血管钙化的治疗的制作方法

本发明涉及血管钙化，并且具体涉及用于治疗与过度和/或不当的血管钙化相关的疾病的化合物。本发明尤其涉及治疗中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化。本发明涉及治疗过度和/或不当(即中膜性(medial))血管钙化的药物组合物和方法。

背景技术：

血管钙化与一系列疾病有关，并且可以大致分为三种不同的类型，即(1)内膜性(intimal)动脉粥样硬化钙化，其为内膜性的钙化，并且包括动脉粥样硬化和相关的炎症；(2)瓣膜钙化主动脉瓣狭窄，其为主动脉瓣的钙化；和(3)动脉中膜性钙化，其为中膜的钙化，见demer和tintut“vascularcalcification”，circulation，2008；117，2938-2948。

中膜是动脉或静脉的中间层，并且由平滑肌细胞和弹性组织组成。如图28a所示，动脉粥样硬化钙化是偏心的并且导致管腔变形。管腔的变形是由脂蛋白沉积3引起的，由于负载有胆固醇的白细胞(泡沫细胞)，被纤维内膜性帽4覆盖。钙化1发生在整个动脉粥样硬化病变中，包括在帽4中，并且局灶性弹性蛋白溶解2发生在与脂蛋白沉积3相邻的中膜中。血管硬化是由动脉粥样硬化钙化引起的。

相反，如图28b所示，中膜性钙化是同心的。因此，钙化1和弹性蛋白分解在整个中膜中发生。血管硬化也是由中膜性钙化引起的。

在分子水平上，钙化是矿物颗粒形成和结合到细胞外基质中。过去20年的工作证实，血管钙化是一种细胞介导的过程，与发育性骨/软骨形成相似。钙化导致基质变硬，这对骨骼是必需的，但对血管组织的机械性质具有不利影响。

门克伯格氏动脉硬化(arteriosclerosis)，也称为中膜性钙化硬化，是最常见的中膜性钙化种类。此外，钙性尿毒症性小动脉病(cua)，也称为钙化防御，是一种严重的病态和危及生命的中膜性血管钙化形式，其导致皮肤坏死和脂膜炎。

由血管钙化引起的主动脉和动脉弹性减小会损害心血管血流动力学。这可导致高血压、主动脉瓣狭窄、心脏肥大、心肌和下肢缺血以及充血性心力衰竭。尤其，血管钙化是心血管疾病的主要危险因素。

血管钙化通常还与i型糖尿病、ii型糖尿病、慢性肾病、衰老、甲状旁腺功能亢进(hyperpathyreoidism)、维生素d病症、维生素k缺乏、骨质疏松症、川崎病、cd73缺乏引起的动脉钙化(acdc)、婴儿全身性动脉钙化(gaci)、特发性基底神经节钙化(ibgc)、弹性假黄色瘤(pxe)、类风湿性关节炎、辛-梅二氏综合征(singleton-mertendysplasia)、β-地中海贫血和华法林使用有关。

因此，需要可用于治疗、预防或改善与过度和/或不当的血管钙化，和尤其中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化相关的疾病的化合物。

如实施例中所述，发明人已经证明，一系列用作聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂和四环素类抗生素的化合物可用于减少中膜性血管钙化。

技术实现要素：

因此，根据本发明的第一方面，提供了聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂和/或四环素，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，用于治疗、预防或改善中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化。

根据本发明的第二方面，提供了治疗、预防或改善受试者的中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂和/或四环素，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

有利地，实施例显示parp抑制剂和/或四环素以剂量依赖性方式抑制钙化。此外，实施例显示parp抑制剂和/或四环素抑制中膜中存在的平滑肌细胞的钙化。因此，优选地，parp抑制剂和/或四环素抑制中膜中存在的平滑肌细胞的钙化。优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善动脉中膜性钙化。

优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善中膜性血管钙化。

优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善选自由下述组成的组中的疾病：门克伯格氏动脉硬化；和钙性尿毒症性小动脉病(cua)。

优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善患有下述疾病的受试者的中膜性血管钙化：慢性肾病、糖尿病、衰老、甲状旁腺功能亢进、高磷血症、维生素d病症、维生素k病症、骨质疏松症、川崎病、cd73缺乏引起的动脉钙化(acdc)、婴儿全身性动脉钙化(gaci)、特发性基底神经节钙化(ibgc)、弹性假黄色瘤(pxe)、类风湿性关节炎、辛-梅二氏综合征和/或β-地中海贫血。优选地，慢性肾病是终末期肾病。糖尿病可为i型糖尿病。优选地，糖尿病是ii型糖尿病。优选地，维生素d病症是维生素d毒性。优选地，维生素k病症是维生素k缺乏症。

优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善正在服用华法林的受试者的中膜性血管钙化。

优选地，parp抑制剂和/或四环素不用于治疗、预防或改善瓣膜钙化的主动脉瓣狭窄，例如主动脉瓣的钙化。可选地，parp抑制剂和/或四环素可用于治疗、预防或改善内膜性动脉粥样硬化钙化。

发明人注意到，动脉粥样硬化钙化需要血管平滑肌细胞的成骨分化，换句话说，动脉粥样硬化钙化发生之前血管细胞的特定转化。由于这个原因，存在从不钙化的动脉粥样硬化斑块(无论它们有多么糟糕)，同样存在在血管损伤早期钙化的其他斑块。因此，钙化不是动脉粥样硬化的必然部分，并且仅由选定的一组患者遭受。导致动脉粥样硬化钙化的细胞转化的原因尚不清楚，但是推测，可防止动脉粥样硬化钙化的控制机制通常可在导致动脉粥样硬化钙化的某些患者中发生故障。

可使用计算机断层摄影术(ct)扫描来识别患有动脉粥样硬化钙化的患者。ct扫描可用于计算患者的盖斯顿评分(agatstonscore)，即源自斑块密度及其在所有冠状动脉中的面积的伪连续变量。因此，盖斯顿评分为0的患者没有冠状动脉钙化。优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗盖斯顿评分为至少20、更优选至少40、至少60或至少80、最优选至少100的患者的动脉粥样硬化钙化。

斑块结构应力最初随着早期斑块钙化而增加，并且可导致斑块破裂，这可能接着导致心脏病发作。因此，parp抑制剂和/或四环素用于治疗在动脉粥样硬化中表现出早期钙化的患者的动脉粥样硬化钙化。可以使用虚拟组织学血管内超声(vh-rvtjs)获得患者血管系统的图像，并且可以从中识别出表现出早期钙化的患者。

因此，发明人已经鉴定出一种新的患者组，即可使用parp抑制剂成功治疗的患有动脉粥样硬化钙化的患者。发明人注意到他汀类药物通常用于治疗动脉粥样硬化。然而，如实施例9中所示，他汀类药物本身不治疗钙化，因此不能使用他汀类药物治疗动脉粥样硬化钙化。事实上，有证据表明，使用他汀类药物可使内膜性钙化增加。因此，本发明允许使用parp抑制剂特异性和有目的地治疗新的患者组。

