作为肝细胞癌治疗剂的龙葵皂苷B及其衍生物的制作方法

总的来说，本发明涉及新型皂苷及其衍生物，其用作药物，特别是用于癌症治疗的药物的制备方法。

背景技术：

就皂苷和皂苷衍生物描述本发明的的背景，不限制本发明的范围。三萜和甾体糖苷通常被称为皂苷，其主要分离自植物界，由于其巨大的结构多样性而表现出许多种药理学性质¹。皂苷形成天然存在的糖缀合物化合物的大家族，具有相当大的结构多样性。可变数量的糖通过糖苷键连接到这些化合物中的甾体、三萜或甾体生物碱糖苷配基。皂苷展现出广泛的生物活性和实际应用。

标题为“皂苷化合物，其制备方法，其用途和药物组合物(saponincompounds,methodsofpreparationthereof,usethereofandpharmaceuticalcompositions)”的第8,552,161号美国专利公开了皂苷化合物，其具有对甲氧基苯甲酰基取代，并且具有c6-10芳基、c6-10芳基-c1-4烷基、c1-18烷酰基、c3-18链烯基、c6-10芳基-c(o)-、c6-10芳基-c1-4烷基-c(o)-的取代，其中每个基团可以任选地被取代。这些化合物具有选择性细胞抑制活性，可用于例如治疗增殖性疾病。

标题为“来自茄属植物的水溶性提取物及其制备方法，和含有该水溶性提取物的药物组合物(watersolubleextractfromplantofsolanumgenusandthepreparationprocessthereof,andpharmaceuticalcompositioncontainingthewatersolubleextract)”的第7,078,063号美国专利公开了来自茄属植物的水溶性提取物，其基本上由至少60％-90％的澳洲茄边碱(solamargine)和澳洲茄碱(solasonine)组成。由茄属植物制备水溶性提取物的方法涉及用酸水解，用碱沉淀和用氯仿、醇和水作为提取溶剂分离处理的步骤。由该方法制备的水溶性提取物可以直接溶于纯水或中性ph的水中，以形成淡黄色澄清且透明的水溶液，其水溶解度为2-20mg/ml或更高。

发明概述

目前治疗肝细胞癌的组合物很少。用于肝癌的化学治疗选择有限，并且hcc患者的预后仍然令人沮丧。索拉非尼是通过高通量筛选由从头组合方法获得的，并且是于2007年被us-fda批准的目前唯一可用于治疗肝细胞癌的药物。从龙葵(solanumnigrum)的叶分离的龙葵皂苷b(uttrosideb)对肝癌细胞(hepg2)显示出选择性和显著的细胞毒性，ic50值为0.5μm，比唯一被fda批准的用于肝癌的药物索拉非尼的ic50(ic505.8μm)低11.6倍以上。对肝癌细胞(hepg2)的这种突出的选择性和显著的细胞毒性是令人惊讶且出乎意料的。在所评价的各种细胞存活信号传导途径中，龙葵皂苷b在hepg2细胞中诱导凋亡并下调mapk和mtor途径。在体外在正常的永生化肝细胞(张氏肝细胞)中和在体内使用瑞士白化小鼠的急性和慢性毒性模型评价了化合物的生物安全性。使用nod-scid小鼠的hepg2异种移植物模型的体内研究也确定了该分子对抗肝癌的抗癌功效。这些结果表明，龙葵皂苷b作为药理学上安全的药物保证了针对肝癌的进一步临床验证，而肝癌是当前化疗设备只有很少对抗其的手段的肿瘤。

本发明提供了用于治疗肝细胞癌的组合物，其中该组合物包括：药学上有效量的龙葵皂苷b，其置于药物载体中。本发明提供了提高龙葵皂苷b组合物的稳定性的方法，该方法包括向龙葵皂苷b组合物添加脯氨酸的步骤。本发明提供了用于抑制肿瘤生长的组合物，其中该组合物包含：药学上有效量的龙葵皂苷b，其置于药物载体中。本发明提供了通过诱导细胞凋亡、下调mapk途径、下调mtor途径或其组合来治疗肝癌的龙葵皂苷b组合物，其中所述龙葵皂苷b组合物包含：药学上有效量的龙葵皂苷b，其置于药物载体中。本发明提供了用于治疗肝脏疾病的组合物，其中该组合物包含：药学上有效量的龙葵皂苷b，其置于药物载体中。本发明提供了用作治疗肝脏疾病的药物的龙葵皂苷b组合物，其中该组合物包含：药学上有效量的龙葵皂苷b，其置于药物载体中。

本发明用于治疗任何形式或状态的肝脏疾病，包括但不限于肝脏硬化、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、肝硬化或原发性胆汁性胆管炎。类似地，本发明用于治疗任何形式或状态的肝癌，包括但不限于肝细胞癌(hcc)、纤维板层癌、肝胆管型癌症(胆管癌)、血管肉瘤或肝母细胞瘤。

任何组合物和药物可以进一步包含稳定剂，所述稳定剂包括脯氨酸，优选脯氨酸寡聚物，最优选游离脯氨酸。任何组合物和药物可以进一步包含一种或多种谷胱甘肽，任选一种或多种谷胱甘肽的寡聚物或植物螯合肽。

本发明可以与其他治疗以单剂量、多剂量、顺序剂量组合，与一种或多种活性剂，例如置于药物载体中的索拉非尼组合。

类似地，龙葵皂苷b的浓度范围约为0.05至150mg/kg体重，优选为5至80mg/kg体重，更优选为10至50mg/kg体重，最优选约为10mg/kg体重。当将药剂添加到药物载体以增加稳定性并降低龙葵皂苷b的活性时，可以提高龙葵皂苷b浓度。在一些情况下，可以是75-125mg/体重。龙葵皂苷b的浓度范围约为0.66μm至2mm，优选为0.066至1.32mm，最优选为0.132至1.05mm。

附图的简要说明

为了更完整地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，其中：

图1是显示龙葵皂苷b的结构的图像。

图2a-2f说明龙葵皂苷b对肝癌细胞显示出最大的敏感性。

图3a-3e是蛋白质印迹的图像，显示hepg2细胞中的半胱天冬酶活化。

图3f是显示龙葵皂苷b不影响hepg2细胞中细胞周期的任何阶段的图像。

图4a-4e是显示龙葵皂苷b抑制mapk和mtor信号传导的图像，mapk和mtor信号传导是肝癌中至关重要的存活信号。

图5a-5e显示在瑞士白化小鼠中龙葵皂苷b的毒理学评价。

图6a是说明抗肿瘤研究的图示。图6b是使用或不使用龙葵皂苷b处理4周后，携带hepg2异种移植物肿瘤的小鼠的代表性照片。图6c是显示龙葵皂苷b在nod-scid小鼠模型中有效抑制肿瘤体积的图。图6d是从对照和龙葵皂苷b处理的nod-scid小鼠组分离的肿瘤组织的组织病理学评价的图像。图6e是在龙葵皂苷处理的肿瘤切片中龙葵皂苷b诱导细胞凋亡的图像。

图7a是龙葵的有机提取物在一组五种癌细胞系中的细胞毒性的图。图7b是从龙葵分离的柱级分在hepg2细胞中诱导的细胞毒性的图。用所示的不同浓度的柱级分处理hepg2细胞，并通过mtt评估细胞活力。

图8a是由皂苷和脯氨酸(sp)的混合物在hepg2细胞中诱导的剂量依赖性细胞毒性的图。图8b是淡黄色泡沫状固体，脯氨酸和皂苷的混合物的图像。图8c是分离的皂苷和脯氨酸的剂量依赖性方式的细胞毒性的图。图8d是龙葵皂苷b(1)的图像，是白色固体。

图9是龙葵皂苷b(1)的hresims图像。

图10是龙葵皂苷b(1)的负模式ms-ms分析的图像。

图11是龙葵皂苷b(1)的正模式ms-ms分析的图像。

图12是来自龙葵皂苷b(1)的全乙酰化化合物(2)的合成的图像。

图13是龙葵皂苷b的¹hnmr谱的图像。

图14是龙葵皂苷b的¹³cnmr谱的图像。

图15是化合物2的¹hnmr谱的图像。

图16是化合物2的¹³cnmr谱的图像。

图17是显示由龙葵皂苷b在hetg2中诱导的形态变化和空泡形成的代表性图像。

图18是通过吖啶橙染色显示龙葵皂苷b诱导hepg2细胞中酸性空泡形成的代表性图像。

图19显示蛋白质印迹图像，该图像显示龙葵皂苷b诱导的mtor下游靶点磷酸-4e-bp1和磷酸-p70s6激酶的磷酸化作用的动力学。

图20显示代表性h&e图像，表明在nod-scid小鼠的hepg2异种移植物肿瘤中，龙葵皂苷b显著下调磷酸-4ebp1和磷酸-p70s6激酶的表达。

图21显示龙葵皂苷b对hepg2细胞中lc3i到lc3ii(微管相关蛋白1轻链3)的内源转化的时间依赖性作用。

图22显示龙葵皂苷b处理的携带hepg2异种移植物的nod-scid小鼠的肿瘤切片的h&e染色，显示出lc3的显著下调。

图23显示hepg2细胞中不同的自噬相关蛋白beclin-1、atg7、atg5的时间依赖性作用。

图24显示龙葵皂苷b对另一种肝癌细胞hep3b细胞中不同的自噬相关蛋白beclin-1、atg7、atg5、atg3、atg12的时间依赖性作用。

图25显示龙葵皂苷b显著上调nod-scid小鼠的hepg2异种移植物中的beclin-1的表达。

图26显示用于饱和自噬体-溶酶体阻断的巴弗洛霉素a1浓度的标准化。

图27显示龙葵皂苷b是hepg2细胞中的自噬诱导物。使用龙葵皂苷b(500nm)和/或巴弗洛霉素a1(10nm)处理细胞24小时以将lc3i内源性转化为lc3ii，并在15％的凝胶上解析全细胞裂解液，并针对lc3抗体进行免疫印迹。

