本发明涉及乳剂形式、特别是水包油型乳剂形式的包含某些多不饱和长链酮的药物组合物。本发明还涉及采用本发明的组合物治疗或预防某些炎性或增殖性病症的方法。
背景技术：
：大量现有技术的参考文献描述了将某些多不饱和长链酮用于治疗包括牛皮癣、皮炎、皮肤癌、肾小球肾炎和类风湿性关节炎的病症(参见ep-a-1469859、wo2010/139482、wo2012/028688、wo2014/082960和wo2015/181135)。这些参考文献描述的多不饱和长链酮具有两亲性，但主要具有疏水性，并因而不溶于水。缺乏水溶性限制了化合物的生物可利用度，并限制了技术人员向患者给予有用剂量的这些化合物的能力。特别是，缺乏水溶性限制了本领域技术人员向患者肠胃外(例如，静脉内、肌内或皮下)给予化合物的能力。本发明多不饱和酮化合物的另一个问题是它们易于降解。这些化合物的任何制剂还应该确保化合物在延长期限内保持稳定。本发明人寻求这些化合物的肠胃外给药问题及其稳定性问题的解决方案。目前本发明人已经发现可以将这些化合物有利地配制成乳剂，特别是水包油型乳剂。设想了乳剂的使用可以延长保质期，并且还应该允许通过肠胃外途径(如静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)和皮下(s.c.))给予本发明化合物。技术实现要素：因此，从一方面来看，本发明提供了以水性乳剂形式的组合物，所述组合物包含：(i)式(i)的化合物或其盐，r-l-co-cf3(i)其中r是未取代的直链c10-24不饱和烃基，所述烃基包含至少4个非共轭双键，l是在r基团和羰基co之间形成2至5个原子的桥的连接基团，其中l在连接基团的主链中包含s、so、so2中的至少一种；(ii)聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂；(iii)任选的甘油三酯；和(iv)缓冲剂、螯合剂和/或脂溶性抗氧化剂。从另一方面来看，本发明提供了以水包油型乳剂形式的组合物，所述组合物包含：(i)式(i)的化合物或其盐，r-l-co-cf3(i)其中r是直链c10-24不饱和烃基，所述烃基包含至少4个非共轭双键，l是在r基团和羰基co之间形成2至5个原子的桥的连接基团，其中l在连接基团的主链中包含s、so、so2中的至少一种；(ii)聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂；(iii)甘油三酯；和(iv)缓冲剂和/或螯合剂。从另一方面来看，本发明提供了以水包油型乳剂形式的组合物，所述组合物包含：(i)式(i)化合物r-l-co-cf3(i)其中r是直链c10-24不饱和烃基，所述烃基包含至少4个非共轭双键，l是在r基团和羰基co之间形成2至5个原子的桥的连接基团，其中l在连接基团的主链中包含s、so、so2中的至少一种；(ii)聚山梨醇酯表面活性剂；(iii)甘油三酯；和(iv)缓冲剂。从另一方面来看，本发明提供了治疗或预防炎性或增殖性病症的方法，所述方法包括向需要其的动物(优选哺乳动物，例如人类)给予有效量的如上定义的组合物。从另一方面来看，本发明提供了如上所述的乳剂在制备用于治疗或预防动物中的炎性或增殖性病症的药物中的用途。从另一方面来看，本发明提供了用于在治疗或预防动物中的炎性或增殖性病症中使用的如上所述的组合物。从另一方面来看，本发明提供了包括承载如上所定义的组合物的容器的制品。定义术语“本发明化合物”涉及式(i)的活性剂、或其盐或溶剂化物，特别是如本文所定义的化合物a或b。可以将术语“水包油型制剂”和“水包油型乳剂”互换使用以描述水相中的分散体。“分散相”包含本发明的化合物，并处于水相(“连续相”)中。术语“纳米乳剂”是指在水包油型乳剂中处于连续水相中的分散油相包含纳米直径(即1至1000nm)的疏水性液滴(即，“纳米液滴”)的水包油型乳剂。