优选地，parp抑制剂和/或四环素用于治疗、预防或改善患有高血压、主动脉瓣狭窄、心脏肥大、心肌和下肢缺血以及充血性心力衰竭的受试者的动脉粥样硬化钙化。

parp抑制剂可以选自由下述组成的组中：奥拉帕尼(olaparib)；鲁卡帕尼(rucaparib)；尼拉帕尼(niraparib)；维利帕尼(veliparib)；他拉唑帕尼(talazoparib)；米诺环素；西洛他唑；n-(6-氧-5,6-二氢菲啶-2-基)-(n,n-二甲基氨基)乙酰胺盐酸盐(pj34)；3-氨基苯甲酰胺(3-ab)；和3,4-二氢-5-[4-(1-哌啶基)丁氧基]-1(2h)-异喹啉酮(dpq)或其衍生物。

优选地，parp抑制剂能够抑制哺乳动物细胞产生的parp。

优选地，parp抑制剂包括奥拉帕尼；鲁卡帕布；尼拉帕尼；维利帕尼；他拉唑帕尼；米诺环素；或西洛他唑；或其衍生物。可选地，parp抑制剂包括pj34；米诺环素；3-ab；或dpq。

米诺环素的衍生物可具有通式[ii]：

其中，每个r3是c1-3烷基。

维利帕尼的衍生物可具有通式[iii]：

其中，r4是c1-3烷基；且

r5和r6与它们所键合的碳原子一起形成五元或六元杂环基。

优选地，r4是甲基。优选地，r5和r6与它们所键合的碳原子一起形成五元杂环基。更优选地，杂环基是吡咯烷或四氢呋喃。

尼拉帕尼的衍生物可具有通式[iv]：

其中，l1是六元芳基或杂芳基；且

r7和r8与它们所键合的碳原子一起形成五元或六元杂环基。

优选地，l1是苯基。优选地，l1在对位被取代。优选地，r7和r8与它们所键合的碳原子一起形成六元杂环基。更优选地，杂环基是哌啶、四氢吡喃或噻烷(thiane)。

鲁卡帕尼的衍生物可具有通式[v]：

其中，x6是卤素；

l2是六元芳基或杂芳基；且

r9是c1-3烷基。

优选地，x6是氟、氯或溴，更优选氟或氯，最优选氟。优选地，l2是苯基。优选地，l2在对位被取代。优选地，r9是甲基。

奥拉帕尼的衍生物可具有通式[vi]：

其中，x7是卤素；

l3是六元环烷基或杂环基；且

r10和r11与它们所键合的碳原子一起形成3元至6元环烷基。

优选地，x7是氟、氯或溴，更优选氟或氯，最优选氟。优选地，l3是六元杂环基。更优选地，l3是哌嗪、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。更优选地，l3是优选地，r10和r11与它们所键合的碳原子一起形成环丙基、环丁基或环戊基，更优选环丙基或环丁基，最优选环丙基。

他拉唑帕尼的衍生物可具有通式[vii]：

其中，x8是卤素；

x9是卤素；且

r12是c1-3烷基。

优选地，x8是氟、氯或溴，更优选氟或氯，最优选氟。优选地，x9是氟、氯或溴，更优选是氟或氯，最优选是氟。优选地，r12是甲基。

如图9b、13和16所示，米诺环素以剂量依赖性方式抑制钙化。

四环素是一组具有以下式i结构的广谱抗生素：

其中：

x1是h、cl或n(ch3)2；

r1是h或ch3，且x2是h或oh；或者r1是ch2且x1不存在；

x3是oh或h；

x4是oh；

r2是

且

x5是h或

优选地，用于治疗、预防或改善中膜性血管钙化的四环素是式(i)化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

四环素可以选自由下述组成的组中：四环素；金霉素；土霉素；地美环素；赖甲环素；甲氯环素；美他环素；米诺环素；吡甲四环素；多西环素；替吉环素；氯莫环素；和匹哌环素。如图9b、13和16所示，米诺环素以剂量依赖性方式抑制钙化。因此，最优选四环素是米诺环素。应理解，米诺环素既是parp抑制剂又是四环素。

药学上可接受的盐包括本文提供的parp抑制剂和/或四环素的任何盐，其保留其生物学性质并且就药学用途而言是无毒的或不合需要的。药学上可接受的盐可以衍生自本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子。

药学上可接受的盐可包括与有机或无机酸形成的酸加成盐，所述酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸等。可选地，药学上可接受的盐可包括当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子取代时形成的碱加成盐，所述金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子、铝离子、碱金属或碱土金属氢氧化物，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡，或与有机碱的配合物，比如脂肪族、脂环族或芳香族有机胺，比如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、n-苄基苯乙胺、n-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等。

例如，匹哌环素的药学上可接受的盐可为青哌四环素(penimepicycline)。

药学上可接受的溶剂化物是指本文提供的parp抑制剂和/或四环素或其盐，其进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的溶剂。当溶剂是水时，溶剂化物是水合物。

应理解，本文所述的parp抑制剂和/或四环素，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，可用于药物，该药物可用于单一疗法(即单独使用parp抑制剂和/或四环素)，用于治疗、改善或预防中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化。可选地，parp抑制剂和/或四环素或其药学上可接受的盐或溶剂化物可用作治疗、改善或预防中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化的已知疗法的辅助或与其组合。

parp抑制剂和/或四环素可以组合在具有许多不同形式的组合物中，尤其取决于组合物的使用方式。因此，例如，组合物可为粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液的形式或可为可向需要治疗的人或动物施用的任何其他合适的形式。应当理解，根据本发明的药物载体应该是给予它的受试者良好耐受的载体。

包括本文所述的parp抑制剂和/或四环素的药物可以以多种方式使用。包括本发明的parp抑制剂和/或四环素的组合物可以通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可以配制用于局部使用。例如，可以将乳膏或软膏施用于皮肤。

根据本发明的parp和/或四环素抑制剂也可以掺入缓释或延迟释放装置中。这样的装置可以例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周或甚至数月内释放。该装置可以至少位于治疗部位附近。当需要用根据本发明使用的parp抑制剂和/或四环素进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如至少每日注射)时，这样的装置可能是特别有利的。

根据本发明的parp抑制剂和/或四环素和组合物可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位，例如患有钙化的特定血管(静脉或动脉)，来向受试者施用。注射可为静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)，或皮内(推注或输注)。

