嵌合神经毒素的制作方法
本发明涉及具有增强特性的嵌合神经毒素及其在治疗中的用途。
背景
梭状芽孢杆菌(clostridia)属细菌产生高度有效且特异性的蛋白质毒素，其可以毒害神经元和它们被递送到的其他细胞。此类梭菌毒素的实例包括由破伤风梭菌(tent)和肉毒梭菌(bont)血清型a-g产生的神经毒素，以及由巴氏梭菌(c.baratii)和丁酸梭菌(c.butyricum)产生的神经毒素。
梭菌神经毒素中已知有一些最有效的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对于小鼠的半数致死剂量(ld50)值为0.5至5ng/kg。破伤风和肉毒杆菌毒素都通过抑制受影响的神经元的功能，特别是神经递质的释放起作用。虽然肉毒杆菌毒素作用于神经肌肉接点并抑制外周神经系统中的胆碱能传递，但破伤风毒素在中枢神经系统中起作用。
在自然界中，梭菌神经毒素被合成为单链多肽，其被蛋白水解切割事件翻译后修饰以形成通过二硫键连接在一起的两条多肽链。切割发生在特定的切割位点，该位点通常称为位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间的激活位点。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(h链)，其具有约100kda的分子量，和轻链(l链)，其具有约50kda的分子量。h链包含n-端易位组分(hn结构域)和c-端靶向组分(hc结构域)。切割位点位于l-链和易位结构域组分之间。在hc结构域与其靶神经元结合并通过内体将结合的毒素内化入细胞后，hn结构域将l链易位穿过内体膜并进入胞质溶胶，并且l-链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶)。
非细胞毒性蛋白酶通过蛋白水解切割称为snare蛋白的细胞内转运蛋白(例如snap-25、vamp或syntaxin)来起作用-参见geraldk(2002)“cellandmolecularbiology”(第4版)johnwiley&sons，inc。首字母缩写词snare来源于术语solublensfattachmentreceptor，其中nsf是指n-乙基马来酰亚胺敏感因子(n-ethylmaleimide-sensitivefactor)。snare蛋白与细胞内囊泡融合所必需的，因此是通过囊泡转运从细胞中分泌分子所必需的。蛋白酶功能是锌依赖性内肽酶活性并且对snare蛋白表现出高底物特异性。因此，一旦递送至期望的靶细胞，非细胞毒性蛋白酶能够抑制来自靶细胞的细胞分泌。梭菌神经毒素的l链蛋白酶是切割snare蛋白的非细胞毒性蛋白酶。
鉴于snare蛋白质的普遍性质，梭菌神经毒素如肉毒杆菌毒素已成功用于各种疗法中。
举例来说，我们提及williamj.lipham,cosmeticandclinicalapplicationsofbotulinumtoxin(slack,inc.,2004)，其描述了使用梭菌神经毒素如肉毒杆菌神经毒素(bont)，bont/a，bont/b，bont/c1，bont/d，bont/e，bont/f和bont/g以及破伤风神经毒素(tent)，以在许多治疗和化妆或美容应用中抑制神经元传导-例如市售肉毒杆菌毒素产品目前被批准为用于适应证的治疗，所述适应证包括局灶性痉挛状态、上肢痉挛状态、下肢痉挛状态、颈部张力障碍、眼睑痉挛、半面痉挛、腋部多汗症、慢性偏头痛、神经性逼尿肌过度活动、眉间纹和严重外眦线。另外，描述了梭菌神经毒素疗法用于治疗神经肌肉病症(参见us6,872,397)；用于治疗子宫病症(参见us2004/0175399)；用于治疗溃疡和胃食管反流疾病(参见us2004/0086531)；用于治疗张力障碍(参见us6,319,505)；用于治疗眼睛病症(参见us2004/0234532)；用于治疗眼睑痉挛(参见us2004/0151740)；用于治疗斜视(参见us2004/0126396)；用于治疗疼痛(参见us6,869,610，us6,641,820，us6,464,986和us6,113,915)；用于治疗纤维肌痛(参见us6,623,742，us2004/0062776)；用于治疗腰痛(参见us2004/0037852)；用于治疗肌肉损伤(参见us6,423,319)；用于治疗窦性头痛(参见us6,838,434)；用于治疗紧张性头痛(参见us6,776,992)；用于治疗头痛(参见us6,458,365)；用于减轻偏头痛性头痛(参见us5,714,469)；用于治疗心血管疾病(参见us6,767,544)；用于治疗神经障碍例如帕金森病(参见us6,620,415，us6,306,403)；用于治疗神经精神障碍(参见us2004/0180061，us2003/0211121)；用于治疗内分泌失调(参见us6,827,931)；用于治疗甲状腺病症(参见us6,740,321)；用于治疗受胆碱能影响的汗腺病症(参见us6,683,049)；用于治疗糖尿病(参见us6,337,075，us6,416,765)；用于治疗胰腺病症(参见us6,261,572，us6,143,306)；用于治疗癌症例如骨肿瘤(参见us6,565,870，us6,368,605，us6,139,845，us2005/0031648)；用于治疗耳部病症(参见us6,358,926，us6,265,379)；用于治疗自主神经障碍如胃肠肌肉障碍和其他平滑肌功能障碍(参见us5,437,291)；用于治疗与皮肤细胞增殖性病症相关的皮肤损伤(参见us5,670,484)；用于治疗神经源性炎性病症(参见us6,063,768)；用于减少脱发和刺激毛发生长(参见us6,299,893)；用于治疗下行口(参见us6,358,917)；用于减少食欲(参见us2004/40253274)；用于牙科治疗和程序(参见us2004/0115139)；用于治疗神经肌肉障碍和病症(参见us2002/0010138)；用于治疗各种病症和状况以及相关的疼痛(参见us2004/0013692)；用于治疗由粘液高分泌导致的病症，如哮喘和copd(参见wo00/10598)；和用于治疗非神经元病症如炎症，内分泌疾病，外分泌疾病，免疫病症，心血管疾病，骨骼病症(参见wo01/21213)。所有上述出版物均通过引用整体并入本文。
预计非细胞毒性蛋白酶如梭菌神经毒素(例如bont和tent)在人类和其他哺乳动物的治疗和美容治疗中的应用将扩大到可受益于这些毒素的性质的不断扩大的疾病和病痛范围。
目前，所有批准的包含bont的药物/化妆品制剂含有从梭菌菌株中纯化的天然存在的神经毒素(在
重组技术通过引入对神经毒素序列和/或结构的修饰，提供了改变或优化其性质的可能性。特别地，已经产生了嵌合神经毒素，其中hc结构域或hcc亚结构域被来自不同神经毒素的hc结构域或hcc亚结构域替代。
rummel等人，2011(exchangeofthehccdomainmediatingdoublereceptorrecognitionimprovesthepharmacodynamicpropertiesofbotulinumneurotoxin.febsjournal,278(23),4506-4515)产生了各种活性全长杂交神经毒素，包括aabb，aacc和bbaa嵌合体(字母代表四个结构域中每一个的血清型起源：l，hn，hcn，hcc)。在小鼠膈神经单侧膈膜测定中发现aabb嵌合体比bont/a更有效，而aacc仅保留了10％的bont/a效力。bbaa嵌合体保留了bont/a的85％的效力，并且与bont/b等效。
wang等人，2008(novelchimerasofbotulinumneurotoxinsaandeunveilcontributionsfromthebinding,translocation,andproteasedomainstotheirfunctionalcharacteristics.journalofbiologicalchemistry,283(25),16993-17002)产生ae(来自bont/a的lhn和来自bont/e的hc)和ea(来自bont/e的lhn和来自bont/a的hc)嵌合神经毒素，在lhn和hc结构域之间的ae嵌合体的情况下添加接头以增加灵活性。两者都能够在小鼠膈神经单侧膈膜测定以及体内引起麻痹。
wang等人，2012a(longer-actingandhighlypotentchimaericinhibitorsofexcessiveexocytosiscreatedwithdomainsfrombotulinumneurotoxinaandb.biochemicaljournal,444(1),59-67)产生ab(来自bont/a的lhn和来自bont/b的hc，具有改善折叠的接头)和ba(来自bont/b的lhn和来自bont/a的hc)嵌合神经毒素。ab嵌合体诱导了比在小鼠中的bont/a更长时间的神经肌肉麻痹。ba嵌合体能够减少非神经元细胞的胞吐作用。