图28显示使用ptflc3报告蛋白的自噬通量分析。

图29是显示由龙葵皂苷b在hepg2细胞中诱导的自噬的定量分析的条形图。

图30显示条形图，表明通过3-ma抑制自噬显著地增强龙葵皂苷b诱导的细胞毒性。

图31显示蛋白质印迹，表明龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被自噬抑制剂3-ma增强。

图32显示蛋白质印迹，表明龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被自噬抑制剂巴弗洛霉素a1增强。

图33显示蛋白质印迹，表明龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中半胱天冬酶9活化的切割被自噬抑制剂3-ma增强。

图34显示蛋白质印迹，表明龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中半胱天冬酶9活化被自噬抑制剂巴弗洛霉素a1增强。

图35显示蛋白质印迹，表明龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被beclin-1的基因沉默增强。

发明详述

虽然以下详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用，但是应该理解，本发明提供了许多可以体现在很多种具体环境中的可用的发明构思。这里讨论的具体实施方案仅说明形成和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有与本发明相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”的术语不旨在仅指单个实体，而是包括可以用具体实例来说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是除了权利要求中所概述的之外，它们的使用不限制本发明。

所述技术涉及龙葵皂苷b(从龙葵植物分离)作为肝细胞癌的治疗的用途。当前肝细胞癌的治疗包括：放射(内部或外部)、化疗栓塞、酒精注射、消融(冷冻或rf)和手术/移植。当前唯一可用的口服治疗性处理是由bayer&onyxpharmaceuticals生产的nexavar^tm(索拉非尼)，它是酪氨酸蛋白激酶抑制剂。

已报道了大量皂苷显示出针对许多种癌细胞的抗肿瘤作用^2-3。在天然产物研究中，皂苷针对各种癌细胞的化学治疗功效限于具体强调皂苷的结构鉴定的体外数据³。发现茄属的各种植物物种具有相当大量的皂苷，其针对不同的癌细胞系显示强效的抗癌活性^4,5。龙葵，俗称黑茄(blacknightshade)，是茄科家族的药用植物成员，广泛用于许多传统医学体系⁶。已报道了全植株的酒精提取物含有各种甾体皂苷，其在不同的癌细胞系中诱导细胞毒性^7-9。sharma等已经报道了两种呋喃甾醇皂苷，即龙葵皂苷a和b，其来自龙葵(s.nigrum)的茎和根的甲醇提取物¹⁰。

图1是显示龙葵皂苷b的结构的图像。龙葵皂苷b的特征在于在呋喃甾醇的c-26处存在β-d-吡喃葡萄糖基单元，在c-3处存在β-石蒜四糖苷单元。该化合物还已经从蒺藜(tribulusterrestris)¹¹和晚香玉(polianthestuberosa)¹²分离出来，并且已经显示针对pc-12(ic501.20μm)和hct-116(ic502.33μm)细胞的显著细胞毒性¹³和针对hela细胞的中度细胞毒性(ic5015.43μm)¹²。parvispinosideb是从细刺蒺藜(tribulusparvispinus)分离的另一种皂苷，其由于在石蒜四糖苷单元中仅有一个糖而在结构上不同于龙葵皂苷b，其针对u937白血病细胞系显示强烈的细胞毒性(ic500.5μm)，而针对hepg2细胞无效(ic50>100μm)¹⁴。然而，在本研究中，龙葵皂苷b针对hepg2细胞显示最大的细胞毒性(ic500.5μm)，其比fda批准的唯一用于肝癌的药物索拉非尼有效十倍以上(ic505.8μm)。龙葵皂苷b在hepg2细胞中的细胞毒性是通过对细胞凋亡的诱导，并通过体外(正常张氏肝细胞)和体内研究证实了其生物安全性。使用nod-scid小鼠的hepg2-异种移植物模型在体内进一步证明了该分子的抗癌效力。

图2a-2f说明龙葵皂苷b显示出对肝癌细胞的最大敏感性。图2a是比较龙葵皂苷b在一组不同来源的癌细胞中的ic50的图。如示出的，用龙葵皂苷b处理癌细胞系hela、a375、hepg2、mda-mb-231、hl60、a549和hct116，孵育72小时，通过mtt分析评估细胞活力。图2b是显示龙葵皂苷b在肝癌细胞系和正常的永生化肝细胞中的剂量依赖性作用的图。将肝癌细胞系hepg2、hep3b、skhep-1、huh-7和正常肝细胞(张氏肝)用龙葵皂苷b处理，孵育72小时，并且通过mtt分析评估细胞活力。图2c是比较龙葵皂苷b与索拉非尼的ic50的图。如示出的，用龙葵皂苷b处理hepg2细胞，孵育72小时，并通过mtt分析评估细胞活力。图2d是由龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞形态变化的图像。如示出的，用龙葵皂苷b处理hepg2细胞并孵育72小时。图2e是显示龙葵皂苷b抑制hepg2细胞的克隆形成潜力的图像。用不同浓度的龙葵皂苷b处理hepg2细胞72小时，并进行克隆形成分析。图2f是比较龙葵皂苷b在抑制hepg2细胞的克隆形成潜力方面的功效的图。对形成的克隆计数并绘制成图。将含有多于4个细胞的集落计数为一个克隆。

令人感兴趣的是，注意到hepg2(肝癌)细胞对该化合物显示出最大的敏感性，ic50为0.5μm，其次是a549(1μm)、hela(1.5μm)、a375(1.6μm)、mda-mb-231(1.6μm)、hl60(2.5μm)和hct-116(6μm)[图2a)]。接下来的尝试是使用mtt分析比较龙葵皂苷b在不同的肝细胞癌细胞(hepg2、hep3b、skhep1和huh-7)和正常的永生化肝细胞(张氏肝)中的作用。虽然没有在任何肝癌细胞之间观察到它们对龙葵皂苷b的敏感性(ic50：400-600nm)的显著差异，但即使在1250nm时，70％的正常的永生化肝细胞(张氏肝)也是存活的[图2b]。总之，揭示了龙葵皂苷b在纳摩尔浓度下针对肝癌细胞有效，同时对正常的永生化肝细胞无毒。选择细胞系组中最敏感的hepg2用于进一步研究。比较龙葵皂苷b与fda批准的唯一对抗肝癌的药物索拉非尼的细胞毒性。令人惊讶的是，在杀伤肝癌细胞方面，龙葵皂苷b的效力是索拉非尼的十倍以上[图2c]。在用龙葵皂苷b处理72小时后，通过相差显微镜检查hepg2细胞的形态变化。与未处理的对照相比，在龙葵皂苷b-处理的hepg2细胞中观察到剂量依赖性方式的核浓染、膜起泡和凋亡小体的形成，这些是细胞凋亡的特征[图2d]。还研究了龙葵皂苷b在hepg2细胞中以浓度依赖性方式的抗克隆形成潜力。克隆形成分析是体外分析，常规用作研究特定的药剂对细胞存活和增殖的有效性的技术^15,16。所形成的集落的数量和大小的急剧剂量依赖性减少表明龙葵皂苷b的抗克隆形成潜力[图2e-2f]。

图3a-3f显示龙葵皂苷b诱导半胱天冬酶依赖性的细胞凋亡，导致hepg2细胞中parp切割，而与细胞周期无关。图3a-3e是蛋白质印迹的图像，显示hepg2细胞中的半胱天冬酶活化。用指定浓度的龙葵皂苷b处理hepg2细胞48h后，制备全细胞提取物，用15％的凝胶解析全细胞裂解液，并使用针对半胱天冬酶8、9和7的抗体进行蛋白质印迹，通过ecl检测。将hepg2细胞用龙葵皂苷b以不同浓度处理48小时，并将全细胞裂解液在10％的凝胶上解析，针对抗parp进行免疫印迹并通过ecl检测。图3f是显示龙葵皂苷b不影响hepg2细胞中的细胞周期的任何阶段的图像。用龙葵皂苷b处理hepg2细胞48h，用碘化丙锭染色，用荧光激活细胞分选仪进行细胞周期分析。使用姜黄素25μm(24小时)作为阳性对照。

龙葵皂苷b诱导hepg2细胞中的细胞凋亡，但不影响细胞周期的任何阶段。使用蛋白质印迹法进行细胞凋亡分析。发现龙葵皂苷b在将启动半胱天冬酶半胱天冬酶原9切割为其活性片段(p35/37和p17)中表现出时间依赖性和浓度依赖性的增强[图3a]。24小时后出现半胱天冬酶活化的强烈诱导，并在48小时达到峰值。在48小时后以浓度依赖性方式进行剩余的半胱天冬酶及其下游靶点的分析。如之前观察到的，由于在48小时后以浓度依赖性方式的龙葵皂苷b处理，启动半胱天冬酶半胱天冬酶原9切割为其活性片段(p35/37和p17)增强[图3b]，半胱天冬酶原8切割为其活性片段(p43/41)增强[图3c]，并且半胱天冬酶原7切割为其活性片段(p-20)也增强[图3d]。如预期的，龙葵皂苷b诱导parp的切割，这是半胱天冬酶活化的下游事件。在龙葵皂苷b处理的细胞中，母带强烈切割为其子带，其中89kda的子带完全降解至25kda，而在对照细胞中母带116kdaparp保持完整[图3e]。可以通过流式细胞术分析定量测量核dna含量来评估给定细胞群向细胞周期的不同阶段的分布。用所研究的任何浓度的龙葵皂苷b处理hepg2细胞，即使在48小时后也没有显示对细胞周期的任何显著作用，而阳性对照(25μm)姜黄素在24小时后容易诱导细胞周期停滞在g2/m[图3f]。

