使用GSK-3-α抑制剂的受控增殖干细胞/产生内耳毛细胞的方法与流程

本申请要求在35u.s.c.§119(e)下于2016年3月2日提交的美国申请号62/302,803和2016年3月3日提交的美国申请号62/303,099的优先权，它们中的每一篇通过引用整体并入。

背景

技术领域。

本发明涉及用于诱导干/祖支持细胞的自我更新（包括诱导干/祖细胞增殖，同时在子代细胞中维持分化成组织细胞的能力）的组合物和方法。

相关技术的描述

干细胞在体内展现出惊人的产生多种细胞类型的能力。除了胚胎干细胞外，组织特异性的干细胞在发育期间以及在成年人的体内稳态和损伤修复中发挥关键作用。干细胞通过增殖而自我更新，以及通过分化而产生组织特异性的细胞类型。不同干细胞的特性随组织不同而变化，并且由其固有的遗传状态和表观遗传状态决定。但是，不同干细胞在自我更新和分化之间的平衡都受到严格控制。失控的自我更新可能导致干细胞的过度生长，并可能导致肿瘤形成，而失控的分化可能耗尽干细胞库，从而导致维持组织体内稳态的能力受损。因而，干细胞持续地感知它们的环境并适当地以增殖、分化或细胞凋亡做出应答。通过控制干细胞增殖和分化的时机和程度来驱动再生将是合乎需要的。用随时间被清除的小分子来控制增殖，将允许控制干细胞增殖和分化的时机和程度。值得注意的是，来自不同组织的组织干细胞共享有限数目的调节其自我更新和分化的信号传递途径，但是以非常依赖于环境的方式。这些途径中的一些是wnt和gsk3-β途径。

lgr5在多种组织中表达，并且已被鉴定为多种组织中的成体干细胞的生物标志物，诸如肠上皮(barker等人.2007)、肾、毛囊和胃(barker等人,2010;haegebarth&clevers,2009)。例如，在2011年首次公开了哺乳动物内耳毛细胞源自lgr5⁺细胞(chai等人,2011,shi等人.2012)。lgr5是wnt/β-连环蛋白途径的已知组分，其已经被证实在分化、增殖和诱导干细胞特征中起主要作用(barker等人.2007)。

内耳毛细胞的永久性损伤会导致感音神经性听觉丧失，从而在大比例的人群中造成交流困难。毛细胞是转换听觉刺激的感受细胞。受损的毛细胞的再生为目前除了假体装置以外再无其它疗法的病症的治疗提供了途径。尽管毛细胞在哺乳动物耳蜗中不会再生，但是在低等脊椎动物中的新毛细胞由环绕毛细胞的上皮细胞（被称作支持细胞）产生。

先前的工作已经聚焦于通过导致毛细胞形成的基因的活化或强制表达而使支持细胞转分化为毛细胞，特别聚焦于增强atoh1的表达的机制(bermingham等人,1999;zheng和gao,2000;izumikawa等人,2005;mizutari等人,2013)。令人感兴趣的是，已经证实用atoh1载体转导的细胞会获得前庭表型(kawamoto等人,2003;huang等人,2009;yang等人,2012,2013)，并且缺乏完整的发育。如提及的，已经证实通过基因插入而上调atoh1会产生非耳蜗细胞类型，其行为方式在天然耳蜗中未发现。另外，这些方法会增加毛细胞数目，但减少支持细胞数目。由于已知支持细胞具有专门作用(ramirez-camancho2006,dale和jagger2010)，这些细胞的损失将对适当的耳蜗功能带来问题。

因而，仍然存在长期感觉到的需求：在损伤前保护听觉细胞，在损伤后维持/促进现有细胞的功能，在损伤后再生结构（包括神经元和毛细胞），和在损伤后再生耳蜗支持细胞或毛细胞。如下面公开的，在某些实施方案中，本发明提供了用于预防和治疗听觉功能障碍的方法。

附图说明

图1a-1b显示了在多种条件下lgr5-gfp内耳支持细胞的扩增。图1a显示了在含有与chir99021(c)（优先抑制gsk3β的分子）或azd1080（优先抑制gsk3α的分子）组合的生长因子(gf)=[egf、bfgf、igf-1]、vpa(v)的培养基中培养10天的lgr5-gfp内耳祖细胞的亮视野和gfp荧光图像。图1b显示了在含有与chir99021(c)（优先抑制gsk3β的分子）或azd1080（优先抑制gsk3α的分子）组合的gf=[egf、bfgf、igf-1]、vpa(v)的培养基中培养10天的lgr5-gfp内耳祖细胞的定量。

图2a-2b显示了在多种条件下lgr5-gfp内耳支持细胞的扩增。图2b显示了在含有与chir99021(c)（优先抑制gsk3β的分子）或gsk3抑制剂xxii（同样抑制gsk3α和gsk3β的分子）组合的gf=[egf、bfgf、igf-1]、vpa(v)的培养基中培养10天的lgr5-gfp内耳祖细胞的亮视野和gfp荧光图像。图2b显示了在含有与chir99021(c)（优先抑制gsk3β的分子）或gsk3抑制剂xxii（其具有比chir99021更高的gsk3α-抑制偏好）组合的gf=[egf、bfgf、igf-1]、vpa(v)的培养基中培养10天的lgr5-gfp内耳祖细胞的定量。

图3显示了在离体处理的柯蒂氏器官中增加的数目的毛细胞。用gsk3-抑制剂xxii处理的柯蒂氏器官表现出增加的lgr5-gfp表达，2排内毛细胞，和6排外毛细胞。这是相对于在耳蜗中通常见到的正常1排内毛细胞和3排外毛细胞的增加。

图4显示了在噪音损伤的cba/caj小鼠中的听力恢复。用丙戊酸和chir99021(cv)（其中与gskα相比，chir99021优先抑制gsk3β）处理的动物在所有试验的频率表现出显著恢复(n=32)。用vpa(v)和gsk3-抑制剂xxii(具有比chir99021更高的gsk3α-抑制偏好的分子(n=6))处理动物。

发明简述

在一个方面，本发明提供了一种用于增殖干细胞的方法，其包括使细胞群体与有效量的gsk3-α抑制剂或其药学上可接受的盐接触。在某些实施方案中，所述方法还包括使所述细胞群体与分化抑制剂（例如，hdac抑制剂或notch激动剂）接触。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

因此，在本发明的不同方面，可以注意到一种用于在细胞群体中活化wnt途径以增加该群体的自我更新能力(即，重复产生具有相同增殖和“细胞命运指定”潜能的子代细胞的能力)和分化能力(即，产生被指定用于分化的子代细胞的能力)的方法。在一个实施方案中，所述细胞群体是耳蜗支持细胞群体。优选地，在该群体的成员的c-myc基因上游活化wnt途径，而不对该群体进行任何遗传修饰。作为替代，优选地用瞬时诱导这种活性的小分子活化wnt途径。另外，所述支持细胞群体优选地包括对柯蒂氏器官而言内源性的lgr5⁺支持细胞。

本发明的另一个方面是一种用于诱导被耳蜗细胞群体包含的干/祖支持细胞的自我更新的方法。也就是说，诱导干/祖支持细胞增殖(即，分裂并形成子代细胞)，同时在子代细胞中保持分化为毛细胞的能力。相反，如果仅诱导干/祖支持细胞增殖(而不保持多潜能性)，则子代细胞将缺乏分裂为毛细胞的能力。此外，仅增强预先存在的干/祖细胞群体的分化具有耗尽干细胞库的潜力。

优选地用瞬时诱导这种活性的小分子活化增殖。另外，在某些实施方案中，所述支持细胞群体优选地包括对柯蒂氏器官而言内源性的lgr5⁺支持细胞。

在不同的实施方案中，用gsk3-α抑制剂活化所述wnt途径。在某些实施方案中，用多种gsk3-α抑制剂活化所述wnt途径。在某些实施方案中，根据本文方法使用的gsk3-α抑制剂包括本文中公开的gsk3-α抑制剂中的一种或多种。在一个实施方案中，所述一种或多种gsk3-α抑制剂是表1中的gsk3-α抑制剂中的一种或多种。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了通过活化某些途径和机制(例如，wnt途径)来诱导支持细胞群体的自我更新的方法，所述某些途径和机制参与诱导干细胞性质以建立“诱导的多能干细胞”，例如，通过使所述细胞与gsk3-α抑制剂接触。优选地，用小分子(例如，在表1中的gsk3-α抑制剂中的任意一种或多种)活化所述途径。例如，当在体外施用给支持细胞群体时，组合物在干细胞增殖测定中诱导该群体以高程度和高纯度增殖，并且在干细胞分化测定中也允许该群体分化为高纯度的组织细胞群体。在一个这样的实施方案中，所述组合物通过增殖产生干细胞来诱导和保持干细胞性质，所述干细胞可以分裂许多代并保持具有高比例的所产生的细胞分化为组织细胞的能力。此外，增殖中的干细胞表达干细胞标志物，它们可以包括lgr5、sox2、opeml、phex、lin28、lgr6、cyclind1、msx1、myb、kit、gdnf3、zic3、dppa3、dppa4、dppa5、nanog、esrrb、rex1、dnmt3a、dnmt3b、dnmt3l、utf1、tcl1、oct4、klf4、pax6、six2、zic1、zic2、otx2、bmi1、cdx2、stat3、smad1、smad2、smad2/3、smad4、smad5和smad7中的一种或多种。

在某些实施方案中，本发明提供了一种在包含亲本细胞群体的耳蜗组织中扩增耳蜗细胞群体的方法，所述方法包括使所述耳蜗组织与干细胞增殖剂接触以在所述耳蜗组织中形成扩增的细胞群体，其中

所述干细胞增殖剂能够(i)在干细胞增殖测定中经历增殖测定时间段从增殖测定初始细胞群体形成增殖测定最终细胞群体，和(ii)在干细胞分化测定中经历分化测定时间段从分化测定初始细胞群体形成分化测定最终细胞群体，其中：

(a)所述增殖测定初始细胞群体具有：(i)增殖测定初始细胞总数，(ii)增殖测定初始lgr5⁺细胞数，(iii)增殖测定初始毛细胞数，(iv)增殖测定初始lgr5⁺细胞比例，其等于增殖测定初始lgr5⁺细胞数与增殖测定初始细胞总数之比，和(v)增殖测定初始毛细胞比例，其等于增殖测定初始毛细胞数与增殖测定初始细胞总数之比；

(b)所述增殖测定最终细胞群体具有：(i)增殖测定最终细胞总数，(ii)增殖测定最终lgr5⁺细胞数，(iii)增殖测定最终毛细胞数，(iv)增殖测定最终lgr5⁺细胞比例，其等于增殖测定最终lgr5⁺细胞数与增殖测定最终细胞总数之比，和(v)增殖测定最终毛细胞比例，其等于增殖测定最终毛细胞数与增殖测定最终细胞总数之比；

(c)所述分化测定初始细胞群体具有：(i)分化测定初始细胞总数，(ii)分化测定初始lgr5⁺细胞数，(iii)分化测定初始毛细胞数，(iv)分化测定初始lgr5⁺细胞比例，其等于分化测定初始lgr5⁺细胞数与分化测定初始细胞总数之比，和(v)分化测定初始毛细胞比例，其等于分化测定初始毛细胞数与分化测定初始细胞总数之比；

(d)所述分化测定最终细胞群体具有：(i)分化测定最终细胞总数，(ii)分化测定最终lgr5⁺细胞数，(iii)分化测定最终毛细胞数，(iv)分化测定最终lgr5⁺细胞比例，其等于分化测定最终lgr5⁺细胞数与分化测定最终细胞总数之比，和(v)分化测定最终毛细胞比例，其等于分化测定最终毛细胞数与分化测定最终细胞总数之比；

(e)所述增殖测定最终lgr5⁺细胞数比增殖测定初始lgr5⁺细胞数大至少10倍；和

(f)所述分化测定最终毛细胞数是非零数字。

在某些这样的实施方案中，所述干细胞增殖剂包含干性驱动剂(例如，gsk3-α抑制剂)。在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂包含分化抑制剂。在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂包含干性驱动剂和分化抑制剂。在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂是gsk3-α抑制剂(例如，表1中所示的gsk3-α抑制剂)，且所述方法还包括使所述耳蜗组织中的耳蜗细胞与分化抑制剂接触。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，本发明提供了一种增加耳蜗细胞群体中的支持细胞的细胞密度的方法，所述方法包括：活化所述支持细胞中的诱导干细胞性质的途径和机制，使活化的支持细胞增殖(同时在新形成的子代细胞中保持所述支持细胞的多潜能特性)，并随后允许(或甚至诱导)扩增的群体分化为毛细胞以形成扩增的耳蜗细胞群体，其中所述扩增的耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度大于原始的(未扩增的)耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度。在某些实施方案中，所述支持细胞群体是体外支持细胞群体。在某些实施方案中，所述支持细胞群体是体内支持细胞群体。此外，优选地控制所述增殖阶段以基本上保持耳蜗结构的天然构造。在这样的实施方案中，通过瞬时诱导这种活性的一种或多种gsk3-α抑制剂(例如，表1所示的gsk-α抑制剂中的一种或多种)来诱导增殖，而不是通过诱导c-myc来诱导增殖，且不对该群体进行任何遗传修饰。在某些实施方案中，这样的方法进一步包括使所述细胞与分化抑制剂接触。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。另外，在某些实施方案中，所述支持细胞群体优选地包括对柯蒂氏器官而言内源性的lgr5⁺支持细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了一种增加耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度的方法，所述方法包括：活化lgr5⁺支持细胞中的诱导或保持干细胞性质的途径和机制，使活化的lgr5⁺支持细胞增殖(同时保持这种干细胞性质)，并随后允许(或甚至诱导)扩增的群体分化为毛细胞以形成扩增的耳蜗细胞群体，其中所述扩增的耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度大于原始的(未扩增的)耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度。在某些实施方案中，所述lgr5⁺支持细胞群体是体外lgr5⁺干细胞群体。在某些实施方案中，所述lgr5⁺支持细胞群体是体内支持细胞群体。另外，在某些实施方案中，优选地控制所述增殖阶段以基本上保持耳蜗结构的天然构造。在这样的实施方案中，通过一种或多种gsk3-α抑制剂(例如，表1所示的gsk-α抑制剂中的一种或多种)来诱导增殖。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂瞬时诱导这种活性，而不是通过诱导c-myc，且不对该群体进行任何遗传修饰。在某些实施方案中，这样的方法进一步包括使所述细胞与分化抑制剂接触。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，将含有干性驱动剂(例如，gsk-α抑制剂)和分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂诸如丙戊酸)的组合物施用给耳蜗细胞群体以诱导干细胞的增殖和抑制干细胞的分化，直到达到期望的干细胞群体扩增。此后，允许(或任选地甚至诱导)扩增的群体分化为毛细胞。另外，优选地控制所述增殖阶段以基本上保持所述耳蜗结构的天然构造。在某些实施方案中，所述干性驱动剂和分化抑制剂是小分子。在某些实施方案中，所述干细胞群体是体内干细胞群体。在某些实施方案中，所述干细胞群体是体外干细胞群体。在某些实施方案中，所述干细胞群体是体内lgr5⁺干细胞群体。在某些实施方案中，所述干细胞群体是体外lgr5⁺干细胞群体。在某些实施方案中，所述干性驱动剂是gsk-α抑制剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，本发明提供了一种增加初始耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度的方法，所述初始群体(其可以是体内或体外群体)包含毛细胞、lgr^-支持细胞和lgr5⁺支持细胞。所述方法包括给所述初始群体施用干性驱动剂和分化抑制剂。在某些实施方案中，所述干性驱动剂是gsk-α抑制剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，所述方法在干细胞增殖测定中产生表达干细胞标志物lgr5⁺的干细胞。在某些实施方案中，如果将lgr5⁺和非-lgr5⁺干细胞混合群体置于干细胞增殖测定中，那么所述方法增加该群体中的lgr5⁺细胞的比例。

