用于将试剂递送至特异性靶向组织。给予选择特定载体和递送系统的考虑包括例如靶细胞的特征、所需的表达寿命、载体的毒力和侵袭性；以及待转移的遗传材料的大小。

hsv-1载体通常可容纳高达25kb的外源dna序列。hsv-1具有大约152-kb的双链线性dna基因组，其可在细胞的核中附加地维持。hsv-1病毒粒子有包膜且直径大约110nm。通过病毒包膜糖蛋白与质膜上的硫酸肝素部分的结合，病毒感染在皮肤或粘膜的上皮细胞中启动。hsv特别良好地适合于将基因递送至神经系统，并且具有对于感觉神经元的天然向性。该病毒可建立其中病毒基因组作为核内附加型元件对于宿主的寿命持续的潜伏状态。潜伏基因组在人三叉神经节中的终身持续而不发展感觉缺失或对神经节的组织学损害，例证了潜伏机制的有效性。野生型hsv病毒可在各种胁迫的影响下从潜伏期再激活。然而，致使复制缺陷的重组病毒载体保留了在神经元中建立持久休眠状态，但仍不能在神经系统中复制(或再激活)的能力。

基于hsv-1的载体可具有致使无功能(例如，通过缺失或破坏)的复制必需的一个或多个hsv基因。复制必需的hsv基因包括例如立即早期基因，例如icp4和icp27。在一些实施例中，本公开提供了复制缺陷型hsv载体，其中icp0、icp4、icp22、icp27和icp47中的一种或多种被缺失或破坏。在一些实施例中，本公开提供了具有无功能的icp4基因的hsv载体。在一些实施例中，本公开提供了具有无功能的icp4、icp22和icp47基因的hsv载体。在一些实施例中，本公开提供了具有icp4被缺失且icp22和icp47被破坏的hsv载体。在一些实施例中，本公开提供了具有icp4被缺失且icp22和icp47的表达被破坏或延迟的hsv载体。在一些实施例中，本公开提供了具有icp4被缺失，icp0、icp22、icp27和/或icp47不表达为立即早期基因的hsv载体。

具有缺失的hsv基因的hsv-1载体可在反式表达缺陷蛋白的细胞系中产生。在一些实施例中，hsv-1载体在哺乳动物细胞系中产生。在一些实施例中，hsv-1载体在vero谱系的哺乳动物细胞系中产生。在一些实施例中，细胞系表达icp4。在一些实施例中，细胞系表达icp0、icp4、icp22、icp27和icp47中的一种或多种。在一些实施例中，细胞系表达icp4和至少一种另外的立即早期基因。在一些实施例中，细胞系表达icp4、icp22和icp47。在一些实施例中，细胞系表达icp4、icp22和ul55。在一些实施例中，细胞系表达icp4、icp27和ul55。在一些实施例中，细胞系包含具有猿猴病毒40多腺苷酸化信号(sv40pa)的核酸分子。在一些实施例中，病毒载体在vero6-5c细胞中产生。在一些实施例中，病毒载体在verod细胞中产生。

mckrae株

已分离出至少17个hsv-1毒株，包括但不限于mckrae、毒株17、毒株f、h129、hf10、macintyre、毒株hf、atcc2011和kos(关于综述，参见watson等人，virology(2012))。mckrae株从患有单纯疱疹性角膜炎的患者中分离，且随后在组织培养中传代。mckrae的部分基因组序列显示于图9(seqidno:1)(登录号jq730035)中。

在注射到动物内之后观察到hsv-1外周复制和毒力中的毒株间差异。mckrae以比其它已知毒株更高的频率经历自发或诱导的再激活，并且在最具毒力的hsv-1毒株中。mckrae也比其它已知毒株例如毒株17、kos、f和h129更具神经侵袭性。在一项研究中，将kos或mckrae注射到小鼠的角膜和生殖道内，以比较发病机理(wang等人(2013)virusres.173(2):436-440。发现每种都在角膜上皮和三叉神经节中复制至相似程度；然而，mckrae滴度在脑干中高出100倍以上。在阴道内注射后，mckrae和kos复制至相似的程度，除了在四天时mckrae滴度中的瞬时尖峰之外。mckrae，而不是kos，引发外生殖器的显著炎症连同动物中的重量减轻。kos在神经组织中未检测到，并且mckrae很少检测到。