在优选的实施方式中，parp抑制剂和/或四环素口服施用。因此，parp抑制剂和/或四环素可以包括在组合物中，该组合物可以例如以片剂、胶囊或液体的形式口服摄入。

应当理解，所需的parp抑制剂和/或四环素的量由其生物活性和生物利用度决定，而生物活性和生物利用度又取决于施用方式、parp抑制剂和/或四环素的生理化学性质以及它是用作单一疗法还是用于综合疗法。施用频率也受所治疗的受试者内parp抑制剂和/或四环素的半衰期的影响。施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且将随使用的特定parp抑制剂和/或四环素、药物组合物的强度、施用方式和中膜性血管钙化的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。

parp抑制剂和/或四环素可以在待治疗的中膜性血管钙化出现之前、期间或之后施用。每日剂量可以作为单次施用给予。然而，优选地，parp抑制剂和/或四环素在一天中给予两次或更多次，最优选每天两次。

待施用的parp抑制剂和/或四环素的日剂量可为1mg与10000mg之间，或2mg与2000mg之间，更优选在5mg与1000mg之间或10mg与200mg之间，最优选15mg与100mg之间或20mg与50mg之间。

在最优选的实施方式中，根据本发明的parp抑制剂和/或四环素可作为两个日剂量施用，每个剂量在1mg与5000mg之间或2mg与1000mg之间，更优选在3mg与500mg之间，或4mg与100mg之间，最优选5mg与50mg之间或10mg与25mg之间。最优选的剂量包括10mg至25mg的两个剂量。

接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂，然后在晚上服用第二剂(如果采用双剂量方案)或之后以3或4小时的间隔服用。可选地，可以使用缓释装置向患者提供根据本发明的parp抑制剂和/或四环素的最佳剂量，而无需施用重复剂量。

已知的方法，例如制药工业常规使用的那些(例如体内实验、临床试验等)，可用于形成包括根据本发明的parp抑制剂和/或四环素的特定制剂和精确的治疗方案(比如parp抑制剂和/或四环素的每日剂量和施用频率)。发明人认为，基于使用本发明的parp抑制剂和/或四环素，他们第一次描述了用于治疗中膜性血管钙化的药物组合物。

因此，在本发明的第三方面中，提供了用于治疗中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化的药物组合物，其包括parp抑制剂和/或四环素，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，和药学上可接受的载体。

该药物组合物可用于中膜性血管钙化或内膜性动脉粥样硬化钙化的受试者的治疗改善、预防或治疗。

在第四方面中，本发明还提供了制备根据第三方面的组合物的方法，该方法包括使治疗有效量的第一方面的parp抑制剂和/或四环素或药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体接触。

“受试者”可为脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的parp抑制剂和/或四环素、组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或可用于其他兽医应用。然而，最优选地，受试者是人类。

parp抑制剂和/或四环素的“治疗有效量”是，当向受试者施用时，治疗中膜性血管钙化所需的药物量的任何量。

例如，所使用的parp抑制剂和/或四环素的治疗有效日剂量可在1mg与10000mg之间或2mg与2000mg之间，更优选5mg与1000mg之间或10mg与200mg之间，并且最优选15mg与100mg之间或20mg与50mg之间。优选10mg至25mg的每日两次剂量。

本文提及的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知的可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。

在一个实施方式中，药学上可接受的载体可为固体，并且组合物可为粉末或片剂的形式。药学上可接受的固体载体可包括一种或多种物质，其也可用作调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、涂料或片剂崩解剂。载体也可为包封材料。在粉末中，载体是细碎的固体，其与根据本发明的细碎的活性剂(即，parp抑制剂或四环素)掺混。在片剂中，活性parp抑制剂和/或四环素可以与具有适当比例的必要压缩性质的载体混合，并压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性parp抑制剂和/或四环素。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方式中，药物载体可为凝胶，并且组合物可为乳膏等形式。

然而，药物载体可为液体，并且药物组合物是溶液形式。液体载体用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的parp抑制剂和/或四环素可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。液体载剂可含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体载体的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物，和油(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，载体也可为油性酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物。用于加压组合物的液体载体可为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。

液体药物组合物是无菌溶液或悬浮液，其可以通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和尤其皮下注射来使用。parp抑制剂和/或四环素可以制备成无菌固体组合物，其可以在施用时使用无菌水、盐水或其他适当的无菌可注射介质溶解或悬浮。

本发明的parp抑制剂和/或四环素和组合物可以以无菌溶液或悬浮液的形式施用，所述溶液或悬浮液含有其他溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆盐、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等。根据本发明使用的parp抑制剂和/或四环素也可以以液体或固体组合物形式口服施用。适于口服施用的组合物包括固体形式，比如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉末，以及液体形式，比如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。

根据本发明的另一方面，提供了四环素和/或聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物，用于治疗、预防或改善以不当的血管钙化为特征的疾病。

根据本发明的又一方面，提供了治疗、预防或改善以受试者的不当的血管钙化为特征的疾病的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的四环素和/或聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

根据又一方面，提供了一种减少受试者的血管钙化的方法，该方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂和/或四环素，或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

血管钙化可包括动脉粥样硬化钙化。可选地，血管钙化可包括中膜性钙化。

附图说明

本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合与任何上述方面组合，但至少一些这样的特征和/或步骤是相互排斥的组合除外。

为了更好地理解本发明，并示出如何实现本发明的实施方式，现在将通过实施例的方式参考附图，其中：

图1a显示了细胞裂解和冲洗基质后，体外人vsmc细胞外基质的二维¹³c-¹³c相关nmr光谱。从葡萄糖生物合成的糖组分是¹³c标记的，甘氨酸和脯氨酸/羟脯氨酸(主要存在于胶原蛋白中)也是如此。除了来自胶原甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸以及来自胶原糖基化(主要是o-连接的α-葡糖基-半乳糖基和β-半乳糖基)的预期氨基酸信号之外，还存在来自聚(adp核糖)的明确信号。斜体字的分配表明来自其他分子种类的信号与聚(adp核糖)信号重叠；并且图1b说明图1a中使用的聚(adp核糖)原子编号方案；

图2显示了人颈动脉病变中聚(adp核糖)(par)/dna损伤的表达。低放大倍数(比例尺为150μm)的人颈动脉损伤的相衬(a)和荧光图像(b)。在图像的左上方是病变的非细胞核心(ac)，其边缘是内膜性增厚(it)区域，其中钙化(cap)紧邻培养基(右下)。病变钙化清晰可见，(a)中为暗沉积物，和(b)中为钙黄绿素染色后的绿色荧光。细胞核用赫斯特(hoechst)染料染色并呈蓝色。培养基中的dna损伤(γh2ax抗体，红色)和par(克隆10h抗体，绿色)的免疫染色(c和d，比例尺为18μm)显示染色主要位于细胞核附近；相反，在内膜性增厚/钙化(e和f，比例尺为16μm)的区域中，染色更广泛并且与细胞核以及细胞质和/或细胞外区域相关联；