将支持细胞群体扩增至这样的程度，破坏所述耳蜗结构的天然构造可能抑制耳蜗功能。与使用基因递送相比，用小分子信号驱动现有支持细胞的增殖可以实现更加受控的毛细胞再生，所述基因递送不能靶向特定细胞类型且会永久地改变细胞的遗传信息。在所需的接近正常的耳蜗结构中，各排毛细胞之间是支持细胞，且毛细胞不接触其它毛细胞。另外，合乎需要的是，避免使用遗传修饰来驱动增殖以在耳蜗中产生破坏器官解剖学构造的大的细胞聚集体。

在某些实施方案中，本发明提供了一种包含干性驱动剂的组合物，所述干性驱动剂可以用来驱动耳蜗支持细胞的选择性扩增。在某些情况下，如果分化抑制剂不以有效分化抑制浓度存在，那么干性驱动剂也可以诱导支持细胞分化为毛细胞。可以驱动增殖和分化的干性驱动剂的例子包括gsk3-α抑制剂。在这些实施方案中的某些中，所述组合物包含干性驱动剂和分化抑制剂，其中所述干性驱动剂和所述分化抑制剂是不同的试剂。在一个这样的实施方案中，所述干性驱动剂是gsk3-α抑制剂(例如，本文中公开的gsk3-α抑制剂之一)，且所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，本发明提供了一种增加包含毛细胞和支持细胞的初始耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度的方法。所述方法包括选择性地扩增所述初始群体中的支持细胞的数量以形成中间耳蜗细胞群体，其中所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞的数量比大于所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞的数量比。所述方法还包括在所述中间耳蜗细胞群体中产生毛细胞以形成扩增的耳蜗细胞群体，其中所述扩增的耳蜗细胞群体中的毛细胞与支持细胞的数量比大于所述中间耳蜗细胞群体中的毛细胞与支持细胞的数量比。

在某些实施方案中，本发明提供了一种在初始耳蜗细胞群体中增加lgr5⁺支持细胞的数量或增加lgr5⁺活性的方法，其中所述初始群体包含支持细胞和毛细胞。例如，在一种这样的方法中，形成中间群体，其中lgr5⁺支持细胞的数量相对于所述初始群体扩增。可替换地，在一种这样的方法中，形成中间群体，其中所述支持细胞的lgr5⁺活性相对于所述初始群体增加。可替换地，有如下方法：通过在通常缺乏lgr5⁺或具有非常低水平的lgr5⁺的细胞类型中活化lgr5⁺表达，使lgr5⁺细胞的数量相对于所述初始细胞群体增加。再例如，形成中间群体，其中相对于所述初始耳蜗细胞群体，lgr5⁺支持细胞的数量扩增且lgr5活性增加。此后，可以在所述中间耳蜗细胞群体中产生毛细胞以形成扩增的耳蜗细胞群体，其中所述扩增的耳蜗细胞群体中的毛细胞与支持细胞的数量比大于所述中间耳蜗细胞群体中的毛细胞与支持细胞的数量比。

在某些实施方案中，本发明的方法包括具有有效干性驱动剂浓度和分化抑制剂的有效分化抑制浓度的第一增殖阶段，随后是具有有效干性驱动剂浓度且没有分化抑制剂的有效分化抑制浓度的分化阶段。在某些这样的实施方案中，在以不同速率释放所述干性驱动剂和分化抑制剂的制剂中将所述干性驱动剂和分化抑制剂提供给所述耳蜗细胞。在某些这样的实施方案中，所述干性驱动剂是gsk3-α抑制剂(例如，在表1中公开的gsk3-α抑制剂中的一种或多种)。在某些这样的实施方案中，所述干性驱动剂是gsk3-α抑制剂(例如，在表1中公开的gsk3-α抑制剂中的一种或多种)，且所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些这样的实施方案中，所述干性驱动剂是gsk3-α抑制剂(例如，在表1中公开的gsk3-α抑制剂中的一种或多种)，且所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，本发明提供了用于产生毛细胞的方法和组合物，所述方法包括将包含(i)和(ii)的组合物施用给或造成所述组合物被施用给干细胞群体(例如，体外、离体或体内样品/受试者的干细胞群体)：(i)gsk3-α抑制剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)和(ii)丙戊酸(或其衍生物或类似物或药学上可接受的盐)，由此增殖所述干细胞群体中的干细胞并得到扩增的干细胞群体；和将所述扩增的干细胞群体暴露于gsk3-α抑制剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)和任选的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)，由此促进从所述扩增的干细胞群体产生内耳毛细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了预防和治疗听觉功能障碍的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了预防或治疗受试者的听觉受损的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的gsk3-α抑制剂(例如，在表1中公开的gsk3-α抑制剂中的任意一种或多种)。

在某些实施方案中，本发明还涉及本文所述的细胞的离体应用。例如，本文所述的方案可用于hi和用于发现目的。例如，本发明的某些实施方案可用于鉴别使毛细胞祖细胞增殖和/或增加毛细胞数量的试剂以及保护支持细胞和/或毛细胞(例如，支持它们的存活)的试剂，还可用于鉴别对支持细胞或分化的后代（包括毛细胞）具有毒性或没有毒性的试剂。

在某些实施方案中，本发明提供了抑制受试者的听觉系统细胞的损失或死亡的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文描述的组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂和任选的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)或其衍生物或其药学上可接受的盐和可接受的载体或赋形剂，由此抑制受试者的听觉系统细胞的损失或死亡或再生包括毛细胞和/或神经元在内的结构。

在某些实施方案中，本发明提供了保持或促进受试者的听觉系统细胞的生长的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的组合物以放大或启动内源修复，所述组合物包含本文描述的试剂(包含gsk3-α抑制剂和任选的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)或其衍生物或其药学上可接受的盐，由此保持或促进所述受试者的听觉系统细胞的生长。

本文还描述了一种扩增包含亲本细胞群体的耳蜗组织中的耳蜗细胞群体的方法，所述亲本群体包括支持细胞和许多lgr5⁺细胞，所述方法包括：使所述耳蜗组织与干细胞增殖剂接触以在所述耳蜗组织中形成扩增的细胞群体，其中所述干细胞增殖剂能够(i)在干细胞增殖测定中将干细胞增殖测定细胞群体中的lgr5⁺细胞的数量增加至少10倍，和(ii)在干细胞分化测定中从包含lgr5⁺细胞的细胞群体形成毛细胞。

本文还描述了一种扩增包含包含亲本细胞群体的耳蜗组织中的耳蜗细胞群体的方法，所述亲本群体包括支持细胞，所述方法包括：使所述耳蜗组织与干细胞增殖剂接触以在所述耳蜗组织中形成扩增的细胞群体。所述干细胞增殖剂能够(i)在干细胞增殖测定中经历增殖测定时间段从增殖测定初始细胞群体形成增殖测定最终细胞群体，和(ii)在干细胞分化测定中经历分化测定时间段从分化测定初始细胞群体形成分化测定最终细胞群体，其中：(a)所述增殖测定初始细胞群体具有(i)增殖测定初始细胞总数，(ii)增殖测定初始lgr5⁺细胞数，(iii)增殖测定初始毛细胞数，(iv)增殖测定初始lgr5⁺细胞比例，其等于增殖测定初始lgr5⁺细胞数与增殖测定初始细胞总数之比，和(v)增殖测定初始毛细胞比例，其等于增殖测定初始毛细胞数与增殖测定初始细胞总数之比；(b)所述增殖测定最终细胞群体具有(i)增殖测定最终细胞总数，(ii)增殖测定最终lgr5⁺细胞数，(iii)增殖测定最终毛细胞数，(iv)增殖测定最终lgr5⁺细胞比例，其等于增殖测定最终lgr5⁺细胞数与增殖测定最终细胞总数之比，和(v)增殖测定最终毛细胞比例，其等于增殖测定最终毛细胞数与增殖测定最终细胞总数之比；(c)所述分化测定初始细胞群体具有(i)分化测定初始细胞总数，(ii)分化测定初始lgr5⁺细胞数，(iii)分化测定初始毛细胞数，(iv)分化测定初始lgr5⁺细胞比例，其等于分化测定初始lgr5⁺细胞数与分化测定初始细胞总数之比，和(v)分化测定初始毛细胞比例，其等于分化测定初始毛细胞数与分化测定初始细胞总数之比；(d)所述分化测定最终细胞群体具有(i)分化测定最终细胞总数，(ii)分化测定最终lgr5⁺细胞数，(iii)分化测定最终毛细胞数，(iv)分化测定最终lgr5⁺细胞比例，其等于分化测定最终lgr5⁺细胞数与分化测定最终细胞总数之比，和(v)分化测定最终毛细胞比例，其等于分化测定最终毛细胞数与分化测定最终细胞总数之比；(e)所述增殖测定最终lgr5⁺细胞数比增殖测定初始lgr5⁺细胞数大至少10倍；和(f)所述分化测定最终毛细胞数是非零数字。

所述增殖测定最终lgr5⁺细胞数可以比增殖测定初始lgr5⁺细胞数大至少50倍或至少100倍。所述耳蜗组织中扩增的细胞群体可以包括比亲本群体更大数目的毛细胞。所述增殖测定最终lgr5⁺细胞比例可以比分化测定初始lgr5⁺细胞比例大至少2倍。所述分化测定最终毛细胞比例可以比增殖测定初始毛细胞比例大至少2倍。所述增殖测定最终毛细胞比例可以比增殖测定初始毛细胞比例小至少25%。所述增殖测定最终lgr5⁺细胞比例可以比增殖测定初始lgr5⁺细胞比例大至少10%。可以保持耳蜗组织的多种形态学特征之一。可以保持天然形态学。所述干细胞增殖剂可以分散在生物相容的基质中，所述基质可以是生物相容的凝胶或泡沫。所述耳蜗组织可以是体内耳蜗组织或离体耳蜗组织。所述方法可以产生处于s-期的lgr5⁺细胞群体。所述至少一种干细胞增殖剂可以包括干性驱动剂和分化抑制剂。例如，在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂包括干性驱动剂（其为gsk3-α抑制剂）和分化抑制剂。在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂包括干性驱动剂（其为gsk3-α抑制剂）和分化抑制剂（其为hdac抑制剂或notch激动剂）。在某些实施方案中，所述干细胞增殖剂包括干性驱动剂（其为gsk3-α抑制剂）和分化抑制剂（其为丙戊酸）。接触可以给耳蜗组织提供：在初始阶段，至少有效增殖浓度的干性驱动剂和至少有效分化抑制浓度的分化抑制剂；在后续阶段，至少有效增殖浓度的干性驱动剂和低于有效分化抑制浓度的分化抑制剂。所述耳蜗组织可以是在受试者中，并且，使所述耳蜗组织与所述组合物接触可以通过向所述受试者经鼓膜施用所述组合物来实现。使所述耳蜗组织与所述组合物接触可以导致所述受试者的听觉功能改善。

本文还描述了治疗具有听力损失或处于发生听力损失的风险中的受试者的方法。所述方法可以包括向所述受试者的耳蜗组织经鼓膜地施用gsk3-α抑制剂。在某些这样的实施方案中，所述方法还包括将分化抑制剂施用给所述组织。在一个这样的实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在一个这样的实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

某些实施方案涉及药物组合物，其包含药学上可接受的载体和干细胞增殖剂，所述干细胞增殖剂是gsk3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述组合物适合施用至内耳和/或中耳。在某些情况下，所述组合物适合局部施用至圆窗膜。在某些实施方案中，所述组合物适合鼓室内或经鼓膜施用，例如，施用至耳蜗组织。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂分散在生物相容的基质中。在某些实施方案中，所述生物相容的基质是生物相容的凝胶或泡沫。

某些组合物进一步包含分化抑制剂。在特定实施方案中，所述分化抑制剂选自hdac抑制剂和notch激动剂或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，所述hdac抑制剂是丙戊酸或其衍生物或类似物或药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有至少约0.5倍或0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍或1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的gsk3-α/gsk3-β选择性比率。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有针对gsk3-α和gsk3-β的效能，其中所述效能对于抑制gsk3-α和gsk3-β而言小于约100nm，或对于抑制gsk3-α和gsk3-β而言小于约50nm、20nm、10nm、5nm、2nm或小于约1nm。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的gsk3-α/cdk选择性比率。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的gsk3-α/mapk选择性比率。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的gsk3-α/erk选择性比率。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有至少约10倍或15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、60倍、80倍、90倍或至少约100倍的gsk3-α/mek选择性比率。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含对于gsk3-α而言在以下范围内的效能：约1nm至约1000nm；约100nm至约1000nm；约10nm至约100nm；约1nm至约10nm。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含泊洛沙姆。在特定实施方案中，所述泊洛沙姆包含泊洛沙姆188和泊洛沙姆407中的至少一种或其混合物。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约5重量%至约25重量%之间的浓度。在特定实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约10重量%至约23重量%之间的浓度。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约15重量%至约20重量%之间的浓度。在具体实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物大约17重量%的浓度。

在某些组合物中，所述gsk3-α抑制剂是在约0.01um至1000mm、约0.1um至1000mm、约1um至100mm、约10um至10mm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um、约1mm至10mm或约10mm至100mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.01-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-5000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约50-2000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或在相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约0.01nm至1000um、约0.1nm至1000um、约1nm至100um、约10nm至10um、约1nm至10nm、约10nm至100nm、约100nm至1000nm、约1um至10um或约10um至100um的浓度。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是gsk3抑制剂xxii，其在约0.1um至1000mm、约1um至100mm、10um至10mm、约100um至10mm或100um至1mm或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约0.1nm至1000um、约1nm至100um、约10nm至10um、约100nm至1um或约0.5um的浓度。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是azd1080，其在约0.1um至1000mm、约1um至1000mm、约10um至100mm、约100um至10mm、约1mm至10mm或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约1nm至1000um、约10nm至1000um、约100nm至100um、约1um至10um或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10um的浓度。

在某些实施方案中，所述hdac抑制剂是在约0.01um至100,000mm、约1um至10,000mm、约10um至10,000mm、约100um至1000mm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um、约1000um至10mm、约10mm至100mm、约100mm至1000mm、或约1000mm至10,000mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍；或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约0.01nm至100,000um、约1nm至10,000um、约10nm至10,000um、约100nm至1000um、约1nm至10nm、约10nm至100nm、约100nm至1000nm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um或约1000um至10,000um的浓度。