wang等人，2012b(novelchimerasofbotulinumandtetanusneurotoxinsyieldinsightsintotheirdistinctsitesofneuroparalysis.thefasebjournal,26(12),5035-5048)产生atx(来自bont/a的lhn和来自tent的hc)，txa(来自tent的lhn和来自bont/a的hc)，etx(来自bont/e的lhn和来自tent的hc)和txe(来自tent的lhn和来自bont/e的hc)嵌合体。关于这些现有技术嵌合神经毒素的蛋白质序列提供的信息总结在下表1中：
表1-现有技术嵌合神经毒素中的lhn和hc结构域
然而，仍然需要嵌合神经毒素的优化设计，从而允许改善治疗性质。
本发明通过提供如权利要求中所述的嵌合神经毒素解决了上述问题。
技术实现要素：
一方面，本发明提供了嵌合神经毒素，其包含来自第一神经毒素的lhn结构域，与来自第二神经毒素的hc结构域共价连接，其中第一和第二神经毒素是不同的，其中lhn结构域的c-末端氨基酸残基对应于分离第一神经毒素中的lhn和hc结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基，并且其中hc结构域的n-末端氨基酸残基对应于分离第二神经毒素中lhn和hc结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基。
在第二方面，本发明提供了编码根据本发明的嵌合神经毒素的核苷酸序列。
在第三方面，本发明提供了包含根据本发明的核苷酸序列的载体。
在第四方面，本发明提供了包含根据本发明的核苷酸序列或载体的细胞。
在第五方面，本发明提供了包含根据本发明的嵌合神经毒素的药物组合物。
在第六方面，本发明提供了根据本发明的嵌合神经毒素，其用于治疗。
在第七方面，本发明提供了根据本发明的嵌合神经毒素用于治疗美学或美容状况的非治疗用途。
详细说明
在一个方面，本发明提供嵌合神经毒素，其包含来自第一神经毒素的lhn结构域，与来自第二神经毒素的hc结构域共价连接，其中第一和第二神经毒素是不同的，
·其中lhn结构域的c-末端氨基酸残基对应于分离第一神经毒素中lhn和hc结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基，和
·其中hc结构域的n-末端氨基酸残基对应于分离第二神经毒素中的lhn和hc结构域的310螺旋的第二个氨基酸残基。
如本文所用，术语“一”、“一个”和“该”可以表示一个或多个。
本文所用的术语“神经毒素”是指进入神经元并抑制神经递质释放的任何多肽。该过程涵盖神经毒素与低或高亲和力受体的结合，神经毒素的内化，神经毒素的内肽酶部分易位到细胞质中以及神经毒素底物的酶促修饰。更具体地，术语“神经毒素”涵盖由梭菌属细菌(梭菌神经毒素)产生的任何多肽，其进入神经元并抑制神经递质释放，以及通过重组技术或化学技术产生的此类多肽。正是这种双链形式是毒素的活性形式。这两条链被称为重链(h链)，其具有约100kda的分子量，和轻链(l链)，其具有约50kda的分子量。优选地，第一和第二神经毒素是梭菌神经毒素。
bont/a神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：1(uniprot登录号a5hzz9)。bont/b神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：2(uniprot登录号b1inp5)。bont/c神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：3(uniprot登录号p18640)。bont/d神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：4(uniprot登录号p19321)。bont/e神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：5(uniprot登录号q00496)。bont/f神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：6(uniprot登录号q57236)。bont/g神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：7(uniprot登录号q60393)。tent神经毒素氨基酸序列的实例提供为seqidno：8(uniprot登录号p04958)。所述神经毒素的氨基酸序列以及其他神经毒素的序列(即seqidno：58至91)显示在下面图1的比对中。
本文所用的术语“嵌合神经毒素”是指包含源自第一神经毒素的lhn结构域和源自第二神经毒素的hc结构域或由其组成的神经毒素。
本文所用的术语“hc结构域”是指神经毒素重链的功能不同区域，其具有约50kda的分子量，能够使神经毒素与位于靶细胞表面的受体结合。hc结构域由两个结构上不同的亚结构域组成，即“hcn亚结构域”(hc结构域的n末端部分)和“hcc亚结构域”(hc结构域的c末端部分)，每个亚结构域具有约25kda的分子量。
本文所用的术语“lhn结构域”是指缺乏hc结构域并由内肽酶结构域(“l”或“轻链”)和负责内肽酶易位到细胞质中的结构域(重链的hn结构域)组成的神经毒素。
本文提及“分离第一神经毒素中lhn和hc结构域的310螺旋的第一个氨基酸残基”是指分离lhn和hc结构域的310螺旋的n-末端残基。
本文提及“分离第二神经毒素中的lhn和hc结构域的310螺旋的第二氨基酸残基”是指分离lhn和hc结构域的310螺旋的n-末端残基之后的氨基酸残基。
“310螺旋”以及α-螺旋，β-折叠和反向转角是蛋白质和多肽中发现的二级结构的类型。310螺旋中的氨基酸以右手螺旋结构排列，其中每个完整的转角由三个残基和十个原子完成，它们将它们之间的分子内氢键分开。每个氨基酸对应于螺旋中的120°转角(即，螺旋每匝有三个残基)，并且沿着螺旋轴具有
该310螺旋对应于形成实际螺旋的四个残基和两个帽(或过渡)残基，在这四个残基的每个末端各一个。如本文所用的术语“分离lhn和hc结构域的310螺旋”由这6个残基组成。
通过进行结构分析和序列比对，发明人鉴定了分离破伤风和肉毒杆菌神经毒素中的lhn和hc结构域的310螺旋。该310螺旋在其n-末端(即在lhn结构域的c-末端部分)被α-螺旋包围，在其c-末端(即在hc结构域的n-末端部分)被β-链包围。310螺旋的第一(n-末端)残基(帽或过渡残基)也对应于该α-螺旋的c-末端残基。
分离lhn和hc结构域的310螺旋可以例如从公共可用的肉毒杆菌神经毒素的晶体结构确定，例如分别用于肉毒杆菌神经毒素a1和b1的3bta(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝3bta)和1epw(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureid＝1epw)。
公共可用的在计算机中建模和比对工具也可用于确定其他神经毒素中分离lhn和hc结构域的310螺旋的位置，例如同源建模服务器loopp(学习，观察和输出蛋白质模式，http：//loopp.org)，phyre(蛋白质同源性/类比识别引擎，http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)和rosetta(https://www.rosettacommons.org/)，蛋白质叠加服务器superpose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)，比对程序clustalomega(http://www.clustal.org/omega/)，以及列于internetresourcesformolecularandcellbiologists的许多其他工具/服务(http://molbiol-tools.ca/)。发明人特别发现“hn/hcn”连接处周围的区域在结构上高度保守，这使其成为叠加不同血清型的理想区域。
例如，发明人使用以下方法来确定该310螺旋在其他神经毒素中的序列：
1.使用结构同源建模工具loop(http://loopp.org)基于bont/a1晶体结构(3bta.pdb)获得所有bont血清型和tent的预测结构；
2.如此获得的结构(pdb)文件被编辑为仅包括hcn结构域的n末端和其前面的约80个残基(其是hn结构域的一部分)，从而保留在结构上高度保守的“hn/hcn”区域；
3.使用蛋白质叠加服务器superpose(http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/)将每种血清型叠加到3bta.pdb结构上；
4.检查叠加的pdb文件以在bont/a1的hc结构域的起始处定位310螺旋，然后鉴定另一血清型中的相应残基。
5.将所有bont血清型序列与clustalomega比对，以检查相应的残基是否正确。