在一些实施例中，本公开提供了具有基因缺失的hsv病毒载体，所述基因致使hsv复制缺陷，但不减少hsv神经侵袭性。因此，hsv载体能够穿过周围神经系统，以在施用于皮肤后到达背根神经节中的神经元。

hsv基因影响病毒特征和表型。存在对于mckrae株独特的至少9个基因和几个非编码序列。除与发病机理和潜伏期再激活相关的那些例如rl1、rs1和rl2之外，三个ul基因(ul36、ul49a、ul56)和三个us基因(us7、us10和us11)对于mckrae株是独特的。除基因变异之外，非编码序列如lat、‘a’序列和mirna含有对于mckrae独特的变异。

下述基因和非编码序列中的一种或多种可视为mckrae株的特征。在mckrae中，rl1(icp34.5)具有在残基159和160之间的延伸p–a–t重复，其导致8次迭代，而其它毒株仅含有3-5次迭代。认为p-a-t重复影响icp34.5蛋白的细胞定位。(mao&rosenthal,j.biol.chem.277(13):11423-31(2012)。认为icp34.5是涉及病毒复制和抗宿主应答的神经毒力因子。

mckrae株还含有位于us07(gi)的编码序列内的内部串联重复stpsttt(seqidno:11)的六次迭代的延伸重复元件。另外，在mckrae中，ul36含有由于编码氨基酸残基2453(nt72,535)的单核苷酸串中的g核苷酸缺失而引入的过早终止密码子，并且ul56(180aa)含有在核苷酸115,992(氨基酸97)处的单碱基对插入。mckrae株还含有在us10中的延伸orf，其来源于在核苷酸143,416处的单个bp插入，并且移码引起mckrae中的终止密码子缺失和独特的c末端蛋白质序列。与其它毒株相比，mckrae具有在残基28和51的ul49a处的氨基酸差异。mckrae分别在残基28和51处具有组氨酸和苏氨酸，而毒株17具有精氨酸和苏氨酸，并且其它毒株(例如kos)具有组氨酸和丙氨酸。另外，mckrae株含有在ul–rl连接处发现的减少的串联重复(mckrae中的49bp，与毒株17和kos中的181bp相比)，以及紧在ul–rl连接重复后缺失的大约330个核苷酸。mckrae还含有在‘a’序列直接重复2(dr2)阵列中的独特变异。代替一系列完整的串联重复，mckraedr2重复被相同的富含鸟嘌呤的序列中断两次。

毒株之间的lat内含子内的主要变异是由于重复元件(gcacccccactcccac)(seqidno:12)中的差异，其在mckrae株的核苷酸119,482处开始的迭代次数方面不同，其中mckrae含有13个重复，而毒株f、h129和17含有9个重复，并且kos含有15个重复。另外，毒株之间的串联重复变异在mckrae在125,520碱基处开始发现。mckrae重复元件包括ccccagccctccccag(seqidno:13)的十二次迭代和cccctcgccccctcccg(seqidno:14)的八次迭代。第一重复单元与其它毒株不同，因为它含有g-a转换，并且毒株mckrae含有多于任何其它毒株的三次迭代。mckrae株第二重复元件塌陷(collapsed)，相对于所有其它毒株缺失188个核苷酸，并且通过含有mir-h5的105bp的100％保守序列与上游重复分离。

mckrae还含有icp4的独特编码序列，这在其它已知毒株中未发现。(watson等人，virology(2012))。icp4是立即早期转录调节因子，并且已牵涉再激活。尽管其它毒株含有在残基707和720之间的富含丙氨酸的区域(aasapdaadalaaa)(seqidno:15)，但在mckrae中，富含丙氨酸的区域被替换为富含丝氨酸的序列(gprrsssssgvaa)(seqidno:16)。mckrae中存在的富含丝氨酸的取代嵌段与核定位信号(nls)(氨基酸728-734)相邻。该区域的构象变化可改变nls，并且依次又不仅影响icp4的定位，还影响受icp4定位影响的其它病毒蛋白(例如icp0、icp8)(knipe和smith，1986)。因此，该区域可通过改变蛋白质对核的定位来部分地影响病毒表型。

复制缺陷型mckrae载体

mckrae主链

病毒基因以严格调节的有序级联表达，其开始于立即早期(ie)基因的产生。所得到的ie蛋白包括受感染的细胞蛋白icp0、icp4、icp22、icp27和icp47，负责在复制周期的后续阶段期间调节病毒基因表达。复制缺陷型变体病毒对于一种或多种功能是有缺陷的，所述功能对于病毒基因组复制或病毒颗粒的合成和组装是必需的。这些病毒可在表达缺失的基因产物的互补细胞系中繁殖；然而，在正常(即非互补)细胞中，病毒表达病毒基因产物，但不复制以形成子代病毒颗粒。