在某些实施方案中，所述hdac抑制剂是丙戊酸，其在约10um至100,000mm、约1mm至10,000mm、约10mm至10,000mm、约100mm至10,000mm、约200mm至2000mm、约1000mm、或约600mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约10nm至100,000um、1um至10,000um、约10um至10,000um、约100um至10,000um、约200um至2000um或约1000um的浓度。

在某些实施方案中，如本文中所述的，在lgr5增殖测定中测量所述有效活性。

在某些组合物中，所述gsk3-α抑制剂能够在干细胞增殖测定中使干细胞增殖测定细胞群体中的lgr5⁺细胞的数量增加至少约1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍，且任选地选自表1。在某些组合物中，所述gsk3-α抑制剂能够在干细胞分化测定中从包含lgr5⁺细胞的细胞群体形成毛细胞。

所述药物组合物可以用在任意一种或多种本文所述的方法中，包括所述组合物用于扩增耳蜗组织中的耳蜗细胞群体的用途。所述药物组合物还可以用于治疗具有听力损失或处于发生听力损失的风险中的受试者。

也包括产生myo7a+耳蜗细胞的方法。所述方法可以包括使lgr5+耳蜗细胞与gsk3-α抑制剂接触，由此产生扩增的lgr5+细胞群体;由此产生myo7a+耳蜗细胞。

将在下文中部分地明白和在下文中部分地指出其它目的和特征。

发明详述

定义

在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用包括“和/或”。如在本申请中使用的，术语“包含”和该术语的变形(诸如“包括”和“含有”)不意图排除其它添加剂、组分、整数或步骤。“由……组成”是指包括且限于在短语“由（……组成）”之内的对象。因而，短语“由……组成”指示，列出的要素是必需的或强制性的，并且不可存在其它要素。“基本上由……组成”是指，包括在该短语后面列出的任意要素，且限于不干扰或有助于在本发明中关于列出的要素详细说明的活性或作用的其它要素。因而，短语“基本上由……组成”指示，列出的要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的，且可能存在或不存在，取决于它们是否实质上影响列出的要素的活性或作用。

如在本申请中使用的，术语“约”和“大约”等同地使用。在本申请中使用的任何数字，不论有没有约/大约，都意在覆盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”表示在所述参考值的任一个方向(大于或更小)落入25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文中显而易见(这样的数字会超过可能值的100%的情况除外)。

“施用”表示将物质引入受试者中。在某些实施方案中，施用是耳部、耳内、耳蜗内、前庭内或经鼓膜施用，例如通过注射。在某些实施方案中，施用是直接施用至内耳，例如通过圆窗、耳囊或前庭管注射。在某些实施方案中，通过耳蜗植入递送系统直接施用进内耳。在某些实施方案中，将所述物质经鼓膜地注射至中耳。在某些实施方案中，“造成……被施用”表示在已经施用了第一组分之后施用第二组分(例如，在不同时间和/或由不同的操作者)。

“抗体”表示具有免疫原结合能力的免疫球蛋白多肽或其片段。

本文中使用的“激动剂”是分别造成靶基因、蛋白或途径的表达或活性的增加的试剂。因此，激动剂可以以某种方式结合并活化它的相应受体，这直接地或间接地给靶基因或蛋白带来该生理学影响。激动剂还可以通过调节途径组分的活性(例如，通过抑制途径的负调节剂的活性)而增加途径的活性。因此，“wnt激动剂”可以定义为增加wnt途径的活性的试剂，其可以通过细胞中增加的tcf/lef介导的转录来测量。因此，“wnt激动剂”可以是结合并活化卷曲受体家族成员的真正wnt激动剂，包括任意的和所有的wnt家族蛋白、细胞内β-连环蛋白降解的抑制剂和tcf/lef的活化剂。

“拮抗剂”表示结合受体并又减少或消除其它分子的结合的试剂。

“反义”表示与核酸序列的编码链或mrna互补的核酸序列，不论长度。可以将反义rna引入单个细胞、组织或类器官。反义核酸可以含有经修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它经修饰的主链，或者可以含有非天然的核苷间键。

如本文提及的，“互补核酸序列”是能够与包含互补核苷酸碱基对的另一个核酸序列杂交的核酸序列。“杂交”是指在合适的严谨性条件下在互补的核苷酸碱基之间配对以形成双链分子(例如，在dna中，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)形成碱基对，鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)形成碱基对)(参见，例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399;kimmel,a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。

“耳部施用”表示使用导管或管芯针装置跨鼓膜将组合物施用至受试者的内耳的方法。为了便于管芯针或导管的插入，可以使用适当尺寸的注射器或移液器穿过鼓膜。使用本领域技术人员已知的任意其它方法也可以插入所述装置，例如，所述装置的外科植入。在特定实施方案中，所述管芯针或导管装置可以是独立装置，这意味着将它插入受试者耳中，并然后将所述组合物受控地释放至内耳。在其它特定实施方案中，所述管芯针或导管装置可以连接或偶联至泵或允许施用额外组合物的其它装置。所述泵可以被自动地程序化为递送剂量单位，或可以由受试者或医学专业人员控制。

本文中使用的“细胞聚集体”应当是指柯蒂氏器官中的体细胞，所述体细胞已经增殖以形成大于40微米直径的给定细胞类型的团簇和/或产生其中超过3个细胞层垂直于基底膜而驻留的形态。“细胞聚集体”还可以指这样的过程：其中细胞分裂产生了细胞实体，所述细胞造成一种或多种细胞类型突破网板或内淋巴与外淋巴之间的界限。

本文中结合特定细胞类型使用的“细胞密度”是在代表性显微术样品中单位面积上的该细胞类型的平均数量。所述细胞类型可以包括、但不限于lgr5⁺细胞、毛细胞或支持细胞。可以用给定器官或组织(包括、但不限于耳蜗或柯蒂氏器官)中的给定细胞类型来评估所述细胞密度。例如，柯蒂氏器官中的lgr5⁺细胞密度是跨所述柯蒂氏器官测量的lgr5⁺细胞的细胞密度。通常，将通过截取柯蒂氏器官的横截面来计数支持细胞和lgr5⁺细胞。虽然在某些情况下可以使用横截面，但是通常通过向下观看柯蒂氏器官的表面来计数毛细胞，如在代表性显微术样品中描述的。通常，将如下测量lgr5⁺细胞的细胞密度：分析柯蒂氏器官的整体制备物，并沿着上皮表面在给定距离上计数lgr5细胞的数量，如在代表性显微术样品中描述的。通过其形态学特征诸如束状物或毛细胞特异性染料(例如，肌球蛋白viia、prestin、vglut3、pou4f3、espin、缀合的鬼笔环肽、pmca2、ribeye、atoh1等)，可以鉴别毛细胞。通过特异性染料或抗体(例如，lgr5-gfp转基因报告物、抗-lgr5抗体等)，可以鉴别lgr5⁺细胞。

本文中使用的“耳蜗浓度”将是通过对耳蜗液取样而测得的给定试剂的浓度。除非另外指出，否则所述样品应当含有基本上足够的耳蜗液部分，使得它近似代表耳蜗中试剂的平均浓度。例如，可以从前庭管抽出样品，并且是依次取样的一系列体液样品，使得各个样品包含耳蜗的特定部分的耳蜗液。

“互补核酸序列”表示能够与另一条由互补核苷酸碱基对构成的核酸序列杂交的核酸序列。

本文中结合特定细胞类型使用的“横截面细胞密度”是在代表性显微术样品中穿过组织的单位横截面面积上该细胞类型的平均数量。柯蒂氏器官的横截面也可以用于确定给定平面中的细胞数。通常，将如下测量毛细胞横截面细胞密度：分析柯蒂氏器官的整体制备物，并在沿着上皮部分切取的横截面中在给定距离上计数毛细胞的数量，如在代表性显微术样品中描述的。通常，将如下测量lgr5⁺细胞的横截面细胞密度：分析柯蒂氏器官的整体制备物，并在沿着上皮部分切取的横截面中在给定距离上计数lgr5⁺细胞的数量，如在代表性显微术样品中描述的。通过其形态学特征诸如束状物或毛细胞特异性染料（合适的染料包括例如肌球蛋白viia、prestin、vglut3、pou4f3、缀合的鬼笔环肽、pmca2、atoh1等），可以鉴别毛细胞。通过特异性染料或抗体（合适的染料和抗体包括lgr5mrna的荧光原位杂交、lgr5-gfp转基因报告物系统、抗-lgr5抗体等）可以鉴别lgr5⁺细胞。

“减少”表示减少至少5％，例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%，例如与参照水平相比。

“减少”还指减少至少1倍，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多，例如与参照水平相比。

本文中使用的“分化抑制剂”是可以抑制内耳干细胞向内耳毛细胞的分化的试剂。一些分化抑制剂维持出生后干细胞标志物的表达。一些分化抑制剂包括、但不限于notch激动剂和hdac抑制剂。

本文中使用的“分化阶段”是其中存在有效干性驱动剂浓度而没有有效分化抑制浓度的时间持续期间。

“有效浓度”可以是对干性驱动剂而言的有效干性驱动剂浓度，或对分化抑制剂而言是的有效分化抑制浓度。

“有效分化抑制浓度”是分化抑制剂的最低浓度，与干细胞增殖测定的开始相比，所述最低浓度不允许在干细胞增殖测定结束时毛细胞在细胞总数中的比例增加超过50％。在测量有效分化抑制浓度时，细胞的毛细胞染料可以与流式细胞计量术一起使用，以定量非atoh1-gfp小鼠的小鼠品系的毛细胞。可替换地，也可以使用atoh1-gfp小鼠品系。

本文中使用的“有效释放速率”(质量/时间)是有效浓度(质量/体积)*30ul/1小时。

“有效干性驱动剂浓度”是干性驱动剂的最低浓度，与未使用干性驱动剂进行的且所有其它组分以相同浓度存在的干细胞增殖测定中的lgr5⁺细胞的数量相比，所述最低浓度在干细胞增殖测定中诱导lgr5⁺细胞的数量的至少1.5倍增加。

“消除”是指降低到不可检测的水平。

“移入”或“移植物植入”表示通过与组织的现有细胞接触而将干或祖细胞掺入体内目标组织的过程。“上皮祖细胞”表示具有变成局限于产生上皮细胞的细胞谱系的潜力的多潜能细胞。

“上皮干细胞”表示具有变成定型为多个细胞谱系(包括产生上皮细胞的细胞谱系)的潜力的多潜能细胞。

“片段”表示多肽或核酸分子的一部分。该部分优选地含有参照核酸分子或多肽的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。

在本文中互换使用的“gsk3-α”、“gsk3α”和“gsk3a”是糖原合酶激酶3α的首字母简略词。

“gsk3-α抑制剂”是抑制gsk3-α的活性的化合物或组合物(例如，在本文中（例如，在表1中）公开的gsk3-α抑制剂中的任一种)。

在本文中互换使用的“gsk3-β”、“gsk-3β”和“gsk-3b”是糖原合酶激酶3β的首字母简略词。

“gsk3-β抑制剂”是抑制gsk3β的活性的化合物或组合物。

“gsk3-α效能”表示gsk3-α抑制剂的ic50值。使用本领域已知的任意合适方法可以测量ic50值。在一个实施方案中，活性测定包括单独的或与10μm已知肽底物一起的大约0.2um酶(例如，gsk3-α)。对肽进行激酶反应(10mmhepes[ph7.0],10mmmgcl2,200μmedta,100μm冷atp,1μci[γ-32p]atp)以确定磷酸向所述肽中的时间依赖性掺入。

“gsk3-β效能”表示gsk3-β抑制剂的ic50值。

“gsk3-α选择性的”表示这样的gsk3-α抑制剂：与它对另一种靶标（例如，gsk3-β、cdk、mapk、erk或mek）的效能相比，它对gsk3-α具有更高的效能。

给定化合物(例如，gsk3-α抑制剂)的“gsk3-α/cdk选择性比率”是所述化合物关于cdk的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

给定化合物(例如，gsk3-α抑制剂)的“gsk3-α/gsk3-β选择性比率”是所述化合物关于gsk3-β的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

给定化合物(例如，gsk3-α抑制剂)的“gsk3-α/erk选择性比率”是所述化合物关于erk的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

给定化合物(例如，gsk3-α抑制剂)的“gsk3-α/mapk选择性比率”是所述化合物关于mapk的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

给定化合物(例如，gsk3-α抑制剂)的“gsk3-α/mek选择性比率”是所述化合物关于mek的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

“杂交”表示在合适的严谨性条件下在互补的核苷酸碱基之间配对以形成双链分子(例如，在dna中，腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)形成碱基对，鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)形成碱基对)(参见，例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399;kimmel,a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。

“抑制剂”表示分别造成靶基因或蛋白的表达或活性的减少的试剂。“拮抗剂”可以是抑制剂，但更具体地是结合受体并进而减少或消除其它分子的结合的试剂。

本文中使用的“抑制性核酸”是双链rna、rna干扰、mirna、sirna、shrna或反义rna或其部分或其模拟物，其当施用给哺乳动物细胞时导致靶基因的表达的下降。通常，核酸抑制剂包含靶核酸分子的至少一部分或其直系同源物，或包含靶核酸分子的互补链的至少一部分。通常，使靶基因的表达减少10%、25%、50%、75%或甚至90-100%。

“体外lgr5活性”表示在体外细胞群体中的lgr5的表达水平或活性。它可以如下例如在源自表达lgr5-gfp的小鼠(诸如b6.129p2-lgr5tm1(cre/ert2)cle/j小鼠(也被称作lgr5-egfp-ires-creert2或lgr5-gfp小鼠,jacksonlabstockno:008875))的细胞中测量：将细胞解离为单细胞，用碘化丙啶(pi)染色，并使用流式细胞计针对lgr5-gfp表达来分析细胞。经过相同培养和分析操作的野生型(非-lgr5-gfp)小鼠的内耳上皮细胞可以用作阴性对照。通常，将两个细胞群体显示在双变量图中(其中gfp/fitc作为一个变量)，其包括gfp阳性群和gfp阴性群。通过门控gfp阳性细胞群体来鉴别lgr5-阳性细胞。通过相对于gfp阴性群和阴性对照门控gfp阳性细胞群体，测量lgr5-阳性细胞的百分比。通过将细胞总数乘以lgr5-阳性细胞的百分比来计算lgr5-阳性细胞的数量。对于源自非-lgr5-gfp小鼠的细胞，可以使用抗-lgr5抗体或在lgr5基因上的定量-pcr来测量lgr5活性。

本文中使用的“体内lgr5活性”是在受试者中的lgr5的表达水平或活性。可以例如通过移除动物的内耳并测量lgr5蛋白或lgr5mrna来测量它。可以如下测量lgr5蛋白产生：使用抗-lgr5抗体测量荧光强度（如通过对耳蜗样品成像所确定的），其中使用荧光强度作为lgr5存在的量度。蛋白质印迹可以与抗-lgr5抗体一起使用，其中可以从经处理的器官收获细胞以确定lgr5蛋白的增加。定量-pcr或rna原位杂交可以用于测量lgr5mrna产生的相对变化，其中可以从内耳收获细胞以确定lgr5mrna的变化。可替换地，可以使用lgr5启动子驱动的gfp报告基因转基因系统来测量lgr5表达，其中使用流式细胞计量术、成像可以直接检测gfp荧光的存在或强度，或使用抗-gfp抗体间接检测。

