本发明涉及制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)准备包含卵黄的缓冲溶液；(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加蜂毒后进行搅拌；(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物进行冷却的同时，加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，并进行浓缩及干燥。
背景技术：
：蜂毒是指蜜蜂所具有的毒，自古以来，蜂毒的医学上的治疗效果得到认证。根据最近的研究结果发现蜂毒除了具有诸如抗癌作用、缓解关节炎、缓解动脉硬化、缓解腰痛、治疗皮肤伤口、增强免疫的作用、抗炎症作用、降低血压并增加血液中的淋巴细胞及红血球的再生的医学功能之外，还具有改善皱纹、美白作用等以美容为目的的作用。观察蜂毒的主要组成成分及其药理功能如下述表1中所示。[表1]成分药理功能成分比(％)肽(蜂毒肽、蜂毒明肽)镇定作用、免疫作用50％左右蛋白质(磷脂酶a2)破坏细胞、过敏15％胺类(组胺)降低血压1～2％蜂毒包含肽、蛋白质及低分子活性胺等，由40种以上的物质组成，主要的有效成分如上述表中所示。蜂毒的组成中，蛋白质类是由具有13kda以上的分子量的磷脂酶a2(phospholipasea2，pla2)、透明质酸酶(hyaluronidase)、磷酸酶(phosphatase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)等成分组成，主要具有破坏血液细胞膜、血液凝固、血管扩张及渗透、促进血液循环、促进蛋白质的水解等生理活性作用。尤其，磷脂酶和透明质酸酶为诱发强烈的过敏反应的蜂毒组成物质，对蜂毒具有过敏性的使用者而言，会引起非常严重的安全上的问题。因此，为了以治疗的目的使用蜂毒，可以说所述成分的失活或完全去除是必需的。据此，目前公知有从蜂毒中去除上述诱发过敏的物质的技术。例如，韩国授权专利第1382404号中记述了将蜂毒进行溶解以制备蜂毒溶液，并将该蜂毒溶液加入到乙二胺-n-丙基硅烷(primarysecondaryamine，psa)吸附剂中制备混合物，之后将其进行精密过滤，从而大规模制备去除杂质的纯蜂毒的方法。此外，韩国授权专利第1364506号中公开了使用截留(cut-off)分子量的大小为10kda以上的超滤膜来去除蜂毒中的磷脂酶，使精制蜂毒中含有4重量％以上的蜂毒明肽、50重量％以上的蜂毒肽的方法。此外，韩国授权专利第1608045号中公开了利用阳离子交换树脂来去除蜂毒中的磷脂酶，并只分离蜂毒肽的技术。但是，还完全没有如同本发明的利用卵黄制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法。技术实现要素：要解决的技术问题本发明是根据如上所述的需求而提出的，本发明的目的在于提供制备精制蜂毒的方法，所述方法能够在完好地保留诸如蜂毒肽及蜂毒明肽的蜂毒的有效成分的同时，能够有效地完全去除蜂毒的过敏成分磷脂酶a2及透明质酸酶。技术方案为了解决上述技术问题，本发明提供制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)准备包含卵黄的缓冲溶液；(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加蜂毒后进行搅拌；(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物进行冷却的同时，加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，并进行浓缩及干燥。此外，本发明提供去除过敏成分的精制蜂毒，其通过所述方法制备。有益效果通过本发明的方法制备的精制蜂毒完全去除诱导强烈的过敏反应的磷脂酶a2及透明质酸酶，从而能够制备从根本上对过敏反应安全的精制蜂毒，并且完好地保留包含在蜂毒中的有效成分，因此具有为了各种药理功能能够更加安心使用的优点。具体实施方式为了实现本发明的目的，本发明提供制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)准备包含卵黄的缓冲溶液；(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加蜂毒后进行搅拌；(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物进行冷却的同时，加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，并进行浓缩及干燥。