通过该方法测定的lhn、hc和310螺旋结构域的实例列于表2中。
表2-lhn、hc和310螺旋结构域
使用结构分析和序列比对，发明人发现分离lhn和hc结构域的310螺旋后的β-链是所有肉毒杆菌和破伤风神经毒素中的保守结构，并且当从分离lhn和hc结构域的310螺旋的第一个残基(例如，在bont/a1的残基879处)开始时从第8个残基开始。
根据另一种定义，本发明的第一方面提供了嵌合神经毒素，其包含来自第一神经毒素的lhn结构域，与来自第二神经毒素的hc结构域共价连接，其中第一和第二神经毒素是不同的，
·其中lhn结构域的c-末端氨基酸残基对应于位于第一神经毒素中hc结构域起始(n-末端)的β-链n-末端的第8个氨基酸残基，和
·其中hc结构域的n-末端氨基酸残基对应于位于第二神经毒素中hc结构域的起始(n-末端)的β-链的n-末端的第7个氨基酸残基。
根据另一个定义，本发明的第一方面提供了嵌合神经毒素，其包含来自第一神经毒素的lhn结构域，与来自第二神经毒素的hc结构域共价连接，其中第一和第二神经毒素是不同的，
·其中lhn结构域的c-末端氨基酸残基对应于位于第一神经毒素中lhn结构域末端(c-末端)的α-螺旋的c-末端氨基酸残基，和
·其中hc结构域的n-末端氨基酸残基对应于位于第二神经毒素的lhn结构域末端(c-末端)的α-螺旋的c-末端氨基酸残基的c-末端的氨基酸残基。
根据本发明的嵌合神经毒素的设计过程的基本原理是试图确保二级结构不受损害，从而使三级结构和每个结构域的功能的任何变化最小化。
在一些现有技术的嵌合神经毒素中，lhn和hc结构域之间需要接头(参见表1)，可能是为了确保可接受的表达和纯化。
不希望受理论束缚，假设以具有与天然神经毒素的三级结构紧密相似的三级结构的蛋白质形式结构化嵌合神经毒素将促进它们的溶解性。
不希望受理论束缚，进一步假设不破坏嵌合神经毒素中310螺旋的四个中心氨基酸残基的事实确保了嵌合神经毒素的最佳构象，从而允许嵌合神经毒素将其功能发挥至全部能力。
事实上，发明人惊奇地发现仅保留第一神经毒素的310螺旋的第一个氨基酸残基和第二神经毒素在前的310螺旋的第二个氨基酸残基不仅允许产生可溶性和功能性嵌合神经毒素，而且进一步导致优于其他嵌合神经毒素的改善的性质，特别是增加的效力、增加的安全比和/或更长的作用持续时间。
神经毒素的不希望的效果(由神经毒素从施用部位扩散引起)可以通过测量相关动物模型(例如，在施用后7天内检测到体重减轻的小鼠)中的体重百分比损失来实验评估。相反，可以通过后趾外展评分(das)测定(肌肉麻痹的测量)通过实验评估所需的神经毒素的上靶作用。可以通过将配制在明胶磷酸盐缓冲液中的20μl神经毒素注射到小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体中，然后使用aoki的方法(aokikr，toxicon39：1815-1820；2001)评估后趾外展评分来进行das测定。在das测定中，小鼠通过尾巴短暂悬吊以引发特征性惊恐反应，其中小鼠伸展其后肢并外展其后趾。在神经毒素注射后，不同程度的后趾外展以五分制评分(0＝正常至4＝后趾外展和腿伸展的最大减少)。
然后，神经毒素的安全比可以表示为小鼠体重下降10％所需的神经毒素的量(在小鼠给药后的前七天内的峰值效应下测量)与das评分为2所需的神经毒素的量之间的比例。因此需要高安全性比分，并且表明能够有效地使目标肌肉麻痹而具有很少不希望的脱靶效应的神经毒素。
高安全比在治疗中特别有利，因为它代表治疗指数的增加。换句话说，这意味着与已知的梭菌毒素治疗剂相比可以使用减少的剂量和/或可以使用增加的剂量而没有任何额外的效果。使用较高剂量的神经毒素而没有额外作用的可能性是特别有利的，因为较高剂量通常导致神经毒素的较长作用持续时间。
神经毒素的效力可表示为神经毒素的最小剂量，当施用于小鼠腓肠肌/比目鱼肌复合体时，其导致给定的das评分，例如das评分为2(ed50剂量)或das评分为4。神经毒素的效力也可以表示为测量snare通过神经毒素切割的细胞测定中的ec50剂量，例如在测量通过嵌合bont/ab神经毒素切割snap-25的细胞测定中的ec50剂量。
神经毒素的作用持续时间可表示为向小鼠腓肠肌/比目鱼复合体给予给定剂量的神经毒素，例如导致das评分为4的最小剂量的神经毒素后检索das评分为0所需的时间。
在一个实施方案中，第一神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b，血清型c，血清型d，血清型e，血清型f或血清型g或破伤风神经毒素(tent)，并且第二神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b，血清型c，血清型d，血清型e，血清型f或血清型g或破伤风神经毒素(tent)。在优选的实施方案中，第一神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b或血清型c，第二神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b或血清型c。
可以基于特定中和抗血清的失活来区分不同的bont血清型，这种通过血清型分类与氨基酸水平的百分比序列同一性相关。基于氨基酸百分比序列同一性，将给定血清型的bont蛋白进一步分成不同的亚型。
优选地，第一和第二神经毒素是来自不同血清型的肉毒杆菌神经毒素。在另一个实施方案中，第一或第二神经毒素是肉毒杆菌神经毒素，而另一种神经毒素是破伤风神经毒素。
使用“xy”表示，据此，x是lhn结构域，y是hc结构域，以下嵌合神经毒素是本发明的实施方案：
ab，ac，ad，ae，af，ag，atx,
ba，bc，bd，be，bf，bg，btx,
ca，cb，cd，ce，cf，cg，ctx,
da，db，dc，de，df，dg，dtx,
ea，eb，ec，ed，ef，eg，etx,
fa，fb，fc，fd，fe，fg，ftx,
ga，gb，gc，gd，ge，gf，ftx,
txa，txb，txc，txd，txe，txf，txg，
其中a，b，c，d，e，f，g和tx分别是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b，血清型c，血清型d，血清型e，血清型f，血清型g和破伤风神经毒素(tent)。
然而，使用与上述相同的“xy”表示，以下嵌合神经毒素是本发明的优选实施方案：
ab，ac，
ba，bc，
ca，cb，
其中a，b，c分别是肉毒杆菌神经毒素(bont)血清型a，血清型b和血清型c。
在一个实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于：
-seqidno：1的氨基酸残基1至872，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：2的氨基酸残基1至859，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：3的氨基酸残基1至867，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：4的氨基酸残基1至863，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：5的氨基酸残基1至846，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：6的氨基酸残基1至865，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：7的氨基酸残基1至864，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，或
-seqidno：8的氨基酸残基1至880，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。
以及来自第二神经毒素的hc结构域对应于：
-seqidno：1的氨基酸残基873至1296，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：2的氨基酸残基860至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：3的氨基酸残基868至1291，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：4的氨基酸残基864至1276，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：5的氨基酸残基847至1251，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：6的氨基酸残基866至1275，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，
-seqidno：7的氨基酸残基865至1297，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列，或