可通过本领域已知的用于修饰基因的各种方法产生复制缺陷型病毒。在一些实施例中，致使一个或多个核苷酸相对于野生型序列不同。在一些实施例中，一个或多个核苷酸被缺失。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生过早终止密码子。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生编码截短多肽的基因。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失产生编码非功能性多肽的基因。在一些实施例中，一个或多个核苷酸的缺失致使基因通过破坏而无功能。在一些实施例中，通过缺失其启动子来破坏基因。

在一些实施例中，一个或多个基因被缺失，以致使病毒复制缺陷。在一些实施例中，编码icp0的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码icp4的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码ic22的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码icp27的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码icp47的基因被完全或部分缺失。在一些实施例中，编码icp4的基因被完全或部分缺失，而不破坏任何另外立即早期基因的表达。在一些实施例中，编码icp4的基因被完全或部分缺失，并且一个或多个其它立即早期(ie)基因被破坏。在一些实施例中，编码icp4的基因被缺失，并且icp22和icp47被破坏。

hsv-1ie启动子含有共有taatgarat(seqidno:19)(其中r是嘌呤)的ie特异性调节序列的一个或多个拷贝。这些基序通常位于近端ie启动子序列的几百个碱基对内，但与其侧翼序列结合，它们是离散的功能实体，其可对不同时间类别的其它近端启动子元件赋予ie特异性调节。在一些实施例中，通过缺失ie特异性调节序列中的核苷酸来产生复制缺陷型病毒。在一些实施例中，ie特异性调节序列含有内部缺失。在一些实施例中，ie特异性调节序列含有末端缺失。在一些实施例中，ie特异性调控序列被完全缺失。

下文描绘了示例性复制缺陷型mckrae株病毒载体的示意图。该示意图显示了病毒icp4基因的两个拷贝的完全缺失，以及插入缺失的icp4基因座的两个拷贝内的人巨细胞病毒(hcmv)立即早期启动子驱动的表达盒。表达盒含有用于在靶细胞中表达的目的有效负载。

icp4缺失的程度导致去除两个另外的立即早期病毒基因的上游启动子序列：icp22和icp47。

有效负载

根据本公开的病毒载体含有包含载体有效负载的核酸分子。在一些实施例中，有效负载包含编码蛋白质的核酸分子。在一些实施例中，有效负载包含核酸分子，所述核酸分子包含与编码蛋白质的核酸序列互补的序列。在一些实施例中，有效负载编码调节的核酸分子。在一些实施例中，有效负载编码小干扰rna(sirna)多核苷酸。在一些实施例中，有效负载编码微rna(mirna)多核苷酸。

在一些实施例中，有效负载是编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质对于载体施用于其的靶组织或受试者是外源的。在一些实施例中，有效负载是编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质对于载体施用于其的靶组织或受试者是内源的。在一些实施例中，核酸分子是密码子优化的。

调节元件

本文考虑了在本公开的核酸中包括非天然调节序列、基因控制序列、启动子、非编码序列、内含子或编码序列。本文还考虑了包括核酸标签或信号序列、或编码蛋白质标签或蛋白质信号序列的核酸。通常，编码区与一种或多种调节核酸组分可操作地连接。

包括在本公开的核酸中的启动子可为组织或细胞类型特异性启动子、对多重组织或细胞类型特异性的启动子、器官特异性启动子、对多重器官特异性的启动子、系统或遍在启动子、或几乎系统或遍在的启动子。具有随机表达、诱导表达、条件表达或以其它方式的不连续、不稳定或不可预测表达的启动子也包括在本公开的范围内。本公开的启动子可包括任何本领域已知的上述特征或其它启动子特征。

已知启动子的例子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)启动子cmv/人β3珠蛋白启动子gfap启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、β-葡萄糖醛酸酶(gusb)启动子和遍在蛋白启动子，例如从人遍在蛋白a、人遍在蛋白b和人遍在蛋白c中分离的那些。

在一些实施例中，启动子是神经元特异性启动子，因为它是在神经元中具有特异性表达、在神经元中优先表达、或通常在神经元或神经元子集中驱动相关编码序列表达，但在一种或多种其它组织或细胞类型中则不是这样的启动子。此类启动子的例子包括降钙素基因相关肽(cgrp)、突触蛋白i(syn)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii、微管蛋白αi、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白1b(map1b)和血小板源性生长因子β链启动子、以及其衍生物。在一些实施例中，启动子是降钙素基因相关肽(cgrp)启动子或其衍生物。

