用于在发炎病灶或区域中局部注射的脂质体皮质类固醇的制作方法

本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及局部治疗发炎病灶(lesion)或区域，例如发炎的关节、发炎的皮肤或发炎的眼睛。

背景技术：

非传染性前葡萄膜炎(au)是一组免疫相关的、威胁视力的炎性病况，其占眼科中心所见的所有葡萄膜炎病例的60％。这些患者对临床负荷有显著贡献。在全球范围内,葡萄膜炎的发病率从14至52.4/100,000不等，每10万人的年患病率为69.0至114.5。葡萄膜炎是美国高达10％的法定盲的原因，或每年约有30000例新的失明病例。在当地，在新加坡国立眼科中心的葡萄膜炎门诊每周看到多达100名葡萄膜炎患者。

au可能会有复发和缓解临床过程。长期不受控制的炎症(例如白内障、青光眼和中央视网膜肿胀)可能会发生威胁视力的眼部并发症。这些并发症导致高达25％的患者失明。

目前通常对葡萄膜炎特别是au的治疗包括强化和频繁地滴注类固醇滴眼剂，通常持续数周至数月，并且对于更严重或顽固的病例，将类固醇注射到眼睛周围的组织或眼睛本身。尽管类固醇滴眼剂在治疗中是有效的，但它们具有较差的眼睛渗透性，并且在初始治疗期间需要强化的、高达每小时的滴注以达到所需效果。它们的功效进一步受到泪液从眼睛的快速冲洗和滴眼液滴注技术的限制，这在视力不佳的患者中并不罕见。滴眼剂的这些问题通常导致对治疗的依从性差、持续性炎症和与慢性炎症相关的视力威胁性并发症。此外，向不发炎的眼组织非靶向递送类固醇可能导致类固醇相关的副作用，如白内障和青光眼。

鉴于药物在患病目标部位的保留往往很差，并且鉴于频繁施用的需要涉及患者的不适，已经在本领域中研究和开发药物递送系统，其目的在于缓慢释放包封的药物。这种缓释药物递送系统的例子是聚合物基质和装置。另外，已经描述了包括脂质体的缓释纳米颗粒。

例如，美国2011/0033468描述了包含50％至90％游离治疗剂和磷脂载体的药物递送系统，其包封治疗剂的其余部分用于治疗眼睛。将载体玻璃体内施用，即在玻璃体内施用。这种施用方式通过形成局部仓库，用于延长治疗剂在眼睛中的寿命。载体由含有不饱和脂肪酸酸的磷脂，如2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dopc)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(popc)和二油酰磷脂酰甘油(dopg)组成。这种不饱和脂质形成允许渗漏的流体磷脂膜，使得治疗剂缓慢释放到玻璃体中。美国2011/0033468的方法的缺点是不直接靶向眼睛中的炎性细胞。

美国2004/0224010描述了用于增强含有治疗剂，特别是双氯芬酸的眼科药物递送的基于脂质体的制剂。脂质体制剂靶向并粘附至角膜表面，使得药物在眼内储存。脂质体含有阳离子试剂和/或粘膜粘附性化合物，以增加眼部停留时间并使治疗剂能够持续地细胞外释放。美国2004/0224010的方法也具有不直接靶向眼睛中的炎性细胞的缺点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是通过将根据本发明的含皮质类固醇的脂质体局部施用至患有炎性病症的受试者的发炎病灶或区域来进行治疗，从而克服上述一个或多个限制。所述治疗优选包括直接靶向炎性细胞。

因此，本发明提供了由不带电荷的形成囊泡的脂质组成的脂质体，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径，并且包含水溶性皮质类固醇衍生物，用于治疗受试者的炎性病症的方法，其剂量为至多20mg皮质类固醇，优选至多15mg皮质类固醇，更优选至多10mg皮质类固醇，其中所述治疗包括局部施用至发炎病灶或区域，优选在发炎病灶或区域中局部注射，并且其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

本发明进一步提供了用于治疗有需要的受试者的炎性病症的方法，该方法包括向受试者施用由不带电荷的形成囊泡的脂质组成的脂质体，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径，并且包含水溶性皮质类固醇衍生物，其剂量为至多20mg皮质类固醇，优选至多15mg皮质类固醇，更优选至多10mg皮质类固醇，其中所述治疗包括局部施用至所述受试者的发炎病灶或区域，优选在所述受试者的发炎病灶或区域中局部注射，并且其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

在一些优选实施方式中，本发明提供了由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，其中所述磷脂包含长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径，并且包含水溶性形式的皮质类固醇，用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者的眼部炎性病症的方法，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

本发明进一步提供了治疗有需要的受试者的眼部炎性病症的方法，该方法包括通过结膜下施用，向受试者施用由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，其中所述磷脂包括长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径，并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其剂量为至多5mg皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