-seqidno：8的氨基酸残基881至1315，或与其具有至少70％序列同一性的多肽序列。
两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是由比对序列共有的相同位置处的相同核苷酸/氨基酸的数量的函数。因此，％同一性可以计算为比对中每个位置的相同核苷酸/氨基酸的数量除以比对序列中核苷酸/氨基酸的总数，乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑空位数量，以及需要引入的每个空位的长度以优化两个或更多个序列的比对。序列比较和两个或多个序列之间的同一性百分比的确定可以使用特定的数学算法进行，特别是全局比对数学算法(needleman和wunsch，j.mol.biol.48(3)，443-453,1972)。例如blast，这是技术人员熟悉的。
第一或第二神经毒素可以是镶嵌神经毒素。在本上下文中使用的术语“镶嵌神经毒素”是指天然存在的梭菌神经毒素，其包含来自另一种梭菌神经毒素(例如不同血清型的梭菌神经毒素)的至少一个功能结构域，所述梭菌神经毒素通常不包含所述至少一个功能结构域。镶嵌神经毒素的实例是天然存在的bont/dc和bont/cd。bont/dc包含血清型d的l链和hn结构域和血清型c的hc结构域，而bont/cd由血清型c的l链和hn结构域和血清型d的hc结构域组成。
第一和第二神经毒素可以是修饰的神经毒素及其衍生物，包括但不限于下面描述的那些。修饰的神经毒素或衍生物可含有一种或多种氨基酸，其与天然(未修饰的)形式的神经毒素相比已经被修饰，或者可含有一种或多种插入的氨基酸，其不以毒素的天然(未修饰的)形式存在。举例来说，相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。此类修饰可以修饰神经毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，第一神经毒素和/或第二神经毒素是经修饰的神经毒素或经修饰的神经毒素衍生物。
修饰的神经毒素保留神经毒素的至少一种功能，选自与靶细胞上的低或高亲和力神经毒素受体结合的能力，以将神经毒素(轻链)的内肽酶部分转移到细胞质中并切割snare蛋白质。优选地，修饰的神经毒素保留这些功能中的至少两种。更优选地，修饰的神经毒素保留这三种功能。
修饰的神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(例如修饰的hc结构域)，其中所述修饰的重链以比天然(未修饰的)神经毒素更高或更低的亲和力结合靶神经细胞。hc结构域中的此类修饰可包括修饰hc结构域的神经节苷脂结合位点或蛋白质(sv2或突触结合蛋白)结合位点中的残基，其改变与靶神经细胞的神经节苷脂受体和/或蛋白质受体的结合。此类修饰的神经毒素的实例描述于wo2006/027207和wo2006/114308中，这两篇文献均通过引用整体并入本文。
修饰的神经毒素可以在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如底物结合或催化结构域中的修饰，其可以改变或修饰修饰的lc的snare蛋白特异性。此类修饰的神经毒素的实例描述于wo2010/120766和us2011/0318385中，这两篇文献均通过引用整体并入本文。
修饰的神经毒素可包含一种或多种修饰，其增加或降低修饰的神经毒素的生物活性和/或生物持久性。例如，修饰的神经毒素可包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序增加或降低修饰的神经毒素的生物活性和/或生物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xdxxxll，xexxxll，xexxxil和xexxxlm(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括y-x-x-hy(其中hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的神经毒素的实例描述于wo2002/08268中，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/a，其具有与seqidno：1为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/b，其具有与seqidno：2为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/c，其具有与seqidno：3为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/d，其具有与seqidno：4为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/e，其具有与seqidno：5为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/f，其具有与seqidno：6为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的bont/g，其具有与seqidno：7为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一或第二神经毒素是修饰的tent，其具有与seqidno：8为至少70％，优选至少75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二神经毒素是bont/b。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/xb神经毒素”。
在优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/a，第二神经毒素是bont/b。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/ab神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/a1，第二神经毒素是bont/b1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/a1的氨基酸残基1至872，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/b1的氨基酸残基860至1291。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：1的氨基酸残基1至872，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：2的氨基酸残基860至1291。换句话说，根据本发明的优选嵌合神经毒素包含氨基酸序列seqidno：13或由氨基酸序列seqidno：13组成。
与bont/a血清型相比，天然bont/b的效力要小得多，尽管它在突触小泡上的受体丰度相对较高。这是由于与啮齿动物(大鼠/小鼠)sytii相比，人突触结合蛋白ii(sytii)中毒素结合位点内的独特氨基酸变化(peng,l.等人，jcellsci，125(pt13)：3233-42(2012)；rummel，a.等人，febsj278：4506-4515(2011).13,22。由于这种残基变化，人类sytii具有大大降低的对天然bont/b以及对天然bont/dc和/g的结合。这些发现为临床观察提供了解释，即需要比bont/a(结合不同受体)更高剂量的bont/b来实现在患者中的相同水平的治疗效果。根据本发明的bont/xb或bont/ab神经毒素的优选实施方案中，来自bont/b神经毒素的hc结构域在hcc亚结构域包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，其与天然bont/b序列相比具有增加bont/b神经毒素对人sytii的结合亲和力的作用。
bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失已在wo2013/180799和pct/us2016/024211中公开，其尚未公开(均通过引用并入本文)。
bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括选自下组的取代突变：v1118m；y1183m；e1191m；e1191i；e1191q；e1191t；s1199y；s1199f；s1199l；s1201v；e1191c，e1191v，e1191l，e1191y，s1199w，s1199e，s1199h，w1178y，w1178q，w1178a，w1178s，y1183c，y1183p及其组合。
bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失还包括选自下组的两个取代突变的组合：e1191m和s1199l，e1191m和s1199y，e1191m和s1199f，e1191q和s1199l，e1191q和s1199y，e1191q和s1199f，e1191m和s1199w，e1191m和w1178q，e1191c和s1199w，e1191c和s1199y，e1191c和w1178q，e1191q和s1199w，e1191v和s1199w，e1191v和s1199y，或e1191v和w1178q。
bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失还包括三个取代突变的组合，其为e1191m，s1199w和w1178q。
在优选的实施方案中，bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失包括两个取代突变的组合，其为e1191m和s1199y。换句话说，根据本发明的优选嵌合神经毒素包含氨基酸序列seqidno：11或seqidno：12或由其组成。
在另一个优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/c，第二神经毒素是bont/b。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/cb神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/c1，第二神经毒素是bont/b1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/c1的氨基酸残基1至867，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/b1的氨基酸残基860至1291。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：3的氨基酸残基1至867，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：2的氨基酸残基860至1291。在一个优选的实施方案中，来自bont/b神经毒素的hc结构域在hcc亚结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，其具有与天然的bont/b序列相比增加bont/b神经毒素对人sytii的结合亲和力的作用。bont/bhcc亚结构域中合适的氨基酸残基取代、添加或缺失如上所述。
在根据本发明的bont/xdc神经毒素(其中第二神经毒素是镶嵌bont/dc的嵌合神经毒素)的优选实施方案中，来自镶嵌bont/dc神经毒素的hc结构域在hcc亚结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，与天然镶嵌bont/dc序列相比，其具有增加镶嵌bont/dc神经毒素对人sytii的结合亲和力的作用。
在根据本发明的bont/xg神经毒素的优选实施方案中，来自bont/g神经毒素的hc结构域在hcc亚结构域中包含至少一个氨基酸残基取代、添加或缺失，与天然bont/g序列相比，其具有增加bont/g神经毒素对人sytii的结合亲和力的作用。
根据本发明的其他优选神经毒素如下。
在优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/a，第二神经毒素是bont/c。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/ac神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/a1，第二神经毒素是bont/c1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/a1的氨基酸残基1至872，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/c1的氨基酸残基868至1291。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：1的氨基酸残基1至872，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：3的氨基酸残基868至1291。
在另一个优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/b，第二神经毒素是bont/a。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/ba神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/b1，第二神经毒素是bont/a1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/b1的氨基酸残基1至859，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/a1的氨基酸残基873至1296。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：2的氨基酸残基1至859，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：1的氨基酸残基873至1293。
在另一个优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/b，第二神经毒素是bont/c。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/bc神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/b1，第二神经毒素是bont/c1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/b1的氨基酸残基1至859，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/c1的氨基酸残基868至1291。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：2的氨基酸残基1至859，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：3的氨基酸残基868至1291。换句话说，根据本发明的优选嵌合神经毒素包含氨基酸序列seqidno：56或由氨基酸序列seqidno：56组成。
在另一个优选的实施方案中，第一神经毒素是bont/c，第二神经毒素是bont/a。这种嵌合神经毒素在本文中称为“bont/ca神经毒素”。更优选地，第一神经毒素是bont/c1，第二神经毒素是bont/a1。更优选地，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于bont/c1的氨基酸残基1至867，来自第二神经毒素的hc结构域对应于bont/a1的氨基酸残基873至1296。在一个优选的实施方案中，来自第一神经毒素的lhn结构域对应于seqidno：3的氨基酸残基1至867，来自第二神经毒素的hc结构域对应于seqidno：1的氨基酸残基873至1296。
可以使用重组技术生产本发明的嵌合神经毒素。因此，在一个实施方案中，根据本发明的嵌合神经毒素是重组嵌合神经毒素。应容易理解，根据该优选实施方案，编码本发明的重组嵌合神经毒素的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的载体和包含所述载体的细胞，如下文进一步描述的，可以作必要的修改后被称为重组的。
另一方面，本发明提供了编码根据本发明的嵌合神经毒素的核苷酸序列，例如dna或rna序列。在优选的实施方案中，核苷酸序列是dna序列。
可以使用本领域已知的任何合适的方法制备本发明的核酸分子。因此，核酸分子可以使用化学合成技术制备。或者，可以使用分子生物学技术制备本发明的核酸分子。
本发明的dna序列优选在计算机中设计，然后通过常规dna合成技术合成。
根据要采用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地修饰上述核酸序列信息用于密码子偏向。
另一方面，本发明提供了包含根据本发明的核苷酸序列的载体。在一个实施方案中，核酸序列被制备为包含启动子和终止子的dna载体的一部分。在优选的实施方案中，载体具有选自tac、arabad、t7-lac或t5-lac的启动子。
载体可适用于上述核酸序列的体外和/或体内表达。载体可以是瞬时和/或稳定基因表达的载体。载体可另外包含调节元件和/或选择标记。所述载体可以是病毒来源的、噬菌体来源的或细菌来源的。例如，所述表达载体可以是pet、pj401、pgex载体或其衍生物。