具体实施方式本发明涉及包含式(i)化合物或其盐的乳剂(特别是水包油型乳剂)，以及它们在治疗或预防多种病症(如炎性或增殖性病症)中的用途。本发明化合物优选存在于水包油型乳剂的分散相中。本发明的化合物该乳剂包含至少一种式(i)的化合物：r-l-co-cf3(i)，优选地，本发明的乳剂中仅存在一种式(i)化合物。基团r优选地包含5至9个双键，优选地5至8个双键，例如5至7个双键，如5或6个双键。这些键应该是非共轭的。如果双键不与羰基官能团共轭，也是优选的。基团r中存在的双键可以具有顺式或反式构型，但是，如果存在的大部分双键(即至少50％)具有顺式构型，则是优选的。在其它有利的实施方式中，基团r中的所有双键均具有顺式构型，或者所有双键均具有顺式构型，然而与羰基基团最接近的双键可以具有反式构型。基团r可以具有10和24个之间的碳原子，优选17至19个碳原子。r基团是未取代的。r基团是直链的。它优选地源自天然来源，如长链脂肪酸或酯。连接基团l在r基团和羰基之间提供2至5个主链原子(优选2至4个主链原子)的桥连基团。连接基团主链中的原子可以是碳和杂原子，并包含s、so或so2中的至少一种。连接基团优选是未取代的。它优选为直链的。连接基团的优选组成部分是-ch2-、-s-、-so-和-so2-，其可以以任何(化学上有意义的)顺序彼此组合以形成连接基团。因此，通过采用两个亚甲基和一个-s-基团，便形成了连接基团-sch2ch2-。连接基团l的主链含有至少一个杂原子。如果与r基团连接的连接基团的第一个主链原子是选自-s-、-so-和-so2-的杂原子或杂原子基团，则也是优选的。如果连接基团l的主链含有至少一个-ch2-连接，则是非常优选的。理想地，与羰基相邻的连接基团的原子是-ch2-。如果杂原子-s-、-so-或-so2位于羰基的α、β、γ或δ位，则是优选的，优选地位于羰基的β或γ位。因此，高度优选的连接基团是-sch2-、-soch2-或-so2ch2-，优选的式(i)化合物是式(i')的化合物，r-y1-ch2-co-cf3(i’)其中r如前定义；和y1选自s、so或so2。用于在本发明中使用的高度优选的化合物如下所述：其中x是cf3。高度优选地将以下化合物(特别是化合物b)用于本发明：在可能的情况下，化合物可以作为盐或溶剂化物存在于乳剂中。然而，优选地，不采用这种形式。可以使用j.chem.soc.,perkintrans1,2000,2271-2276或j.immunol.,1998,161,3421中描述的已知化学合成途径制备式(i)的化合物。目前已经令人惊讶地确定，当具有本文所述结构的化合物与聚山梨醇酯或泊洛沙姆表面活性剂和任选的甘油三酯赋形剂组合时，可以将其配置成乳剂，如水包油型乳剂，优选纳米乳剂。已经令人惊讶地发现，所述化合物的乳剂具有优异的长期储存稳定性，特别是在冰箱或冷冻室温度下。在不希望受理论束缚下，所述化合物具有两亲性，但主要具有疏水性。认为的是由于这些特性，本发明的化合物能够在水性环境中形成有序的纳米结构，如胶束。这些胶束不具有通常被纯化合物或常规溶剂中的化合物所采用的结构。目前发明人已经确定，包含本发明化合物和甘油三酯赋形剂的特别稳定的结构(如混合的胶束)具有优异的储存稳定性。乳剂中的本发明化合物的量可以改变。每毫升乳剂中的合适量为1至500mg，如1至300mg，更优选1至250mg，特别为1至150mg，特别为1至100mg。1至20mg/ml(如1至10mg/ml)的值是特别优选的。聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂本发明乳剂包含聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂。每毫升乳剂中的适当表面活性剂含量为0.1至100mg，如0.1至25mg表面活性剂，优选为每毫升乳剂0.2至20mg，如0.5至15mg，特别是1至12mg。聚山梨醇酯表面活性剂基于脱水山梨糖醇，其为每分子具有四个oh基团的糖衍生物。