“增加”还指增加至少1倍，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多，例如，与参比标准的水平相比。

“增加”表示增加至少5%，例如，5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%或更多，例如与参照水平相比。

“耳内施用”表示通过直接注射组合物将所述组合物施用至受试者的中耳或内耳。

“耳蜗内”施用表示穿过鼓膜和穿过圆窗膜将组合物直接注射进耳蜗。

“前庭内”施用表示穿过鼓膜和穿过圆窗膜将组合物直接注射进前庭器官。

“分离的”表示与在其天然状态下发现的通常伴随它的组分不同程度地分离的物质。“分离”表示与原始来源或环境分离的程度。

“lgr5”是含有富亮氨酸重复序列的g-蛋白偶联受体5的首字母简略词，也被称作g-蛋白偶联受体49(gpr49)或g-蛋白偶联受体67(gpr67)。它是在人类中由lgr5基因编码的蛋白。

“lgr5活性”被定义为在细胞群体中的lgr5的活性水平。在体外细胞群体中，可以在体外lgr5活性测定中测量lgr5活性。在体内细胞群体中，可以在体内lgr5活性测定中测量lgr5活性。

本文中使用的“lgr5⁺细胞”或“lgr5-阳性细胞”是表达lgr5的细胞。本文中使用的“lgr5^-细胞”是非lgr5⁺的细胞。

本文中使用的“谱系示踪”是使用能够对在报告物诱导时表达靶基因的任何细胞进行命运追踪的小鼠系。这可以包括毛细胞或支持细胞基因(sox2、lgr5、肌球蛋白viia、pou4f3等)。例如，谱系示踪可以使用与报告小鼠杂交的lgr5-egfp-ires-creert2小鼠，其在诱导后允许人们跟踪在诱导时表达lgr5的细胞的命运。再例如，可以将lgr5细胞分离成单细胞并在干细胞增殖测定中培养以产生集落，然后在分化测定中使其分化，并如下分析细胞命运：对毛细胞和/或支持细胞蛋白染色，并确定报告物与毛细胞或支持细胞染色的共定位以确定lgr5细胞的命运。另外，可以在耳蜗外植体中进行谱系示踪以跟踪治疗后在完整器官内的支持细胞或毛细胞命运。例如，通过从与报告小鼠杂交的lgr5-egfp-ires-creert2小鼠分离出耳蜗并在治疗之前或治疗期间诱导在lgr5细胞中的报告物，可以确定lgr5细胞命运。然后可以如下分析所述器官的细胞命运：将毛细胞和/或支持细胞蛋白染色，并确定所述报告物与毛细胞或支持细胞染色的共定位以确定lgr5细胞的命运。此外，可以在体内进行谱系示踪以跟踪治疗后在完整器官内的支持细胞或毛细胞命运。例如，通过在与报告小鼠杂交的lgr5-egfp-ires-creert2小鼠中诱导报告物，治疗所述动物，然后分离出耳蜗，可以确定lgr5细胞命运。然后可以如下分析所述器官的细胞命运：将毛细胞和/或支持细胞蛋白染色，并确定报告物与毛细胞或支持细胞染色的共定位，以确定lgr5细胞的命运。可以使用本领域中的标准的替代性目标报告物进行谱系示踪。

“哺乳动物”表示任何哺乳动物，包括、但不限于人、小鼠、大鼠、绵羊、猴、山羊、兔、仓鼠、马、奶牛或猪。

本文中使用的“平均释放时间”是在释放测定中一半试剂从载体释放到磷酸盐缓冲盐水中的时间。

本文中使用的“天然形态”是指，组织构造在很大程度上反映了健康组织中的构造。

本文中使用的“非人哺乳动物”表示非人类的任何哺乳动物。

如在本文的有关上下文中使用的，术语细胞的“数量”可以是0、1或更多个细胞。

本文中使用的“柯蒂氏器官”表示位于耳蜗中的听觉器官的感觉细胞(内毛细胞和外毛细胞)。

“类器官”或“上皮类器官”表示与器官或器官的一部分类似并且具有与该特定器官相关的细胞类型的细胞簇或聚集体。

细胞的“群体”表示大于1的任何细胞数量，但优选至少1x10³个细胞、至少1x10⁴个细胞、至少1x10⁵个细胞、至少1x10⁶个细胞、至少1x10⁷个细胞、至少1x10⁸个细胞、至少1x10⁹个细胞或至少1x10¹⁰个细胞。

本文中使用的“祖细胞”表示这样的细胞：其像干细胞一样，具有分化成特定细胞类型的趋势，但是已经比干细胞更专一，并被驱使分化成它的“靶”细胞。

本文中使用的“增殖阶段”是其中存在有效干性驱动剂浓度和分化抑制浓度的分化抑制剂的时间持续期间。

在某些实施方案中，可以具体地定义组合物中的任何给定化合物的“纯度”。例如，某些组合物可能包含至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%（包括之间的所有小数）纯的化合物，如例如且决不限于通过高效液相色谱法(hplc)所测得的，所述高效液相色谱法是一种众所周知的柱色谱法形式，其在生物化学和分析化学中经常用于分离、鉴别和定量化合物。

“参照”是指标准或对照条件(例如，未用测试试剂或测试试剂的组合处理)。

本文中使用的“释放测定”是这样的试验：其中测量试剂从生物相容的基质穿过透析膜释放到盐水环境中的速率。可以如下进行一种示例性的释放测定：将30微升组合物放入具有适当截留值的盐水透析袋内的1ml磷酸盐缓冲盐水中，并将该透析袋置于37℃的10ml磷酸盐缓冲盐水内。可以基于试剂大小来选择透析膜大小以允许待评估的试剂离开所述膜。对于小分子释放，可以使用3.5-5kda的截留值。所述试剂可以是干性驱动剂、分化抑制剂或其它试剂。组合物的释放速率可以随时间而变化，并且可以以1小时增量进行测量。

本文中使用的“代表性显微术样品”描述了在细胞培养系统、提取的组织的一部分、或整个提取的器官内的足够数目的视野，其使被测量的平均特征大小或数目可以合理地被认为代表测量全部相关视野时的平均特征大小或数目。例如，为了评估柯蒂氏器官上在某个频率范围的毛细胞计数，可以使用imagej软件(nih)来测量耳蜗整体样品的总长度和各个计数段的长度。内毛细胞、外毛细胞和支持细胞的总数可以在1200-1400μm的四个耳蜗段(顶段、中顶段、中底段和底段)中任意一个的全部或部分中计数，在100μm视野大小的至少3个视野将被合理地视为代表性显微术样品。代表性显微术样品可以包括在视野内的测量值，其可以测量为每给定距离的细胞数。代表性显微术样品可以用于评估形态学，诸如细胞-细胞接触、耳蜗体系结构和细胞组分(例如，束、突触)。

“玫瑰样图案”是耳蜗中的特征性细胞排列，其中<5％的毛细胞与其它毛细胞相邻。

术语“样品”表示得到的、提供的和/或进行分析的体积或质量。在某些实施方案中，样品是或包含组织样品、细胞样品、流体样品等。在某些实施方案中，样品取自(或是)受试者(例如，人或动物受试者)。在某些实施方案中，组织样品是或包含脑、毛发(包括根)、口腔拭子、血液、唾液、精液、肌肉，或来自与这些中的任何一种相关的任何内脏器官或癌细胞、癌变前细胞或肿瘤细胞。流体可以是、但不限于尿、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身体组织可以包括、但不限于脑、皮肤、肌肉、子宫内膜、子宫和宫颈组织，或与这些中的任何一种相关的癌细胞、癌变前细胞或肿瘤细胞。在一个实施方案中，身体组织是脑组织或脑肿瘤或癌症。本领域普通技术人员会明白，在某些实施方案中，“样品”是“原生样品”，因为其从来源(例如，受试者)获得；在某些实施方案中，“样品”是处理原生样品的结果，例如以除去某些潜在污染性组分和/或分离或纯化某些目标组分。

给定化合物的“选择性比率”是，所述化合物对对照酶的效能与它对试验酶的效能相比的比率。例如，给定抑制剂“gsk3-α/gsk3-β选择性比率”是所述化合物关于gsk3-β的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。类似地，给定抑制剂的gsk3-α/mek选择性比率是所述化合物关于mek的ic50除以它关于gsk3-α的ic50的比率。

“自我更新”表示干细胞分裂以产生一个(不对称分裂)或两个(对称分裂)子代细胞的过程，所述子代细胞具有与亲代细胞无差别的发育潜能。自我更新涉及增殖和未分化状态的维持。

“sirna”表示双链rna。最佳地，sirna是18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的长度，并且在其3'末端具有2个碱基的突出端。可以将这些dsrna引入单个细胞或培养系统中。这样的sirna用于下调mrna水平或启动子活性。

“干细胞”表示具有自我更新并分化成多个细胞谱系的能力的多潜能细胞。

本文中使用的“干细胞分化测定”是确定干细胞的分化能力的测定。在一种示例性的干细胞分化测定中，如下从3-7日龄的atoh1-gfp小鼠获取初始细胞群体的细胞数目：分离柯蒂氏器官感觉上皮，将上皮解离成单细胞，并使所述细胞穿过40um细胞过滤网。将大约5000个细胞包埋在40µl培养基质(例如：matrigel(corning，减少了生长因子))中，并置于24孔板的具有500µl适当培养基、生长因子和待测试剂的孔的中心。适当的培养基和生长因子包括advanceddmem/f12，其含有培养基补充剂(1xn2,1xb27,2mmglutamax,10mmhepes,1mmn-乙酰半胱氨酸,和100u/ml青霉素/100µg/ml链霉素)和生长因子(50ng/mlegf,50ng/mlbfgf,和50ng/mligf-1)，以及将待测试剂加入每个孔中。将细胞在37℃和5％co2的标准细胞培养箱中培养10天，每2天更换培养基。然后通过除去干细胞增殖测定试剂并用基础培养基和驱动分化的分子替换，培养这些细胞。适当的基础培养基是advanceddmem/f12，其补充了1xn2、1xb27、2mmglutamax、10mmhepes、1mmn-乙酰半胱氨酸和100u/ml青霉素/100µg/ml链霉素，适当的驱动分化的分子是3µmchir99021和5µmdapt，并历时10天，其中每2天更换培养基。使用针对gfp的流式细胞计量术，可以测量群体中的毛细胞数目。使用qpcr测量用合适的和失调的参照或持家基因(例如，hprt)归一化的毛细胞标志物(例如，myo7a)表达水平，可以进一步评估毛细胞分化水平。通过针对毛细胞标志物(例如肌球蛋白7a、vglut3、espin、pmcas、ribeye、缀合的鬼笔环肽、atoh1、pou4f3等)的免疫染色，也可以评估毛细胞分化水平。通过针对肌球蛋白7a、vglut3、espin、pmcas、prestin、ribeye、atoh1、pou4f3的蛋白质印迹，也可以评估毛细胞分化水平。

本文中使用的“干细胞测定”是这样的测定：其中针对一系列标准来测试细胞或细胞群体，以确定该细胞或细胞群体是否是干细胞或富集干细胞或干细胞标志物。在干细胞测定中，测试细胞/细胞群体的干细胞特征诸如干细胞标志物的表达，并进一步任选地测试干细胞功能，包括自我更新和分化的能力。

本文中使用的“干细胞增殖剂”是诱导具有自我更新和分化能力的细胞群体的增加的化合物(或组合物，如果这样指出的话)。

本文中使用的“干细胞增殖测定”是确定试剂诱导从起始细胞群体产生干细胞的能力的测定。在一种示例性的干细胞增殖测定中，如下从3-7日龄的lgr5-gfp小鼠诸如b6.129p2-lgr5tm1(cre/ert2)cle/j小鼠(也被称作lgr5-egfp-ires-creert2或lgr5-gfp小鼠,jacksonlabstockno:008875)获得初始细胞群体的细胞数目：分离柯蒂氏器官感觉上皮，并将所述上皮解离成单细胞。将大约5000个细胞包埋在40µl培养基质(例如:matrigel(corning,减少了生长因子))中，并置于24孔板的具有500μl适当培养基、生长因子和待测试剂的孔的中心。适当的培养基和生长因子包括advanceddmem/f12，其含有培养基补充剂(1xn2,1xb27,2mmglutamax,10mmhepes,1mmn-乙酰半胱氨酸,和100u/ml青霉素/100µg/ml链霉素)和生长因子(50ng/mlegf,50ng/mlbfgf,和50ng/mligf-1)，以及将待测试剂加入每个孔中。将细胞在37℃和5％co2的标准细胞培养箱中培养10天，每2天更换培养基。通过计数在体外lgr5活性测定中被鉴别为lgr5⁺的细胞的数量，定量lgr5⁺细胞的数量。通过将细胞群体中被鉴别为lgr5⁺的细胞的数量除以所述细胞群体中存在的细胞的总数，定量lgr5⁺细胞的比例。通过测量使用合适的和失调的参照或持家基因(例如，hprt)归一化的群体的lgr5的平均mrna表达水平，定量该群体的平均lgr5⁺活性。可以如下测量群体中的毛细胞的数量：用毛细胞标志物(例如，肌球蛋白viia)进行染色，或使用毛细胞基因的内源报告物(例如，pou4f3-gfp、atoh1-ngfp)，并使用流式细胞计量术进行分析。通过将细胞群体中被鉴别为毛细胞的细胞的数量除以所述细胞群体中存在的细胞的总数，定量是毛细胞的细胞的比例。通过qpcr可以测量lgr5活性。

本文中使用的“干细胞标志物”可以定义为在干细胞中特异性地表达的基因产物(例如蛋白、rna等)。一种类型的干细胞标志物是直接地和特异性地支持干细胞特性的维持的基因产物。例子包括lgr5和sox2。使用在文献中描述的测定，可以鉴别另外的干细胞标志物。为了确定基因对干细胞特性的维持而言是否是必要的，可以使用功能获得和功能缺失研究。在功能获得研究中，特定基因产物(干细胞标志物)的过表达将有助于维持干细胞特性。而在功能缺失研究中，干细胞标志物的除去将造成干细胞特性的丧失或诱导干细胞的分化。另一种类型的干细胞标志物是仅在干细胞中表达但不一定具有维持干细胞特性的特定功能的基因。通过用测定（诸如微阵列和qpcr）对比分选的干细胞和非干细胞的基因表达概况，可以鉴别这类标志物。这类干细胞标志物可以在文献中找到(例如liuq.等人,intjbiochemcellbiol.2015年3月；60:99-111.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750)。潜在的干细胞标志物包括ccdc121、gdf10、opcm1、phex等。使用测定诸如qpcr、免疫组织化学、蛋白质印迹和rna杂交，可以测量在给定的细胞或细胞群体中的干细胞标志物(诸如lgr5或sox2)的表达。使用可以指示给定干细胞标志物的表达的转基因细胞表达报告物（例如lgr5-gfp或sox2-gfp），也可以测量干细胞标志物的表达。然后可以使用流式细胞计量术分析来测量报告物表达的活性。还可以使用荧光显微术直接使报告物的表达可视化。使用用于全基因表达概况分析的微阵列分析，可以进一步确定干细胞标志物的表达。可以将给定的细胞群体或纯化的细胞群体的基因表达概况与干细胞的基因表达概况对比以确定两个细胞群体之间的相似性。通过集落形成测定或球形成测定、自我更新测定和分化测定，可以测量干细胞功能。在集落(或球)形成测定中，当在适当的培养基中培养时，所述干细胞应当能够在细胞培养表面(例如细胞培养皿)上形成集落或嵌入细胞培养基质(例如matrigel)中，或能够在悬浮培养时形成球。在集落/球形成测定中，将单个干细胞以低细胞密度接种在适当的培养基中，并允许其增殖给定的时间段(7-10天)。然后对形成的集落进行计数，并针对干细胞标志物表达进行评分，作为原始细胞的干性的指标。任选地，随后挑选所形成的集落并传代以测试其自我更新和分化潜力。在自我更新测定中，当在适当的培养基中培养时，所述细胞应当在至少一次(例如1、2、3、4、5、10、20次等)细胞分裂期间维持干细胞标志物(例如lgr5)表达。在干细胞分化测定中，当在适当的分化培养基中培养时，所述细胞应当能够产生毛细胞，其可以通过毛细胞标志物表达来鉴别，所述标志物表达通过qpcr、免疫染色、蛋白质印迹、rna杂交或流式细胞计量术来测量。