另一方面，本发明提供了包含根据本发明的核苷酸序列或载体的细胞。术语“细胞”在本文中可与术语“宿主细胞”或“细胞系”互换使用。合适的细胞类型包括原核细胞，例如大肠杆菌，和真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。优选地，细胞是大肠杆菌。
另一方面，本发明提供了一种产生本发明嵌合神经毒素的方法，所述方法包括在产生所述嵌合神经毒素的条件下培养如上所述的细胞的步骤。所述条件是本领域技术人员所熟知的，因此在此不需要进一步详述。优选地，所述方法还包括从培养物中回收嵌合神经毒素的步骤。
另一方面，本发明提供了包含根据本发明的嵌合神经毒素的药物组合物。优选地，药物组合物包含嵌合神经毒素和至少一种选自药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的组分。
另一方面，本发明提供了用于治疗的本发明的嵌合神经毒素或药物组合物。更确切地说，本发明涉及如本文所述的嵌合神经毒素或药物组合物在制备药物中的用途。换句话说，本发明涉及治疗有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的嵌合神经毒素或药物组合物的步骤。“有效量”是指嵌合神经毒素或药物组合物是以足以提供其指示效果的量施用。如本文所用，术语“受试者”优选是指人或动物，更优选是指人。
根据本发明的嵌合神经毒素优选适用于治疗有需要的受试者中与不想要的神经元活性相关的病症，例如选自痉挛性发声困难，痉挛性斜颈，喉性肌张力障碍，口颚肌发声困难，舌性肌张力障碍，颈肌张力障碍，局灶性手肌张力障碍，眼睑痉挛，斜视，半面肌痉挛，眼睑紊乱，脑瘫，局灶性痉挛和其他嗓音障碍，痉挛性结肠炎，神经源性膀胱，肛门痉挛，肢体痉挛，抽搐，震颤，磨牙症，肛裂，失弛缓症，吞咽困难和其他肌张力障碍以及其他以肌肉群不自主运动为特征的病症，流泪，多汗症，过度唾液分泌，过度胃肠分泌物，分泌性病症，肌肉痉挛引起的疼痛，头痛疼痛，偏头痛和皮肤病病症。更确切地说，本发明涉及如本文所述的嵌合神经毒素或药物组合物用于制备旨在治疗与不想要的神经元活性相关的病症的药物的用途，如上所述。换句话说，本发明涉及在有需要的受试者中治疗如上述与不想要的神经元活性相关的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的嵌合神经毒素或药物组合物的步骤。
另一方面，本发明提供了根据本发明的嵌合神经毒素在有需要的受试者中治疗美容或美学状况的非治疗用途。换句话说，本发明涉及治疗有需要的受试者的美容或美学状况的方法，包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的嵌合神经毒素或药物组合物的步骤。根据本发明的该方面，待治疗的受试者优选不患有与如上所述的不想要的神经元活性相关的病症。更优选地，所述受试者是健康受试者，即不患有任何疾病的受试者。
另一方面，本发明提供了用于治疗或非治疗(美容或美学)方法，或用于治疗或非治疗(美容或美学)用途的药盒，如上所述，所述药盒包含本发明的药物组合物和用于实施所述方法或用途的说明书。更确切地说，本发明涉及一种药盒，其包含本发明的药物组合物和用于将所述组合物治疗或美容性施用于有需要的受试者的说明书。如本文所用，术语“说明书”是指出版物、记录、图表或可用于传达如何执行本发明的方法或用途，例如向有需要的受试者治疗或美容施用所述组合物的任何其他表达介质。所述说明书可以例如固定在包含所述组合物或所述药盒的容器上。
本发明的工程化嵌合神经毒素可以配制用于口服、肠胃外、连续输注、吸入或局部应用。适于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液的形式，或在使用前溶解或悬浮在合适载体中的干粉。
在要局部递送的嵌合神经毒素的情况下，嵌合神经毒素可以配制成乳膏(例如用于局部施用)，或用于皮下注射。
局部递送手段可包括气溶胶或其他喷雾(例如喷雾器)。在这方面，嵌合神经毒素的气溶胶制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。
本发明的嵌合神经毒素可以在涉及受影响器官的神经支配的脊柱水平，通过脊柱中的鞘内或硬膜外注射给予患者。
优选的给药途径是经由腹腔镜和/或局部，特别是肌肉内注射。
给予本发明的嵌合神经毒素的剂量范围是产生所需治疗效果的剂量范围。应当理解，所需的剂量范围取决于嵌合神经毒素或组合物的确切性质、给药途径、制剂的性质、患者的年龄、患者病症的性质，程度或严重性、禁忌症，如果有的话，以及主治医师的判断。可以使用标准经验程序调整这些剂量水平的变化以进行优化。
通常使用嵌合神经毒素和无热原的无菌载体制备流体剂型。根据使用的载体和浓度，工程化的梭菌毒素可以溶解或悬浮在载体中。在制备溶液时，嵌合神经毒素可以溶解在载体中，如果需要，通过加入氯化钠使溶液等渗，并通过无菌过滤器使用无菌技术过滤灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿中并密封。或者，如果溶液稳定性足够，则可以通过高压灭菌对其密封容器中的溶液进行灭菌。有利地，诸如缓冲剂，增溶剂，稳定剂，防腐剂或杀菌剂，悬浮剂或乳化剂和/或局部麻醉剂的添加剂可以溶解在载体中。
在使用前溶解或悬浮在合适载体中的干粉可以通过在无菌区域中使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。或者，可以在无菌区域中使用无菌技术将成分溶解到合适的容器中。然后将产物冷冻干燥并无菌密封容器。
适用于肌肉内、皮下或皮内注射的肠胃外悬浮液以基本相同的方式制备，除了无菌组分悬浮在无菌载体中，而不是溶解并且不能通过过滤完成灭菌。组分可以以无菌状态分离，或者可以在分离后灭菌，例如，通过伽马照射。
根据本发明的给药可以利用多种递送技术，包括微粒包封、病毒递送系统或高压气溶胶冲击。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于实施或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5'至3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左到右书写。
在提供一系列值的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围内排除，并且在较小范围中包括任一个，没有一个或者两个极限的每个范围也包括在本公开内容中，属于规定的范围中任何特别排除的极限。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限之一或两者的范围也包括在本公开中。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“梭菌神经毒素”包括多种这样的候选试剂，并且提及“梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及其本领域技术人员已知的等同物，等。
现在将参考以下附图和实施例仅通过举例描述本发明。
附图说明
图1-使用clustalomega(1.2.1)多序列比对工具对bont/a1-8，/b1-8，/c，/d，/e1-12，/f1-7，/g，/“h”和tent进行序列比对。分离lhn和hc结构域的推定310螺旋的位置用粗体和下划线字符表示。
图2-纯化的重组bont/ab嵌合体1，2和3a的sdspage(分别为seqidno：9，10和11)。泳道标记为“分子量标准”(分子量标记)，“-dtt”(氧化的bont/ab嵌合体样品)和“+dtt”(还原的bont/ab嵌合体样品)。
图3-通过重组bont/ab嵌合体1，2和3a(分别为seqidno：9，10和11)切割大鼠脊髓神经元中的snap-25。在37℃下在含10％co2的潮湿气氛中，将培养的大鼠原代脊髓神经元(scn)暴露于不同浓度的重组bont/ab嵌合体1，2或3a中24小时。然后用补充有dtt和benzonase的1xnupage缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在90℃下在加热块上加热5分钟并储存在-20℃，然后通过western印迹分析snap-25切割。使用多克隆抗体检测snap-25，其检测snap-25的全长和切割形式(sigma#s9684)。抗兔hrp(sigma#a6154)用作二级抗体。
图4-小鼠后趾外展评分测定。在短暂的全身麻醉下，将小鼠注射到一只后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合肌中；使用后趾外展评分(das)在0-4等级上测量肌肉减弱。测定每种剂量的das最大值并相对于剂量作图，并将数据拟合至4-参数逻辑方程，并测定ed50以及导致das4(das4剂量)值的剂量。