图3显示了胎羊骨生长板中聚(adp核糖)(par)/dna损伤的表达。胎羊生长板在低放大倍数(比例尺为150μm)下的相衬(a)和荧光图像(b)。在图像的左上方是生长板的肥大软骨(hc)区域，与钙化区(cf)接壤，在那里矿物开始形成(右下)。在(b)中钙黄绿素染色后，通过绿色荧光可清楚地看到矿物。细胞核用赫斯特染料染色并呈蓝色。在发生矿化的边界附近的hc区(c和d，比例尺为10μm)中对par(克隆10h抗体，绿色)和dna损伤(h2a.x抗体，红色)的免疫染色显示主要位于细胞核附近的染色(箭头)，但也可见远离核dna的弱染色(星号)。在骨小梁周围的cf区(e和f，比例尺为10μm)中，par和dna损伤染色与细胞核(箭头)以及细胞质和/或细胞外区域(星号)相关联；

图4a和b是显示浓度为0μm至100μm的n-(6-氧-5,6-二氢菲啶-2-基)-(n,n-二甲基氨基)乙酰胺盐酸盐(pj34)、米诺环素(mc)、西洛他唑(cs)的毒性的图。波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)、双嘧达莫(dp)、3-氨基苯甲酰胺(3-ab)和3,4-二氢-5-[4-(哌啶基)丁氧基]-1(2h)-异喹啉酮(dpq)，以及相应稀释度的dmso载体，在7天内对牛血管平滑肌细胞(bvsmc)的毒性的图；

图5a和b是显示浓度为0μm至100μm的pj34、米诺环素(mc)、西洛他唑(cs)、波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)、双嘧达莫(dp)、3-ab和dpq，以及相应的稀释度的dmso载体，在7天内对人单核细胞-巨噬细胞(hmm)的毒性的图；

图6显示了使用茜素红s染色获得的结果，其中bvsmc仅用培养基(na)或在gad培养基中生长，并且未添加抑制剂，或者以10μm的浓度添加pj34、米诺环素(mc)、西洛他唑(cs)、波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)、双嘧达莫(dp)或3-ab；

7a是显示从板中获得的钙的质量的图，其中bvsmc仅用培养基(na)生长，并且未添加抑制剂，或者以10μm的浓度添加pj34、米诺环素(mc)、西洛他唑(cs)、波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)、双嘧达莫(dp)或3-ab；并且图7b是显示从板中获得的钙的质量的图，其中bvsmc在gad培养基中生长，并且未添加抑制剂，或者以10μm的浓度添加pj34、米诺环素(mc)、西洛他唑(cs)、波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)、双嘧达莫(dp)或3-ab；

图8是显示图7中给出钙含量的每个板的蛋白质含量的图；

图9a和b是分别将图7a和b中所示结果归一化的图，以给出每质量蛋白质的钙质量；

图10是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34(pj)或米诺环素(mc)的存在下，用对照培养基(无gad)或与β-gad培养基(有gad)孵育7天的bvsmc的细胞活力结果的图；

图11是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34(pj)或米诺环素(mc)的存在下，用对照培养基(无gad)或与β-gad培养基(有gad)孵育9天的bvsmc的细胞活力结果的图；

图12是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34或米诺环素(mc)的存在下，用对照培养基(无gad)或与β-gad培养基(有gad)孵育7天的bvsmc样品中ca²⁺浓度的图；

图13是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34或米诺环素(mc)的存在下，用对照培养基(无gad)或与β-gad培养基(有gad)孵育9天的bvsmc样品中ca²⁺浓度的图；

图14是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34或米诺环素(mc)的存在下，仅在对照培养基(-)中或用β-gad培养基(+)孵育7天的bvsmc样品中蛋白质总质量的图；

图15是显示在没有潜在抑制剂(na)存在下或在浓度为10μm、1μm或0.1μm的pj34或米诺环素(mc)的存在下，仅在对照培养基(-)中或用β-gad培养基(+)孵育9天的bvsmc样品中蛋白质总质量的图；

图16是显示在有或没有潜在抑制剂的情况下，在9天内在gad培养基中生长的bvsmc样品中ca²⁺浓度的图，表示为与在没有潜在抑制剂(na)的情况下在9天内在gad培养基中生长的bvsmc相比的百分比；

图17是显示从板中获得的钙的质量的图，其中人血管平滑肌细胞(hvsmc)仅在存在dmso(阴性对照)、dmso+ca/p(矿化的阳性对照)，或在各种浓度的parp抑制剂(pj-34、米诺环素或西洛他唑)的存在下的矿化条件下生长；

图18是显示图17中给出的钙含量的每个板的蛋白质含量的图；

图19是将图17中所示结果归一化以得到每质量蛋白质的钙质量的图。

图20是显示从板中获得的钙的质量的图，其中人血管平滑肌细胞(hvsmc)仅在存在dmso(阴性对照)、dmso+ca/p(矿化的阳性对照)，或在浓度为3μm的parp抑制剂(米诺环素、西洛他唑、奥拉帕尼、他拉唑帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼或pj-34)存在下的矿化条件下生长；

图21是显示图20中给出钙含量的每个板的蛋白质含量的图；

图22是将图20所示结果归一化以得到每质量蛋白质的钙质量的图；

图23显示了对于图20中给出的钙含量的每个板使用茜素红s染色获得的结果；

图24显示了图20中给出的钙含量的每个板的特写照片；

图25是显示从板中获得的钙的质量的图，其中人血管平滑肌细胞(hvsmc)仅在存在dmso(阴性对照)、dmso+ca/p(矿化的阳性对照)，或各种浓度的parp抑制剂(维利帕尼、米诺环素或西洛他唑)或其他药物(波生坦、己酮可可碱、氯沙坦、氨氯地平或阿托伐他汀)存在下的矿化条件下生长，如图所示；

图26是显示图25中给出的钙含量的每个板的蛋白质含量的图；

图27是将图25中所示结果归一化以得到每质量蛋白质的钙质量的图；并且

图28a显示了动脉粥样硬化钙化；并且图28b显示了中膜性钙化。

具体实施方式

发明人进行了各种实验，可以总结如下：

实施例1：证明聚(adp核糖)(par)与血管钙化之间的生理学联系；

实施例2：检测parp抑制剂/四环素对牛血管平滑肌细胞的毒性；

实施例3：检测parp抑制剂/四环素对人单核细胞巨噬细胞的毒性；

实施例4：parp抑制剂/四环素对体外牛血管平滑肌细胞血管钙化模型的初步测试；

实施例5：试验抑制剂对体外牛血管平滑肌细胞血管钙化模型中钙化水平的剂量依赖性；

实施例6：对使用pk浓度相关性的试验抑制剂的实施例剂量建议；

实施例7：parp抑制剂/四环素对体外人血管平滑肌细胞血管钙化模型的初步测试；

实施例8：parp抑制剂/四环素对体外人血管平滑肌细胞血管钙化模型的进一步测试，包括测试化合物列表中的奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼和他拉唑帕尼；和