其它调节元件可另外与有效负载例如增强子和多腺苷酸化位点可操作地连接。在一些实施例中，增强子包含人巨细胞病毒(hcmv)序列。在一些实施例中，多腺苷酸化位点包含牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号。

在一些实施例中，启动子是在自然界中发现的一种或多种启动子或调节元件的嵌合体。在一些实施例中，病毒载体包含有效负载，其表达由具有hcmv增强子序列的cgrp启动子驱动。

载体的制备

本公开特别涉及复制缺陷的mckrae株病毒载体。在一些实施例中，通过缺失或破坏一个或多个立即早期基因来生成病毒载体。可使用本领域已知的重组技术方法来缺失或破坏病毒基因。在一些实施例中，由于同源重组事件，本公开的病毒载体可致使复制缺陷。在一些实施例中，通过缺失icp4基因来生成复制缺陷型病毒载体。在一些实施例中，通过缺失icp4基因和缺失一个或多个其它立即早期基因(例如icp22和/或icp47)的启动子来生成复制缺陷型病毒载体。

在一些实施例中，通过经由同源重组缺失编码一种或多种icp(例如，icp4)的基因座来生成本公开的病毒载体。在一些实施例中，本公开的病毒载体的生成包括第一质粒与第二质粒的同源重组的步骤。在一些实施例中，第一质粒含有与hsv基因组区域同源的核酸序列，所述hsv基因组区域与预期替换的hsv基因组的核酸区域相邻。在一些实施例中，第二质粒含有hsv基因组或其片段。在一些实施例中，第一质粒含有编码在同源核酸序列之间的目的基因的核酸序列。在一些实施例中，目的基因可为或包括可通过荧光、化学发光或其它性质检测的标记物蛋白，其可用于选择来源于成功的同源重组的载体。

在一些实施例中，通过第一质粒与含有hsvmckrae株基因组的第二质粒的同源重组来生成本公开的病毒载体，所述第一质粒含有与icp4启动子上游的区域同源的核酸序列，包括在hsv的短反向重复区域内包含的病毒起点。

在一些实施例中，通过首先使用质粒sasb3通过同源重组替换icp4基因座的两个拷贝，并且筛选表达绿色荧光蛋白(gfp)的噬斑来制备载体。在一些实施例中，通过将hsv-1kos株基因组(核苷酸124485-126413)的sphi至afliii(sali连接的)片段(1928bp)克隆到sphi/sali消化的psp72内，随后将695bpbglii至bamhi片段(核苷酸131931至132626)(其含有icp4启动子上游的区域，包括在短反向重复区域内包含的病毒起点)插入载体质粒的bglii至bamhi位点内来构建质粒。在一些实施例中，通过如上所述在质粒的bamhi位点克隆hcmv-egfp片段来构建质粒。在一些实施例中，然后将如上所述的质粒重组到野生型mckrae病毒的特定基因座内。在一些实施例中，使用稳定细胞系分离所得到的载体，所述稳定细胞系表达复制所需的在hsv基因组中被缺失或破坏的一个或多个基因。

在一些实施例中，载体通过以下进行制备：首先使用质粒sdaxb通过同源重组替换icp4基因座的两个拷贝，并且筛选表达绿色荧光蛋白(gfp)的噬斑。在一些实施例中，质粒通过以下进行构建：将hsv-1kos株基因组(登录kt899744的核苷酸124346至126273)的sphi至afliii片段(1928bp)克隆到sphi/afliii消化的psp72内，以制备sda，随后将afliii位点改变为bamhi位点(sdab)。将包含在短反向重复区内的bamhi至bgliidnapcr片段克隆到sdab的bamhi位点内，以制备sdaxb，所述片段含有包括病毒起源(登录jq730035的核苷酸144933至145534)的icp4启动子上游的区域。在一些实施例中，通过如上所述在质粒的bamhi位点克隆hcmv-egfp片段来构建质粒。在一些实施例中，然后将如上所述的质粒重组到野生型mckrae病毒的特定基因座内。在一些实施例中，使用稳定细胞系分离所得到的载体，所述稳定细胞系表达复制所需的在hsv基因组中被缺失或破坏的一个或多个基因。