合适的表面活性剂是其中脱水山梨糖醇的oh基团被重复的乙氧基封端并且重复的乙氧基之一本身被脂肪酸酯封端的那些。可以采用多种聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、40、60或80。特别优选的表面活性剂是聚山梨醇酯80。可替换地，表面活性剂可以是泊洛沙姆。术语“泊洛沙姆”是本领域的术语，并且描述了具有一个聚氧丙烯中心嵌段和两个聚氧乙烯外部嵌段的嵌段聚合物。特别优选的泊洛沙姆是泊洛沙姆188。通常，聚乙氧基化的非离子表面活性剂在本文中是合适的。可以采用表面活性剂的混合物(如两种或更多种聚山梨醇酯、两种或更多种泊洛沙姆或泊洛沙姆和聚山梨醇酯)。优选地采用一种表面活性剂。在优选的实施方式中，活性化合物是以上定义的化合物a或b，并且表面活性剂是聚山梨醇酯，特别是聚山梨醇酯80。甘油三酯赋形剂除表面活性剂外，本发明的组合物还可以包含一种或多种甘油三酯，优选为一种甘油三酯。理想的是，甘油三酯组分用于溶解本发明的化合物，以在表面活性剂存在下促进水性环境中的胶束形成。在甘油三酯是次要组分的情况下，可以看出其有助于形成胶束和/或改善由本发明化合物形成的胶束的稳定性。在该赋形剂是主要组分(即以比化合物更高的重量百分比存在)的情况下，则可以将其视为化合物的一种类型的载体。甘油三酯优选为中链甘油三酯(mct)，其为具有由三个c6-c12脂肪酸(特别是己酸(c6:0)、辛酸(c8:0)、癸酸(c10:0)或月桂酸(c12:0))酯化的甘油主链的化合物。合适的来源包括玉米油、向日葵油、花生油、橄榄油、椰子油或最优选为mct油(高度纯化的椰子油)。每毫升乳剂中合适的赋形剂含量为0.1至500mg，如0.1至25mg甘油三酯，优选为每毫升乳剂0.2至20mg，如0.5至15mg，特别是1至12mg。当将甘油三酯的混合物用作赋形剂时，该赋形剂含量涉及甘油三酯的混合物。在优选的实施方式中，化合物是如本文所定义的化合物a或b，甘油三酯是mct油。在更优选的实施方式中，化合物是a或b，甘油三酯是mct油，并且表面活性剂是聚山梨醇酯80。在优选的实施方式中，可以存在：(i)1至20mg/ml的如上所述的式(i)化合物；(ii)1至20mg/ml的聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂；和可选地(iii)1至20mg/ml的甘油三酯。在优选的实施方式中，可以存在：(i)1至10mg/ml的如上所述的式(i)化合物；(ii)1至10mg/ml的聚山梨醇酯和/或泊洛沙姆表面活性剂，例如聚山梨醇酯80；和(iii)1至10mg/ml的甘油三酯，例如mct油。理想的是，乳剂的余量是缓冲剂和/或螯合剂(和水)。其它组分本发明的乳剂包含缓冲剂、脂溶性抗氧化剂和/或螯合剂。优选地，本发明的乳剂包含缓冲剂和/或螯合剂。理想地，乳剂含有缓冲剂。理想地，任何存在的缓冲剂将使乳剂的ph维持在约7。优选地，缓冲剂将乳剂的ph维持在6至9的范围内，优选为6至8，更优选ph为7±0.5。可以采用任何合适的缓冲剂。然而，特别优选的缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。理想地，乳剂是等渗的。缓冲剂的摩尔浓度可以是5至20mmol，如10mmol。某些缓冲剂(如柠檬酸盐缓冲剂)也可以结合痕量的金属，从而减少本发明化合物的氧化降解。可替换地或与缓冲剂一样，也可以存在单独的螯合剂，例如edta或其盐。该组合物还可以包含脂溶性抗氧化剂，如生育酚或其它维生素e类似物。本发明的乳剂还可以含有其它的活性组分，例如，其它药物，尽管这不是优选的。在最优选的实施方式中，乳剂由本发明化合物、聚山梨醇酯或泊洛沙姆表面活性剂、甘油三酯赋形剂和缓冲剂和/或螯合剂(以及水)组成。