本文中使用的“干性驱动剂”是在保持自我更新的潜力和分化成毛细胞的潜力的同时诱导lgr5⁺细胞的增殖、上调细胞中的lgr5、或维持细胞中的lgr5表达的组合物。通常，干性驱动剂上调出生后干细胞的至少一种生物标志物。干性驱动剂包括、但不限于wnt激动剂和gsk3β抑制剂。

“受试者”包括人类和哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马)。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是灵长类动物，特别是人类。在某些实施方案中，受试者是家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛和猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和驯化的动物，特别是宠物诸如狗和猫。在某些实施方案中(例如，特别是在研究背景下)，受试哺乳动物将是例如啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类动物或猪诸如近交猪等。

在本文中与耳蜗上皮关联使用的“支持细胞”包含在柯蒂氏器官内的非毛细胞的上皮细胞。这包括内柱细胞、外柱细胞、内指细胞、代特氏细胞、亨森细胞、伯特舍细胞和/或克劳迪乌斯细胞。

“统计上显著的”是指所述结果不可能偶然地发生。通过本领域已知的任意方法可以确定统计显著性。常用的显著性量度包括p-值，其是如果零假设成立的话观察的事件将发生的频率或概率。如果得到的p-值小于显著性水平，那么舍弃零假设。在简单情况下，在0.05或更小的p-值定义显著性水平。

“实质上”或“基本上”是指几乎完全地或完全地，例如，某个给定量的95%或更大。

“协同作用”或“协同效应”是大于分别做出的每项效果的总和的效果，即大于累加效应。

本文中使用的“tgf-β抑制剂”是减少tgf-β的活性的组合物。

“组织”是来自相同来源的类似细胞的集合体，所述细胞一起执行特定功能，包括例如耳蜗组织，诸如柯蒂氏器官。

“经鼓膜”施用表示穿过鼓膜将组合物直接注射进中耳。

在本文中与细胞群体关联使用的“处理”是指向该群体递送物质以产生结果。在体外群体的情况下，可以将所述物质直接地(或甚至间接地)递送给该群体。在体内群体的情况下，可以通过施用将所述物质递送给宿主受试者。

“丙戊酸”(vpa)具有化学式c8h16o2和以下替代名称:2-丙基戊酸。它的化学结构如下：

。

在某些实施方案中，在本文中对“丙戊酸”或“vpa”的提及是指“丙戊酸或其药学上可接受的盐”。

本文中使用的“wnt活化”是wnt信号传递途径的活化。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“药学上可接受的酸加成盐”表示保留游离碱的生物学有效性和性能（其不是在生物学上或其它方面不希望的）的那些盐，并且其用无机酸和有机酸形成，所述无机酸是例如、但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸是例如、但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羟乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。

“药学上可接受的碱加成盐”表示保留游离酸的生物学有效性和性能（其不是在生物学上或其它方面不希望的）的那些盐。通过向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备这些盐。源自无机碱的盐包括、但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。例如，无机盐包括、但不限于铵、钠、钾、钙和镁盐。源自有机碱的盐包括、但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，被取代的胺（包括天然存在的被取代的胺），环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基还原葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、多胺树脂等。在某些实施方案中使用的实例有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本发明的示例性实施方案的描述如下。

本发明涉及用于活化wnt途径和/或抑制gsk3-α活性的方法和组合物。

在某些方面，本发明提供了干细胞的受控增殖的方法，其包括在抑制分化的同时诱导干性的初始阶段和使干细胞分化成组织细胞的后续阶段，所述方法包括给细胞群体施用有效量的gsk3-α抑制剂或其药学上可接受的盐，任选地与分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)组合。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸或其药学上可接受的盐。

在某些方面，本发明涉及预防、减轻或治疗与某些组织细胞的缺失或缺乏有关的障碍或疾病的发病率和/或严重程度的方法。在一个方面，本发明涉及预防、减轻或治疗内耳障碍和听力损害的发病率和/或严重程度的方法，所述内耳障碍和听力损害涉及内耳组织、特别是内耳毛细胞、其祖细胞和任选的血管纹及相关听觉神经。特别感兴趣的是导致永久性听力损失（可能因减少的毛细胞数量引起）和/或降低的毛细胞功能的那些病症。还感兴趣的是作为耳毒性治疗药物（包括顺铂和它的类似物、氨基糖苷抗生素、水杨酸盐和它的类似物或袢利尿剂）的不良副作用而出现的那些病症。在某些实施方案中，本发明涉及诱导、促进或增强内耳组织（特别是内耳支持细胞和毛细胞）的生长、增殖或再生。

除此之外，本文提供的方法可用来制备用于预防和/或治疗急性和慢性耳疾病和听力损失、头晕和平衡问题的药物制剂，特别是突然听力损失、声创伤、因长期噪音暴露引起的听力损失、老年性耳聋、在植入内耳假体期间的创伤(插入创伤)、由内耳区的疾病引起的眩晕、梅尼埃病相关的头晕和/或作为梅尼埃病的征状的头晕、梅尼埃病相关的眩晕和/或作为梅尼埃病的征状的眩晕、耳鸣、和因抗生素和细胞抑制剂和其它药物引起的听力损失。

当用所述化合物处理耳蜗支持细胞群体时，无论该群体是在体内还是在体外，经处理的支持细胞都表现出干细胞样行为，因为经处理的支持细胞具有增殖和分化（更具体地，分化成耳蜗毛细胞）的能力。优选地，所述组合物诱导和维持支持细胞以产生子代干细胞，所述干细胞可以分裂许多代并保持具有高比例的所得细胞分化为毛细胞的能力。在某些实施方案中，增殖中的干细胞表达干细胞标志物，其可以包括lgr5、sox2、opeml、phex、lin28、lgr6、cyclind1、msx1、myb、kit、gdnf3、zic3、dppa3、dppa4、dppa5、nanog、esrrb、rex1、dnmt3a、dnmt3b、dnmt3l、utf1、tcl1、oct4、klf4、pax6、six2、zic1、zic2、otx2、bmi1、cdx2、stat3、smad1、smad2、smad2/3、smad4、smad5和/或smad7。

在某些实施方案中，本发明的方法可以用于在显著的毛细胞形成之前维持或甚至瞬时增加预先存在的支持细胞群体的干性(即自我更新)。在某些实施方案中，所述预先存在的支持细胞群体包含内柱细胞、外柱细胞、内指细胞、代特氏细胞、亨森细胞、伯特舍细胞和/或克劳迪乌斯细胞。可以使用在代表性显微术样品上的免疫染色形态学分析(包括细胞计数)和谱系示踪来确认这些细胞类型中的一种或多种的扩增。在某些实施方案中，所述预先存在的支持细胞包含lgr5⁺细胞。可以使用免疫染色形态学分析(包括细胞计数)和qpcr和rna杂交来确认细胞群体中的lgr5上调。

有利的是，本发明的方法在不使用遗传操作的情况下实现了这些目标。在许多学术研究中使用的种系操纵不是治疗上合乎需要的治疗听力损失的方案。一般而言，所述疗法优选地包括在不伴随基因治疗的情况下施用小分子、肽、抗体或其它非核酸分子或核酸递送载体。在某些实施方案中，所述疗法包括施用小有机分子。优选地，通过使用注射进中耳中并扩散进耳蜗中的(非基因)治疗剂来实现听力保护或恢复。

耳蜗非常依赖于所有存在的细胞类型，并且这些细胞的构造对其功能而言是重要的。因为支持细胞在神经递质循环和耳蜗力学中起重要作用。因而，在柯蒂氏器官内保持玫瑰样图案可能对于功能而言是重要的。基底膜的耳蜗力学会活化毛细胞转导。由于耳蜗力学的高灵敏度，还需要避免细胞团块。总之，保持毛细胞和支持细胞沿基底膜的适当分布和关系(甚至在增殖之后)，对于听觉而言可能是期望的特征，因为支持细胞功能和适当力学对于正常听力而言是必需的。

在本发明的一个实施方案中，以维持或甚至建立耳蜗上皮的玫瑰样图案特征的方式增大耳蜗细胞群体中的毛细胞的细胞密度。

根据本发明的一个方面，可以在包含毛细胞和支持细胞的耳蜗细胞群体中增加毛细胞的细胞密度。所述耳蜗细胞群体可以是体内群体(即由受试者的耳蜗上皮组成)，或者所述耳蜗细胞群体可以是体外(离体)群体。如果所述群体是体外群体，那么通过参考在任何处理之前和之后采集的群体的代表性显微术样品，可以确定细胞密度的增加。如果所述群体是体内群体，那么通过确定与听力改善相关的毛细胞密度增加对受试者听力的影响，可以间接地确定细胞密度的增加。

在一个实施方案中，在没有神经元细胞存在下置于干细胞增殖测定中的支持细胞形成带状突触。

在天然耳蜗中，毛细胞和支持细胞的图案化以与基底膜平行的方式发生。在本发明的一个实施方案中，以耳蜗上皮的基底膜特征的方式扩增耳蜗细胞群体中的支持细胞的增殖。

在一个实施方案中，通过用本发明的组合物(例如，含有有效浓度的干性驱动剂（例如，gsk3-α抑制剂）和有效浓度的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂诸如丙戊酸)的组合物)处理初始耳蜗细胞群体来选择性地扩增初始耳蜗细胞群体中的支持细胞的数量，以形成中间耳蜗细胞群体，并且其中所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比大于所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比。所述扩增的耳蜗细胞群体可以是例如体内群体、体外群体或甚至体外外植体。在一个这样的实施方案中，所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比大于所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比。例如，在一个这样的实施方案中，所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比超过所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比1.1倍。又例如，在一个这样的实施方案中，所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比超过所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比1.5倍。又例如，在一个这样的实施方案中，所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比超过所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比2倍。又例如，在一个这样的实施方案中，所述中间耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比超过所述初始耳蜗细胞群体中的支持细胞与毛细胞之比3倍。在前述实施方案中的每一个中，借助于干细胞增殖测定可以确定本段落所述的本发明的组合物的扩增耳蜗细胞群体的能力。

在一个实施方案中，通过用本发明的组合物(例如，含有有效浓度的干性驱动剂（例如，gsk3-α抑制剂）和有效浓度的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂诸如丙戊酸)的组合物)处理耳蜗细胞群体来扩增耳蜗细胞群体中的干细胞的数量，以形成中间耳蜗细胞群体，其中所述中间耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度大于所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度。经处理的耳蜗细胞群体可以是例如体内群体、体外群体或甚至体外外植体。在一个这样的实施方案中，所述经处理的耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度超过所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度至少1.1倍。例如，在一个这样的实施方案中，所述经处理的耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度超过所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度至少1.25倍。例如，在一个这样的实施方案中，所述经处理的耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度超过所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度至少1.5倍。又例如，在一个这样的实施方案中，所述经处理的耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度超过所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度至少2倍。又例如，在一个这样的实施方案中，所述经处理的耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度超过所述初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度至少3倍。体外耳蜗细胞群体可以扩增得显著超过体内群体；例如，在某些实施方案中，扩增的体外干细胞群体中的干细胞的细胞密度可以是初始耳蜗细胞群体中的干细胞的细胞密度的至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000或甚至3000倍。在前述实施方案中的每一个中，借助于干细胞增殖测定可以确定本段落所述的本发明的组合物的扩增耳蜗细胞群体的能力。

根据本发明的一个方面，用本发明的组合物(例如，含有有效浓度的干性驱动剂（例如，gsk3-α抑制剂）和有效浓度的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)的组合物)处理耳蜗支持细胞群体来增加该群体的lgr5活性。例如，在一个实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体外群体的lgr5活性增加和保持在至少1.2倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体外群体的lgr5活性增加1.5倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体外群体的lgr5活性增加2、3、510、100、500、1000、2000或甚至3000倍的能力。也可以针对体内群体观察到lgr5活性的增加，但是所观察到的增加可能略微更加轻微。例如，在一个实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体内群体的lgr5活性增加至少5%的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体内群体的lgr5活性增加至少10%的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体内群体的lgr5活性增加至少20%的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有将耳蜗支持细胞的体内群体的lgr5活性增加至少30%的能力。在前述实施方案中的每一个中，所述gsk3-α抑制剂的这种增加lgr5活性的能力可以例如在体外lgr5⁺活性测定中证实，而在体内群体中，可以例如在体内lgr5⁺活性测定中证实，如通过分离所述器官并使用免疫染色进行形态学分析、lgr5(例如，lgr5、sox2)的内源性荧光蛋白表达和针对lgr5的qpcr测量的。

通过用本发明的组合物(例如，含有有效浓度的干性驱动剂（例如，gsk3-α抑制剂）和有效浓度的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂诸如丙戊酸)的组合物)处理含有lgr5⁺支持细胞的耳蜗细胞群体(无论是在体内还是在体外)，除了增加群体的lgr5活性之外，还可以增加耳蜗细胞群体中lgr5⁺支持细胞的数量。一般而言，通过几种机制中的一种或多种，可以相对于初始细胞群体扩增干/祖支持细胞的细胞密度。例如，在一个这样的实施方案中，可以产生具有增大的干细胞倾向(即，更大的分化成毛细胞的能力)的新产生的lgr5⁺支持细胞。又例如，在一个这样的实施方案中，没有子代lgr5⁺细胞是通过细胞分裂产生，而是诱导预先存在的lgr5⁺支持细胞分化为毛细胞。又例如，在一个这样的实施方案中，没有子代lgr5⁺细胞是通过细胞分裂产生，而是将lgr5^-支持细胞活化至更大的lgr5活性水平，所述活化的支持细胞然后能够分化为毛细胞。不论机制，在一个实施方案中，本发明的组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将体外分离的耳蜗支持细胞群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少5倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体外群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少10倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体外群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少100、至少500、至少1000或甚至至少2000倍的能力。也可以在体内群体中观察到lgr5⁺支持细胞的细胞密度的增加，但是所观察到的增加可能略微更加轻微。例如，在一个实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体内群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少5％的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体内群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少10%的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体内群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少20%的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将耳蜗支持细胞的体内群体中的lgr5⁺支持细胞的细胞密度增加至少30%的能力。例如在干细胞增殖测定中或在适当的体内测定中，可以证实所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)的这种增加体内群体中的lgr5⁺支持细胞的能力。在一个实施方案中，本发明的组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有这样的能力：通过在具有无检测水平或低检测水平的所述蛋白的细胞中诱导lgr5的表达来增加耳蜗中lgr5⁺细胞的数量，同时维持天然形态。在一个实施方案中，本发明的组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有这样的能力：通过在具有无检测水平或低检测水平的所述蛋白的细胞中诱导lgr5的表达来增加耳蜗中lgr5⁺细胞的数量，同时维持天然形态且不产生细胞聚集体。