如下文更详细解释的，一些实施方式提供了根据本发明使用的脂质体，其中所述脂质体由以下组成：

不带电荷的形成囊泡的磷脂，其中所述磷脂含有长链饱和脂肪酸，和

任选地，不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质，和

任选地，不超过10摩尔％的peg化的脂质。

所述脂质体包含水溶性形式的皮质类固醇。

在本发明的优选实施方式中，使用脂质体药物递送载体，其不用作缓释药物递送系统。相反，用脂质体直接靶向炎性细胞，该脂质体含有具有长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成囊泡的磷脂。这些脂质体载体在体内是稳定的，随时间推移，在它们到达炎症靶细胞之前，皮质类固醇具有最小的渗漏(如果有的话)。炎性靶细胞对脂质体的摄取和随后的皮质类固醇的细胞内释放带来治疗益处。因此，在接近或在病理病灶中局部施用时，炎性靶细胞进行缓慢和选择性摄取根据本发明的脂质体，并且皮质类固醇在细胞内有效释放。

因此，本发明的优选实施方式包括向存在炎性靶细胞的区域施用根据本发明的载有皮质类固醇的脂质体，该脂质体包含具有长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成囊泡的磷脂。与局部施用现有技术的缓释药物递送系统(比如，例如美国2011/0033468和美国2004/0224010中公开的)相比，本发明提供了出人意料的观点，即，获得了改善的治疗结果，和/或需要更低的治疗频率。

在一些优选的实施方式中，根据本发明的脂质体用于通过结膜下施用来治疗受试者的眼部炎性病症的方法中。不受理论束缚，认为，当在结膜下空间注射时，根据本发明的含类固醇的脂质体被位于结膜下空间中的炎性细胞缓慢吸收，并且随后，在这些炎性细胞中选择性地实现了皮质类固醇的持续细胞内释放，本发明的发明人已经证实，单次结膜下注射根据本发明的脂质体磷酸曲安奈德(tap)，或单次结膜下注射根据本发明的脂质体磷酸泼尼松龙(plp)，可以在一个月的时间内有效地抑制最初的炎症，并且减轻复发的au的炎症反应。单次结膜下注射根据本发明的脂质体tap或plp在治疗的最初第一周中优于强化的3小时类固醇滴眼剂滴注，并且在接下来的3周内获得相似的功效。如实施例中所示，与用含有游离形式的醋酸泼尼松龙的滴眼剂强化治疗相比，单剂量的根据本发明的结膜下脂质体tap或脂质体plp出人意料地提供了更好的葡萄膜炎治疗的急性结果，并且在长期治疗中这些单剂量在抑制炎症方面与强化滴眼剂治疗同样有效。与含有游离形式的皮质类固醇的滴眼剂相比，根据本发明的脂质体制剂特别更快地起作用。此外，单剂量的脂质体制剂足以进行有效治疗。这减少了否则将不得不接受多次施用的患者的不适。根据本发明的单剂量脂质体制剂进一步出人意料地提供了即使在再次激发后也能减弱炎症反应的持续临床益处。此外，在实施例中还显示，脂质体制剂的施用与类固醇相关的副作用白内障和青光眼的关联性较小。总之，根据本发明的载有皮质类固醇的脂质体直接靶向炎性靶细胞，该脂质体含有具有长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成囊泡的磷脂，与现有技术的局部施用方案相比，带来改善的治疗结果，和/或需要治疗频率更低，和/或副作用更小。

通过结膜下施用而施用的根据本发明的优选含皮质类固醇的脂质体由以下组成：

包含长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成泡囊的磷脂，其优选地选自由二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、氢化蛋磷脂酰胆碱(hepc)及其组合组成的组中，和

任选地，不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或peg化的脂质。

在一些实施方式中，所述脂质体通过结膜下注射来施用。

在诸如葡萄膜炎的眼部炎性病症中，炎性细胞位于结膜下空间中，因此结膜下施用直接将脂质体靶向炎性细胞。脂质体由包含长链饱和脂肪酸的磷脂组成的事实确保了脂质体由于脂质双层的高转变温度而是相对刚性的。结果，在被靶炎性细胞吸收之前，皮质类固醇从脂质体中的渗漏最小。一旦脂质体被炎性细胞吸收并且在细胞内降解，最可能通过溶酶体降解途径，皮质类固醇就会释放出来。因此，由于施用途径和脂质体的组成，皮质类固醇从脂质体中细胞内释放出来，优选在驻留在眼睛的结膜下空间的炎性细胞中释放。这样，脂质体非常有效地抑制眼睛的炎症反应。

如本文所使用，术语“长链脂肪酸”(lcfa)是指具有至少13个碳原子的脂肪族尾部的脂肪酸。优选地，这种长链饱和脂肪酸具有至少13个碳原子和至多21个碳原子。lcfa的非限制性例子为棕榈酸。当脂肪酸在碳原子之间没有双键时，脂肪酸是“饱和的”。