实施例9：parp抑制剂/四环素和其他常见心血管药物对体外人血管平滑肌细胞血管钙化模型的进一步测试，包括测试化合物列表中的氯沙坦、氨氯地平和阿托伐他汀。

实施例1：证明聚(adp核糖)(par)和血管钙化之间的生理学联系

血管平滑肌细胞(vsmc)在受到压力时，使其周围的细胞外基质钙化。使用vsmc组织的体外模型来确定在压力下的vsmc是否以任何可感知的量产生聚(adp核糖)(par)。

在该模型中，vsmc在高浓度的葡萄糖中生长，其诱导细胞中的氧化压力。细胞合成细胞外基质并使基质矿化，然后模拟细胞坏死的细胞裂解从基质中去除细胞。在细胞裂解后，用磷酸盐缓冲液将基质冲洗至少6次，以除去未与基质牢固结合的任何分子组分。

这些实验中的细胞培养基含有u-¹³c-葡萄糖和u-¹³c、¹⁵n-甘氨酸和脯氨酸，因此细胞从葡萄糖合成的所有糖种类都被¹³c标记为是胶原蛋白(其组成中含有～33％的甘氨酸和22％的脯氨酸/羟脯氨酸)。然后可以通过二维¹³c-¹³c相关光谱检查所得基质的胶原蛋白和糖含量，从而允许详细表征相对于胶原蛋白的基质的糖组成。

图1显示了从该实验获得的典型的二维¹³c-¹³c相关光谱。所有光谱清楚地显示par的预期信号。在冲洗基质后从par观察到¹³cnmr信号的事实表明par在基质中的强结合或捕获。

然后，发明人对离体人颈动脉病变成像，以观察钙化沉积物以及par和dna损伤(红色是h2a.x抗体)的存在。使用相衬成像和钙黄绿素染色对矿物沉积物进行成像。在相邻切片中，使用间接免疫组织化学染色来成像par(使用单克隆抗聚(adp核糖)抗体克隆10h，绿色荧光)和dna损伤(使用针对h2a.x的单克隆抗体，红色荧光)。

图2显示了来自病变相邻切片的相衬图像和荧光成像。钙黄绿素染色的相衬图像和荧光图像都清楚地显示在损伤中的内膜性增厚区域中存在矿物沉积物，邻近损伤的坏死的非细胞核心。在相邻切片(切片厚度5μm)中，对于细胞核区域以及细胞质和/或细胞外基质区域的聚(adp核糖)存在显着染色。在体外冠状动脉粥样硬化病变中观察到类似的聚(adp核糖)染色模式。

关键问题是什么驱动聚(adp核糖)在发育中的骨骼和氧化压力的血管组织中的合成。聚(adp核糖)在细胞死亡(当dna损伤驱动parp表达过度导致糖酵解损害时，通过线粒体释放aif或依赖性细胞死亡(parthanatos)而凋亡)和dna修复中具有充分证明的作用。就与基质钙化相关的细胞死亡而言，60％至80％的成骨细胞在骨钙化期间死亡。类似地，无论钙化是否与动脉粥样硬化或中膜性钙化相关，细胞死亡(凋亡和坏死)总是先于血管钙化。dna损伤与血管钙化相关的可能性很强：活性氧/氮种类对氧化压力血管平滑肌细胞中的dna损伤可能是一种情况。也许不那么直观，因此更有趣的是，saos-2细胞，一种成骨细胞细胞系，当它们表达成骨标志物时释放过氧化氢，并且过氧化氢释放与聚(adp核糖)合成密切相关，表明聚(adp核糖)合成在骨发育中的可能的dna-损伤依赖性机制。

因此，发明人假设细胞外基质中聚(adp核糖)的出现可能来自dna损伤依赖性细胞死亡，因此他们检查了发育中的骨和人血管钙化沉积物中是否在钙化区域中存在与空间相关的细胞中的dna损伤。图2(右栏)显示，在血管钙化中，细胞核和细胞外聚(adp核糖)染色与磷酸化组蛋白h2a.x共定位，h2a.x是dna损伤的标志。

图3显示了胎儿骨生长板中聚(adp核糖)和h2a.x之间非常相似的关系-聚(adp核糖)和h2a.x在细胞核和细胞外基质中的共定位。

聚(adp核糖)与骨和血管矿物沉积物的直接关联表明聚(adp核糖)的细胞外沉积与矿物形成的诱导之间的机制联系。

实施例2：聚(adp核糖)聚合酶(parp)抑制剂在7天内对牛血管平滑肌细胞(bvsmc)的毒性

鉴于par的细胞外沉积与矿物形成的诱导之间的机制联系，决定测试parp抑制剂以确定它们是否会抑制血管钙化。

已显示pj34、米诺环素(mc)和3-ab抑制哺乳动物细胞产生的parp。因此，鉴定出这些化合物以待测试。

此外，西洛他唑(cs)、波生坦mh(bosmh)、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)和双嘧达莫(dp)都显示出抑制重组parp。因此，虽然不确定这些化合物是否是真正的parp抑制剂，但决定也应该对它们进行测试。

使用mtt测定法测定鉴定的化合物对牛vsmc的毒性，该测定法测量活细胞的脱氢酶活性。该测定可以获得细胞死亡和增殖。

方法

将牛vsmc接种在96孔板中并在m199/20％fcs中培养1天。然后，用0.5至100μm的抑制剂浓度(在m199培养基+5％fbs中)孵育细胞。将细胞与抑制剂一起培养7天；每隔2-3天更换培养基-/+抑制剂。然后，进行mtt测定。在0.1％dmso或更低浓度下，以对抑制剂的相应浓度对储备载体dmso进行测试。

结果

结果在下表1中给出，并在图4中以图形方式显示。给出的值代表三次实验的平均值，每个重复一次。在图4中，误差条表示三次实验的标准偏差(se)。与na对照相比，下表中的阴影值被认为具有统计学意义(无抑制剂)；p≤0.01(anova+post-hoclsd检验)。

表1：7天内潜在抑制剂对bvsmc的毒性

mtt测定结果表明，己酮可可碱(pf)、3ab、dpq和dmso载体在测试浓度下几乎无毒；波生坦一水合物(bos)也几乎显示没有毒性。pj34、双嘧达莫(dp)和西洛他唑(cs)在550和100μm时是有毒的。米诺环素(mc)和地尔硫卓都是无毒的并且另外显示出对20μm及以上的细胞的刺激作用。因此，在可能用于钙化模型的浓度下，bvsmc可以很好地耐受所有抑制剂。