在另一个优选的实施方式中，本发明提供了以水性乳剂形式的药物组合物，其包含：约1mg至约500mg式a或b的化合物，其中x是cf3；约0.1mg至约10mg的聚山梨醇酯80；约0.1mg至约10mgmct油；和缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂。纳米乳剂在优选的实施方式中，本发明的乳剂是纳米乳剂。纳米乳剂包含分散的油相和连续的水相。分散相颗粒的平均粒径为1至小于1000nm，优选为5至200nm。可以通过常规方法(例如，通过显微镜(tem、sem、afm)、光散射技术(光子相关光谱(pcs))等)测量粒径。通常通过将多种组分(化合物、表面活性剂、赋形剂和任何添加剂)混合并且采用注射用水(wfi)使体积达到预定含量而形成本发明的乳剂(如本发明的纳米乳剂)。可以在加入表面活性剂之前，将本发明的化合物与甘油三酯预先接触。通常加入含有缓冲剂/螯合剂的水。然后，可以搅拌组分混合物，例如，使用振动器和/或利用超声处理。可以在生产乳剂后将其无菌过滤。稳定性存在于本发明组合物中的化合物可以分解成多种副产物。在稳定性研究中，发明人已经确定了特别值得注意的副产物是源自本发明化合物的亚砜和硫醇化合物。通过将化合物配制成如本文所述的乳剂，可以减少副产物的产生。如实施例所示，包含表面活性剂和本发明赋形剂的乳剂具有优异的长期储存稳定性。“稳定”是指在惰性气氛中以5℃储存1个月后通过色谱法测量的化合物峰面积降低不超过20％，并且优选地以5℃储存3个月后降低不超过20％，优选地以5℃储存6个月后降低不超过20％。优选地，在5℃下储存1个月、3个月或6个月后，峰面积降低不超过10％。最优选地，在惰性气氛中以5℃储存1个月、3个月或6个月后，峰面积降低不超过5％。优选地，在惰性气氛中以-20℃储存1个月后，通过色谱法测量的化合物峰面积降低不超过5％，并且优选地以-20℃储存3个月后降低不超过5％，优选地以-20℃储存6个月后降低不超过5％。优选地，在惰性气氛中在-20℃下储存1个月、3个月或6个月后，峰面积降低不超过3％。最优选地，在惰性气氛中在-20℃下储存1个月、3个月或6个月后，峰面积降低不超过2％。制品本发明的组合物适合用于对患者给药。为了给予乳剂，可以将组合物提供在容纳乳剂的容器中。容器可以与组合物给药说明书一起形成试剂盒的部件。当给药途径是肠胃外的(如皮下、肌内或静脉内)时，容器可以是包含预定量制剂的给药装置，例如，预填充的注射器。容器优选地包含添加的惰性气体以置换空气，并因此最大化储存稳定性。合适容器的体积可以高至10ml，如1至10ml。治疗提议将本发明的乳剂用于在治疗或预防炎性疾病或增殖性病症中使用，所述炎性疾病或增殖性病症包括牛皮癣、肾小球肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病性肾病、类风湿性关节炎、皮炎和如皮肤癌的癌症。具体地，提议将本发明的乳剂用于在治疗或预防包括糖尿病性肾病和关节炎(如类风湿性关节炎)的炎性病症或增殖性病症中使用。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指下列中的至少一种：(i)抑制疾病，即阻止、减轻或延缓疾病或其复发或其至少一种临床或亚临床症状的进展，或(ⅱ)缓解或减轻疾病的一种或多种临床或亚临床症状。“预防”是指(i)预防或延缓哺乳动物中发展的疾病的临床症状的出现。对待治疗的受试者的益处是统计学上显著的，或至少是患者或医生可察觉到的。通常，技术人员可以理解何时进行“治疗”。如果将本发明的组合物用于治疗(即治疗已经显示症状的病症而非预防性病症)，则是特别优选的。当将本发明组合物用于治疗比用于预防时，本发明的组合物可能更加有效。可以将本发明的组合物用于任何动物受试者，特别是哺乳动物，并且更具体地用于人类或作为疾病模型的动物(例如小鼠、猴子等)。为了治疗疾病，需要向患者给予有效量的活性组合物。“治疗有效量”是指在为了治疗病状、失调或病症向动物给药时组合物的量足够用于实现这种治疗。