由不带电荷的形成囊泡的脂质组成的脂质体，任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性皮质类固醇衍生物，以及由包含长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，在本文中也称为“用于根据本发明的方法的脂质体”或称为“根据本发明的脂质体”或称为“如本文所述的脂质体”。

包含这种脂质体的药物组合物在本文称为“用于根据本发明的方法的药物组合物”或“包含如本文所述的脂质体的药物组合物”。

如本文所使用，术语“受试者”包括人和动物，优选哺乳动物。优选地，受试者为哺乳动物，更优选为人。

术语“治疗”是指抑制病症，特别是抑制炎症，即停止或减少其发展或其至少一种临床症状，和/或缓解病症的至少一种临床症状。

如本文所使用，“炎性病症”还意指包括炎性疾病和炎性病况。

在根据本发明的方法中，将本文所述的脂质体或包含这种脂质体的药物组合物局部施用至有需要的受试者(优选人)的发炎病灶或区域。在一些实施方式中，根据本发明的治疗包括在所述受试者的发炎病灶或区域中局部注射。优选地，根据本发明的治疗是通过结膜下施用，优选通过结膜下注射。“局部注射”是指使用针局部施用。在本发明的方法或用途中，脂质体局部，优选通过注射，施用到发炎病灶或区域中。例如，如果炎性病症是关节炎，优选骨关节炎，则优选将脂质体注射到发炎的关节中，最优选通过关节内注射。如果炎性疾病是眼部炎性病症，则将脂质体施用至眼睛。在这种情况下，脂质体优选施用至结膜，以直接靶向炎性细胞。如果炎性病症是炎性皮肤病，则优选将脂质体注射到发炎的皮肤中。因此，优选的发炎区或区域是发炎的关节、发炎的皮肤或发炎的眼睛。优选的施用方式是眼部炎性病症例如葡萄膜炎和结膜炎的结膜下注射。结膜下注射是指在眼睑内侧排列并覆盖巩膜的结膜下方注射。

如本文所使用，“治疗频率”是指用于根据本发明的方法的脂质体(或包含该脂质体的药物组合物)的施用频率。例如，每两周一次的治疗频率意味着每两周一次向患者施用药物组合物，即，将两次不同剂量的施用间隔为约两周。在临床实践中，这可以是两周加或减一天或两天。至多每两周一次的治疗频率表示将药物组合物每两周向患者施用一次或更不经常，例如每三周一次，或每四周一次，或仅作为单次剂量治疗一次。因此，就治疗频率为至多每两周一次，两次剂量之间的时间为至少两周，或者根本不施用第二次剂量。如本文所述的药物组合物的单独和单一的施用也包括在术语“至多每两周一次的治疗频率”内。优选地，根据本发明的治疗是治疗频率为至多每月一次的治疗，这意味着两次剂量之间的时间是至少一个月，或者根本不施用第二次剂量。在特别优选的实施方式中，根据本发明的治疗包括施用根据本发明的单剂量的脂质体，其中所述剂量为水溶性形式的至多10mg皮质类固醇。优选地，所述单剂量为水溶性形式的至多5mg皮质类固醇。在一些实施方式中，所述剂量为水溶性形式的至多2.5mg，或至多1.5mg，或至多1mg，或至多0.5mg皮质类固醇。

根据本发明，包含用于根据本发明的方法的脂质体的药物组合物的剂量为至多10mg皮质类固醇。“至多xmg皮质类固醇的剂量”意指每次，即每次单一施用脂质体，至多xmg皮质类固醇。例如，“至多10mg皮质类固醇的剂量”意指每次，即每次单一施用脂质体，至多10mg皮质类固醇。所述剂量优选为至多5mg皮质类固醇。

具体地，如果病症是手术后的眼科病症或眼部炎症，则可以施用的体积通常为至多0.5ml。由于皮质类固醇的最大浓度通常为10mg/ml，因此至多0.5ml的体积通常含有至多5mg皮质类固醇。因此，如果病症是手术后的眼科疾病或眼部炎症，则剂量优选为至多5mg皮质类固醇。在一些实施方式中，所述皮质类固醇选自由磷酸泼尼松龙、磷酸地塞米松、磷酸曲安西龙及其组合组成的组中。

此外，如果病症是关节炎疾病或炎性皮肤病，则可以施用的体积通常为至多2ml。因此，如果病症是关节炎疾病或炎性皮肤病，则剂量优选为至多20mg皮质类固醇。在一些实施方式中，所述剂量为至多15mg皮质类固醇。在一些实施方式中，所述剂量为至多10mg皮质类固醇，优选至多7.5mg皮质类固醇，更优选至多5mg皮质类固醇。