实施例3：潜在抑制剂对人单核细胞-噬细胞(hmm)的毒性

用人单核细胞-巨噬细胞(hmm)进行类似的一组毒性实验。由于hmm不在培养物中增殖，因此分裂细胞(bvsmc)和非分裂细胞(hmm)之间的比较有时可以帮助区分由于毒性引起的影响和由于增殖引起的影响。此外，对于化合物的预期用途，重要的是确定它们对人巨噬细胞没有毒。

该方法如实施例2所述，不同之处在于hmm在培养基(无血清培养基)中培养用于常规培养以及毒性测定。

结果

结果在下表2中给出，并在图5中以图形方式显示。如前所述，给出的值代表三次实验的平均值，每个重复一次。在图5中，误差条表示三次实验的标准偏差(se)。与na对照(无抑制剂)相比，下表中的阴影值被认为具有统计学意义；p≤0.01(anova+post-hoclsd检验)。

表2：潜在抑制剂超过7天对hmm的毒性

毒性测定的结果显示，在100μmc的浓度下，pj34、dz和bos是对hmm的抑制剂中毒性最大的，而cs、dp、pf、dpq和3ab是相对无害的。

实施例2和3的结果使我们能够在随后的实施例中判断抑制血管钙化所需的化合物浓度的毒性。

实施例4：pj34、米诺环素(mc)、西洛他唑ccs)、波生坦mh(bos)、3-ab、己酮可可碱(pf)、地尔硫卓(dz)和双嘧达莫(dp)对血管钙化的初步试验

方法

对于bvsmc，使用gad培养基(10mmβ-甘油磷酸盐/0.1mml-抗坏血酸-2-磷酸/10nm地塞米松)模型来诱导bvsmc中的矿化。因此，使用m199/20％fcs培养基将细胞接种在组织培养板中并培养过夜。第二天，用仅培养基(m199/5％fbs)+/-抑制剂或用gad培养基(10mmβ-甘油磷酸盐/0.1mml-抗坏血酸-2-磷酸盐/10nm地塞米松)+/-抑制剂处理细胞。

所有抑制剂以10μm的浓度使用，因为实施例2和3显示所有化合物在该浓度下都是无毒的，而且，似乎没有诱导其他效应，例如显着增殖，这可能使它们可能表现出任何钙化抑制作用的评估复杂化。每2天至3天更换培养基+/-抑制剂。在评估之前将牛vsmc孵育7天。

茜素红s染色

茜素红s染色是组织钙沉积物的视觉/组织学染色。将细胞在4％多聚甲醛/pipes缓冲液ph7.2中短暂固定，并随后用茜素红s(2％茜素红s/diwph4.2)染色5分钟。通过在diw中冲洗除去过量的污渍。钙矿物沉积物被染成亮橙红色。

邻甲酚酞测定

邻甲酚酞测定是用于测量细胞/组织裂解物中的ca²⁺浓度的分光光度法。在钙化实验之后，将细胞短暂冲洗以除去培养基，并向每个孔中加入100l的0.1nhcl以溶解任何矿物沉积物。然后，在邻甲酚酞测定中借助于cacl2标准曲线，在～0.02-270gca²⁺/ml的浓度范围内，通过分光光度法(570nm)测量样品的ca²⁺浓度。

biorad蛋白质测定

商业bioraddc蛋白质测定基于lowry方法，也就是蛋白质与铜-酒石酸盐络合物的反应以及随后与福林(folin)试剂的反应。在钙化实验后，将细胞短暂冲洗以除去培养基，并向每个孔中加入100l增溶溶液(0.1mnaoh/1％sds/diw)以裂解细胞。随后使用bsa(牛血清白蛋白)作为标准，按照供应商的说明在bioraddc测定中测定裂解物的蛋白质浓度。

结果

用茜素红s染色处理的板的照片显示在图6中。明显地，对于仅用培养基(na)处理的细胞，没有看到由茜素引起的红色染色。这表明培养物很少或没有发生钙化。

相反，gad处理的细胞用茜素染色阳性，显示培养物钙化。通过肉眼判断，米诺环素(mc)样品中的矿化程度略轻，而pj34和双嘧达莫(dp)样品中的矿化程度稍严重。

邻甲酚酞测定使发明人能够量化ca²⁺沉积，如图7a和b所示。

如图7a所示，甲酚酞测定显示na处理组中的钙含量非常低(基本上在测定的检测极限)。在gad处理组中，如图7b所示，钙水平升高至未处理细胞的约50-60倍。

如图7b中所示，cs、bos、3ab和pf似乎对钙水平没有影响，而pj34和dp似乎提高了钙水平。然而，与未添加抑制剂的样品相比，dz和尤其mc似乎降低了钙水平。

biorad蛋白质测定的结果显示在图8中。当评估化合物抑制钙化的程度时，通常将抑制程度量化为样品中每质量蛋白质(通过biorad蛋白质测定法测定)的样品中钙的质量(通过甲酚酞测定法测定)。这是因为样品中蛋白质的总质量可能在实验进行的时间段内增加，在这种情况下为7天，这是由于添加的化合物诱导的基质的细胞生长、增殖或细胞合成。这些归一化结果如图9所示。

如图9b所示，当结果归一化时，cs似乎仍未显示对钙水平的影响，并且pj34和dp仍然似乎提高钙水平。然而，bos、3ab、pf和dz似乎都略微降低了钙水平，而mc似乎显着降低了钙水平。

实施例5：试验抑制剂对体外血管钙化模型中钙化的剂量依赖性

方法

体外模型与实施例4中使用的模型相同；培养牛血管平滑肌细胞(bvsmc)，使其产生细胞外基质，加入gad培养基(10mmβ-甘油磷酸盐/0.1mml-抗坏血酸-2-磷酸盐/10nm地塞米松)。

如上所述，细胞仅用培养基(“无添加”；na)+/-抑制剂或用gad-培养基+/-抑制剂处理。使用的抑制剂是10μm、1μm和0.1μm的pj34和米诺环素(mc)。目视检查细胞培养物的矿化，并在gad处理7天时评估钙化程度，因为此前已计划作为第一个数据点。评估钙化程度的第二时间点为9天，因为gad处理的细胞中的矿化似乎进展相当快。较长的治疗持续时间被认为是有风险的，因为细胞具有剥离孔的倾向，然后可能完全丧失。

与实施例4类似，进行用于定量ca²⁺沉积的邻甲酚酞测定和用于蛋白质含量的biorad蛋白质测定。该方法与实施例4中描述的方法相同。

另外，进行mtt测定作为细胞活力/增殖的量度。将牛vsmc接种在96孔板中并在m199/20％fcs中培养1天。然后，与用10μm、1μm和0.1μm(在m199培养基+5％fbs中)的抑制剂浓度孵育细胞。将细胞与抑制剂一起孵育7或9天；每隔2天至3天更换培养基-/+抑制剂。然后，进行mtt测定。