载体的表征

可通过基因组测序来表征根据本公开的病毒载体，以便确定预期的载体是否成功产生。本领域已知的任何测序方法对于此目的都是可接受的。测序方法包括例如纳米孔测序、单分子实时测序(smrt)、dna纳米球(dnb)测序、焦磷酸测序和使用dna阵列。

可通过本领域已知的用于检测蛋白质或核酸的任何方法检测来自病毒载体的有效负载的表达。检测蛋白质表达的方法包括免疫组织化学、流式细胞术、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫电子显微镜检查、个别蛋白质免疫沉淀(ip)、蛋白质复合物免疫沉淀(co-ip)、染色质免疫沉淀(chip)、rna免疫沉淀(rip)、免疫电泳、分光光度法和二辛可宁酸测定(bca)。检测核酸表达的方法包括dna印迹、rna印迹、聚合酶链反应(pcr)、定量pcr和rt-pcr。

在一些实施例中，本公开提供了用于测试病毒载体转导神经元的能力的方法。在一些实施例中，神经元是周围神经元。在一些实施例中，神经元是感觉神经元。在一些实施例中，神经元包括背根神经节(drg)。

在一些实施例中，可将病毒载体制剂注射到对应于drg的区段的一个或多个皮节内，例如左和右l4、l5和l6drg。取出drg并且从drg中分离dna，并且使用靶向hsv-1内的序列的qpcr测定分析载体基因组拷贝。在一些实施例中，qpcr测定靶向hsv-1糖蛋白(ul-22)基因内的序列。

应用/用途

根据本公开的病毒载体可用于广泛多样的治疗应用。在一些实施例中，如本文所述的载体可用于将一种或多种有效负载递送至一种或多种靶细胞。在一些实施例中，靶细胞存在于弱血管化且难以通过体循环到达的组织中。在一些实施例中，靶细胞是易受hsv感染的细胞。在一些实施例中，靶细胞特别易受hsv的mckrae株感染。在一些实施例中，靶细胞是或包括一种或多种神经元细胞。在一些实施例中，靶细胞是背根神经节(drg)细胞。

基因治疗

根据本公开的病毒载体可用于其中考虑基因疗法的任何背景中。例如，包含与启动子可操作地连接的异源核酸区段的病毒载体可用于与由异源核酸区段编码的蛋白质的减少或缺乏相关的任何疾病或临床状况，或者可通过在受试者内表达编码的蛋白质来有效治疗的任何疾病或临床状况。含有用于合成rnai试剂(例如，一种或多种sirna或shrna)的表达盒的病毒载体可用于治疗与受试者中的转录物或其编码蛋白质的过表达相关的任何疾病或临床状况，或者可通过在受试者中引起转录物或其编码蛋白质的减少来治疗的任何疾病或临床状况。包含用于合成一种或多种rna的表达盒的病毒载体可用于调节免疫系统应答(例如，负责器官移植排斥、过敏、自身免疫疾病、炎症等的应答)，所述rna自杂交或彼此杂交，以形成靶向编码细胞因子的转录物的rnai试剂。提供用于合成一种或多种rna的模板的病毒载体可用于治疗传染病，所述rna自杂交或彼此杂交，以形成靶向传染剂的转录物或靶向细胞转录物的rnai试剂，所述转录物的编码产物是传染过程必需的或促进传染过程的任何方面。

施用

包含如本文所述的病毒载体的组合物可配制用于通过任何可用途径递送，所述途径包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、经口(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜、直肠和阴道。优选的递送途径包括皮内。在一些实施例中，药物组合物包括与药学可接受的载体组合的病毒载体。如本文使用的，措辞“药学可接受的载体”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。补充的活性化合物也可掺入组合物内。在一些实施例中，病毒载体在甘油中配制。在一些实施例中，病毒载体在磷酸盐缓冲盐水中的大约10％甘油中配制。

以剂量单位形式配制组合物以便于施用和剂量均匀性是有利的。如本文使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单元；每个单元含有经计算与药物载体结合产生所需疗效的预定数量的病毒载体。

药物组合物可根据需要以不同的间隔和经过不同的时间段施用，例如，每周一次，共约1至10周、2至8周、约3至7周、约4、5或6周等。技术人员将了解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其它疾病。用病毒载体治疗受试者可包括单次治疗，或者在许多情况下，可包括一系列治疗。

组合物

在一些实施例中，用载体制备活性剂，即本公开的病毒载体和/或待连同本公开的病毒载体一起施用的其它试剂，所述载体将保护化合物免受从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种组合物的方法对于本领域技术人员是显而易见的。在一些实施例中，组合物靶向特定细胞类型或被病毒感染的细胞。