除了增加lgr5⁺支持细胞的细胞密度之外，在一个实施方案中，本发明的方法具有增加耳蜗细胞群体中lgr5⁺细胞与毛细胞之比的能力。在一个实施方案中，通过用本发明的组合物(例如，含有有效浓度的干性驱动剂（例如，gsk3-α抑制剂）和有效浓度的分化抑制剂(例如，notch激动剂或hdac抑制剂诸如丙戊酸)的组合物)处理初始耳蜗细胞群体来选择性地扩增初始耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞的数量，以形成扩增的细胞群体，并且其中所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞的数量至少等于毛细胞的数量。所述扩增的耳蜗细胞群体可以是例如体内群体、体外群体或甚至体外外植体。在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少1:1。例如，在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少1.5:1。又例如，在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少2:1。又例如，在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少3:1。又例如，在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少4:1。又例如，在一个这样的实施方案中，所述扩增的耳蜗细胞群体中的lgr5⁺支持细胞与毛细胞之比为至少5:1。在前述实施方案中的每一个中，借助于干细胞增殖测定可以确定本段落所述的本发明的组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)的扩增耳蜗细胞群体的能力。

在某些实施方案中，所述方法将感觉上皮上的lgr5⁺细胞在总细胞中的比例增加至少10%、20%、50%、100%、250%500%、1000%或5000%。

在某些实施方案中，所述方法增加lgr5⁺细胞，直到它们达到感觉上皮(例如柯蒂氏器官)上的细胞的至少10％、20％、30％、50％、70％或85％。

一般而言，优选地避免耳蜗中支持细胞的过度增殖。在一个实施方案中，本发明的方法具有这样的能力：扩增耳蜗细胞群体，且不产生超过耳蜗的天然表面的新细胞的突出物，例如细胞聚集体。在某些实施方案中，在将组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)置于圆窗膜上后30天，所述耳蜗组织具有天然形态。在某些实施方案中，在将所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)置于圆窗膜上后30天，所述耳蜗组织具有天然形态且缺乏细胞聚集体。在某些实施方案中，在将所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)置于圆窗膜上后30天，所述耳蜗组织具有天然形态，且在所述柯蒂氏器官中的至少10％、20％、30％、50％、75％、90％、95％、98％或甚至至少99％的lgr5⁺细胞都不是细胞聚集体的一部分。

除了上述的扩增总体的支持细胞群体和具体的lgr5⁺支持细胞以外，本发明的方法具有在子代细胞中保持分化为毛细胞的能力。在体内群体中，通过受试者的听力的改善可以间接地观察到这种能力的保持。在体外群体中，这种能力的保持可以通过毛细胞数量相对于起始群体的增加而直接观察到，或通过测量lgr5活性、sox2活性或本文别处鉴别的一种或多种其它干细胞标志物而间接观察到。

在一个实施方案中，所述方法增加总体的耳蜗支持细胞群体或具体的lgr5⁺支持细胞群体的干性的能力可以与分离的lgr5⁺细胞的体外群体的lgr5活性的增加(通过lgr5活性测定来确定)相关联。如以前指出的，在一个这样的实施方案中，相对于初始细胞群体中的细胞的lgr5活性，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有将中间细胞群体中的干细胞的lgr5活性增加平均5倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，相对于初始细胞群体中的细胞的lgr5活性，所述方法具有将中间细胞群体中的干细胞基因的lgr5活性增加10倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，相对于初始细胞群体中的细胞的lgr5活性，所述方法具有将中间细胞群体中的干细胞的lgr5活性增加100倍的能力。又例如，在一个这样的实施方案中，相对于初始细胞群体中的细胞的lgr5活性，所述方法具有将中间细胞群体中的干细胞的lgr5活性增加1000倍的能力。在前述实施方案中的每一个中，通过靶基因的免疫染色或内源性荧光蛋白表达和经由成像分析或流式细胞计量术分析它们的相对强度，或使用针对靶干细胞基因的qpcr，可以在体外确定所述细胞群体中的干细胞活性的增加。可以任选地通过干细胞测定进一步确定所得的干细胞群体的身份，所述干细胞测定包括在干细胞测定中定义的干细胞标志物表达测定、集落形成测定、自我更新测定和分化测定。

在某些实施方案中，应用于成年哺乳动物的所述方法产生处于s期的成年哺乳动物lgr5⁺细胞群体。

在一个实施方案中，在将gsk3-α抑制剂应用于小鼠的圆窗后，相对于未暴露于所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)的群体的基线，在柯蒂氏器官中的细胞群体的体内lgr5⁺活性增加1.3倍、1.5倍、至多20倍。在某些实施方案中，相对于未暴露于所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)的群体的基线，将所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)应用于小鼠的圆窗会使柯蒂氏器官中的细胞的平均体内lgr5⁺活性增加1.3倍、1.5倍、至多20倍。

在某些实施方案中，所述方法增加lgr5⁺细胞，直到它们在数量上达到支持细胞群体的至少10%、7.5%、10%、至多100％。

在某些情况下，如果分化抑制剂不以有效分化抑制浓度存在，那么干性驱动剂也可以诱导支持细胞分化为毛细胞。可以驱动增殖和分化的干性驱动剂的例子包括gsk3-α抑制剂，例如，在表1中公开的那些。

在某些实施方案中，可以使用干性驱动剂来驱动lgr5⁺干细胞的增殖。在某些情况下，如果分化抑制剂不以有效分化抑制浓度存在，那么干性驱动剂也可以诱导lgr5⁺细胞分化成毛细胞。可以驱动增殖和分化的干性驱动剂的例子包括gsk3-α抑制剂，例如，在表1中公开的那些。在某些实施方案中，所述分化抑制剂也是干性驱动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸，其可以是干性驱动剂。在某些实施方案中，如果分化抑制剂也是干性驱动剂，那么所述分化抑制剂的浓度在分化阶段中低于所述有效分化抑制浓度。

在某些实施方案中，所述组合物(例如，包含gsk3-α抑制剂的组合物)具有使耳蜗中的lgr5⁺细胞的百分比增加5%、10%、25%、50%或80%的能力。在某些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含(i)gsk3-α抑制剂和(ii)丙戊酸的组合。在某些实施方案中，这样的包含上面(i)和(ii)的组合组合物的应用具有使耳蜗中的lgr5⁺细胞的百分比增加5%、10%、25%、50%或80%的能力。

干性驱动剂

在本发明内的示例性gsk3-α抑制剂出现在表1中。

在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含对于gsk3-α而言小于1nm的效能。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含对于gsk3-α而言1-10nm的效能。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含对于gsk3-α而言10nm至100nm的效能。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含对于gsk3-α而言100nm至1000nm的效能。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在以下文献中公开的吡唑并吡啶化合物：witherington,j.等人,bioorganic&medicinalchemistryletters(2003),13(18),3055-3057;witherington,j.等人,bioorganic&medicinalchemistryletters(2003),13(18),3059-3062；或witherington,j.等人,bioorganic&medicinalchemistryletters(2003),13(9),1577-1580，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在witherington,j.等人,bioorganic&medicinalchemistryletters(2003),13(9),1581-1584（通过引用整体并入本文）中公开的吡唑并哒嗪化合物。

如在以下参考文献的实验操作中所述，可以确定相对于gsk3-α和gsk3-β的效能：unoa,y.等人,brainresearch(2009),1296,148;neumann,t.等人,b.journalofmedicinalchemistry(2015),58(22),8907-8919，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，具有与有效gsk3-α抑制剂类似的结构的化合物将同样表现出有效的gsk-3-α抑制。因此，在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是吡唑，其形成与gsk-3βxxii抑制剂cas1195901-31-5类似的结合基序：

。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含以下结构：

。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在以下文献中公开的化合物：unoa,y.,iwashitaa等人,brainresearch(2009)1296,148；或tsukamoto,t.;wo2006085685。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在以下文献中公开的化合物：wyatt,p.g.等人,j.med.chem.2008,51,4986-4999;wo2005002552a2,wo2005012256a1,wo2007129062a1,wo2007129066a1,wo2008001101a2,wo2008001115a2;us20110002879a1;wo2005002576a2;wo2006070192;wo2006077414a1;wo2006077416;wo2006077419wo2006077424;wo2006077425a1;wo2006070198a1wo2006070195;wo2006077426a2;wo2006003440a1;wo2007129062;wo2006077428;wo2006070202;wo2008007113a2;wo2008007122a2;wo2008007123a2；或wo2008009954，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在以下文献中公开的化合物：urich,r.等人,journalofmedicinalchemistry(2014),57(18),7536-7549，通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是在以下文献中公开的化合物：cn102060772或lu,y.等人,chemicalpharmaceuticalbulletin(2014),62(3),238-246，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂抑制gsk3-α和gsk3-β。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂具有针对gsk3-α和gsk3-β的效能，其中所述效能对于抑制gsk3-α和gsk3-β而言小于约100nm，或对于抑制gsk3-α和gsk3-β而言小于约50nm、20nm、10nm、5nm、2nm或小于1nm。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂对gsk3-α的选择性胜过gsk3-β。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含至少约0.5倍或至少约0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍或1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的gsk3-α/gsk3-β选择性比率，包括在gsk3-α/gsk3-β选择性比率之间的所有整数(例如，61倍、62倍、63倍)和范围(例如，约1倍至约100倍；约20倍至约90倍；约40倍至约60倍)。

在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含针对gsk3-α和gsk3-β的效能，其中所述针对gsk3-α和gsk3-β的效能相差约100%或约50%；约25%；约20%；或约5%。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂包含针对gsk3-α和gsk3-β的效能，其中所述针对gsk3-α和gsk3-β的效能不是检测上不同的。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是具有胜过gsk3-β的gsk3-α选择性的化合物，其选自(i)在以下文献中公开的噁二唑化合物：lomonte,f.等人,journalofmedicinalchemistry(2012),55(9),4407-4424;neumann,t.等人,journalofmedicinalchemistry(2015),58(22),8907-8919；(ii)在以下文献中公开的吲哚化合物：georgievska,b.等人,journalofneurochemistry(2013),125(3),446-56；(iii)在以下文献中公开的异烟酰胺化合物：luo,g.等人,journalofmedicinalchemistry(2016),59(3),1041-1051；(iv)在以下文献中公开的马来酰亚胺化合物：remsingrix,l.l.等人,acschemicalbiology(2014),9(2),353-358或bertrand,j.a.等人,journalofmolecularbiology(2003),333(2),393-407；(v)在以下文献中公开的二氨基嘧啶和氮杂嘌呤化合物：lum,c.等人,bioorganic&medicinalchemistryletters(2008),18(12),3578-358；和(vi)在以下文献中公开的金属络合物：kramer,t.;schmidt,b.;lomonte,f.internationaljournalofalzheimer’sdisease(2012),381029,32;feng,l.等人,journaloftheamericanchemicalsociety(2011),133(15),5976-5986;bregman,h.等人,journaloftheamericanchemicalsociety(2004),126(42),13594-13595;atilla-gokcumen,g.e.;dicostanzo,l.;meggers,e.jbic,journalofbiologicalinorganicchemistry(2011),16(1),45-50，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，使用标准放射测量体外激酶测定，本发明的gsk3-α抑制剂不包含关于抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)(例如，在体外针对一组cdk诸如cdk1、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk9)的任何可检测效能，在所述测定中，在有所述抑制剂存在下试验所述cdk将放射性atp掺入已知肽底物中的能力。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂对gsk3-α的选择性胜过cdk。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约60倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约1000倍或至少约15,000倍的gsk3-α/cdk选择性比率，包括在gsk3-α/cdk选择性比率之间的所有整数(例如，81倍、82倍、83倍)和范围(例如，约10倍至约1000倍；约200倍至约900倍；约400倍至约600倍)。

在某些实施方案中，使用标准放射测量体外激酶测定，本发明的gsk3-α抑制剂不包含关于在体外促分裂原活化蛋白激酶(mapk)的任何可检测效能，在所述测定中，在有所述抑制剂存在下试验所述mapk将放射性atp掺入已知肽底物中的能力。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂对gsk-α的选择性胜过mapk。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约60倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约1000倍或至少约15,000倍的gsk3-α/mapk选择性比率，包括在gsk3-α/mapk选择性比率之间的所有整数(例如，81倍、82倍、83倍)和范围(例如，约10倍至约1000倍；约200倍至约900倍；约400倍至约600倍)。

在某些实施方案中，使用标准放射测量体外激酶测定，本发明的gsk3-α抑制剂不包含关于在体外抑制细胞外信号调节的激酶(erk)的任何可检测效能，在所述测定中，在有所述抑制剂存在下试验所述erk将放射性atp掺入已知肽底物中的能力。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂对gsk-α的选择性胜过erk。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约60倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约1000倍或至少约15,000倍的gsk3-α/erk选择性比率，包括在gsk3-α/erk选择性比率之间的所有整数(例如，81倍、82倍、83倍)和范围(例如，约10倍至约1000倍；约200倍至约900倍；约400倍至约600倍)。

在某些实施方案中，使用标准放射测量体外激酶测定，本发明的gsk3-α抑制剂不包含关于在体外抑制促分裂原活化蛋白激酶(mek)的任何可检测效能，在所述测定中，在有所述抑制剂存在下试验所述mek将放射性atp掺入已知肽底物中的能力。在某些实施方案中，本发明的gsk3-α抑制剂对gsk-α的选择性胜过mek。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂包含至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约60倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍、至少约1000倍或至少约15,000倍的gsk3-α/mek选择性比率，包括在gsk3-α/mek选择性比率之间的所有整数(例如，81倍、82倍、83倍)和范围(例如，约10倍至约1000倍；约200倍至约900倍；约400倍至约600倍)。

用于用在本文公开的组合物和方法的不同实施方案中的gsk3-α抑制剂的类别包括、但不限于在表1的a列中列出的那些。用于用在本文公开的组合物和方法的不同实施方案中的具体gsk3-α抑制剂包括、但不限于在表1的b列中列出的那些。

试剂的组合

在某些实施方案中，所述组合物包含在表1、a列的类别内的试剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)和分化抑制剂。在某些实施方案中，所述组合物包含在表1、a列的类别内的试剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)和hdac抑制剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)或notch激动剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)。在某些实施方案中，所述组合物包含在表1、a列的类别内的试剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)和丙戊酸(或其衍生物或类似物或药学上可接受的盐)。组合的试剂的递送特性。