图5-纯化的重组bont/ab嵌合体3b和3c(分别为seqidno：12和13)的sdspage。泳道标记为“分子量标准”(分子量标记)，“-dtt”(氧化的bont/ab嵌合体样品)和“+dtt”(还原的bont/ab嵌合体样品)。
图6-在人诱导的多能干细胞衍生的外周神经元(peri.4u-axiogenesis，germany)中通过重组bont/a和bont/ab嵌合体3b和3c(分别为seqidno：1，12和13)切割snap-25。在37℃下在含有5％co2的潮湿co2气氛中，将peri.4u细胞暴露于各种浓度的重组bont/a或bont/ab嵌合体3b或3c中24小时。然后用补充有dtt和benzonase的1xnupage缓冲液裂解细胞。将样品转移到微量离心管中，在90℃下在加热块上加热5分钟并储存在-20℃，然后通过western印迹分析snap-25切割。使用多克隆抗体检测snap-25，所述抗体检测snap-25的全长和切割形式(sigma#s9684)。抗兔hrp(sigma#a6154)用作二级抗体。
图7-小鼠后趾外展评分测定中随时间肌肉减弱的持续时间。在短暂的全身麻醉下，将小鼠注射一只后肢的腓肠肌-比目鱼肌复合肌中；使用后趾外展评分(das)在0-4等级上测量肌肉减弱。监测用在注射的前四天期间诱导的最低剂量注射的组的动物为4的das直至肌肉肌无力完全恢复至das为0(未观察到肌无力)。
图8-纯化的重组bont/bc(seqidno：56)的sdspage。泳道标记为“分子量标准”(分子量标记)，“-dtt”(氧化的bont/bc嵌合体样品)和“+dtt”(还原的bont/bc嵌合体样品)。
图9-通过天然bont/b，bont/bc嵌合体和大鼠皮质神经元中无活性的重组bont/b(分别为seqidno：2，56和57)切割vamp-2。在37℃下在含有5％co2的潮湿co2气氛中，将细胞暴露于各种浓度的bont24小时。用补充有dtt和benzonase的1xnupage缓冲液裂解细胞，并在90℃下加热5分钟，然后在-20℃下储存。使用多克隆兔抗-vamp-2(abcamab3347，1：1000)一级抗体和hrp-缀合的抗兔二级抗体(sigma#a6154)通过蛋白质印迹分析样品的vamp-2切割。
图10-使用botest试剂盒(biosentinel)通过天然bont/b和bont/bc嵌合体(分别为seqidno：2和56)切割vamp-2肽报道分子。在30℃下将各种浓度的bont与具有cfp-yfpfret对的vamp-2肽作为报道分子孵育18小时，测量未切割的：切割的报告底物的比例，作为在528nm处的yfp荧光强度的损失以及在440nm激发后，在485nm处的cfp荧光增益。
实施例
以下实施例用于说明本发明的具体实施方案，并不以任何方式限制权利要求中限定的本发明的范围。
实施例1-梭菌神经毒素中310螺旋的作图
所有bont血清型和tent的氨基酸序列均从公共数据库(例如，www.uniprot.org或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，然后使用www.loopp.org建模到已知的bont/a1(3bta.pdb)晶体结构上。这产生了预测的蛋白质结构，其被编辑以仅保留至hcn结构域的n末端部分和之前约80个残基(hn结构域的c末端部分)-该结构域(“hn/hcn”)在结构上高度保守，因此，使其成为叠加不同血清型的最佳区域。然后使用http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/将每个编辑的结构叠加到3bta.pdb上，并且然后鉴定了在bont/a1(872niints876)的hc开始处对应于明显的310螺旋的残基和在另一种血清型中的相应残基。用clustalomega(www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)对所有bont血清型的序列比对进行交叉检查(图1)。
通过鉴定不同神经毒素之间的结构等同区域，可以鉴定一个特定点，在该点处，一种神经毒素的c-末端一半可以转变为另一种神经毒素的n-末端一半，而不会中断整个分子的二级结构。该点被选为310螺旋的起点。
结果列于上表2中。
实施例2-bont/ab嵌合体的克隆、表达和纯化
使用标准分子生物学技术从编码亲本血清型分子的dna和合适的寡核苷酸构建bont/ab嵌合构建体1，2，3a，3b和3c(seqidno：9至13)。然后将这些克隆到具有或不具有c-末端his10-标签的pj401表达载体中，并转化到blr(de3)大肠杆菌细胞中用于过表达。在37℃和225rpm振荡下，这些细胞在含有补充有适当抗生素的1l改良terrificbroth(mtb)的2l带挡板的锥形瓶中生长。一旦a600达到>0.5，将培养箱温度降至16℃，然后在1小时后用1mmiptg以225rpm振荡诱导20h，以表达重组bont/ab构建体。
通过超声处理裂解收获的细胞，并通过在4℃以4500rpm离心1小时使其澄清。然后将重组bont/ab嵌合分子在硫酸铵中提取并通过标准快速蛋白质液相色谱(fplc)技术纯化。这涉及使用疏水相互作用树脂进行捕获，以及使用阴离子交换树脂进行中间纯化步骤。然后用内切蛋白酶lys-c蛋白水解切割部分纯化的分子以得到活性双链。用第二种疏水相互作用树脂进一步纯化以得到最终的bont/ab嵌合体。
对于具有十组氨酸标签(h10)的bont/ab嵌合分子(嵌合体1，2，3a)，捕获步骤使用固定的镍树脂代替疏水相互作用树脂。
每种嵌合体的序列如表3所示。
表3-嵌合bont/ab构建体
实施例3-bnt/ab嵌合体1,2和3a的比较
如实施例1(图2)所述纯化具有c末端his10标签和e1191m/s1199y双突变的bont/ab嵌合体1，2和3a，并测试其功能活性。
大鼠脊髓神经元snap-25切割测定法
制备大鼠脊髓神经元(scn)的原代培养物，并在96孔组织培养板中生长3周(如描述于：masuyer等人，2011，2011,j.struct.biol.structureandactivityofafunctionalderivativeofclostridiumbotulinumneurotoxinb；andin:chaddock等人，2002,proteinexpr.purif.expressionandpurificationofcatalyticallyactive,non-toxicendopeptidasederivativesofclostridiumbotulinumtoxintypea)。在scn进料培养基中制备bont/ab的系列稀释液。收集来自待处理孔的生长培养基并过滤(0.2μm过滤器)。将125μl经过滤的培养基加回到每个测试孔中。然后将125μl稀释的毒素加入板中(一式三份孔)。将处理过的细胞在37℃，10％co2下孵育24±1小时。
使用snap-25切割测定法分析bont活性
处理后，除去bont并用pbs(gibco，uk)洗涤细胞一次。在补充有0.1m二硫苏糖醇(dtt)和250单位/mlbenzonase(sigma)的1xnupage裂解缓冲液(lifetechnologies)中裂解细胞。通过sds-page分离裂解物蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。用对snap-25特异的一级抗体(sigma#s9684)探测膜，所述一级抗体识别未切割的snap-25以及由bont/a内肽酶切割的snap-25。使用的二级抗体是hrp缀合的抗兔igg(sigma#a6154)。通过增强的化学发光检测条带，并使用pxi6access(synoptics，uk)成像。使用genetools软件(syngene，cambridge，uk)测定条带的强度，并计算在每种bont浓度下裂解的snap-25的百分比。将数据拟合至4-参数逻辑方程，并使用graphpadprismversion6(graphpad)计算pec50。
下表4提供了在大鼠scnsnap-25切割测定中对嵌合体1，2和3a测定的pec50值。这些结果表明三种bont/ab嵌合体保留了进入大鼠脊髓神经元并切割其靶底物的能力。然而，在该测定中嵌合体3a比嵌合体1和2更有效(也参见图3)。
表4
后趾外展评分(das)测定
在das测定中测量bont/ab嵌合体1，2和3a活性的方法是基于通过尾巴快速悬吊时小鼠的惊恐反应脚趾扩展反射。该反射评分为后趾外展评分(das)，并且在将bont施用到后爪的腓肠肌-比目鱼肌中后被抑制。小鼠被通过尾巴快速悬吊以引起特征性的惊恐反应，其中动物伸展其后肢并外展其后趾。(aoki等人1999，eur.j.neurol.；6(suppl.4)s3-s10)。
在注射当天，将小鼠在接受3％氧气的异氟烷的诱导室中麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受肌内注射bont/ab嵌合体或载体(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)。