优选地，根据本发明使用的脂质体包含在药物组合物中。配制该药物组合物用于局部施加至发炎病灶或区域。因此，进一步提供了由不带电荷的形成囊泡的脂质组成的脂质体用于制备治疗受试者炎性病症的药剂的用途，其剂量为至多20mg皮质类固醇，优选至多15mg皮质类固醇，更优选至多10mg皮质类固醇，所述脂质任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性皮质类固醇衍生物，其中所述治疗包括在发炎病灶或区域中局部注射，并且其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

一些优选的实施方式提供了由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，用于制备用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者眼部炎性病症的药剂的用途，其中所述磷脂包含长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。包含根据本发明的脂质体的药物组合物优选进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。优选地，这种药物组合物包含在水溶液或水凝胶中的脂质体，例如乙酰透明质酸。

通过使用malverndls测量激光设备进行动态光散射测定，用于根据本发明的方法的脂质体具有40nm至200nm的平均颗粒直径。优选脂质体具有75nm和150nm之间的直径。脂质体优选具有相当低的多分散指数，即低于0.2，这意味着粒度分布窄。

根据本发明使用的脂质体通常包含来自磷脂组的不带电荷的形成囊泡的脂质，其可为人工合成的或源自天然来源，任选地是人工修饰的。优选地，所述不带电荷的形成囊泡的脂质是部分或全部合成的。磷脂酰胆碱(pc)，包括从天然来源获得的那些或部分或全部合成的那些，适用于本发明。如本文所使用，术语“部分合成或完全合成的形成囊泡的磷脂”意指至少一种形成囊泡的磷脂，其已经人工制成或源自天然存在的磷脂，其已被人工修饰。优选的磷脂含有长链饱和脂肪酸，因为它们产生具有相对高转变温度的双层。如前文所述，这具有以下优点：在被靶炎性细胞吸收之前，皮质类固醇从脂质体中的渗漏最小。在靶炎性细胞摄取脂质体后，与现有技术的缓释递送载体相比，皮质类固醇从脂质体细胞内释放，导致改善的治疗结果和/或需要更低的治疗频率。

在一些实施方式中，根据本发明的脂质体的至少80％的磷脂包含长链饱和脂肪酸。在更优选的实施方式中，根据本发明的脂质体的至少85％的磷脂包含长链饱和脂肪酸。更优选地，根据本发明的脂质体的至少90％的磷脂包含长链饱和脂肪酸。更优选地，根据本发明的脂质体的至少95％的磷脂包含长链饱和脂肪酸。更优选地，根据本发明的脂质体的至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的磷脂包含长链饱和脂肪酸。含有长链饱和脂肪酸的磷脂的百分比越高，脂质双层的转变温度越高，并且脂质体的刚性越大。在一些实施方式中，根据本发明的脂质体的所有磷脂都含有长链饱和脂肪酸。

因此，一些实施方式提供由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者眼部炎性疾病的方法，其中至少80％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。优选地，至少85％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少90％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少95％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少96％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少97％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少98％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少99％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。

进一步提供了用于治疗有需要的受试者的眼部炎性疾病的方法，该方法包括以至多5mg皮质类固醇的剂量，通过结膜下施用向受试者施用由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，其中至少80％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

进一步提供了由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，用于制备用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者的眼部炎性疾病的药剂的用途，其中至少80％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。如上所述，优选至少85％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少90％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少95％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少96％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少97％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少98％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。更优选地，至少99％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸。

一些实施方式提供由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者的眼部炎性病症的方法，其中所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

进一步提供了治疗有需要的受试者的眼部炎性疾病的方法，该方法包括以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用向受试者施用由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，其中所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

进一步提供了由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，用于制备用于以至多5mg皮质类固醇的剂量通过结膜下施用来治疗受试者的眼部炎性病症的药剂的用途，其中所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，所述脂质体任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质和/或不超过10摩尔％的peg化的脂质，所述脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并且包含水溶性形式的皮质类固醇，其中所述治疗具有至多每两周一次的治疗频率。

特别优选的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)和氢化蛋磷脂酰胆碱(hepc)。用于根据本发明的方法的脂质体包含至多10摩尔％的peg化的脂质和/或至多10摩尔％的带负电荷的脂质。优选的peg化的脂质由一端上分子量为200至20000道尔顿的peg聚合物和另一端上的亲脂性锚定分子组成。通常，锚定分子选自磷脂和固醇的组中。优选的peg化的脂质为peg2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)和peg2000-胆固醇。优选的带负电荷的脂质为二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)和二硬脂酰基磷脂酰甘油(dspg)。用于根据本发明的方法的脂质体进一步优选地包含合成或天然来源的固醇或类固醇，其在a-环的3-位具有羟基。在这组固醇化合物中，优选胆固醇。