组合疗法

根据本公开，提供的组合物可与一种或多种其它活性剂和/或治疗模式组合施用，例如已知的治疗剂和/或独立地活性的生物活性剂。在一些实施例中，提供的组合物包括一种或多种此类其它活性剂；在一些实施例中，此类其它活性剂作为不同组合物的部分提供。在一些实施例中，组合疗法涉及同时施用两种或更多种不同的活性剂和/或治疗模式的一个或多个剂量或单位；在一些实施例中，组合疗法涉及同时暴露于两种或更多种不同的活性剂和/或治疗模式，例如通过重叠给药方案。

在一些实施例中，提供的组合物包括或与可用于治疗相关疾病、病症和/或状况的一种或多种其它活性剂组合施用。

实例

实例1：用于评价drg转导的测定

该实例显示了用于测定背根神经节(drg)组织中的病毒载体转导的示例性方法。

在病毒载体的皮内施用后，取出l4、l5和l6drg，并且伴随倒置，在预冷lysingmatrixa试管(mpbiomedicals)中涡旋40秒，所述试管具有在bufferrltplus/dtt溶液中的350μl0.5％reagentdx(qiagen)。

使用allprepdna/rnaminikit(qiagen)，从样品匀浆物中分离dna和rna。rna分离部分包括柱上dna酶处理步骤。在每次洗脱的10-15分钟室温温育后，将dna在2x100μlultrapure蒸馏水(invitrogen)中洗脱。在每次洗脱的3分钟室温温育后，将rna在2x30μl无rna酶的水*中洗脱。通过在37℃下开放温育过夜浓缩dna。

通过靶向ul22(糖蛋白h)基因中的区域的qpcr测定，在用于hsv载体基因组的50-μl反应中分析十(10)μl浓缩的dna。

对于mrna表达分析，8μlrna首先经历使用superscript^tmiiifirst-strandsynthesissupermixforqrt-pcr(invitrogen)的逆转录，随后为rna酶处理。然后可通过靶向特定转基因(例如有效负载转录物)、稳定的2kblat内含子或5’lat外显子的许多qpcr测定中的何一种，分析rna酶处理的cdna。

实例2：不同hsv毒株的神经转导能力的比较

该实例证实mckrae株载体比kos株载体更有效地转导神经元。

制备两种不同的hsv-1野生型毒株(mckrae和kos)，并且注射到三只sprague-dawley(sd)大鼠的右和左后爪的背部和足底表面，各自为100μl/注射。在载体注射后五天对所有动物实施安乐死。在末端手术期间，取出左和右l4、l5和l6背根神经节(drg)，在-70℃下冷冻，并且在干冰上运送。

使用qiaampdnaminikit(qiagen)，从研究中的所有动物的左l4-l6drg分离dna。在rotor-geneqreal-timepcrcycler(qiagen)上，使用靶向hsv-1糖蛋白h(ul-22)基因内的序列的qpcr测定，分析样品dna的载体基因组拷贝。如表1中所示，mckrae株看起来比kos株明显更好地转导神经元。在kos组的drg中检测到的平均基因组拷贝数是73，而mckrae组的平均基因组拷贝数是21,347。

表1

loq:对照＝36.34

实例3：载体的制备

该实例描述了制备和配制用于基因治疗的示例性载体的方法。

载体的遗传结构

通过首先使用质粒通过同源重组替换icp4基因座的两个拷贝，并且筛选表达标记物元件的噬斑来制备载体。通过克隆hsv-1基因组的片段来构建质粒，所述片段包含icp4启动子上游的区域，包括在短反向重复区域内包含的病毒起点。通过将标记物元件例如hcmv-egfp片段克隆到质粒内进一步修饰质粒。然后将该质粒重组到野生型hsv病毒的icp4基因座内。使用表达稳定icp4的vero细胞系分离所得到的载体，例如‘6-5c’。vero6-5c细胞是表达icp4的互补细胞。

为了用上述载体中的目的基因(goi)替换标记物元件(例如gfp)，通过将hcmv-goi-pa克隆到质粒内来构建质粒。分离不表达标记物元件的噬斑，并且通过elisa测试goi表达。

粗载体的生产

使用完全培养基(补充有fbs、hepes和penstrep的dmem)在组织培养瓶中培养补充icp4的vero细胞，并且以3-4x10⁴细胞/cm²的接种密度扩增到6–12xt175烧瓶内。将培养瓶在37℃/7.5％co2下温育3-4天。