图4a-4e是显示龙葵皂苷b抑制mapk和mtor信号传导的图像，mapk和mtor是肝癌中至关重要的存活信号。图4a显示龙葵皂苷b在nf-кb的核转位中没有任何作用。图4b显示龙葵皂苷b在hetg2细胞中诱导的akt磷酸化作用的动力学。用龙葵皂苷b处理hepg2细胞不同的时间间隔(0-240min)，并在10％的凝胶上解析全细胞裂解液，并针对磷酸-erk1/2和磷酸-akt抗体进行免疫印迹。紫杉醇用作阳性对照。图4c显示龙葵皂苷b下调p-jnk、p38和erk1/2的组成型和pma诱导的磷酸化作用。图4d显示龙葵皂苷b显著下调ap-1的核转位。图4e显示龙葵皂苷b的动力学—hepg2细胞中的龙葵皂苷b诱导的mtor的诱导磷酸化作用。用龙葵皂苷b以不同的时间间隔处理hepg2细胞，并在8％的凝胶上解析全细胞裂解液，并针对磷酸-mtor(2448)和磷酸-mtor(2481)抗体进行免疫印迹。

龙葵皂苷b在调节癌症进展中普遍存在的各种存活信号的作用。为了找出与癌症进展相关的一些主要信号传导事件相关的调节分子，用龙葵皂苷b处理hepg2细胞，制备核提取物和全细胞提取物。虽然在hepg2细胞中存在nf-κb的组成型活化，但是如通过电泳迁移率变动分析所评估的，龙葵皂苷b不能产生对nf-κb的任何显著的下调(emsa，图4a)。在这些细胞中也通过蛋白质印迹评估了akt的活化状态。然而，在hepg2中没有观察到akt的基础活化，因此，龙葵皂苷b在激活akt途径中没有显著作用(图4b)。有趣的是，mapk途径的基础活化在这些被龙葵皂苷b显著下调的细胞中是明显的，尤其是p-42/44和p-jnk信号传导。此外，pma诱导的p-jnk、p-38和p-42/44的活化也被龙葵皂苷b下调，表明该途径在调节龙葵皂苷b针对肝癌的抗癌潜力方面的重要作用[图4c]。支持这一观察结果，如通过电泳迁移率变动分析所评估的，mapk信号传导的下游靶点ap-1也被龙葵皂苷b下调[图4d]。mtor途径是主要的存活信号，在细胞生长和代谢中起关键作用，并且在近50％的肝癌中上调。在hepg2细胞中观察到该途径的强烈基础活化。我们通过蛋白质印迹分析检查了龙葵皂苷b是否可以下调这种激活的mtor。非常有趣的是，在2448和2481磷酸化位点处看到m-tor的磷酸化作用的时间依赖性减少，表明了在龙葵皂苷b暴露时p-mtor的活化[图4e]。

图5a-5e显示了龙葵皂苷b在瑞士白化小鼠中的毒理学评估。图5a是使用龙葵皂苷b在瑞士白化小鼠中的毒性研究的示意图。图5b-5d显示(b-d)龙葵皂苷b的血清生化分析，说明如通过急性和慢性毒性研究所评估的，其不诱导任何肝毒性、血液毒性和肾毒性。如图5e所见，如通过肝组织病理学分析所评估的，龙葵皂苷b不诱导肝毒性。从对照和龙葵皂苷b处理的瑞士白化小鼠组分离的肿瘤组织的组织病理学评价。福尔马林固定的冷冻切片使用苏木精和曙红染色。

如通过急性和慢性毒性模型所评估的，龙葵皂苷b在药理学上是安全的。如图5a中所示出的，为了排除由于龙葵皂苷b引起的任何毒性副作用的可能性，在瑞士白化小鼠中进行了该化合物的详细的毒理学评价。接受10mg/kg和50mg/kg剂量的龙葵皂苷b的小鼠组没有显示任何异常行为，并且没有显示肝功能异常的明确标志物ast[(天冬氨酸转氨酶，sgot)]、alt[(丙氨酸转氨酶，sgpt)]和alp(碱性磷酸酶)[图5b]的血清水平的任何偏差。在3个月的慢性细胞毒性研究中，通过分别在对照和处理的小鼠中分析wbc的总计数和差异计数的水平以及ast、alt、alp和bun(血尿素氮)的血清水平来分析由龙葵皂苷b引起的血液毒性、肝毒性和肾毒性[图5c-5d]。结果表明，任何这些参数与其值的正常范围没有显著差异，表明龙葵皂苷b在药理学上是安全且无毒的。对从急性(10mg/kg和50mg/kg)和慢性毒性研究(10mg/kg)中的小鼠分离的肝组织的组织病理学分析没有表现出毒性的任何形态变化特征，所述急性(10mg/kg和50mg/kg)和慢性毒性研究(10mg/kg)使用与用于肿瘤减少研究相同剂量的龙葵皂苷b。在急性毒性研究的肝组织中，在比处理剂量高5倍的量(50mg/kg)下，显示出微囊泡脂肪变化，这是与任何化学疗法相关的可逆变化。这些观察结果证实，龙葵皂苷b可以安全地用作化学治疗药物，用于通过临床前试验进行验证[图5e]。

图6：龙葵皂苷b抑制nod-scid小鼠的肝异种移植物肿瘤的发展。图6a是说明抗肿瘤研究的图示。图6b是使用或不使用龙葵皂苷b处理4周后，携带hepg2异种移植物肿瘤的小鼠的代表性照片。图6c是显示龙葵皂苷b在nod-scid小鼠模型中有效抑制肿瘤体积的图。示出了对照组和龙葵皂苷b处理组中hepg2异种移植肿瘤的平均体积。数据显示三组独立研究的平均值，每组9只动物(p值<0.005)。图6d是从对照和龙葵皂苷b处理的nod-scid小鼠组分离的肿瘤组织的组织病理学评价的图像。福尔马林固定的冷冻切片用苏木精和曙红染色。图6e是龙葵皂苷b在龙葵皂苷处理的肿瘤切片中诱导细胞凋亡的图像：使用切割的parp抗体对对照龙葵皂苷b处理的小鼠的肿瘤冷冻切片的ihc分析，并且在来自使用龙葵皂苷b处理的小鼠的肿瘤组织切片中检测到切割的parp的表达，说明细胞凋亡。

我们的下一个尝试是使用nod-scid小鼠的体内hepg2-异种移植模型验证龙葵皂苷b针对肝癌的抗癌潜力。将悬浮在基质胶中的hepg2细胞皮下注射到小鼠的胁腹区域。该研究已在图6a中示意性地表示。在肿瘤细胞植入15天后，当肿瘤达到约50-100mm³的尺寸时，给予溶解在pbs中的龙葵皂苷b。腹膜内注射龙葵皂苷b(10mg/kg体重)，每周三次，持续4周。组1由对照动物组成，其未接受任何处理。每周使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，并计算相应的肿瘤体积。与注射载体的对照小鼠发展的肿瘤体积相比，接受龙葵皂苷b的动物中发展的肿瘤体积显著地低。在处理期结束时，在接受龙葵皂苷b的小鼠组中没有外部可见的肿瘤，而在对照组中发展了可测量的肿瘤。然而，在处死时，在使用龙葵皂苷b处理的动物的皮肤下也观察到非常小的肿瘤，但与对照动物的尺寸相比，其尺寸显著更小[图6b-6c]。使用h&e染色对发展的肿瘤块进行组织病理学分析，其也表明在龙葵皂苷b处理的肿瘤组织中细胞的大量破坏，其与急剧的肿瘤减少相关[图6d]。nod-scid小鼠的异位移植的人肝异种移植物的福尔马林固定冷冻切片针对切割的parp特异性抗体的ihc染色显示了龙葵皂苷b的体内细胞凋亡反应。在来自用龙葵皂苷b处理的小鼠的肿瘤切片中观察到切割的parp表达的显著上调[图6e]。尽管该研究是在小鼠中进行的，但技术人员知道该剂量可以通过简单的数学转换成人的相当剂量。例如，对于小鼠的10mg/kg体重将转化为对于人的0.8mg/kg体重，并且得到0.05至1.2mg/kg体重的范围。