本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述过敏成分可以是磷脂酶a2(phospholipasea2)及透明质酸酶(hyaluronidase)，但并不受限于此。此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(a)的卵黄为源自鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋等禽类蛋的生卵黄，可以使用将蛋进行割卵并分离为蛋清和卵黄而得到的卵黄。此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(a)的缓冲溶液优选可以是包含1～10％(w/v)的卵黄的ph为7～9的缓冲溶液，更优选可以是包含5％(w/v)的卵黄的ph为8的缓冲溶液。将卵黄溶解在缓冲溶液中时，卵黄蛋白质、卵黄卵磷脂、中性脂质及胆固醇等被卵黄卵磷脂乳化，从而形成以胶体状态存在的乳化悬浮液。此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(b)优选可以为向缓冲溶液中添加0.5～1.5％(w/v)的蜂毒，然后在30～50℃下搅拌5～20分钟，更优选可以为向缓冲溶液中添加1％(w/v)的蜂毒，然后在35℃下搅拌10分钟。以如上所述的条件向缓冲溶液中添加蜂毒后进行搅拌时，能够使蜂毒中所含有的诱发过敏的物质有效地结合于卵黄脂蛋白。此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(c)优选可以将经过搅拌的反应物进行冷却至-5～-15℃的同时，加入冷却至-10～-20℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质，更优选可以将经过搅拌的反应物进行冷却至-10℃的同时，加入冷却至-15℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质。如上所述，将结合有诱发过敏的物质的卵黄脂蛋白进行凝固时，能够进行离心分离以使凝固物沉淀，从而容易去除诱发过敏的物质。就本发明的制备精制蜂毒的方法而言，更具体地，可以包括以下步骤：(a)准备包含1～10％(w/v)的卵黄的ph为7～9的缓冲溶液；(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加0.5～1.5％(w/v)的蜂毒，然后在30～50℃下搅拌5～20分钟；(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物进行冷却至-5～-15℃的同时，加入冷却至-10～-20℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，并进行浓缩及干燥。更加具体地，可以包括以下步骤：(a)准备包含5％(w/v)的卵黄的ph为8的缓冲溶液；(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加1％(w/v)的蜂毒，然后在35℃下搅拌10分钟；(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物进行冷却至-10℃的同时，加入冷却至-15℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，并进行浓缩及干燥。此外，本发明还提供通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒。本发明的精制蜂毒的特征在于，未检测出诱发过敏的物质磷脂酶a2(phospholipasea2)及透明质酸酶(hyaluronidase)，并且作为蜂毒的有效成分包含60％以上的蜂毒肽、2％以上的蜂毒明肽。此外，在以金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株及痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacne)菌株为对象的抗菌实验中，与精制前的蜂毒相比，本发明的精制蜂毒显示出相似的抗菌效果，以豚鼠为对象确认精制蜂毒的抑制过敏的效果的结果，豚鼠中没有观察到异常变化，并且能够确认其没有抗原性。下面，列举本发明的实施例进行详细的说明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不受下述实施例的限定。制备例1：去除诱发过敏的物质的精制蜂毒的制备(a)准备100ml的ph为8的10mmedta缓冲溶液，其溶解有5％(w/v)的从生鸡蛋分离的卵黄。(b)向所述步骤(a)中所准备的缓冲溶液中添加购自大韩养蜂协会的1％(w/v)的蜂毒，然后在35℃下搅拌10分钟。