当细胞在汇合后1-2天时，它们用已知浓度的病毒原液以约0.1的感染复数(moi)感染。通过从每个烧瓶中取出培养物上清液，并且用含有适当量病毒原液的总共2.5ml完全培养基感染来起始感染。通过将培养物温育1.5-2小时，每15-20分钟摇动并旋转烧瓶，将病毒吸附在细胞单层上。在吸附步骤后，向每个烧瓶中加入另外的10ml完全培养基，并且将培养物再次在37℃/7.5％co2下温育。

在起始感染后大约48小时，通过显微镜观察烧瓶，以确认细胞显示致细胞病变效应的征兆和从烧瓶表面脱离。此时收获细胞和上清液，合并在一起，并以约1500xg离心约10分钟。上清液从细胞团块中去除，并且分开保留用于后续处理。

将细胞团块重悬浮于4-5ml完全培养基中，匀浆化，然后在-80℃下冷冻。在细胞悬浮液已冷冻>20分钟后，将其解冻并以约1500xg离心约10分钟。去除该第二细胞团块上清液，并且与第一次收集的上清液组合。

将合并的上清液等分到离心管内。然后将病毒以约40,000xg在2-8℃下离心约30分钟，以便使病毒形成团块。在离心步骤完成后，取出管中的上清液并弃去。第二天，通过移液将病毒团块匀浆化且合并在一起。然后将重悬浮的病毒原液等分到冷冻小瓶内，通常为约120μl/小瓶的体积。将完全培养基(200-300μl)加入病毒团块中，以便用液体覆盖它们并在2-8℃下贮存过夜，以使病毒颗粒松散。将小瓶标记并在-80℃下冷冻。随后，解冻冷冻小瓶以便执行病毒噬斑滴定测定，以在用于任何体内或体外研究之前确定制备的病毒原液的浓度。

澄清载体的制造

细胞解冻和扩增

将来自工作细胞库的vero细胞(例如，vero6-5、verod细胞)在37℃下解冻，并且转移到锥形管中且合并。verod细胞是表达或icp4、icp27和ul55的互补细胞。细胞以大约1.0×10⁷个活细胞/ml/管加入小瓶。用完全培养基逐渐稀释细胞，且取出样品以获得活细胞计数。将细胞以3.0-5.0×10⁴个细胞/cm²的密度在组织培养瓶中铺平板。

使细胞在37℃、7.5％co2下温育，并且通过相差显微镜检查定期检查。细胞在亚汇合时进行传代。去除完全培养基，用pbs冲洗，且使细胞解离。将烧瓶温育直至细胞解离，然后将它们重悬浮于完全培养基中，合并，计数且以1.0-4.0×10⁴个细胞/cm²的密度种植到新烧瓶内。将细胞扩增并且允许在感染前扩展至汇合后1-2天。

用载体感染

当细胞达到所需的汇合时，将模型烧瓶进行传代培养，并且计数细胞，以估计每个细胞工厂的细胞数目。通过解冻获得0.1的感染复数(moi)所需的适当体积，并且用完全培养基稀释原液直至感染所需的靶体积，来制备主病毒库载体接种物。细胞工厂通过初始吸附期感染，随后为在完全培养基中的温育用于第一天感染。在大约24小时后，去除培养基且替换为等体积的无血清培养基。将细胞工厂置于培养箱中，且将温度降至33℃/具有7.5％co2。每天监测培养物并且通过目视检查估计致细胞病变效应百分比。

粗病毒收获和澄清

通过将细胞工厂置于生物安全柜中，并且将上清液和细胞碎片合并到无菌袋内来停止感染。就外来因子取样这种批量未澄清的收获物。在取样后，收获的氯化钠水平增加，然后将其混合。然后将收获物等分到离心管内，并且通过离心去除细胞碎片。将上清液合并到无菌袋内。在用无菌水预处理澄清过滤器胶囊后，然后将含病毒的上清液泵送通过过滤器胶囊到另一个无菌袋内，随后为无菌水，以回收胶囊中剩余的病毒。将袋混合并将滤液在4℃下贮存过夜。

其后，将滤液加温，并且通过加入在无菌水中的2体积的3mmmgcl2，将其调节至约2mmmgcl2。将稀释的滤液混合并用核酸内切酶处理。

阳离子交换柱色谱

bpg400柱用sp高性能树脂填充，用0.5nnaoh消毒，并且用洗涤缓冲液(pbsph7.0)和剥离缓冲液(1mnacl-pbsph7.0)平衡，然后装载核酸内切酶处理的病毒。