一些研究表明，许多含有来自植物的生物活性物的传统药物显示抗肿瘤作用，并且已经被用于治疗不同类型的癌症^17-20。有报道表明使用皂苷作为抗癌剂^3,21。rce-4，(1β,3β,5β,25s)-螺甾烷-1,3-二醇1-[α-l-鼠李糖基-(1→2)-β-d吡喃木糖苷]，一种从吉祥草(reineckiacarnea)分离的螺甾醇皂苷衍生物已显示出诱导人癌细胞的生长抑制和细胞凋亡²²。去半乳糖替告皂苷(degalactotigonin)(1059da)是已知来自龙葵(s.nigrum)的高细胞毒性(0.25μm)皂苷⁹。文献中存在的关于龙葵皂苷b针对宫颈癌和结肠癌细胞的细胞毒性潜力的报道很少^12,13，具有相对较高的ic50值(分别为15.43μm和2.33μm)，但还没有报道关于其生物安全性或作用机制的进一步的信息。据我们所知，这是第一项报告龙葵皂苷b对抗肝细胞癌的优异抗癌潜力，同时对正常肝细胞在药理学上是安全和无毒的研究。理想的化学预防剂应该是无毒的，在较低剂量下有效，经济的且容易获得的²³。尽管龙葵(s.nigrum)是印度传统医学体系中使用的重要草药，并且已广泛研究了从其分离出的几种分子的抗癌潜力，从这种植物分离的龙葵皂苷b，1215.12da皂苷的抗癌潜力尚未得到很好的研究。根据我们的观察，龙葵皂苷b对肝癌细胞的细胞毒性最大，尽管它也在其他癌细胞中诱导细胞毒性。本研究还揭示了龙葵皂苷b抑制肝癌细胞系hepg2的克隆形成潜力。大多数化学治疗剂主要通过诱导癌细胞中的细胞凋亡起作用。化疗的功效取决于细胞凋亡的成功诱导，因为细胞凋亡信号传导的缺陷是耐药性的主要原因²⁴。细胞凋亡是分子级联事件，其特征是半胱天冬酶的活化，半胱天冬酶被合成为酶原(半胱天冬酶原)，酶原响应化学治疗剂的蛋白质水解切割导致其活化。凋亡程序开始于启动半胱天冬酶的活化，然后是执行半胱天冬酶，其随后导致功能性酶如parp的顺序切割，从而有助于系统地去除肿瘤细胞而不对周围组织造成毒性或炎症。根据当前可接受的关于细胞凋亡的法则，发现龙葵皂苷b在肝癌细胞中诱导这种特征性分子事件，并使启动半胱天冬酶半胱天冬酶9时间依赖性地切割成其活性片段，并且切割的片段在24小时出现，在48小时达到峰值，这促使我们在48小时分析剩余的半胱天冬酶及其下游靶点。一旦被激活，启动半胱天冬酶半胱天冬酶-9/8激活效应半胱天冬酶半胱天冬酶-3/7从而促进细胞凋亡性细胞死亡的执行。在细胞凋亡期间，dna修复酶(聚(adp核糖)聚合酶，parp)最常经历被半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-7的蛋白水解切割，并且天然116kda被切割成含有cooh末端催化结构域的89kda片段和含有截短的nh2-末端dna结合结构域的25kda片段。parp切割被认为是半胱天冬酶活化的重要标志物之一。龙葵皂苷b诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡的所有经典标志物，如凋亡小体，半胱天冬酶和parp的切割的存在所证明的。细胞周期停滞的诱导是另一种机制，化学治疗药物通过该机制诱导癌细胞中的细胞毒性。报告表明，一些甾体皂苷，如薯蓣皂苷元(diosgenin)和异菝葜皂苷元(smilagenin)在g0/g1期阻断细胞周期，而一些其他的如剑麻皂苷元(tigogenin)对细胞周期没有影响，这表明a-和b-环中的空间构象的差异和5,6-双键的存在或缺失并非皂苷对细胞周期的作用方式的决定因素^3,25。我们的研究结果证实，龙葵皂苷b像剑麻皂苷元一样对细胞周期没有任何影响。hcc中肿瘤存活的机制是非常复杂的，涉及调节其生长的多种信号传导机制。nf-κb、akt、mapk和mtor是促进肝癌进展的最普遍的存活信号，大多数靶向肝癌的药物都是这些途径的抑制剂^26,27。龙葵皂苷b在hepg2细胞的nf-κb的组成型活化中不能产生任何显著的下调。另一个有趣的观察结果是在hepg2细胞中没有活化的akt，这使得我们也从调节龙葵皂苷b的抗癌潜力的可能途径的列表排除akt。然而，在这些细胞中被组成型激活的mapk和mtor两者的基础水平磷酸化作用被龙葵皂苷b完全消除，这暗示这两种途径在调节hepg2中的龙葵皂苷b诱导的细胞毒性中具有强作用。龙葵皂苷b还下调mapk途径的所有成员的pma诱导的磷酸化作用(jnk，p38和p42/44)。报告表明，雷帕霉素的哺乳动物靶点(mtor)途径在一定比例的hcc患者中被异常激活，并且mtor的抑制可以抑制肝肿瘤的生长和转移^28,29。此外，在胆管癌中经常观察到mtor的上调，胆管癌是肝脏中第二常见的原发性癌症³⁰。也已证明的是，在肝癌发生过程中，mtor和mapk途径之间的复杂的相互作用³¹。然而，需要更多的研究来确定这两种通路在调节龙葵皂苷b的抗癌潜力方面是相互依赖的还是彼此独立的。龙葵皂苷b的生物安全性在瑞士白化小鼠中使用短期(7天)和长期(3个月)毒性研究进行。几乎所有目前可用于治疗癌症的化疗方案都与相当大的毒性相关，其未超越而成为患者的最佳临床益处。与化疗相关的主要问题是血液学参数如淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞计数的减少。龙葵皂苷b在血液学参数方面没有产生任何显著差异，表明它不在动物中引起任何毒性或免疫抑制。在肝损伤发生后，alp(sgpt)、ast(sgot)和alt从受损伤的细胞释放，使其在血清中的水平升高。在急性和慢性毒性研究二者中，动物血清中肝功能酶的水平在正常范围内，表明龙葵皂苷b在体内是无毒的且在药理学上是安全的。正常水平的血尿素氮(bun)也表明，龙葵皂苷b在肾脏中没有产生任何严重的毒理学表现。如从体重减轻、皮毛褶皱、行为改变和食物摄入等总体测量得出的结论，高达5倍剂量的龙葵皂苷b未在研究动物中显示出任何累积的不良反应的迹象，表明龙葵皂苷b对体内给药是药理学上安全的。龙葵皂苷b在具有人肝癌异种移植物的nod-scid小鼠中产生的肿瘤生长的显著抑制说明并强调了龙葵皂苷b的化学治疗功效，其通过免疫组织化学分析肿瘤切片的切割的parp的表达进一步确定，切割的parp的表达的显著存在是细胞凋亡的明确标志物。

用于肝癌的化学治疗选择有限，并且hcc患者的预后仍然令人沮丧。通过高通量筛选的从头组合方法获得的，并于2007年被美国fda批准的索拉非尼是当前可用于治疗肝细胞癌的唯一药物。它是多激酶抑制剂，可以将存活率延长最高达20％，并且是在两项iii期试验的基础上被批准用于治疗晚期不可切除的hcc的唯一的全身药物，据报道它具有严重的副作用。在本研究中，从龙葵(solannumnigrum)分离出龙葵皂苷b，并发现龙葵皂苷b比索拉非尼更强效。这些结果保证了对龙葵皂苷b对抗肝癌的进一步临床评价。

一般研究程序：硅胶60f254铝tlc板被用于监测具有短波长紫外光的反应，并在用15％硫酸喷雾后使tlc板炭化以使斑点可视化。在60-120和230-400目硅胶上进行柱色谱。使用具有c18-phenomenex反相柱(250×21.20mm，15μ)的岛津(shimadzu)hplc仪器，使用梯度级ch3oh和h2o对半纯化的甲醇提取物进行纯化。分别在500mhz、700mhz和125mhz、176mhz下记录¹h和¹³cnmr谱。所有谱均以甲醇-d4和cdcl3记录。化学位移以百万分率表示，耦合常数以hz表示。hresims分析在thermoscientificexactive质谱仪上进行，离子以m/z给出。

将龙葵(linn.)叶材料在室温下干燥，然后研磨成粗粉末，得到100g材料。在摇床培养箱中，使用以下梯度溶剂系统以150rpm对粉末材料进行浸渍：己烷(500ml)、二氯甲烷(500ml)、乙酸乙酯(500ml)和甲醇(500ml)，在过滤和浓缩后，其产量分别为1.7克、2.5克、4.2克和6.3克。发现甲醇提取物针对肝癌细胞系活性最强。

图7a是龙葵的有机提取物在一组五种癌细胞系中的细胞毒性的图。使用指定浓度的己烷提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇提取物处理癌细胞，如示出的孵育72小时，并通过mtt分析评估细胞活力。图7b是从龙葵分离的柱级分在hepg2细胞中诱导的细胞毒性的图。用如所示的不同浓度的柱级分处理hepg2细胞，并通过mtt评估细胞活力。数据代表三组独立的研究。误差条表示±s.d。

龙葵皂苷b(1)的分离和纯化：通过柱色谱对甲醇提取物(6.3g)进行分离。将该柱(60-120目硅胶，45cm×3cm)用己烷填充，负载化合物并使用以下梯度溶剂系统洗脱：己烷/氯仿(100/0、80/20、60/40、50/50、40/60、20/80、0/100各500ml)至氯仿/甲醇(100/0、95/5、90/10、85/15、80/20、75/25、70/30、60/40、50/50各500ml)。在氯仿/甲醇(60/40)洗脱期间洗脱的级分浓度提供了主要的极性级分(1.125g)，其被发现为最佳活性级分。通过快速柱色谱法(230-400目硅胶，30cm×2cm)对极性活性级分(1.125g)进行进一步纯化。将柱用氯仿填充，负载化合物并使用梯度溶剂系统洗脱：氯仿(100ml)至氯仿/甲醇(90/10、80/20、70/30各300ml)。发现在以氯仿/甲醇(70/30)洗脱期间获得的级分含有浅黄色泡沫状固体(700mg)，如¹h-nmr中所观察到的，发现其为脯氨酸和皂苷的混合物。将脯氨酸和皂苷的混合物(700mg)再溶解于h2o(6ml)中，然后通过反相制备型hplc，使用以下梯度程序进行纯化：溶剂a(h2o)和溶剂b(meoh)，线性梯度0分钟0％b，5分钟10％b，10分钟20％b，15分钟30％b(分离的脯氨酸，130毫克，10-15分钟)，20分钟50％b，30分钟60％b，60分钟80％b，65分钟90％b，70分钟100％b。通过在tlc板上收集洗脱的级分并用15％硫酸的乙醇溶液炭化来监测在65％至80％b之间洗脱的皂苷。浓缩，然后冷冻干燥，得到白色固体龙葵皂苷b(1，120mg)。