在本发明内的示例性hdac抑制剂出现在表4中。

在本发明内的示例性notch激动剂出现在表3中。

在某些实施方案中，可以使用干性驱动剂驱动lgr5⁺干细胞的增殖。在某些情况下，如果分化抑制剂不以有效分化抑制浓度存在，干性驱动剂也可以诱导lgr5+细胞分化成毛细胞。可以驱动增殖和分化的干性驱动剂的一个例子包括gsk3-α抑制剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂可以是hdac抑制剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)或notch激动剂(或其衍生物或药学上可接受的盐)。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸(或其衍生物或药学上可接受的盐)。在某些实施方案中，所述干细胞群体属于体内受试者，且所述方法是针对听力损失和/或前庭功能障碍的治疗(例如，其中从所述扩增的干细胞群体产生内耳毛细胞会导致听力损失的部分或完全恢复和/或改善的前庭功能)。在某些实施方案中，所述干细胞群体属于体内受试者，且所述方法还包括将药物递送给受试者(例如，为了治疗与听力损失和/或前庭功能障碍无关的疾病和/或障碍)，所述药物的浓度高于所述药物对于所述受试者而言的已知安全最大剂量(例如，如果在没有由所述方法引起的内耳毛细胞产生存在下递送的已知安全最大剂量)(例如，由于所述药物的限制剂量的耳毒性的减少或消除)。

在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的内耳毛细胞执行高通量筛选。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的内耳毛细胞关于对内耳毛细胞的毒性筛选分子。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的内耳毛细胞关于改善内耳毛细胞(例如，暴露于所述分子的内耳毛细胞)的存活的能力筛选分子。

在某些方面，本发明涉及一种生产扩增的干细胞群体的方法，所述方法包括：给干细胞群体(例如，体外、离体或体内样品/受试者的干细胞群体)施用或造成被施用gsk3-α抑制剂(例如，在表1中公开的gsk3-α抑制剂)，任选地与分化抑制剂组合。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，通过执行向耳中的一次或多次注射(例如，经鼓膜注射进中耳和/或内耳中)进行所述施用步骤。

在某些实施方案中，所述施用步骤包括以持续方式施用gsk3-α抑制剂。在某些实施方案中，所述施用步骤还包含施用与gsk3-α抑制剂组合的分化抑制剂。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述分化抑制剂作为单一组合组合物施用。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述分化抑制剂作为单独组合物依次施用。

在某些实施方案中，所述施用步骤包括以持续方式施用gsk3-α抑制剂，其中所述施用步骤还包含施用与gsk3-α抑制剂组合的hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述hdac抑制剂或notch激动剂作为单一组合组合物施用。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述hdac抑制剂或notch激动剂作为单独组合物依次施用。

在某些实施方案中，所述施用步骤包括以持续方式施用gsk3-α抑制剂，其中所述施用步骤还包含施用与gsk3-α抑制剂组合的丙戊酸。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述丙戊酸作为单一组合组合物施用。在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂和所述丙戊酸作为单独组合物依次施用。

在某些实施方案中，所述干细胞是内耳干细胞和/或支持细胞。

在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的扩增的干细胞群体执行高通量筛选。在某些实施方案中，所述方法还包括使用产生的干细胞关于对干细胞和/或它们的后代的毒性筛选分子。在某些实施方案中，所述方法包括使用产生的干细胞关于改善干细胞和/或它们的后代的存活的能力筛选分子。

在某些方面，本发明涉及一种治疗具有听力损失和/或前庭功能障碍或处于发生听力损失和/或前庭功能障碍的风险中的受试者的方法，所述方法包括:鉴别已经经历听力损失和/或前庭功能障碍或处于发生听力损失和/或前庭功能障碍的风险中的受试者，施用或造成被施用gsk3-α抑制剂和任选的分化抑制剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是hdac抑制剂或notch激动剂。在某些实施方案中，所述分化抑制剂是丙戊酸。

在某些实施方案中，所述干细胞群体包含lgr5⁺细胞。在某些实施方案中，所述干细胞群体包含出生后细胞。在某些实施方案中，所述干细胞群体包含上皮干细胞。在某些实施方案中，干细胞包括祖细胞。

在某些实施方案中，所述施用步骤包括给所述受试者施用或造成被施用vpa(例如，以药学上可接受的形式(例如，盐))。在某些实施方案中，通过执行向耳中的一次或多次注射(例如，经鼓膜注射进中耳和/或内耳中)进行所述施用步骤。

在某些方面，本发明涉及一种产生内耳毛细胞的方法，所述方法包括:增殖初始干细胞群体(例如，体外、离体或体内样品/受试者的初始干细胞群体)中的干细胞，产生扩增的干细胞群体(例如，使得扩增的群体是初始干细胞群体的至少1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍)；和促进从所述扩增的干细胞群体产生内耳毛细胞。

在某些方面，本发明涉及一种产生内耳毛细胞的方法，所述方法包括将gsk3-α抑制剂(例如，以药学上可接受的形式(例如，盐))施用给受试者的内耳中的细胞群体，由此促进内耳毛细胞的产生。

在某些方面，本发明涉及一种产生内耳毛细胞的方法，所述方法包括:增殖初始群体(例如，体外、离体或体内样品/受试者的初始群体)中的出生后lgr5+细胞，产生扩增的lgr5+细胞群体(例如，使得扩增的群体是初始干细胞群体的至少1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍)，所述扩增的lgr5+细胞群体导致内耳毛细胞的产生。在某些实施方案中，干细胞包括祖细胞。

在某些方面，本发明涉及一种治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括:增殖受试者的初始群体(体内)中的出生后lgr5⁺上皮细胞，产生扩增的lgr5+上皮细胞群体(例如，使得扩增的群体是初始出生后lgr5⁺上皮细胞群体的至少1.25、1.5、1.75、2、3、5、10或20倍)。

在某些实施方案中，使lgr5⁺细胞分化成毛细胞。

组合物和施用

某些实施方案涉及药用预防或治疗组合物，其包含药学上可接受的载体和干细胞增殖剂，所述干细胞增殖剂是gsk3-α抑制剂或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，如上面所指出的，组合物适合施用至内耳和/或中耳，例如，局部施用至圆窗膜或鼓室内或经鼓膜施用，例如，施用至耳蜗组织。

短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

本文中使用的“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括、但不限于已经被美国食品和药品管理局批准为可接受用于用在人类或家养动物中的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂、或乳化剂。示例性的药学上可接受的载体包括、但不限于：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡类、动物和植物脂肪、石蜡、有机硅、皂粘土、硅酸、氧化锌；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等张盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和在药物制剂中采用的任意其它相容的物质。

某些组合物包含至少一种生物相容的基质。本文中使用的术语“生物相容的基质”是对于施用给人类以释放治疗剂而言可接受的聚合物载体。在某些情况下，生物相容的基质可以是生物相容的凝胶或泡沫。

某些组合物包含至少一种泊洛沙姆。泊洛沙姆是由(即，亲水的聚氧乙烯段和疏水的聚氧丙烯段)形成的三嵌段共聚物，其被构造成聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三段。泊洛沙姆是一类具有环氧丙烷段疏水物和环氧乙烷亲水物的嵌段共聚物表面活性剂。泊洛沙姆是商购可得的(例如，pluronic®多元醇可得自basfcorporation)。可替换地，通过已知技术可以合成泊洛沙姆。

示例性的泊洛沙姆包括泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆包含两种或更多种泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338或泊洛沙姆407的混合物。在某些实施方案中，所述两种或更多种泊洛沙姆的混合物包含泊洛沙姆407和泊洛沙姆124。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆包含泊洛沙姆188和泊洛沙姆407中的至少一种或其混合物。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407。

在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约5重量%至约25重量%之间的浓度，或相对于所述组合物约5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、11重量%、12重量%、13重量%、14重量%、15重量%、16重量%、17重量%、18重量%、19重量%、20重量%、21重量%、22重量%、23重量%、24重量%或25重量%。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约10重量%至约23重量%之间的浓度。在某些实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物约15重量%至约20重量%之间的浓度。在特定实施方案中，所述泊洛沙姆是在相对于所述组合物大约17重量%的浓度。

在某些实施方案中，润湿剂、乳化剂和润滑剂（诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁）、以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于所述组合物中。

某些组合物包含至少一种抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括:(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

在具体实施方案中，所述组合物在约体温的粘度实质上不同于(例如，小于，大于)所述组合物在室温的粘度。

在某些实施方案中，所述组合物包含缓冲液。例如，在某些情况下，所述缓冲液是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。

在某些实施方案中，所述组合物是在或接近生理ph。例如，在某些实施方案中，所述组合物具有约6至约8的ph，包括在之间的所有整数、小数和范围，例如，约6至约6.5至约7至约7.5至约8。在具体实施方案中，所述组合物具有约7.4(±0.2)的ph。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂以有效的或以其它方式限定的浓度或浓度范围存在于药物组合物中。例如，在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂以约0.01um至1000mm、约0.1um至1000mm、约1um至100mm、约10um至10mm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um、约1mm至10mm、或约10mm至100mm的浓度存在于组合物中；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.01-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-5000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约50-2000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或约0.01nm至1000um、约0.1nm至1000um、约1nm至100um、约10nm至10um、约1nm至10nm、约10nm至100nm、约100nm至1000nm、约1um至10um、或约10um至100um的浓度，包括在之间的所有整数和范围。在某些实施方案中，在lgr5增殖测定中测量有效活性，如本文中所述。

在某些实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是gsk3抑制剂xxii，其以约0.1um至1000mm、约1um至100mm、10um至10mm、约100um至10mm、或100um至1mm、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm的浓度存在于组合物中；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约0.1nm至1000um、约1nm至100um、约10nm至10um、约100nm至1um或约0.5um的浓度，包括在之间的所有整数和范围。在某些实施方案中，在lgr5增殖测定中测量有效活性，如本文中所述。

在特定实施方案中，所述gsk3-α抑制剂是azd1080，其在约0.1um至1000mm、约1um至1000mm、约10um至100mm、约100um至10mm、约1mm至10mm、或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约1nm至1000um、约10nm至1000um、约100nm至100um、约1um至10um或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10um的浓度，包括在之间的所有整数和范围。在某些实施方案中，在lgr5增殖测定中测量有效活性，如本文中所述。

在某些实施方案中，所述hdac抑制剂以有效的或以其它方式限定的浓度或浓度范围存在于药物组合物中。例如，在某些实施方案中，所述hdac抑制剂以约0.01um至100,000mm、约1um至10,000mm、约10um至10,000mm、约100um至1000mm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um、约1000um至10mm、约10mm至100mm、约100mm至1000mm、或约1000mm至10,000mm的浓度存在于组合物中；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍；或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约0.01nm至100,000um、约1nm至10,000um、约10nm至10,000um、约100nm至1000um、约1nm至10nm、约10nm至100nm、约100nm至1000nm、约1um至10um、约10um至100um、约100um至1000um或约1000um至10,000um的浓度，包括在之间的所有整数和范围。在某些实施方案中，在lgr5增殖测定中测量有效活性，如本文中所述。

在某些实施方案中，所述hdac抑制剂是丙戊酸，其在约10um至100,000mm、约1mm至10,000mm、约10mm至10,000mm、约100mm至10,000mm、约200mm至2000mm、约1000mm、或约600mm的浓度；或在以下浓度比例：相对于其在体外活性测定中的有效活性约0.1-1,000,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1-100,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约10-10,000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约100-1000倍，或相对于其在体外活性测定中的有效活性约1000倍；或在约10nm至100,000um、1um至10,000um、约10um至10,000um、约100um至10,000um、约200um至2000um或约1000um的浓度，包括在之间的所有整数和范围。在某些实施方案中，在lgr5增殖测定中测量有效活性，如本文中所述。

可以以适合于期望的递送途径（例如，经鼓膜注射、经鼓膜管芯针和导管、耳蜗植入物和可注射蓄池）的任何方式配制本文描述的化合物或组合物。在某些情况下，组合物或制剂包括一种或多种生理学上可接受的组分，包括其衍生物或前药、溶剂合物、立体异构体、外消旋体或互变异构体以及任何生理上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

如上面所指出的，某些组合物适合和某些方法采用向中耳或内耳的施用，例如，通过局部施用至圆窗膜。圆窗膜是内耳空间的生物屏障，且代表听力损害的局部治疗的主要障碍。所施用的药物必须克服该膜以到达内耳空间。可以可操作地(例如，穿过鼓膜注射)将所述药物局部地置于圆窗膜，然后可以渗透穿过圆窗膜。穿透圆窗的物质通常分布在外淋巴中且因而到达毛细胞和支持细胞。

所述药物组合物或制剂还可以含有膜渗透促进剂，其支持本文提及的试剂透过圆窗膜。因此，可以使用液体、凝胶或泡沫制剂。也可能口服地应用活性成分或采用递送方案的组合。

某些组合物适合和某些方法采用向中耳或内耳的施用，例如，通过鼓室内或经鼓膜施用。药物向耳部的鼓室内(it)递送越来越多地用于临床和研究目的。一些小组已经使用微型导管或微型管芯针以持续方式施用药物，但大部分已经将其作为单次或重复it注射来施用(在多达2周的时间段中的多达8次注射)。

鼓室内施用的药物被认为主要通过穿过圆窗(rw)膜而进入内耳流体。计算表明，控制进入耳中的药物的量和药物沿着耳长度的分布的主要因素是药物在中耳空间中停留的时间。单次“单剂(one-shot)”施用或持续几小时的水溶液施用会导致所施用的物质沿着耳蜗长度的陡峭药物梯度，并且随着药物随后分布在整个耳中导致耳蜗的底转中迅速下降的浓度。

其它注射方案包括通过渗透泵，或通过与植入的生物材料组合，和更优选地，通过注射或输注。可以辅助控制药物的释放动力学和分布的生物材料包括水凝胶材料、可降解材料。最优选地使用的一类材料包括原位胶凝材料。在参考文献(almeidah,amaralmh,lobaop,lobojm,drugdiscovtoday2014;19:400-12;wiseak,gillespieln,jneuraleng2012;9:065002;surovtsevaev,johnstonah,zhangw,等人,intjpharmaceut2012;424:121-7;roys,glueckertr,johnstonah,等人,nanomedicine2012;7:55-63;riverat,sanzl,camarerog,varela-nietoi,.currdrugdeliv2012;9:231-42;pararasee,borkholderda,borensteinjt,advdrugdelivrev2012;64:1650-60;liml,leelc,chengyr,等人,ieeetbio-medeng2013;60:2450-60;lajudsa,hanz,chifl,等人,jcontrolrelease2013;166:268-76;kimdk,parksn,parkkh,等人,drugdeliv2014;engledere,honederc,klobasaj,wirthm,arnoldnerc,gaborf,intjpharmaceut2014;471:297-302;bohla,rohmhw,ceschip,等人,jmaterscimatermed2012;23:2151-62;hoskisone,danielm,al-zahids,shakesheffkm,baystonr,birchalljp,therdeliv2013;4:115-24;staeckerh,rodgersb,expertopindrugdeliv2013;10:639-50;pritzco,dudasj,rask-andersenh,schrott-fischera,glueckertr,nanomedicine2013;8:1155-72)中提到的所有潜在的材料和方法都通过引用整体并入本文。其它材料包括胶原或其它天然材料，包括纤维蛋白、明胶和去细胞化的组织。明胶海绵(gelfoam)也可能是合适的。