结果

mtt细胞活力测定

孵育7天的bvsmc的细胞活力结果在下表3中给出，并在图10中以图形方式显示。类似地，孵育9天的bvsmc的细胞活力结果在下表4中给出，并在图11中以图形方式显示。在每种情况下，给出的值代表三次实验的平均值。在图10和11中，误差条代表三次实验的标准偏差(sd)。

表3：仅培养基和gad培养基与潜在抑制剂组合在7天内对bvsmc的毒性

表4：仅培养基和gad培养基与潜在抑制剂组合在9天内对bvsmc的毒性

7天后，na处理和gad处理都不对bvsmc产生毒性。

9天后，已经用gad培养基处理的基质/细胞开始在孔内稍微卷起。mtt测定显示，与na处理组相比，gad处理组中甲臜产量下降约27％。这很可能是由于孔中细胞的卷起以及减少的进入/接触细胞至mtt而不是表示细胞活力下降。这一观点得到以下事实的支持：在10μmmc-样品中，细胞卷起的量明显减少，并且未观察到该处理组中甲臜产量的下降。

甲酚酞测定

孵育7天的bvsmc的ca²⁺浓度结果在下表5中给出，并在图12中以图形方式显示。类似地，孵育9天的bvsmc的ca²⁺浓度结果在下表6中给出，并在图13中以图形方式显示。在每种情况下，给出的值代表三次重复的平均值。在图12和13中，误差条代表三次重复的标准偏差(sd)。

表5：在7天内仅在培养基中和存在潜在抑制剂的gad培养基中生长的bvsmc中发现的ca²⁺浓度

表6：在9天内仅在培养基中和存在潜在抑制剂的gad培养基中生长的bvsmc中发现的ca²⁺浓度

在7天和9天后，在未用gad培养基处理的平板中(在图12和13中标识为“na-处理”)，ca²⁺含量非常低，如预期的那样。

当用gad培养基处理板时，ca²⁺浓度仅比处理7天后未用gad培养基处理的板的ca²⁺浓度高约3倍，此时没有抑制剂存在，见图12中的前两个条形图。然而，在9天后，当没有抑制剂存在时，观察到ca²⁺浓度的更显著增加至比未用gad培养基处理的板观察到的高约25倍，见图13中的前两个条形图。

如实施例4中所讨论的，当评估化合物抑制钙化的程度时，在文献中通常将钙化的抑制程度量化为样品中每质量蛋白质的样品中钙的质量。通过biorad测定法测定样品中蛋白质的总质量，并显示在图14和15中。在这些图中，用“+”标记的样品用gad培养基处理，标记为“-”的样品不用gad培养基处理。

因此，很明显，与未用gad培养基处理的细胞培养物相比，用gad培养基处理的细胞培养物的蛋白质总质量更大。然而，通过mtt测定确定，gad处理不会引起样品中细胞数量的任何明显变化。最可能的是，与没有gad处理相比，gad处理下蛋白质的增加是由于细胞外基质或其他蛋白质产生的刺激。

因此，发明人认为，表达每毫克蛋白质的钙化程度高估了试验抑制剂的任何抑制作用。为了克服这个问题，用gad培养基和潜在抑制剂处理的板的钙化程度计算为与用gad培养基处理和没有抑制剂处理的板相比的百分比。这些值在表7中给出，并在图16中以图形方式显示。

表7：在有或无潜在抑制剂的情况下在9天内在gad培养基中生长的bvsmc的ca²⁺浓度表示为与在没有潜在的抑制剂的情况下在9天内在gad培养基中生长的板相比的百分比

如实施例4中所述，pj-34在10μm的浓度下增加ca²⁺沉积。在1μm的浓度下也观察到该效果。

与不存在潜在抑制剂时相比，浓度为10μm的米诺环素将ca²⁺沉积减少至约19％，即减少约81％。类似地，与不存在潜在抑制剂时相比，浓度为1μm的米诺环素将ca²⁺沉积减少至约62％，即减少约38％。然而，浓度为0.1μm的米诺环素似乎对ca²⁺浓度没有任何影响。

讨论

米诺环素显示出对钙化的剂量依赖性作用，与该药物对血管钙化过程具有直接影响一致。因此，米诺环素显示出作为血管钙化抑制剂的前景。

有利地，据信米诺环素可以以在可接受的安全水平内的相对低的浓度用作血管钙化的抑制剂。

同时，pj-34似乎确实有助于钙化。然而，它似乎也在bvsmc中诱导一些细胞死亡，见图4a和实施例2。因此，这可能是细胞死亡导致观察到的钙化。

死亡的细胞可以(并且通常会)作为沉淀矿物/钙化的病灶(nidus)。尚不清楚在体内死亡细胞周围是否会发生类似的过程。然而，在体外实验中，如上所述，死亡的细胞意味着你会看到钙化。因此，pj-34可能仍然可以抑制剩余活细胞的钙化。

实施例6：实施剂量建议

在实施例5中进行的实验显示米诺环素可以在低至1μm的浓度下抑制钙化，并且也可能在更低浓度下有效。米诺环素的分子量为457克/摩尔，因此1μm的浓度相当于0.46微克/ml。

50mg口服米诺环素剂量，施用后2小时达到的患者血流中的最大浓度(cmax)为0.65微克/ml(tmax)。

米诺环素通常每天服用两次，并且米诺环素在体内的半衰期约为12小时。因此，每12小时连续50mg剂量的稳态浓度为1.3微克/ml。

因此，达到0.46微克/ml浓度所需的剂量将是约20mg米诺环素，每天两次。

米诺环素的副作用似乎是剂量依赖性的，因此在这些低剂量下应该是可以克服的。

应该注意，米诺环素治疗痤疮的成人剂量(主要用途)是50mg至100mg，每天两次，然后继续50mg至100mg的维持剂量，每天一次。因此，建议的剂量在可接受的安全水平内。