图8a是皂苷和脯氨酸(sp)的混合物在hepg2细胞中诱导的剂量依赖性细胞毒性的图。用不同浓度的活性柱级分处理hepg2细胞，并通过mtt评估细胞活力。图8b是淡黄色泡沫状固体，脯氨酸和皂苷的混合物的图像。从龙葵(s.nigrumlinn)的甲醇提取物分离活性柱混合物，并使该级分经受真空条件。图8c是分离的皂苷和脯氨酸以剂量依赖性方式的细胞毒性的图。用指定浓度的脯氨酸和龙葵皂苷b处理hepg2细胞，如所示出的孵育72小时，并通过mtt分析评估细胞活力。数据代表三组独立的研究。误差条代表±s.d。图8d是龙葵皂苷b(1)的图像，是白色固体。从龙葵(s.nigrumlinn)的甲醇提取物的活性柱级分分离活性化合物，并使纯级分经受真空条件。

图9是龙葵皂苷b(1)的hr-esi-ms的图像。以负模式分析的龙葵皂苷b(1)的hr-esi-ms数据显示在m/z1213.6145处的(m-h)离子，表明分子式为c56h93o28。ms-ms负模式断裂得到在m/z1081.5(m-木糖-h)，919.5(m-己糖-h)，757.4(m-己糖-己糖-h)处的离子。正模式断裂得到在m/z1235.5(m-h2o+k)，1197.5(m-h2o)，1073.4(m-h2o-己糖+k)，741.4(m-h2o-己糖-己糖-木糖+h)，579.3(m-h2o-己糖-己糖-木糖-己糖+h)，417.3(m-h2o-己糖-己糖-木糖-己糖-己糖+h)，163.06(m-己糖-己糖-木糖-己糖-己糖-呋喃甾醇+h)处的离子。

图10是龙葵皂苷b(1)的负模式ms-ms分析的图像。关键结构表征：龙葵皂苷b的¹h和¹³c-nmr研究最初在cd3od溶剂中进行。关于甾体呋喃糖环的关键信息包括在δh0.99(3h,d,j＝7)处的h-21甲基和在δc112.5处的半缩酮碳c-22。由于3至4ppm之间的区域中的糖产生的复杂信号模式，龙葵皂苷b被乙酰化，得到全乙酰化化合物(2)。全乙酰化化合物(2)的¹h和¹³c-nmr研究在cdcl3溶剂中进行。令人惊讶的是，在乙酰化后，h-21甲基在δh1.57(3h,s)处显示出低场移位，并且h-17在δh2.45[1h,d,j＝9.8]处显示低场移位。在¹³c-nmr中，半缩酮碳峰消失，并且在δc103.7和151.7处出现另外两个峰，分别表示碳c-20和c-22。通过nmr的上述观察结果使我们相信由于乙酰化过程中水分子的损失，在呋喃糖环中出现新的烯键。

图11是龙葵皂苷b(1)的正模式ms-ms分析的图像。龙葵皂苷b(1)的全乙酰化：将龙葵皂苷b(1，20mg)溶于3ml吡啶:ac2o(2:1)中，然后在室温下在n2气氛下搅拌。24小时后，将反应混合物用饱和nahco3水溶液(25ml)淬灭，并用乙酸乙酯(25ml×2)萃取，用na2so4干燥并浓缩。通过柱色谱法使用己烷/乙酸乙酯60/40至40/60纯化，得到全乙酰化化合物2(10mg)，为白色固体，其通过nmr在cdcl3中表征。化合物2的hr-esi-ms[m+na]⁺c88h124o43na的m/z计算值为1891.7414，实测值为1891.7382。

图12是由龙葵皂苷b(1)合成全乙酰化化合物(2)的图像。本发明包括龙葵皂苷b的衍生化合物，其可以包括全乙酰化化合物(2)中所示的“r”基团的一个或多个取代。此外，通过完全取代“or”基团包括其他衍生物。可以进行取代以调节活性、特异性、溶解度或其他物理或化学性质。取代包括但不限于芳基、烷基芳基、芳基烷氧基、环烷基、桥连环烷基、环烷氧基、芳硫基、烷基亚磺酰基、甲酰胺基(caboxamido)、氨基甲酰基、芳硫基、烷基亚磺酰基、甲酰胺基、氨基甲酰基、羧基、羰基、卤代烷基、卤代烷氧基、杂芳基、杂环、芳基杂环、杂环化合物、酰氨基、烷基酰氨基羧酸酯、羧酸、磷酰基、卤素或氢。

图13是龙葵皂苷b的¹hnmr谱的图像。

图14是龙葵皂苷b的¹³cnmr谱的图像。

图15是全乙酰化化合物2的¹hnmr谱的图像。

图16是全乙酰化化合物2的¹³cnmr谱的图像。

2009年8月，从喀拉拉邦(kerala)的特里凡得琅(thiruvananthapuram)的局部区域收集了新鲜植物，并由印度喀拉拉邦大学植物学部负责人g.valsaladevi博士鉴定，并在拉吉夫甘地生物技术中心癌症研究实验部门(rajivgandhicentrebiotechnology,divisionofcancerresearchlaboratory)保存了凭证标本(voucherno：crp05)。

宫颈癌细胞系(hela)、乳腺癌细胞系(mda-mb-231)、肺癌细胞系(a549)、结肠癌细胞系(hct-116)、皮肤癌细胞系(a375)、肝癌细胞系(hepg2、sk-hep-1、hep3b和huh-7)、白血病细胞系(hl60)和正常肝细胞(张氏肝)购自国家细胞科学中心(nationalcentreforcellsciences)(pune，india)

重要的细胞培养试剂如杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)和硫酸链霉素从invitrogencorporation(grandisland，usa)获得。supersensitive^tm聚合物-hrpihc检测系统试剂盒从biogenexlaboratoriesinc(sanramon，usa)获得，并用于免疫组织化学研究。mtt试剂和amershameclplus^tm蛋白质印迹试剂购自gehealthcarelifesciences(piscataway，usa)。针对半胱天冬酶、β-肌动蛋白、p-p42/44、p-jnk、p-p38、p-akt、p-mtor和粘着斑蛋白的抗体从cellsignalingtechnologies(beverly，ma，usa)获得，针对parp的抗体购自santacruzbiotechnology(santacruz，ca，usa)。用于萃取、柱色谱和高效液相色谱(hplc)的所有化学品均为分析级，并且得自印度孟买的merckltd。用于柱层析的硅胶(60-120和230-400目)和用于薄层层析(tlc)的预涂硅胶60gf254板来自德国的merckltd。除非另有说明，否则所有其他化学品均购自sigmachemicals(st.louis,mo,usa)。

在dmso中制备龙葵的粗提物和分离的化合物的储备物用于体外研究并在-20℃下储存。所有研究，包括对照中的dmso浓度均≤0.2％。在药物处理72小时后进行细胞活力分析，同时在药物处理24小时和48小时后进行全细胞裂解液制备和细胞周期分析。为了研究nf-κb和ap-1，在提取前将龙葵皂苷b孵育2小时。

mtt[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物]分析是标准比色分析，适合分析增殖、活力和细胞毒性。简言之，将hepg2细胞接种在96孔板(2000个细胞/孔)中。孵育过夜后，用不同浓度的龙葵有机提取物(25-250μg/ml)和分离的化合物龙葵皂苷b(250-1250nm)处理细胞72小时，并测量细胞毒性。将含有25μlmtt溶液(在pbs中5mg/ml)和75μl完全培养基的新鲜培养基加入孔并孵育2小时。在孵育结束时，将裂解缓冲液(20％十二烷基硫酸钠在50％二甲基甲酰胺中)加入孔(0.1ml/孔)并在37℃下再孵育1小时。在孵育结束时，使用elisa板读数器(bio-rad)在570nm下测量光密度。相对细胞活力百分比计算为(处理样品的a570/未处理样品的a570)×100。由研究数据的多项式回归分析外推出ic50值¹⁷。

克隆形成细胞存活分析测定细胞无限增殖，从而保持其生殖能力，以形成大的集落或克隆的能力⁵。这种技术用于确定增殖细胞的长期命运，因为使用其他检测方法难以鉴定在晚期发生的细胞生长的不可逆停滞⁶。简言之，将500-1000个细胞/孔接种在6孔板中，并用不同浓度的分离化合物(龙葵皂苷b)处理72小时。然后吸出培养基，添加新鲜培养基并孵育1周。用戊二醛固定产生的克隆并用结晶紫染色。然后在显微镜下观察克隆，拍照并对集落计数并绘制图¹⁶。