基于制剂中形成囊泡的脂质的总摩尔比，聚合物脂质缀合物和带负电荷的脂质的比例为0mol％至10mol％，优选1mol％至10mol％，更优选2.5mol％至10mol％。如果在脂质体制剂中存在带负电荷的脂质，尤其是聚合物-脂质-缀合物，则制剂将是物理稳定的。然而，通过在物理规范上仔细选择特定的脂质组合物，可以在不使用peg-脂质-缀合物或带负电荷的脂质的情况下获得物理稳定性。例如，dspc和胆固醇和/或鞘脂如鞘磷脂的50nm至100nm脂质体适用于根据本发明的方法。

在特别优选的实施方式中，本发明提供了用于根据本发明的用途或根据本发明的方法的脂质体，其中所述脂质体包含：

0mol％至50mol％的胆固醇，

50mol％至90mol％的不带电荷的部分合成或完全合成的形成囊泡的脂质，其优选为具有长链饱和脂肪酸的不带电荷的形成囊泡的磷脂，

0mol％至10mol％的与聚乙二醇偶联的两亲性的形成囊泡的脂质，和

0mol％至10mol％的带负电荷的形成囊泡的脂质。

例如，这种脂质体为根据wo02/45688或wo03/105805中描述的方法所制备。然而，其中没有描述根据本发明的剂量和治疗频率以及实施方式。用于根据本发明的方法的脂质体优选具有尺寸范围为约75nm和150nm之间的平均颗粒直径。如前所述，所述部分合成或完全合成的形成囊泡的脂质优选地选自由dspc、dppc、hspc、hepc及其组合组成的组中。

用于根据本发明的方法的脂质体的具体例子为：

由不带电荷的形成囊泡的脂质(优选不带电荷的形成囊泡的磷脂，其中至少90％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸)组成的脂质体，包含高达10摩尔％的用聚乙二醇衍生的两亲性的形成囊泡的脂质，和任选地包含不超过10摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质，该脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并含有皮质类固醇，其特征在于皮质类固醇以水溶性形式存在；

由胆固醇和不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，该磷脂选自由dspc、hspc、hepc、dppc及其组合组成的组中，该脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并含有皮质类固醇，其特征在于皮质类固醇以水溶性形式存在；

由选自dspc、hspc、hepc、dppc及其组合组成的组中的不带电荷的形成囊泡的磷脂组成的脂质体，该脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并含有水溶性形式的皮质类固醇；

由不带电荷的形成囊泡的脂质(优选不带电荷的囊泡形成的磷脂，其中至少90％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸)和不超过5摩尔％的带负电荷的二棕榈酰磷脂酰甘油组成的脂质体，该脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并含有皮质类固醇，其特征在于皮质类固醇以水溶性形式存在；

由胆固醇和不带电荷的形成囊泡的脂质组成的脂质体，该脂质选自部分或全部合成的磷脂(优选不带电荷的形成囊泡的磷脂，其中至少90％的所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸)，任选地包括不超过5摩尔％的带负电荷的形成囊泡的脂质，该脂质体具有尺寸范围为40nm至200nm的选定平均颗粒直径并含有皮质类固醇，其特征在于皮质类固醇以水溶性形式存在。

如所述，根据本发明使用的脂质体可以根据常规脂质体或peg-脂质体的制备中使用的方法制备，例如wo02/45688或wo03/105805中公开的方法。通过将水溶性皮质类固醇溶解在水相中，将活性成分被动负载到脂质体中足以达到足够的包封，但是也可以使用其他方法，以进一步提高包封效率。用于形成脂质体的脂质组分可选自各种形成囊泡的脂质，例如磷脂、鞘脂和固醇。可以用例如鞘磷脂和麦角固醇替换(完全或部分)这些基本组分。为了有效地包封脂质体中的水溶性皮质类固醇，从而避免药物从脂质体中渗漏，尤其是具有饱和的、硬化的酰基链的磷脂组分似乎是有用的。

在一些实施方式中，本发明包括脂质体的用途，所述脂质体主要由不带电荷的形成囊泡的磷脂组成，其中所述磷脂的脂肪酸是长链饱和脂肪酸，并且其中所述脂质体还包含少量具有不饱和脂肪酸的磷脂，只要这些脂质体保持其体内稳定性，确保在脂质体被靶炎性细胞吸收之前皮质类固醇从脂质体中的渗漏最小。具有不饱和脂肪酸的磷脂的百分比(基于这些脂质体中磷脂的总量)为至多20％，优选至多15％，更优选至多10％，更优选至多8％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，更优选至多2％，更优选至多1％。如前所述，长链饱和脂肪酸的百分比越高，脂质双层的转变温度越高，并且脂质体的刚性越大。