实施例7：利用人血管平滑肌细胞(hvsmc)初步测试pj34、米诺环素和西洛他唑对血管钙化的影响

方法

鉴于在体外牛血管平滑肌细胞模型中抑制血管钙化的积极结果和结论，发明人在体外人血管平滑肌细胞模型中继续他们的实验。

将原代hvsmc在含有fbs(m1995％fbs)的m199培养基中培养。将它们以已知的细胞密度接种，使其生长24小时，然后用对照(仅dmso)或钙化介质(含有2.7mm钙+2.5mμ磷酸盐的dmso)+/-抑制剂处理。6天后，使用邻甲酚酞测定量化ca²⁺沉积和biorad蛋白质测定蛋白质含量来评估钙化。

pj34以10μm的浓度使用，而米诺环素和西洛他唑均以0.5μm、1μm和2μm的浓度使用。每2天至3天更换培养基+/-抑制剂。

每个实验重复三次进行，图17至19显示平均值+平均值的标准误差(sem)。

结果

邻甲酚酞测定使发明人能够量化ca²⁺沉积，如图17所示。这表明dmso组(阴性对照)中的钙含量非常低。相反，在dmsoca+p组(阳性对照)中，钙水平显著升高。pj34、米诺环素和西洛他唑均可降低钙水平。

biorad蛋白质测定的结果显示在图18中。由此获得的数据使得从邻甲酚酞测定获得的结果归一化，得到每质量蛋白质的钙质量。这些归一化结果如图19所示。

如图19所示，当结果归一化时，pj34、米诺环素和西洛他唑各自显著降低钙水平。此外，米诺环素似乎以剂量依赖性方式降低钙水平。

实施例8：利用人血管平滑肌细胞(hvsmc)进一步测试parp抑制剂对血管钙化的影响

方法

将原代hvsmc在含有fbs(m199/5％fbs)的m199培养基中培养。将它们以已知的细胞密度铺平板，使其生长24小时，然后用对照(仅dmso)或钙化培养基(含有2.7mm钙+2.5mm磷酸盐的dmso)+/-抑制剂处理。8天后，使用邻甲酚酞测定量化ca²⁺沉积和biorad蛋白质测定蛋白质含量来评估钙化。

测试的parp抑制剂包括奥拉帕尼(分别测试2种来源)、他拉唑帕尼、尼拉帕尼、鲁卡帕尼和维利帕尼，以及米诺环素和西洛他唑。所有测试的化合物均以3μm的浓度使用。每2天至3天更换培养基+/-抑制剂。

每个实验进行六次，图20和22显示平均值+平均值的标准误差(sem)。

结果

图24中显示了板的特写照片，并且用茜素红s染色处理的板照片显示在图23中。很明显，对于dmso组(阴性对照)中的细胞，由于茜素在图23中可见，钙化最小，并且红色染色最小。这表明培养物的钙化很少或没有发生钙化。

相反，图像显示dmsoca+p组(阳性对照)中的细胞发生大量钙化。虽然用parp抑制剂处理的所有细胞培养物都发生了一定程度的钙化，但显然这显著低于dmsoca+p组中的细胞。

邻甲酚酞测定使发明人能够量化ca²⁺沉积，如图20所示。与实施例7一样，dmso组(阴性对照)中的钙含量非常低，并且dmsoca+p组(阳性对照)中的钙含量显著升高。所有parp抑制剂似乎都会降低钙水平。

biorad蛋白质测定的结果显示在图21中。由此获得的数据使得从邻甲酚酞测定获得的结果归一化，得到每质量蛋白质的钙质量。这些归一化结果如图22所示。

如图22所示，当结果归一化时，所有parp抑制剂显著降低钙水平。米诺环素、西洛他唑、鲁卡帕尼、尼拉帕尼和维利帕尼在降低钙水平方面特别有效。

实施例9：利用人血管平滑肌细胞(hvsmc)进一步测试parp抑制剂对血管钙化的影响

方法

将原代hvsmc在含有fbs(m199/5％fbs)的m199培养基中培养。将它们以已知的细胞密度铺平板，使其生长24小时，然后用对照(仅dmso)或钙化介质(含有2.7mm钙+2.5mm磷酸盐的dmso)+/-化合物处理。8天后，使用邻甲酚酞测定量化ca²⁺沉积和biorad蛋白质测定蛋白质含量来评估钙化。

除dmso阴性对照和dmsoca+p阳性对照外，在该实验中测试以下化合物：波生坦一水合物、己酮可可碱、氯沙坦、氨氯地平、阿托伐他汀、维利帕尼、米诺环素和西洛他唑。

包括波生坦一水合物和己酮可可碱作为最初检查的现有药物的实例，以检验牛vsmc模型中的parp抑制剂特征，结果为阴性(实施例4)。包括氯沙坦、氨氯地平和阿托伐他汀作为常见心血管药物(分别为血管紧张素ii拮抗剂、钙通道阻滞剂和他汀类药物)的实例，以检验它们是否抑制中膜性血管钙化。包括维利帕尼作为已知parp抑制剂的实例，其在实施例8中显示出抑制钙化。考虑到整个牛vsmc模型和人vsmc模型工作的阳性实验结果，将米诺环素包括在内(如实施例4-8所示)。考虑到人vsmc工作中的阳性实验结果，将西洛他唑包括在内(如实施例7和8所示)。

如图中所示，以0.05μm与3μm之间的浓度使用化合物。根据每种药物的处方信息中的剂量方案，选择这些浓度以模拟患者用药后这些药物的全身浓度。每2至3天更换培养基+/-抑制剂。

每个实验进行三次，图25至27显示平均值+平均值的标准误差(sem)。

结果

邻甲酚酞测定使发明人能够量化ca²⁺沉积，如图25所示。这表明dmso组(阴性对照)中的钙含量非常低。相反，在dmsoca+p组(阳性对照)中，钙水平显著升高。

biorad蛋白质测定的结果显示在图26中。由此获得的数据使得从邻甲酚酞测定获得的结果归一化，得到每质量蛋白质的钙质量。这些归一化结果如图27所示。

图27显示了归一化结果。维利帕尼、米诺环素和西洛他唑各自显著和反复地抑制钙化(窄误差条)。结果证实波生坦一水合物和己酮可可碱不抑制钙化。重要的是，结果还证实，示例性常见心血管药物(氯沙坦、氨氯地平和阿托伐他汀)也不会抑制中膜性血管钙化。误差条显示波生坦一水合物、己酮可可碱、氯沙坦、氨氯地平和阿托伐他汀的结果偏差很大。

总结

结果显示，在发育中的骨和病理性血管钙化中，细胞外聚(adp核糖)与细胞外基质的钙化区域之间有很强的空间关系，从而表明聚(adp核糖)与细胞外基质内钙化沉积物的构建之间可能存在直接的机制关系。

血管平滑肌细胞在钙化其基质时表达许多成骨蛋白，包括骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素，因此类似的聚(adp核糖)介导的构建过程也可能发生在血管钙化中。

发明人已经表明，所有已知的parp抑制剂(奥拉帕尼、鲁卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼和他拉唑帕尼)与米诺环素和西洛他唑一起显著减少了牛细胞和人体细胞体外血管钙化模型中的细胞外基质钙化。这表明减少体内中膜性血管钙化的潜在途径。通过测试其他心血管药物(尤其包括他汀类药物)的实施例的阴性结果，发明人已经排除了患者已经从其他常用的心血管药物接受中膜性血管钙化抑制作用。

由于上述化合物能够在低浓度下体外抑制钙化，这表明用于抑制中膜性血管钙化的药物可以在低剂量下使用，这确保了副作用应该是可克服的。