蛋白质印迹分析。约0.5x10⁶个细胞在60mm培养板上生长，并如示出的暴露于药物期望的时间。然后刮出细胞，在冰冷的1xpbs中洗涤，并以13000rpm成团降下2分钟。将成团的细胞悬浮于150μl冰冷的全细胞裂解缓冲液[(ph7.4的20mmtris、250mmnacl、2mmedta、0.1％triton、1mmdtt(1,4-二硫苏糖醇)、0.5mmpmsf、4mm原钒酸钠，抑肽酶(5mgm/l)和亮抑酶肽(5mgm/l)]并在冰中保持30分钟，每5分钟间歇涡旋。孵育后，将裂解液在4℃下以13000rpm离心10分钟。收集上清液。用bradford方法估算裂解液中的总蛋白质含量，然后通过与5x上样染料一起煮沸使其变性，然后通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离蛋白质。电泳后，用towbins缓冲液(1l，25mmtris，192mm甘氨酸，20％(v/v)甲醇(ph8.3))平衡聚丙烯酰胺凝胶和pvdf膜15-30分钟，在寒冷的条件下，使用bio-radminiproteaniii湿印迹仪在100v下在2小时内将分离的蛋白质电转移到pvdf膜(hybond-p,gehealthcarelifescience)。转移后，用tbs-t(20mmtrisph7.5，150mmnacl，0.1％tween20)缓冲液冲洗膜，并用ponceau-s染色以确保均匀转移。用tbst洗掉ponceau染色后，将膜在室温下暴露于含有5％脱脂牛奶的tbst缓冲液1小时以阻断抗体的非特异性结合，然后与在含3％bsa的tbst缓冲液中的第一抗体[1:1000稀释]在4℃下一起孵育过夜。用tbst缓冲液洗掉过量的抗体，并在含5％脱脂牛奶的tbst缓冲液中与偶联辣根过氧化物酶(hrp)的相应的第二抗体[1:5000稀释]一起孵育。使用增强化学发光试剂盒(millipore,stcharles,mo,unitedstates)按照制造商的方案使条带可视化。

流式细胞术：细胞周期分析有助于区分细胞群向周期的不同阶段的分布。使用流式细胞术进行细胞周期分析以研究由龙葵皂苷b诱导的细胞周期停滞。通过用碘化丙啶染色dna定量测量细胞中的核dna含量来进行细胞周期分析。碘化丙啶是dna结合染料，其嵌入双链dna的主沟中，在488nm和约600nm处观察到其激发和发射峰。当将碘化丙锭添加到透化细胞的悬浮液时，它的掺入将与dna含量成比例，并且通过使用流式细胞仪测量总荧光发射可以确定细胞周期的阶段。简言之，将0.5x10⁶个细胞接种在60mm平板中，并经受龙葵皂苷b处理48小时，然后进行胰蛋白酶消化并成团降下。姜黄素(25μm，24h)用作阳性对照。将细胞团固定在70％冰冷的乙醇中，用5μl(10mg/ml)rna酶a处理并在37℃下孵育30分钟，加入10μl(10mg/ml)碘化丙啶并通过过滤管过滤，并使用facsaria^tm流式细胞仪(bdbiosciences)分析。

用于电泳迁移率变动分析的寡核苷酸探针的放射性标记：用龙葵皂苷b处理hepg2细胞2小时，刮下并悬浮于150μl裂解缓冲液(10mmhepes(ph7.9)、10mmkcl、0.1mmedta、0.1mmegta、1mmdtt、0.5mm苯基甲基磺酰氟、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml抑肽酶、0.5mg/ml苯甲脒)中30分钟，然后添加4.5μl的10％nonidetp-40。将团悬浮于25μl核提取缓冲液(ph7.9的20mmhepes、0.4mnacl、1mmedta、1mmegta、1mmdtt、1mm苯甲基磺酰氟、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml抑肽酶、0.5mg/ml苯甲脒)中2小时后离心，收集的核提取物(8μg蛋白质)用于进行emsa，所述emsa通过以下进行：将其与16fmol32p末端标记的来自人体免疫缺陷病毒-1长末端重复序列seqidno:1(5-ttgttacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtgg-3)的45-聚体双链nf-κb寡核苷酸和1μg/ml聚(didc)在结合缓冲液(25mmhepes(ph7.9)、50mmnacl、0.5mmedta、0.5mmdtt、1％nonidetp-40和5％甘油)中在37℃下一起孵育30分钟。使用6.6％的天然聚丙烯酰胺凝胶解析dna-蛋白质复合物，并通过磷光成像(bio-radpersonalfx)使放射性条带可视化¹⁷。

毒理学评价：a.动物：从拉吉夫甘地生物技术中心的动物研究机构(animalresearchfacilityofrajivgandhicentreforbiotechnology)获得6至8周龄雌性瑞士白化小鼠(18-22g)，并且该研究在拉吉夫甘地生物技术中心的机构动物伦理委员会(institutionalanimalethicalcommittee)批准的方案(iaec号:151(a)/ruby/2012)下进行。b.急性毒性研究：将瑞士白化小鼠随机分成3组，每组6只动物，并使其适应环境一周。第i组作为对照，仅接受载体，而第ii组和第iii组接受单剂量的溶于pbs的龙葵皂苷b(分别为10mg/kg和50mg/kg体重)。连续观察小鼠的任何总的行为变化和死亡1小时，然后在接下来的6小时和24小时间歇地观察。从处理当天开始，在接下来的7天经常观察动物，然后使动物在co2室中安乐死。收集血清用于分析肝功能的生化参数，其异常值说明毒性。将肝脏固定在10％的缓冲福尔马林中，将薄的冷冻切片(leicacm1850uv低温恒温器)用苏木精和伊红染色用于组织病理学评价¹⁷。

将瑞士白化小鼠随机分成2组，每组6只动物，并使其适应环境一周。第i组接受载体，第ii组接受10mg/kg体重的龙葵皂苷b。化合物隔天以腹腔注射给予，一周三次，持续3个月。在此段时间期间经常观察动物，之后使动物在co2室中安乐死。收集血清用于分析肝功能的生化参数，其异常值说明肝毒性。将肝脏固定在10％的缓冲福尔马林中，将薄的冷冻切片用苏木精和曙红染色，用于组织病理学评价⁹。

体内hepg2-异种移植物模型：所有动物研究均根据机构动物伦理委员会(instituteanimalethicalcommittee)iace号:151(b)/ruby/2012批准的方案进行。nod-scid(nod.cb17-prkdcscid/j)小鼠的异位异种移植物模型用于评价龙葵皂苷b的抗癌性质。该研究所需的动物获自拉吉夫甘地生物技术中心的动物研究机构，并且使用标准食物颗粒和高压灭菌水随意喂食。在无菌条件下进行动物处理、肿瘤诱导、药物处理和组织收集。

在人肝癌(hepg2)异种移植模型中评价从龙葵分离的龙葵皂苷b的抗癌活性：如文献中所述，在nod-scid小鼠中建立异种移植模型¹⁰。使用6-8周龄的雄性nod-scid(nod.cb17-prkdc^scid/j)小鼠进行研究。通过在小鼠右下或左下胁腹皮下注射hepg2细胞(100μl基质胶中7x10⁶个细胞)诱导肿瘤，并允许其生长两周的时间以获得约50-100mm³的尺寸，如游标卡尺所测量的。然后将小鼠随机分组为对照组和治疗组，每组9只动物。处理组腹膜内注射龙葵皂苷b(10mg/kg剂量，每周三次)持续一个月。每7天测量肿瘤体积以评价肿瘤生长和药物反应。在研究结束时处死动物并收集肿瘤样品用于组织病理学和免疫组织化学分析。

组织病理学：将组织冷冻切片用pbs洗涤(5分钟，2次)并用蒸馏水洗涤5分钟。然后将切片用苏木精染色2分钟。洗掉过量的染色，将载玻片浸入分化溶液中1-2秒。然后将它们分别在自来水中保持10分钟和在70％异丙醇中保持5分钟，并用曙红溶液复染1分钟。然后将切片转移至100％异丙醇并保持2分钟，在二甲苯中澄清1小时并用dpx固定。使用光学显微镜观察染色切片并拍照。肝脏和肿瘤组织切片的病理学由特里凡得琅医学院的病理学教授sankarsundaram博士检查和验证。

异种移植组织切片的免疫组织化学：根据制造商的方案supersensitive^tmpolymer-hrpihc检测系统(biogenex，ca，usa)，使用检测试剂盒对异种移植肿瘤组织切片中的各种蛋白质进行免疫组织化学分析。将多聚甲醛固定的oct包埋的组织切片在pbs中保持15分钟。使用柠檬酸盐缓冲液以热诱导抗原修复方法进行抗原修复。组织切片上的非特异性抗体结合位点被试剂盒提供的powerblock^tm试剂阻断。加入足以覆盖切片的预稀释的第一抗体，并在4℃下孵育12小时。用pbs洗净载玻片以除去未结合的第一抗体。然后用superenhancer^tm试剂覆盖切片，在室温下孵育20分钟，以增强信号并用pbs冲洗。然后将切片与聚-hrp试剂在室温下孵育30分钟。然后用pbs洗涤它们，之后加入底物溶液(dab色原)并孵育5分钟。然后将切片在pbs中洗涤并使用mayer苏木精复染1分钟，并使用dpx固定切片。使用leicadm1000显微镜以40x捕获图像。

酸性囊泡细胞器(avo)的吖啶橙染色

可以使用该方法分析作为自噬体特征的酸性囊泡的存在。吖啶橙将核染为绿色，并将酸性囊泡细胞器(avo)染为红色³²。为了检测hepg2细胞中avo的存在，将5x10³个接种在96孔板中，用龙葵皂苷b处理并孵育24小时。用1xpbs冲洗细胞两次。然后将处理过的细胞用吖啶橙染色，将其以1μg/ml的终浓度添加并孵育15分钟并立即使用荧光显微镜拍照。