“治疗有效量”将根据组合物、疾病及其严重程度和待治疗的受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化，并且最终由主治医生决定。为了根据本发明治疗癌症，可能需要以一定时间间隔重新给予本发明的组合物。可以由医师确定合适的剂量方案。应当理解，根据本发明使用的药物组合物理想地是以肠胃外给药的形式，例如，作为注射用乳剂。治疗剂量通常为约10至2000mg/天之间，优选为约30至1500mg/天之间。可以使用其它范围，包括例如50-500mg/天、50-300mg/天、100-200mg/天。给药可以是每天一次、每天两次、或每天更多次，并且可以在疾病或病症的维持期期间减少，例如，每两天或三天一次，而不是每天一次或每天两次。剂量和给药频率将取决于临床症状，随着至少一种或多种(优选多于一种)的本领域技术人员已知的急性期的临床症状的减轻或消失来确定缓解期的维持。下面参考以下非限制性实施例来进一步描述本发明。实施例在实验中采用以下化合物：实施例1-稳定性研究制备两份重复的制剂用于稳定性研究：表1aa/b对比性c/day-14ay15-01组分含量(mg/ml)含量(mg/ml)含量(mg/ml)含量(mg/ml)化合物b5mg20mg2.0mg2.0mg聚山梨醇酯805mg-2.0mg2.0mgmct油5mg至1ml2.0mg2.0mg柠檬酸盐缓冲剂至1ml-适量至1mla)柠檬酸盐缓冲剂由1.5mm柠檬酸一水合物和8.5mm柠檬酸三钠二水合物组成(wfiph＝7)，并且将氩气用于置换空气。a：采用2mg/mlmct油和2mg/ml聚山梨醇酯80将化合物b溶解于10mm柠檬酸钠(ph7)中；作为填充过程的一部分，已经用氩气将样品饱和，并且填充在10ml冷冻稳定的聚合物小瓶中。在下表1b中，通过精确地称量测试材料(约500mg)至10ml容量瓶中并且用acn/水(95:5)稀释至该体积来制备样品。在每个时间点准备两份重复的样品。表1b计算ay15-01样品中的化合物b含量(两份重复样品)*将结果报道为mg/g，从而未将溶液密度考虑在内。常规步骤组分：2mg化合物b/ml纳米乳剂；mct油2mg/ml和p802mg/ml和柠檬酸盐缓冲剂10mm1.化合物b791mg2.mct油750mg3.聚山梨醇酯80750mg4.柠檬酸钠缓冲剂10mmph7，配制成375ml。在环境温度下在容器中将组分1和组分2混合，并用氩气吹洗。加入组分3，同时进行混合。在水浴中将共混物加热至80-85℃。在60-80℃下缓慢加入组分4，同时频繁地进行混合/涡旋。通过过滤将产物灭菌，用氩气吹扫，并且装至10ml小瓶中。用氩气吹洗小瓶，然后封闭小瓶。将小瓶冷冻在-20℃下。测定、纯度和杂质：所用方法是采用uv检测的rphplc方法。条件总结如下：表2对于ay-14，三个月的数据显示出测试参数没有变化，表明在-20℃下具有良好的稳定性。下表示出了制剂a-d和ay14的4个重复样品的稳定性：表3loq低表示太低而无法看到。1rrt0.57分钟，2rrt1.41分钟，3rrt3.78分钟。由样品1和样品2的数据集可以看出，ay15-01样品实验以一式两份进行。应该注意的是，色谱图是手动积分的，并且由于重叠峰/拖尾峰和“鬼峰”，积分不可避免地存在一些不精确性。但是，应该认为报道的亚砜量是准确的，因为在该保留区域中未观察到鬼峰/重叠峰。从以上数据可以看出，即使以-20℃储存6个月后，制剂a/b的化合物b峰面积基本不变。实施例2已经制备了更多的制剂：表4-ay12胶束成分ay12-01ay12-02ay12-03化合物b(100％)1.0mg2.0mg5.0mg聚山梨醇酯805.0mg10.0mg25.0mgmct油5.0mg10.0mg25.0mgedta5mm5mm5mm注射用水适量至1ml适量至1ml适量至1ml这三种制剂都在ph＝7下，并且将氩气用于置换空气。