使用管道焊接机将含有经核酸内切酶处理的滤液的处理袋连接到入口，并且将病毒装载到柱上。将流通物收集在无菌袋中。病毒捕获步骤随后为用pbs洗涤，直至uv吸光度回到基线。停止泵，并且将含有0.45mnacl-pbs(ph7.0)的处理袋连接到入口。将出口管道转移到生物安全柜中的无菌容器中。将缓冲液泵入柱内，并且当uv吸光度开始急剧增加时，将柱出口转移到新的无菌容器中，以收集洗脱的病毒。在uv吸光度恢复到接近基线后停止收集。这是纯化的病毒洗脱物级分。将包含剥离缓冲液的处理袋连接到入口，并且将出口管道的末端转移到无菌瓶内，以收集剥离级分。将缓冲液泵送通过柱，直到uv吸光度达到峰值并返回到接近基线。将收集的洗脱物于4℃贮存过夜。

切向流过滤

通过组装管道和药液筒，并且通过高压灭菌将系统灭菌，来制备使用0.1微米孔径的中空纤维滤筒的切向流过滤系统。用无菌pbs(ph7.0)冲洗系统，并且将病毒洗脱物级分加入系统储存器中，并且通过再循环平衡。平衡后，打开渗透物收集泵并收集滤液。运行该系统，直到装载的体积减少到大约500ml。用dpbs(ph7.0)伴随连续恒定体积渗滤稀释储存器中的渗余物，并且当渗透物电导率在渗滤缓冲液(dpbsph7.0)的10％内时，回收渗余物中的产物。

配制、最终过滤和包装

用无菌甘油将回收的渗余物调节至10％最终体积，并且充分混合，然后通过0.45μm盘式过滤器单元过滤。将产品分配到标记的冷冻小瓶内，用于在≤-65℃下贮存。

实例4：在爪注射后drg中的mckrae株的转导分析

该实例证实施用基于mckrae株的载体导致在体内背根神经节(drg)的转导。

将如上所述的复制缺陷型hsv-1载体注射到大鼠的足垫内。如图1所示，复制缺陷型hsv-1载体可以剂量依赖性方式(注射后五天)转导drg神经元。纵坐标显示在测定条件下可检测的基因组总数目的一部分，并且指示基因组的数目相对于注射的载体的剂量增加。

图2显示了在注射到啮齿类动物的足垫内之后5、14、47、77和131天时，drg中的有效负载的转录物的总数目。图3显示了作为每个基因组的有效负载的转录物数目、来自相同实验的数据。有效负载的表达由hcmv启动子驱动。

实例5：用不同启动子的有效负载转导和表达的分析

该实例证实使用神经元特异性启动子可在drg中获得增加的基因表达。

测试四种不同的启动子(hcmv、hcmvtac、nse和hcmvcgrp)在将hsv-1载体递送至drg中的功效。包含nse启动子的载体不具有cmv增强子，仅神经元特异性启动子。如图4所示，具有hcmv启动子的载体在drg中平均为每个基因组29个转录物，而hcmvtac、nse和hcmvcgrp启动子分别为平均每个基因组176、327和166个转录物。

将包含与hcmv、nse或cgrp启动子可操作地连接的绿色荧光蛋白(gfp)的mckrae病毒载体注射到大鼠的足垫内，并且随着时间过去在l4-l6drg中测量gfp转录物。如图5所示，组织特异性启动子在足垫接种后5至18天之间改善drg神经元中的转录。

另外，当三种不同的启动子(hcmv、hcmvecgrp和nse)随着时间过去(2-8周)进行比较时，含有nse或hcmvecgrp启动子的载体导致比含有hcmv启动子的载体更多的drg中的总转录物(参见图6和7)。

在接受mckrae病毒载体注射的大鼠的drg中测量有效负载的转录物，所述mckrae病毒载体包含与cgrp嵌合启动子或hcmv启动子可操作地偶联的多肽有效负载。如在注射后第5天和第14天时测量的，包含启动子上游的hcmv增强子的cgrp启动子显示比hcmv启动子更高的每个基因组的多肽有效负载的转录物数目(图8)。

等价方案

本领域技术人员将认识到，或使用不超过常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等价方案。本发明的范围并不预期限于上文说明书，而是如在下述权利要求中阐述的。