在神经毒素注射后，不同程度的后趾外展以0到4的等级评分，其中0＝正常，4＝后趾外展和腿伸展的最大减少。通过使用每个剂量的最大效应的平均值的非线性调整分析来测定ed50。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
在给药后第一天每2小时进行一次das；此后每天进行3次，持续4天。
图4显示了嵌合体1，2和3a(分别为seqidno：9，10和11)的拟合曲线。嵌合体3a曲线向左移动，这意味着与嵌合体1和2相比，较低剂量的嵌合体3a实现了类似的das反应，因此显示嵌合体3a在小鼠das测定中比其它嵌合体更有效；也请参见下表(表5)，其中提供了计算的ed50值和每种嵌合体导致das4(最高分数)的剂量。
下表5提供了在小鼠das测定中测定的重组bont/a1(rbont/a1)和嵌合体1，2和3a的ed50和das4剂量。这些结果表明，在三种嵌合体中，嵌合体3a在诱导肌肉减弱方面具有最高的体内效力。在从charlesriver实验室获得的小鼠中进行图4和表5中所示的研究。
表5
实施例4-bont/ab嵌合体3b，3c和bont/a1的比较
如实施例1(图5)所述，分别在e1191m/s1199y双突变(seqidno：12和13)存在和不存在时，纯化未标记的bont/ab嵌合体3b和3c，并使用重组bont/a1(seqidno：1)作为参照，测试功能活性。
人类多能干细胞snap-25切割测定
冷冻保存的peri.4u-细胞购自axiogenesis(cologne，germany)。按照制造商的建议进行细胞的解冻和铺板。简而言之，将含有细胞的冷冻管在37℃的水浴中解冻2分钟。轻轻再悬浮后，将细胞转移至50ml管中。用制造商提供的1ml的
对于毒素处理，在
使用snap-25切割测定法分析bont活性
处理后，除去bont并用pbs(gibco，uk)洗涤细胞一次。在补充有0.1m二硫苏糖醇(dtt)和250单位/mlbenzonase(sigma)的1xnupage裂解缓冲液(lifetechnologies)中裂解细胞。通过sds-page分离裂解物蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。用对snap-25特异的一级抗体(sigma#s9684)探测膜，所述抗体识别未切割的snap-25以及由bont/a内肽酶切割的snap-25。使用的二级抗体是hrp缀合的抗兔igg(sigma#a6154)。通过增强的化学发光检测条带，并使用pxi6access(synoptics，uk)成像。使用genetools软件(syngene，cambridge，uk)测定条带的强度，并计算在每种bont浓度下裂解的snap-25的百分比。将数据拟合至4-参数逻辑方程，并使用graphpadprismversion6(graphpad)计算pec50。
图6显示了嵌合体3b和3c在诱导的人多能干细胞中显示出比rbont/a1在切割snap-25中更大的效力，但前者显著更强。这可以通过双突变来解释，其增加了嵌合体3b对这些细胞中存在的人突触结合蛋白ii蛋白受体的亲和力(图6，表6)。
表6
后趾外展评分(das)测定-安全比
测量das测定中bont活性的方法是基于当通过尾巴短暂悬吊时小鼠的惊恐反应扩展反射。该反射评分为后趾外展评分(das)，并且在将bont施用到后爪的腓肠肌-比目鱼肌中后被抑制。小鼠通过尾巴短暂悬吊以引起特征性的惊恐反应，其中动物伸展其后肢并外展其后肢。(aoki等人1999，eur.j.neurol.；6(suppl.4)s3-s10)。
在注射当天，将小鼠在接受3％氧气的异氟烷的诱导室中麻醉。每只小鼠在右后爪的腓肠肌-比目鱼肌中接受肌内注射bont或载体(含有0.2％明胶的磷酸盐缓冲液)。
在神经毒素注射后，不同程度的后趾外展以0到4的等级评分，其中0＝正常，4＝后趾外展和腿伸展的最大减少。通过使用每个剂量的最大效应的平均值的非线性调整分析来测定ed50。使用的数学模型是4参数逻辑模型。
在给药后第一天每2小时进行一次das；此后，对于所有剂量，每天进行3次，持续4天。随后监测注射载体和在注射的前四天期间诱导的das为4的最低剂量的组的动物直至肌无力完全恢复至das为0(未观察到肌无力)。
为了计算安全比，在毒素注射前一天(d0)称重所有动物，然后在整个研究期间每天一次称重。为每个剂量组每天计算平均体重、其标准差和标准误平均值。为了获得bont的安全比(-10％δbw/ed50)，将在研究期间的任何时间剂量组的平均重量低于相同剂量的d0的平均重量的10％的剂量除以所研究的bont的ed50。致死剂量定义为该剂量组中一只或多只动物死亡的剂量。
图7显示了rbont/a1，嵌合体3b和嵌合体3c(seqidno：1,12和13)的小鼠后趾外展评分测定中随时间肌肉减弱的持续时间，表明嵌合体具有更长的作用持续时间。
下表7提供了在小鼠das测定中对rbont/a1和嵌合体3b和3c测定的ed50和das4剂量。该表还提供了das4剂量的总作用持续时间，直到肌肉无力完全恢复至das为0(未观察到肌肉无力)。此外，该表显示了小鼠致死剂量和安全比(-10％δbw/ed50)，如上文所定义。与rbont/a1相比，嵌合体3b和3c具有更长的作用持续时间，更好的安全比和更高的致死剂量。在从janvier实验室获得的小鼠中进行图7和表7中所示的研究。
表7
实施例5-bont/bc嵌合体的表达和纯化以及功能活性的确认
如实施例2所述克隆、表达和纯化bont/bc嵌合体4(seqidno：56)，不同之处在于使用不同的表达细胞株(bl21)和用胰蛋白酶而不是内切蛋白酶lys-c进行蛋白水解切割(图8)。
表8-嵌合bont/bc构建体
在vamp-2切割测定中测试该嵌合体的功能活性。
大鼠皮层神经元vamp-2切割测定
制备大鼠皮层神经元，并在37℃，含5％co2的潮湿气氛中，在含有2％b27补充物，0.5mmglutamax，1％胎牛血清(fbs)和100u/ml青霉素/链霉素的125μl的neurobasal培养基中以20000细胞/孔的密度在聚-l-鸟氨酸(plo)包被的96孔板上维持。在div4上加入另外125μl含有2％的b27，0.5mmglutamax的neurobasal培养基。每3-4天更换一半培养基来维持细胞。在div11上，向培养基中加入1.5μm胞嘧啶β-d-阿拉伯呋喃糖苷(arac)以防止非神经元细胞的增殖。在37℃将div19-21的皮层神经元用浓度范围的bont(30fm-3nm)处理24小时。
使用vamp-2切割测定法分析bont活性
在测定培养基(neurobasalw/o酚红，2％的b27，0.5mmglutamax，10μmtfb-tboa((3s)-3-[[3-[[4-(三氟甲基)苯甲酰基]氨基]苯基]甲氧基]-l-天冬氨酸中短暂洗涤细胞，然后在100μl裂解缓冲液(nupagelds样品缓冲液，1mmdtt和1：500benzonase)中裂解，并在90℃加热5分钟。在200v下用mes缓冲液在12％bis-tris胶中运行15μl裂解液50分钟。使用低mw程序通过transblotturbo(biorad)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用pbst中的5％低脂牛奶封闭膜，然后用兔抗vamp-2(abcamab3347,1：1000)一级抗体然后hrp缀合的抗兔二级抗体(sigma#a6154)进行探测。用supersignalwestdura化学发光底物显色膜，并使用syngenepxi系统显现。使用genetools软件(syngene)分析条带密度测定法并测定相对于对照孔，每种浓度的bont下vamp-2百分比切割。将数据拟合至4-参数逻辑方程，并使用prism软件(graphpad)计算pec50。
图9显示了嵌合体4能够结合大鼠脊髓神经元，易位到细胞质中，并特异性地切割其底物vamp-2。作为参照，与无活性的重组bont/b1分子(在e231q和h234y处具有双突变，在本文中也称为bont/b1(0))(seqidno：57)相比，该嵌合体显然是功能性的，并且几乎与天然bont/b1分子(seqidno：2)一样有活性(表9)。这可以通过bont/b与突触结合蛋白和大鼠细胞表面上存在的各种神经节苷脂的高亲和力结合来解释，而嵌合体4中c的结合结构域仅已知以较低的亲和力与神经节苷脂结合。这得到来自轻链蛋白酶活性测定的数据的支持，如下文进一步所示。
表9
轻链蛋白酶活性测定
根据制造商的说明书，使用
轻链蛋白酶活性测定证实嵌合体4的轻链与天然bont/b1的轻链一样有活性(参见图10和表10)，因此，如上所述，vamp-2切割测定的结果可以通过以下事实来解释：与仅与神经节苷脂结合的嵌合体4中的c的结合结构域相比，bont/b对突触结合蛋白和大鼠细胞表面上存在的各种神经节苷脂具有更高的亲和力。
表10
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