用于根据本发明的方法的脂质体组合物包含水溶性形式的皮质类固醇，其在本文中也称为水溶性皮质类固醇。这种水溶性皮质类固醇包括天然可溶于水的皮质类固醇，以及水溶性皮质类固醇衍生物。术语“水溶性”在本文中定义为在25℃的温度下具有至少10g/l水或在中性ph下缓冲的水的溶解度。根据本发明可有利地使用的水溶性皮质类固醇是由具有游离羟基的皮质类固醇以及有机酸比如(c2-c12)脂肪族饱和和不饱和二碳酸，和无机酸比如磷酸和硫酸制备的碱金属和铵盐。作为碱金属盐，优选钾盐和钠盐。如本文所用的“皮质类固醇衍生物”是指皮质类固醇或其衍生物。这种衍生物是化学修饰的皮质类固醇，优选通过酯化。根据本发明的优选皮质类固醇衍生物为皮质类固醇的水溶性磷酸酯、琥珀酸酯和硫酸酯。还可以使用其他水溶性、带正电荷或带负电荷的皮质类固醇衍生物。根据本发明可应用的水溶性皮质类固醇衍生物的非限制性例子为倍他米松磷酸钠、地奈德磷酸钠、地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、甲基泼尼松龙磷酸二钠、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙琥珀酸钠、盐酸泼尼松酯、泼尼松龙磷酸二钠、泼尼松龙琥珀酸钠、曲安奈德磷酸二钠。最优选的是泼尼松龙磷酸钠、地塞米松磷酸钠和曲安奈德磷酸钠。

可以用根据本发明的脂质体组合物成功治疗的炎性病症的例子是以局部炎性病灶或区域为特征的炎性病症。这种病症的例子为炎性眼部病症，例如葡萄膜炎、黄斑水肿和结膜炎；关节炎疾病，例如骨关节炎；手术，例如白内障手术或视网膜剥离手术后的眼部炎症；以及炎性皮肤病，例如牛皮癣和特应性皮炎。因此，在优选的实施方式中，炎性病症选自由炎性眼部病症、关节炎病症、手术后的眼部炎症和炎性皮肤病组成的组中，更优选地，所述病症选自由葡萄膜炎、黄斑水肿、结膜炎、骨关节炎、白内障手术或视网膜剥离手术后的眼部炎症、牛皮癣和特应性皮炎组成的组中。优选地，用根据本发明的方法治疗的炎性病症为关节炎病症，优选骨关节炎，或炎性眼部病症，更优选葡萄膜炎或结膜炎，最优选葡萄膜炎。本文所用的“葡萄膜炎”包括所有类型的葡萄膜炎，包括前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎和后葡萄膜炎。在优选的实施方式中，所述葡萄膜炎是前葡萄膜炎。

出于清楚和简要描述的目的，本文可以将特征描述为本发明的相同或单独的方面或实施方式的一部分。本领域技术人员将理解，本发明的范围可包括具有本文描述的全部或一些特征的组合作为相同或单独的实施方式的一部分的实施方式。

在以下非限制性实施例中将更详细地解释本发明。

附图说明

图1：综合前段炎症评分的平均变化

(归一化至第3天的最大炎症)。

在第3天开始治疗，用一次结膜下注射脂质体磷酸泼尼松龙(lpp)，对照pbs(c)、游离磷酸泼尼松龙(fpp)或脂质体磷酸曲安奈德(ltap)。在第3天开始滴眼剂治疗(ed)，每天q3h/4滴，直至第16天。

图2：第11天的裂隙灯和眼底照片。与用脂质体ta治疗的眼睛相比，对照眼具有更大的虹膜充血、前房细胞和闪辉。对照眼中玻璃体浑浊度稍差。

图3：组织学。利用he染色，对照眼(发炎)和治疗眼之间的差异是可见的，并通过免疫染色证实。

图4：不同治疗组和对照组中的白内障形成。

lpp：脂质体磷酸泼尼松龙

ltap：脂质体磷酸曲安西龙

fpp：游离磷酸泼尼松龙

edn：在非发炎眼中使用外用百力特(predforte)l％q3h进行滴眼剂治疗

ed：在发炎眼中使用外用百力特l％q3h进行滴眼剂治疗

对照：pbs

图5：不同治疗组和对照组中的眼内压(iop)。

lpp：脂质体磷酸泼尼松龙

ltap：脂质体磷酸曲安西龙

fpp：游离磷酸泼尼松龙

edn：在非发炎眼中使用外用百力特l％q3h进行滴眼剂治疗

ed：在发炎眼中使用外用百力特l％q3h进行滴眼剂治疗

c：对照pbs

实施例

方法

预免疫

进行皮下注射悬浮在矿物油(500ul)中的结核分枝杆菌h37ra抗原(10mg；difco，detroit，mi)作为预免疫(ghosn等，2011)。一周后，在另一个部位进行第二次注射相同量的皮下抗原。一周后，注射部位出现可见的皮肤结节，证实预免疫成功。