还可以通过替代方式来增强递送，所述替代方式包括、但不限于添加到递送的组合物中的试剂，诸如渗透促进剂，或者可以通过超声、电穿孔或高速喷射装置。

本文描述的方法还可以用于使用本领域技术人员已知的多种方法可产生的内耳细胞类型，包括在pct申请号wo2012103012a1中描述的那些细胞类型。

关于人和兽医治疗，所施用的特定试剂的量可以取决于多种因素，包括：正在治疗的病症和病症的严重程度；采用的具体试剂的活性；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；采用的具体试剂的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体试剂组合或并用的药物；处方医师或兽医的判断；和医学和兽医学领域中已知的类似因素。

本文描述的试剂可以以治疗有效量施用给需要治疗的受试者。本文描述的组合物(例如，包含一种或多种gsk3-α抑制剂和任选的分化抑制剂(例如，(例如，notch激动剂或hdac抑制剂，例如，丙戊酸)的组合物)的施用可以是通过任何合适的施用途径，例如，通过鼓室内施用。其它途径包括：摄取，或可替换地胃肠外地，例如静脉内地、动脉内地、腹膜内地、鞘内地、心室内地、尿道内地、胸骨内地、颅内地、肌肉内地、鼻内地、皮下地、舌下地、透皮地，或通过吸入或吹入法，或通过耳内滴注进行局部施用以通过耳道皮肤和鼓膜的膜进行吸收。这样的施用可以是单个或多个口服剂量，限定数量的滴耳剂，或快速推注，多次注射，或作为短期或长期输注。可植入装置(例如，可植入输注泵)也可以用于在一段时间内周期性地胃肠外递送等同或不同剂量的特定制剂。对于这种胃肠外施用，优选地将所述化合物配制为在水或其它合适的溶剂或溶剂混合物中的无菌溶液。所述溶液可以含有其它物质，诸如盐、糖(特别是葡萄糖或甘露醇)，以使所述溶液与血液等渗；缓冲剂，诸如乙酸、柠檬酸和/或磷酸及它们的钠盐；和防腐剂。

通过许多足以将所述组合物递送至内耳的方法，可以施用本文描述的组合物。将组合物递送至内耳包括将所述组合物施用至中耳，使得所述组合物可以跨过圆窗扩散至内耳。它也包括通过穿过圆窗膜直接注射而将组合物施用至内耳。这样的方法包括、但不限于耳部施用，通过经鼓膜管芯针或导管，或胃肠外施用，例如，通过耳内、经鼓膜或耳蜗内注射。

在特定实施方案中，局部地施用本发明的化合物、组合物和制剂，这意味着，它们不是全身施用。

在一个实施方案中，使用注射器和针装置使用耳部施用向受试者施用化合物或组合物。使用适当尺寸的针来刺穿鼓膜，并且将包含所述组合物的管芯针或导管穿过被刺穿的鼓膜插入受试者的中耳中。可以插入该装置，使得它与圆窗接触或紧邻圆窗。可用于耳部施用的示例性装置包括、但不限于：经鼓膜管芯针，经鼓膜导管，圆窗微导管(将药物递送至圆窗的小导管)，和silversteinmicrowicks^tm(小管，“管芯针”穿过该管到圆窗，从而允许受试者或医学专业人员调节)。

在某些实施方案中，使用注射器和针装置将化合物或组合物施用给受试者，其中使用经鼓膜注射，在鼓膜后注射进中耳和/或内耳。可以将所述制剂通过经鼓膜注射直接施用到圆窗膜上，或者可以通过耳蜗内注射直接施用至耳蜗或通过前庭内注射直接施用至前庭器官。

在某些实施方案中，所述递送装置是设计用于向中耳和/或内耳施用化合物或组合物的设备。仅举例而言：gyrusmedicalgmbh提供了微型耳镜，其用于圆窗龛的可视化和药物递送；arenberg已经在美国专利号5,421,818、5,474,529和5,476,446（它们中的每一篇关于这样的公开内容通过引用并入本文）中描述了一种将流体递送到内耳结构的医疗装置。美国专利申请系列号08/874,208（其关于这样的公开内容通过引用并入本文）描述了一种用于植入流体转移导管以将组合物递送到内耳的外科手术方法。美国专利申请公开2007/0167918（其关于这样的公开内容通过引用并入本文）进一步描述了用于进行经鼓膜流体取样和药物应用的组合型耳抽吸器和药物分配器。

在某些实施方案中，将本文中公开的化合物或组合物施用给有此需要的受试者一次。在某些实施方案中，将本文中公开的化合物或组合物施用给有此需要的受试者超过一次。在某些实施方案中，本文中公开的化合物或组合物的第一次施用之后是本文中公开的化合物或组合物的第二次、第三次、第四次或第五次施用。

向有此需要的受试者施用化合物或组合物的次数取决于医学专业人员的判断、所述障碍、所述障碍的严重程度和受试者对制剂的应答。在某些实施方案中，将本文中公开的化合物或组合物向具有轻度急性病症的有此需要的受试者施用一次。在某些实施方案中，将本文中公开的化合物或组合物向具有中度或重度急性病症的有此需要的受试者施用超过一次。在受试者的病症没有改善的情况下，根据医生的判断，可以长期施用化合物或组合物，也就是说，持续延长的时间段，包括贯穿受试者的生命持续期间，以便改善或者以其它方式控制或限制受试者的疾病或病症的征状。

在受试者的状况确实改善的情况下，根据医生的判断，可以连续地施用化合物或组合物；可替换地，可以将所施用的药物的剂量暂时减小或暂时停止一段时间(即，“休药期”)。休药期的长度在2天至1年之间变化，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天和365天。在休药期中的剂量减小可以为从10％至100％，仅举例而言，包括10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%。

一旦受试者的听力和/或平衡已经改善，如果必要的话，可以施用维持剂量。随后，作为征状的函数，任选地将剂量或施用频率或二者减小至使改善的疾病、障碍或病症得以保留的水平。在某些实施方案中，在征状的任何复发后，受试者需要长期的间歇性治疗。

实施例

测定：小鼠品系

使用lgr5-egfp-ires-cre-er小鼠(barker等人,2007)(http://jaxmice.jax.org/strain/008875.html)分析小分子对耳蜗干细胞扩增的影响。使用atoh1-ngfp小鼠(lumpkin等人,2003)(由janejohnson博士提供)鉴别分化的毛细胞。

从内耳分离干细胞：在经批准的根据国立卫生研究院（nationalinstitutesofhealth）指南的惯例方案下进行所有动物研究。对于使用新生儿小鼠(出生后1-3天)的实验，在hbss中解剖耳蜗，并将柯蒂氏器官与血管纹和蜗轴分离。然后将科尔蒂器用细胞恢复溶液(corning)处理1h以将耳蜗上皮与基础间充质分离。然后收集上皮并用tryple(lifetechnologies)在37℃处理15-20分钟。将通过机械研磨得到的单细胞过滤(40µm)并悬浮于matrigel(corning)中进行3d培养。

lgr5-阳性细胞的扩增

将细胞在dmem和f12的1:1混合物中培养，所述混合物补充了glutamax(gibco)、n2,b27(invitrogen)、egf(50ng/ml;chemicon)、bfgf(50ng/ml;chemicon)、igf1(50ng/ml;chemicon)和gsk3-α抑制剂。每隔一天更换培养基。

将lgr5-阳性的祖细胞干细胞集落在dmem和f12的1:1混合物中分化，所述混合物补充了glutamax(gibco)、n2,b27(invitrogen)，并加入驱动分化的分子，或者在除去生长因子以后没有加入驱动分化的分子。将小分子加入培养物以试验它们对分化的影响。用3µm的gsk3-α抑制剂实现了最佳分化条件。

分析

在多种条件下培养10天(d10)以后，定量lgr5-阳性细胞。使用tryple(gibco)将细胞集落解离成单细胞。然后将所述细胞用碘化丙啶(pi)染色，并使用流式细胞计分析lgr5-gfp表达。定量gfp-阳性细胞的数目和gfp-阳性细胞的百分比。

在分化处理的第0天(d0)和第10天(d10)定量atoh1-ngfp-阳性细胞以确定已经分化的毛细胞的数目。将细胞集落在细胞恢复溶液中温育以从matrigel释放集落和使用tryple解离成单细胞。对于多种培养条件，使用流式细胞计定量gfp-阳性细胞的总数和百分比。使用anova对比条件之间的平均值，并使用双尾student氏t-检验将每种条件与具有最高收率的处理进行对比。

实施例1

细胞培养：从jacksonlabs得到杂合的lgr5-egfp-ires-creert2(lgr5-gfp)小鼠，并将新生儿p2-p5小鼠用于细胞分离。从lgr5-gfp小鼠分离柯蒂氏器官，并使用tryple(lifetechnologies)进一步解离成单细胞。然后如以前所述(yin等人,2014)培养细胞。简而言之，将细胞包埋在matrigel中并铺板在24-孔板的孔中央。在matrigel的聚合以后，加入500μl培养基(advanceddmem/f12，含有n2和b27)，其含有生长因子（包括egf(50ng/ml)(表皮生长因子)、bfgf(50ng/ml)(成纤维细胞生长因子)和igf1(50ng/ml)(胰岛素-样生长因子1)、丙戊酸钠盐(1mm)）和小分子（包括chir99021(3μm)，或azd1080(不同浓度)，或gsk3抑制剂xxii(不同浓度)）。

对于单细胞分离，从耳囊分离耳蜗，并除去蜗轴组织(听觉神经)和血管纹(离子运输上皮)。然后将柯蒂氏器官放在tryple(lifetechnologies)中在37℃保持15-20分钟。将通过机械研磨得到的单细胞用细胞过滤网(40µm)过滤。然后将单细胞在matrigel中混合并在3d培养系统中培养。在3d培养物中每个含有lgr5细胞的孔中，在有背景生长因子和vpa存在下如上所述加入chir99021、azd1080或gsk抑制剂xxii。

lgr5细胞定量：除去细胞培养基并加入tryple。在37℃温育15-20min以后，使用机械研磨将集落解离成单细胞。使用pi染色和lgr5-gfp计数活lgr5-gfp细胞数目。

对于耳蜗外植体研究，将从lgr5-gfp小鼠分离的柯蒂氏器官用chir99021+vpa或gsk3-抑制剂xxii+vpa处理3天。将柯蒂氏器官铺板在盖玻片上，并浸在含有药物的培养基中。生长因子不存在。chir99021(3um),gsk3-抑制剂xxii(.3um),vpa(1mm)。

对于小鼠研究，如下制备泊洛沙姆407凝胶(sigma-aldrich)的17-19%(w/w)储备溶液：将它缓慢地加入在ph7.4的冷的1倍磷酸盐缓冲盐水中。该溶液当在冷藏或在室温时为液体，但是在体温固化。将所述凝胶用伊文思蓝染料(50ppm)染成蓝色用于在施用过程中显影。

然后用87.6mg/mlvpa和55.6mg/mlchir99021、或87.6mg/mlvpa和50mg/mlgsk3抑制剂xxii（在含有5%dmso的17-19%泊洛沙姆407中）制备制剂。

通过在120dbspl暴露于8-16khz倍频带噪音带2小时，在噪音室中使cba/caj小鼠变聋。噪音暴露以后24小时，通过测量听觉脑干应答(abr)，评估它们的听力。在5、10、20、28.3和40khz确定abr波i的视觉检测所需的最小声压级(spl)。在abr测量以后，递送泊洛沙姆凝胶药物混合物的经鼓膜注射以填充中耳腔。30天以后，评估abr，并确定在噪音暴露以后24小时至30天听力阈值的改善。结果显示在图4中。

结果

lgr5细胞存在于耳蜗上皮内的支持细胞子集中。使用lgr5-gfp小鼠系，我们在基于matrigel的3d培养系统中试验了多种gsk3α和β-抑制剂的活化或抑制以扩增从耳蜗分离的单个lgr5⁺支持细胞。已经证实内耳上皮细胞能够在有生长因子存在下培养为神经球，所述生长因子包括表皮生长因子(egf或e)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf或f)和胰岛素样生长因子1(igf-1或i)(li等人,2003)。但是，在该条件下，没有观察到lgr5-gfp细胞生长。已经证实抑制糖原合酶激酶3β(gsk3β)抑制剂（用与组蛋白脱乙酰基酶(hdac)抑制剂、丙戊酸(vpa或v)组合的chir99021(chir或c)，与加入egf、bfgf和igf-1一起）会增强耳蜗lgr5细胞中的lgr5细胞增殖(mclean等人)。在这里，如在图中所示，发现具有比chir99021更强的gskα-抑制偏好的分子促进lgr5-gfp细胞的扩增，且在egf、bfgf、igf-1和vpa的背景下在azd1080和gsk抑制剂xxii的培养物中观察到lgr5-gfp+细胞的大集落(图1a和2a)。流式细胞计量术分析也揭示，chir和vpa的组合会增加lgr5-gfp细胞数目，这类似于在背景生长因子中的azd108和vpa或gsk抑制剂xxii和vpa(图1b和2b)。

用分子(gsk3抑制剂xxii)离体处理的柯蒂氏器官表现出毛细胞数目增加的证据，所述分子具有相对于与vpa(v)组合的chir99021而言更高的gsk3α-抑制偏好。

当施用至噪音损伤的内耳时，具有相对于与vpa(v)组合的chir99021而言更高的gsk3α-抑制偏好的分子(gsk3抑制剂xxii)表现出听力恢复的证据。

如在图1和图2中所示，含有生长因子(gf)、vpa(v)和gsk3-抑制剂的混合液促进体外lgr5+内耳祖细胞的增殖和gfp表达，并允许这些细胞的扩增。

图3的结果表明用分子(gsk3抑制剂xxii)离体处理的柯蒂氏器官中的毛细胞数目增加，所述分子具有相对于与vpa(v)组合的chir99021而言更高的gsk3α-抑制偏好。

图4的结果表明噪音损伤的cba/caj小鼠的听力恢复。具体地，用gsk3xxii+vpa（对gsk3α抑制具有更高偏好的分子）处理导致比chir99021+vpa(cv)更大的听力恢复。阈值的10db改善会造成给定声音的响度的倍增，且被视作临床上有意义的。cv制剂实现10db恢复，而vpa/gsk3抑制剂xxii制剂实现甚至更大的恢复。

从前面的描述显而易见，可以对本文描述的发明做出变化和修改，以使它适应不同的用法和条件。本文描述了用于用在本发明中的方法和材料；还可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。这样的实施方案也是在以下权利要求的范围内。在本文中对变量的任何定义中的要素的列表的列举包括该变量作为任何单个要素或列出的要素的组合(或子组合)的定义。在本文中一个实施方案的列举包括该实施方案作为任何单个实施方案或与任意其它实施方案或其部分组合。在本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用整体并入。尽管本发明已经参照其示例性实施方案进行了特定地阐明和描述，本领域技术人员将理解，可以在其中做出形式和细节的各种变化，而不脱离所附权利要求包括的本发明的范围。