质粒的分离和转染

开发名为ptf-lc3b的新载体，使双标记gfp-rfp-lc3b蛋白表达，有助于自噬通量的研究，并且这种重组蛋白可以区分自噬体(黄色)和自噬溶酶体(红色)³³。pgfp-mrfp-lc3b(ptf-lc3)载体购自addgene(21074)。简言之，根据制造商的说明(genelute^tmplasmidminiprepkit-sigma-aldrich)分离存在于细菌团中的质粒。根据制造商的方案，使用lipofectamineltx和plusreagent试剂盒(invitrogen，usa)，用gfp-rfp标记的lc3(ptflc3)的串联重复序列瞬时转染hepg2细胞。简言之，将ptflc3载体opti-mem转染培养基(溶液a)与溶解在opti-mem转染培养基(溶液b)中的lipofectamine试剂混合，并在室温下孵育45分钟。然后将转染混合物以50-80％密度覆盖在六孔组织培养板中的细胞中，并孵育6小时。24小时后将含有转染混合物的培养基抽出。

免疫荧光

为了细胞内蛋白质的免疫细胞化学定位，使细胞在玻璃盖玻片上生长并暴露于龙葵皂苷b24小时。然后用pbs洗涤细胞，用4％多聚甲醛固定，在室温下用0.1％tritonx-100透化15分钟，并用3％bsa的pbs溶液封闭1小时。添加在含有1％bsa的pbs中稀释的抗体(抗-lc3)(1:100)以覆盖细胞并在4℃下孵育过夜。用pbs洗去未结合的抗体，并将细胞与2μg/ml的荧光素缀合的或罗丹明缀合的第二抗体在室温下孵育1小时。然后洗掉未结合的第二抗体，用0.5μg/ml4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核染色10分钟。将具有细胞的盖玻片固定在甘油中，使用荧光显微镜检查并拍照。

beclinsirna转染

根据制造商的方案(invitrogen，usa)，使用lipofectamineltxplus试剂盒，用beclinsirna和对照sirna瞬时转染hepg2。将每孔0.35×10⁶个细胞接种在六孔组织培养板中，所述组织培养板含有2ml补充有fbs的无抗生素的正常生长培养基，孵育细胞以达到60％融合。将beclinsirna双链体溶液(溶液a)直接添加到稀释的转染试剂(lpltxplus试剂)(溶液b)。通过上下吸取轻轻地混合溶液，并在室温下孵育45分钟。用2ml转染培养基(optimem培养基)轻轻洗涤细胞。对于每次转染，将0.8ml转染培养基添加到含有sirna转染试剂混合物(溶液a+溶液b)的每个管。轻轻混合，将混合物覆盖到洗过的细胞上。将细胞在37℃下在co2培养箱中孵育5-7小时。除去转染培养基后，添加1ml正常生长培养基，将细胞再孵育18-24小时。通过用抗beclin-1的蛋白质印迹证实beclin表达的沉默，并且在药物处理前50-60h将转染效率标准化。

图17是显示hetg2细胞中由龙葵皂苷b诱导的形态变化和空泡形成的代表性图像。如示出的，用龙葵皂苷b处理hepg2细胞，孵育24小时，并在用龙葵皂苷b处理后通过相差显微镜研究hepg2细胞的形态变化。龙葵皂苷b还诱导空泡形成，这是自噬的独有特征。

图18是通过吖啶橙染色显示龙葵皂苷b诱导hepg2细胞中的酸性空泡形成的代表性图像。为了进一步证实龙葵皂苷b在hepg2细胞中的自噬诱导，将细胞暴露于细胞毒性浓度的龙葵皂苷b24小时的时间段，并用吖啶橙染料染色。ao橙将核染为绿色，将酸性囊泡细胞器，主要是自噬体染为鲜红色。它穿入酸性隔室并变得质子化。质子化的染料堆叠，并且堆叠的吖啶橙在红色范围内发射。在龙葵皂苷b处理的hepg2细胞中，ao阳性，增加的自噬体初步迹象清晰可见。

龙葵皂苷b抑制mtor信号传导，这是肝癌中至关重要的存活信号。

图19显示蛋白质印迹的图像，该图像显示龙葵皂苷b诱导的mtor下游靶点，磷酸-4e-bp1和磷酸-p70s6激酶的磷酸化作用的动力学。用龙葵皂苷b在不同的时间间隔处理hepg2细胞，并在15％凝胶上解析全细胞裂解物，并针对磷酸-4ebp1和磷酸-p70s6激酶抗体进行免疫印迹。同时，发现两种m-tor底物p70s6激酶和4e-bp-1的磷酸化作用响应龙葵皂苷b处理而降低，其磷酸化作用可被认为是m-tor活性的读数。龙葵皂苷b抑制mtor信号传导，这是肝癌中至关重要的存活信号。mtor在hcc的细胞生长和代谢中起关键作用，并且在40-50％的hcc中上调。此外，在胆管癌中经常观察到上调，胆管癌是第二常见的肝脏原发性癌症³¹。龙葵皂苷b处理也已显示在2448和2481磷酸化位点抑制m-tor的磷酸化作用[见图4e]。

图20显示代表性h&e图像，表明龙葵皂苷b显著下调在nod-scid小鼠的hepg2异种移植肿瘤中磷酸-4ebp1和磷酸-p70s6激酶的表达。进行对照和龙葵皂苷b处理的肿瘤组织的免疫组织化学染色。还检查了从nod-scid小鼠异种移植物研究收集的组织的p70s6k和4e-bp-1的磷酸化状态。如在体外研究中观察到的，在组织中也观察到这两种分子的磷酸化状态的显著下调。

龙葵皂苷b在hepg2细胞中诱导自噬。图21显示了龙葵皂苷b对hepg2细胞中lc3i到lc3ii(微管相关蛋白1轻链3)的内源转化的时间依赖性作用。用龙葵皂苷b在不同的时间间隔处理细胞，并在15％凝胶上解析全细胞裂解物，并针对lc3抗体进行免疫印迹。通过阻断mtor信号传导轴介导其活性的化合物很可能诱导自噬，因为存在通过mtor活性抑制自噬的信号传导途径。然而，它可以显著影响抗肿瘤剂诱导的细胞死亡，并且必须研究自噬过程响应龙葵皂苷b处理的状态并分析其在调节细胞死亡动力学中的作用。自噬体标志物lc3表达，微管相关蛋白轻链3(lc3)-i转换为lc3-ii，是自噬的经典标志物^32,34,35。自噬是动态过程，可以降解自噬体膜蛋白lc3ii以及在自噬体中负载的细胞承载物(cellularcargo)。因此，自噬通过测量lc3ii的周转率更准确地表示，而不是在给定的情况下表示其表达水平。

图22显示龙葵皂苷b处理的携带hepg2异种移植物的nod-scid小鼠的肿瘤切片的h&e染色，显示出lc3的显著下调。使用lc3抗体进行对照和龙葵皂苷b处理的肿瘤组织的免疫组织化学染色。为了检查龙葵皂苷b在肝脏肿瘤中是否具有相同的作用，在对照和龙葵皂苷b处理的肿瘤切片中进行ihc分析。在龙葵皂苷b处理的小鼠中，lc3的组织水平表达状态也非常高。图23显示hepg2细胞中不同的自噬相关蛋白beclin-1、atg7、atg5的时间依赖性作用。用龙葵皂苷b在不同的时间间隔处理细胞，并在15％凝胶上解析全细胞裂解物，并针对lc3、beclin-1、atg7和atg5抗体进行免疫印迹。为了研究不同自噬相关蛋白在hepg2和hep3b中的表达状态，用龙葵皂苷b以时间依赖性方式处理细胞，并针对beclin-1、atg5、atg3、atg12进行免疫印迹。结果表明，龙葵皂苷b在hepg2中以时间依赖性方式诱导所有自噬相关蛋白的上调。图24显示龙葵皂苷b对另一种肝癌细胞hep3b细胞中不同的自噬相关蛋白beclin-1、atg7、atg5、atg3、atg12的时间依赖性作用。用龙葵皂苷b在不同的时间间隔处理细胞，并在15％凝胶上解析全细胞裂解物，并针对beclin-1、atg7、atg5、atg3和atg12抗体进行免疫印迹。类似地，龙葵皂苷b在hep3b细胞中也以时间依赖性方式诱导atg5、atg7和lc3。图25显示龙葵皂苷b显著上调nod-scid小鼠的hepg2异种移植物中beclin-1的表达。使用beclin-1抗体进行对照和龙葵皂苷b处理的肿瘤组织的免疫组织化学染色。beclin是存在于复合物的重要蛋白质，有助于自噬体的生物合成³⁶。为了评价beclin-1在人肝癌异种移植物的肿瘤切片中的表达状态，进行免疫组织化学分析。在龙葵皂苷b处理的小鼠中，beclin-1的组织水平表达状态也非常高，说明其在肝癌细胞中诱导自噬的功效。

图26显示用于饱和自噬体-溶酶体阻断的巴弗洛霉素a1的浓度的标准化。巴弗洛霉素a1对hepg2细胞中lc3i内源转化为lc3ii的浓度依赖性作用。用不同浓度的巴弗洛霉素a1处理细胞，并在15％凝胶上解析全细胞裂解液，并针对lc3抗体进行免疫印迹。如通过使用巴弗洛霉素a1的自噬通量所分析的，龙葵皂苷b是hepg2细胞中的自噬诱导剂。先前已经讨论过，在龙葵皂苷b处理的hepg2和hep3b细胞系中均观察到自噬体诱导的标志之一，脂化和自噬体相关形式的lc3(lc3ii)的增加。lc3ii的增加不能被认为是自噬诱导的确定证据，因为导致从自噬体成熟到其与溶酶体融合的任何步骤中的阻断都可能造成其积累。因此，分析了hepg2细胞中龙葵皂苷b对自噬通量的影响，这是关于自噬-溶酶体抑制剂巴弗洛霉素共同处理的自噬的更准确的读数。巴弗洛霉素a通过阻断自噬体与溶酶体的融合来阻断自噬，这导致自噬体或lc3的积累。首先，标准化了使自噬-酶体融合的阻断饱和所需的巴弗洛霉素a1的浓度。发现巴弗洛霉素a1在阻断hepg2中自噬体降解方面的功效在10nm达到峰值，未注意到lc3ii进一步积累超过该值，这与较早的报道相符^32,37,38。