实验性葡萄膜炎的诱导

在第0天，在预免疫的兔子中通过单侧玻璃体内注射诱导实验性葡萄膜炎(第二次预免疫后7天)。通过腹腔内注射盐酸氯胺酮(35mg/kg至50mg/kg)和xylazil(5mg/kg至10mg/kg)来麻醉兔子。在用1％的丁卡因(amethocaine)进行局部麻醉后，用5％聚维酮碘对每只兔子的右眼进行消毒。使用具有31号针头的hamilton注射器通过距角膜缘1.5mm的颞上侧巩膜将悬浮在无菌盐水(50ug；lug/ul)中的结核分枝杆菌h37ra抗原进行玻璃体内注射。在该操作结束时滴注一滴妥布霉素。为了模拟葡萄膜炎的复发，我们按照上述操作在第8天再次诱导实验性葡萄膜炎。临床监测眼睛30天，并由2名不知情的调查员对眼睛炎症进行分级。

干预

将兔子随机分为4个干预组，诱导葡萄膜炎后3天：1组接受单剂量的0.1ml结膜下注射脂质体曲安西龙磷酸钠(ltap)(4mg/ml)(n＝6)，1组接受单剂量的0.1ml结膜下注射脂质体泼尼松龙磷酸钠(lpp)(4mg/ml)(n＝5)，1组接受单剂量的0.1ml结膜下注射磷酸泼尼松龙(fpp)(4mg/ml)，并且1组接受用外用百力特l％q3h滴眼剂治疗；每天4滴施用2周(ed)(n＝5)。第五组接受单剂量的结膜下注射pbs(对照组(c)；未治疗)(n＝5)。

脂质体纳米颗粒由摩尔比为62％、33％和5％的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、胆固醇和peg2000二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)组成(对于脂质体纳米颗粒制备：参见lobatto等，2015的第1134页)。

在注射之前，通过腹膜内注射盐酸氯胺酮(35mg/kg至50mg/kg)和xylazil(5mg/kg至10mg/kg)来麻醉兔子。在用1％的丁卡因进行局部麻醉后，用5％聚维酮碘对每只兔子的右眼进行消毒。使用具有31号针头的hamilton注射器来递送0.1ml治疗的单次注射。在注射结膜下类固醇后，局部施用妥布霉素，每天4次，持续5天。

临床检查

临床检查由2名不知情的独立调查员进行。在葡萄膜炎诱导之前和之后的8个确定时间点(第0、1、3、4、8、9、11、16、24和31天)进行裂缝灯生物显微镜检查、使用tonopen测量眼内压、使用20d镜头双目间接检眼镜进行前段摄影和扩张眼底检查。通过评估前房细胞/闪辉、玻璃体浑浊和虹膜血管来对葡萄膜炎的临床严重程度评分。这些临床评分系统已在先前的文献中描述(nussenblatt等，1985；bloch-michel&nussenblatt，1987)。综合前段炎症评分定义为虹膜血管、前房细胞和前房闪辉的评分之和。在第31天裂隙灯生物显微镜检查确定白内障的存在并进行，并根据locs量表进行分级。

实验时间表：

摘除、安乐死和病理程序

在30天的研究期结束时对所有兔子实施安乐死。用腹膜内戊巴比妥(60mg/kg至150mg/kg)进行安乐死，然后摘除操作的眼睛。

组织病理学和免疫组织化学

将眼睛包埋在石蜡中或在荧光脂质体的情况下直接冷冻。

对于石蜡，将整个兔眼摘除并在10％中性缓冲福尔马林溶液(leicasurgipath，leicabiosystemsrichmond，inc.)中固定24小时。然后，在增加乙醇浓度中脱水之前将整个兔眼切割成前段和后段，在二甲苯中清理，并包埋在石蜡中(leica-surgipath，leicabiosystemsrichmond，inc.)。用旋转切片机(rm2255，leicabiosystemsnusslochgmbh,德国)切割5微米切片，并收集在polysine^tm显微镜载玻片(gerhardmenzel，thermofisherscientific，newington，ct)上。将切片在37℃的烘箱中干燥至少24小时。为了制备用于组织病理学和免疫组织化学检查的切片，将切片在60℃热板上加热，在二甲苯中脱蜡并在降低的乙醇浓度下再水合。

对于冷冻的眼，将整个兔眼在-20℃下，在最佳切割温度(oct)化合物中包埋1小时。用低温恒温器(hm550，thermofisherscientificmicrominternationalgmbh,德国)切割6微米切片，并收集在polysine^tm显微镜载玻片(gerhardmenzel，thermofisherscientific，newington，ct)上。将切片在室温(rt)下风干1小时。

进行苏木精和伊红(h&e)的标准方法。使用光学显微镜(axioplan2；carlzeissmeditecgmbh，oberkochen，德国)检查载玻片并拍摄图像。

平行地，进行免疫荧光染色。对于石蜡，通过将切片在柠檬酸钠缓冲液(10mm柠檬酸钠，0.05％tween20，ph6.0)中于95℃至100℃下温育20分钟来进行热诱导的抗原修复。然后，将切片在柠檬酸钠缓冲液中在室温下冷却20分钟，并用1xpbs洗涤3次，每次5分钟。对于冷冻样品，将切片在1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的4％多聚甲醛(pfa)中固定10分钟，并用1xpbs洗涤3次，每次5分钟。