(c)将所述步骤(b)的经过搅拌的反应物移到-10℃的冰袋后进行冷却的同时，缓慢加入冷却至-15℃的95％(v/v)的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质。(d)将所述步骤(c)的经过凝固的-10℃的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀。(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，进行真空浓缩来去除乙醇，并进行冷冻干燥，从而获得0.75g的精制蜂毒。实施例1：精制蜂毒的抗菌能力为了确认制备例1中得到的精制蜂毒是否保持生理活性，通过最低抑菌浓度(minimuminhibitionconcentration，mic)和最低杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)分析对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株及痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacne)菌株的抗菌能力。[表2]精制前蜂毒和精制后蜂毒的抗菌能力的比较其结果可以确认，与精制前蜂毒相比，制备例1的精制蜂毒完好地保留抗菌效果。实施例2：精制蜂毒的成分变化对精制前蜂毒和通过制备例1的方法进行精制的蜂毒的蜂毒肽、蜂毒明肽、磷脂酶a2、透明质酸酶的成分进行分析。分析设备使用液相色谱仪，柱为sephadextm75、source15rpcst、c18、rp-amide、peptidees-c18，并通过下述式计算蜂毒中的蜂毒肽、蜂毒明肽、磷脂酶a2、透明质酸酶的含量，将其结果示于下述表3中。所取的标准品的量(mg)×(标准品的纯度/100)×(蜂毒中所需成分的峰面积)/(标准品的峰面积)×(100/蜂毒的量)[表3]精制蜂毒的成分变化成分含量(％)蜂毒肽蜂毒明肽磷脂酶a2透明质酸酶精制前蜂毒652.5111.8制备例1632.700其结果可以确认，本发明的精制蜂毒中没有检测出诱发过敏的物质磷脂酶a2(phospholipasea2)及透明质酸酶(hyaluronidase)，并且作为蜂毒的有效成分包含60％以上的蜂毒肽、2％以上的蜂毒明肽。实施例3：精制蜂毒的抑制过敏的效果试验为了确认本发明的精制蜂毒的抑制过敏的效果，进行如下被动皮肤过敏反应(passivecutaneousanaphylaxis，pca)试验。1)试验物质：制备例1的精制蜂毒2)赋形剂：生理盐水注射液3)阳性对照物：卵白蛋白(ovalbumin：源自鸡蛋)4)阳性对照物质赋形剂：生理盐水注射液5)试验动物：300～380g的无特定病原体(spf)的豚鼠(guineapig)6)试验组的组成，施用量的决定，组的分离及施用[表4]试验组的组成及施用量的决定7)施用量的决定：使致敏和pca施用量相同。8)施用：致敏是施用于豚鼠的颈背部，pca反应的引发是使用致敏后采集的血液的血清。就引发pca的那天的被检血清而言，不同个体的每个血清使用2只用于引发的动物来实施pca反应。用生理盐水注射液将被检血清从10倍稀释至5120倍，每次以2倍进行连续稀释，然后分别以100μl施用于豚鼠背部皮内。皮内施用4小时后，将含有2％的伊文斯蓝(evan'sblue)的引发抗原液施用于后肢静脉内，从而引发pca反应。9)观察及检查：对一般症状及体重进行检查。pca反应的判定为如下，即，在引发pca反应30分钟后，以乙醚麻醉法牺牲试验动物后，将豚鼠的背部皮肤进行剥皮，并观察是否有青白色斑。出现青白色斑时，测量长径和短径，将通过(长径+短径)/2来算出的平均值为5mm以上的判定为阳性，并将显示出阳性的最终血清稀释倍数(最大稀释倍数)定为该血清的最终效价(抗体效价)。10)试验结果-一般症状：未观察到由本发明的蜂毒引起的特殊症状及死亡动物。-体重变化：未观察到由本发明的蜂毒引起的体重变化。-pca的判定：本发明的蜂毒的抗原性是以利用豚鼠的pca反应诱发性为指标来实施，并将其结果示于下述表5中。[表5]pca结果(阳性反应动物数量/试验动物总数量)稀释倍数g1g2g3g4100/100/100/1010/10200/100/100/1010/10400/100/100/1010/10800/100/100/1010/101600/100/100/1010/103200/100/100/1010/106400/100/100/108/1012800/100/100/106/1025600/100/100/105/1051200/100/100/103/10pca反应结果，包括阴性对照组g1在内的蜂毒低用量施用组g2、高用量施用组g3均未观察到青白色斑。另一方面，在阳性对照组g4中，抗体效价为5120倍，出现了明显的pca反应。由此结果可以判断，根据本发明制备的精制蜂毒没有抗原性。当前第1页12