图27显示了龙葵皂苷b在hepg2细胞中是自噬诱导剂。在lc3i至lc3ii的内源转化方面，将细胞用龙葵皂苷b(500nm)和/或巴弗洛霉素a1(10nm)处理24小时，并在15％凝胶上解析全细胞裂解液并针对lc3抗体进行免疫印迹。与单独用巴弗洛霉素或龙葵皂苷b处理的细胞相比，当与龙葵皂苷b共同处理时，这个浓度的巴弗洛霉素导致hepg2细胞中lc3ii的过量积累。如果龙葵皂苷b是自噬阻断剂，因为自噬已被阻断，则不应该有lc3ii表达的任何进一步增强。在巴弗洛霉素a1存在下，由龙葵皂苷b诱导的该lc3ii的过量积累表明由于龙葵皂苷b处理引起自噬通量的增强，这有力地证明了龙葵皂苷b是自噬诱导剂。

使用串联的gfp-rfplc3报告蛋白定量分析自噬通量。图28显示了使用ptflc3报告蛋白的自噬通量分析。用编码gfp-rfp-lc3的ptflc3报告质粒瞬时转染hepg2细胞，在完全培养基中培养24小时，并用龙葵皂苷b(500nm)处理24小时。在共聚焦显微镜下拍摄显示gfp-rfp-lc3斑点的细胞的代表性图像。比例尺为20μm。图29是显示在hetg2细胞中由龙葵皂苷b诱导的自噬的定量分析的条形图。如前所述，用编码gfp-rfp-lc3的质粒瞬时转染hepg2细胞，对观察到的斑点计数并绘制为柱状图。接下来的尝试是使用串联gfp-rfplc3报告蛋白验证并定量由龙葵皂苷b诱导的自噬通量。gfp和rfp将根据细胞的ph条件发出荧光(florescence)。如果自噬体的ph值高于5，gfp和rfp都会发荧光，由于绿色和红色的融合，自噬体会发出黄色荧光。如果ph低于5，即酸性，由于自噬体和溶酶体融合，gfp将被淬灭，只有rfp将发荧光，细胞将显示为红色斑点^32,35,39。用报告质粒ptflc3转染hepg2细胞，该质粒含有与lc3融合的gpf-rfp的串联重复序列。质粒整合到细胞中的自噬体中，其作为斑点发出荧光。当用龙葵皂苷b处理转染的细胞时，黄色斑点和红色斑点的量增加，表明发生了自噬体的形成和它向自噬溶酶体的转化，即自噬通量。换句话说，龙葵皂苷b处理的细胞显示gfp+rfp+(自噬体)以及gfp-rfp+(自噬溶酶体)的增加，意味着自噬体的增强及其向自噬溶酶体的进展和自噬的增加，这已通过对斑点计数，将其以图形方式绘制来定量。所有这些证据表明，龙葵皂苷b是有效的自噬诱导剂。

自噬的抑制增强了龙葵皂苷b在hepg2中诱导的细胞毒性和细胞凋亡。自噬和细胞凋亡通常主要以自噬先于细胞凋亡的顺序发生在同一细胞中。这是因为应激经常刺激自噬反应，特别是如果应激水平不是致死的⁴⁰。在临床前模型中，显示通过遗传或药理手段的促存活自噬的抑制杀死肿瘤细胞并触发细胞凋亡性细胞死亡^41,42。使用两种自噬的药理学抑制剂，即3-ma和巴弗洛霉素a1，分析了龙葵皂苷b诱导的自噬在调节hepg2的细胞凋亡程序中的作用³²。为了评价这一方面，将hepg2细胞暴露于含有或不含抑制剂的龙葵皂苷b，并通过mtt分析评估细胞毒性的增强，并通过监测parp和半胱天冬酶9的切割来分析细胞凋亡的程度。3-ma是3类pi3k激酶抑制剂，其阻断自噬的早期，巴弗洛霉素a1是自噬的晚期抑制剂，其阻断自噬体和溶酶体的融合。在图30中，3-ma对自噬的抑制显著增强了龙葵皂苷b诱导的细胞毒性，如所示出的，使用含有或不含3ma(1mm)的龙葵皂苷b处理hepg2细胞，孵育72小时，并通过mtt分析评估细胞活力，并且在图31(龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被自噬抑制剂3-ma增强。用龙葵皂苷b和/或3-ma处理hepg2细胞12小时，在10％凝胶上解析全细胞裂解液，针对parp抗体进行免疫印迹并用ecl检测)和图34(龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被自噬抑制剂巴弗洛霉素a1增强。用龙葵皂苷b和/或巴弗洛霉素a1处理hepg2细胞不同的时间段，在10％凝胶上解析全细胞裂解液，针对parp抗体进行免疫印迹并用ecl检测)中并且在图32(龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp活化的切割被自噬抑制剂3-ma增强。用龙葵皂苷b和/或3-ma处理hepg2细胞12小时，在15％凝胶上解析全细胞裂解液，针对parp抗体进行免疫印迹并用ecl检测)和图33(龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中半胱天冬酶9的活化被自噬抑制剂巴弗洛霉素a1增强。用龙葵皂苷b和/或巴弗洛霉素a1处理hepg2细胞不同的时间段，在15％凝胶上解析全细胞裂解液，针对parp抗体进行免疫印迹并用ecl检测)中用两种抑制剂3-ma和巴弗洛霉素-a1预处理增强了龙葵皂苷b诱导的parp和半胱天冬酶9的切割。结果清楚地表明，由3-ma和巴弗洛霉素-a1抑制自噬增强了龙葵皂苷b在hepg2细胞中诱导细胞毒性和细胞凋亡的潜力。这个观察结果通过由沉默beclin-1对自噬的遗传抑制证实。在许多情况下，通过研究自噬相关蛋白atg6/beclin1确定自噬的作用。这种蛋白质是脂质激酶复合物的部分，并且最近的研究表明它在协调自噬的细胞保护功能和对抗细胞凋亡的细胞死亡过程中起核心作用⁴²。图35a(龙葵皂苷b诱导的hepg2细胞中parp的切割被beclin-1的遗传沉默增强。(a)用beclinsirna瞬时转染hepg2细胞，通过免疫印迹确认自噬抑制，通过lc3免疫印迹分析证实在beclin-1抑制的细胞中的自噬抑制。在图35b(beclin-1沉默的hepg2细胞使用或不用龙葵皂苷b处理24小时，在10％凝胶上解析全细胞裂解液，并针对parp抗体进行免疫印迹)中，当使用sirna抑制beclin-1表达时，在龙葵皂苷b诱导的细胞凋亡中观察到强烈增强，如通过切割的parp的表达增加所证明的。该实验证实，当龙葵皂苷b与自噬抑制剂一起使用时，龙葵皂苷b的抗癌功效可以被进一步增强。

除细胞凋亡外，龙葵皂苷b还诱导空泡化结构，其为自噬的特征并诱导自噬标记物，如肝癌细胞hepg2和hep3b中的lc3ii、beclin1、atg7、atg5、atg12和atg3的活化。使用巴弗洛霉素a1证实了使用龙葵皂苷b处理的hepg2细胞中自噬通量增加，并通过rfp-gfp-lc3标记的蛋白质分析定量，说明龙葵皂苷是自噬诱导剂。龙葵皂苷下调mtor及其下游靶点p-70s6激酶和4e-bp-1。自噬的药理学(使用巴弗洛霉素a1)和遗传(使用beclin-1si-rna)阻断增强了龙葵皂苷b诱导的细胞凋亡，这说明自噬是龙葵皂苷b介导的细胞凋亡的负调节剂。

肝癌细胞对龙葵皂苷b介导的细胞毒性显示出最大的敏感性，同时不影响正常的永生化肝细胞。如通过肝功能测试和组织病理学分析评估的，龙葵皂苷b在药理学上是安全的。

预期本说明书中讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

应当理解，本文所述的特定实施方案是以说明的方式显示的，而不是对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员仅使用常规研究将认识到或能够确定本文所述的具体过程的许多等价方案。这些等价方案被认为是在本发明的范围内，并且被权利要求覆盖。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。

当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，使用词语“一(a)”或“一(an)”可以表示“一个(one)”，但它也与“一个或多个(oneormore)”、“至少一个(atleastone)”和“一个或多于一个(oneormorethanone)”的含义一致。在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或””，除非明确指出仅指供选择的方案或供选择的方案是相互排斥的，尽管本文的公开内容支持仅指供选择的方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于表示这样的值，该值包括设备和用于确定该值的方法的固有误差变化，或研究受试者中存在的变化。

如在本说明书和权利要求(多项权利要求)中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括式的或开放式的，并且不排除其他未列举的要素或方法步骤。

本文使用的术语“或其组合”是指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中的至少一个：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，则还有ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该实例，明确包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。本领域技术人员将理解，除非从上下文显而易见，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。

根据本公开内容，无需过度研究即可形成和实施本文公开并请求保护的所有组合物和/或方法。虽然已经就优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文描述的组合物和/或方法以及步骤或方法的步骤顺序进行变化。对于本领域技术人员显而易见的所有这样类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

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