用0.1％tritonx-100和1xpbs中5％牛血清白蛋白(bsa)的封闭液在室温下在加湿室中阻断非特异性位点1小时。然后，用1xpbs简单冲洗载玻片。应用表1中所示的特异性一抗，并在4℃下在封闭液中制备的加湿室中温育过夜。用1xpbs洗涤两次并用含有0.1％tween的1xpbs洗涤一次每次10分钟之后，在封闭液中以1:1000的浓度应用alexa488/594缀合的荧光素标记的山羊抗兔igg二抗(invitrogen-molecularprobes，eugene，or)，并在室温(rt)下温育90分钟。

然后，将载玻片用1xpbs洗涤两次并用含有0.1％tween的1xpbs洗涤一次，每次5分钟，将载玻片放置在具有用延长金刚石抗褪色dapi5放置介质(prolongdiamondanti-fadedapi5mountingmedia)(invitrogen-molecularprobes，eugene，or)的载玻片上以使细胞核酸可见。对于阴性对照，省略了一抗。使用共聚焦显微镜系统(nikona1r+siconfocalmicroscope)来捕获高分辨率图像。对于四种抗体，重复实验一次。

表1.抗体

结果测量：

虹膜充血(0-3)，前房细胞(0-4)，闪辉(0-3)，玻璃体浑浊(0-4)。

综合前段炎症评分＝虹膜充血、前房细胞和闪辉的总和。

组织学和免疫组织化学染色：h&e，cd3，cd4，cd45。

结果

炎症评分

表2显示了平均综合前段炎症评分。结膜下注射后1天，脂质体磷酸泼尼松龙(pp)组的综合前段炎症评分显著低于对照组(5.4±1.5vs8.4±1.7，p＝0.049)，并且也显著低于滴眼剂组(p＝0.033)。这种差异持续直至初始干预后5天，两个脂质体组(脂质体pp和脂质体磷酸曲安西龙(ta)组分别为2.6±2.1，p＝0.019和3.3±2.5，p＝0.024)表明了综合前段炎症评分显著低于对照组(7.2±2.2)。在玻璃体内tb抗原再激发3天后的第11天，脂质体pp比对照获得更大的反弹炎症减弱(4.7±2.6vs8.5±1.3，p＝0.041)。单次剂量的结膜下脂质体pp或ta在治疗后2周内持续抗炎，类似于每日滴注百力特，每天4次，持续2周(脂质体pp和ta分别为5.0±2.8和5.0±1.0，vs滴眼液为4.6±1.3，p>0.05)。

图2显示了第11天的裂隙灯和眼底照片。

表2.炎症评分

值来自单向anova，比较组间的平均综合前段炎症评分。

*在多重比较的邦弗朗尼(bonferroni)校正后，脂质体pp与对照组的成对比较，p＝0.049，以及与滴眼液的成对比较，p＝0.033。

**在多重比较的邦弗朗尼校正后，脂质体pp与对照之间的成对比较，p＝0.007，以及脂质体ta与对照之间的成对比较，p＝0.019。

***在多重比较的邦弗朗尼校正后，脂质体pp与对照之间的成对比较，p＝0.041。

脂质体类固醇对白内障形成和眼内压(iop)的影响：

白内障形成

总体而言，11只兔子发生了后囊下白内障。没有观察到其他白内障亚型。治疗组之间白内障形成率无显著差异(p＝0.185)，但对照组、滴眼剂和结膜下游离磷酸泼尼松龙组的比率呈上升趋势。组之间白内障的严重程度无显著差异。在施用醋酸泼尼松龙1％滴眼剂(edn)的对侧眼中未见白内障。结果如图4所示。

眼内压(iop)

治疗组之间的iop无显著差异。在实验期间任何时候都没有兔子iop升高>21。结果如图5所示。

组织学：

利用he染色，对照眼(发炎)和治疗眼之间的差异明显，并通过免疫染色证实(图3)。

结果总结

本研究旨在评估结膜下注射脂质体类固醇用于治疗实验性前葡萄膜炎的疗效，我们的主要临床发现如下：1.与滴眼剂相比，这些脂质体类固醇表现出强烈的初始抗炎作用以及强的反弹炎症的减弱；2.单剂量的这些脂质体类固醇实现了持续的抗炎效果，类似于每天滴眼剂施用2周；3.与游离类固醇相比，这些脂质体类固醇表现出持续的抗炎作用。同时，临床疗效通过组织学分析得到了很好的证实，并且我们观察到脂质体与睫状体的共定位，表明脂质体靶向递送至炎性细胞。最后，我们观察到脂质体类固醇对iop或白内障形成没有不利影响。

参考文献

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