可以将这些实施例概括为：ay12-01：化合物b1.0mg/ml静脉内注射(“胶束”：p805mg/mlmct油5mg/mlna-edta5mmph7)ay12-02：化合物b2.0mg/ml皮下注射(“胶束”：p8010mg/mlmct油10mg/mlna-edta5mmph7)ay12-03：化合物b5.0mg/ml皮下注射(“胶束”：p8025mg/mlmct油25mg/mlna-edta5mmph7)测试这些材料以与对比例比较：ay12-04：化合物b2.0mg/ml皮下注射(纯mct油溶液)ay12-05：化合物b5.0mg/ml皮下注射(纯mct油溶液)ay12-06：化合物b2.5mg/ml腹腔注射(纯dmso溶液)数据见表5：实施例3背景胶原蛋白诱导的关节炎(cia)是临床前研究中常用的关节炎模型。在该模型中，通过向高应答者dba/1小鼠品系(或其它物种，如大鼠或猴子)注射在完全弗氏佐剂中乳化的ii型胶原蛋白(软骨成分)来诱导该疾病。胶原蛋白的引入破坏了耐受性，并且引导在关节上发作的免疫介导炎症，其可以基于关节炎指数评分通过评估标准疾病参数来进行测量(关节炎动物模型：预防和治疗的创新工具，annrheumdis.2011年8月；70(8):1357-62)。测试制品和制剂采用以下化合物：将化合物b配制成含有2mg/ml化合物b、2mg/mlmct油(lipoid)、2mg/ml聚山梨醇酯80(fluka)和柠檬酸钠缓冲剂10mm(ph7)的纳米乳剂以用于皮下给药。通过过滤将最终的溶液灭菌，并用氩5.0aga进行饱和，然后平均分配至多个10ml管中，储存在-20℃下直至以后使用。动物7-10周龄雄性dba/1小鼠来自中国北京vitalriver实验室(研究开始时的平均体重：18-25g)。将动物饲养在设定温度为23±2℃、湿度为40-70％、12小时光照/12小时黑暗周期的动物室中。贯穿整个研究过程，以自由采食的方式提供spf(无血清病原体)小鼠生长育种饲料(北京科澳协力饲料有限公司)。水是可以自由获取的。胶原蛋白诱导的关节炎(cia)-实验设计分组将40只雄性dba/1小鼠分成4组，并且根据下面的设计进行处理。表6组别处理方式给药途径给药方案给药体积动物数量1假治疗(无治疗)-每日2ml/kg72溶媒(dmso)腹腔每日2ml/kg113组合物b5mg/kg皮下每日2.5ml/kg114组合物b10mg/kg皮下每日5ml/kg11诱导cia用含有等体积牛ⅱ型胶原蛋白溶液(2mg/ml)和弗氏完全佐剂(fca)的0.1ml乳剂在尾基部进行免疫以在雄性dba/1小鼠(除假治疗组)中诱导cia。在第0天(day0)给予第一次注射，在第21天(day21)给予第二次注射作为加强剂。在第二次胶原蛋白注射前1小时开始治疗，并且持续至少21天。cia评估和治疗由两名观察者在不清楚实验设计的情况下利用容积测量方法(capacitymeasurementmethod)来测量爪肿胀以评估小鼠中的cia。通过对所有四只爪子的红斑和肿胀的严重程度进行评分来观察关节炎的发生，临床评分在如下从0(无肿胀)至4(严重的肿胀和红斑)的范围内，产生的最大关节炎指数(ai)评分为16(4爪×每爪的最大得分)(jmedchem.2014年9月25日；57(18):7523-35,kokotos等人)。评分等级：等级程度0无肿胀，正常外观1踝关节、腕关节或爪趾有轻微的肿胀和红斑2踝关节、腕关节或爪趾有中度的肿胀和红斑3踝关节、腕关节或爪趾有严重的肿胀和红斑4炎症最大化和关节僵硬；非常严重每个治疗组的详细给药信息如下。第1组：7只小鼠未接受胶原蛋白，用溶媒dmso(每天)处理，持续3周。第2组：通过胶原蛋白对11只小鼠进行诱导，并且用溶媒dmso(每天)处理，持续3周。第3组：通过胶原蛋白对11只小鼠进行诱导，并且用化合物b(5mg/kg，每天)处理，持续3周。第4组：通过胶原蛋白对11只小鼠进行诱导，并且用化合物b(10mg/kg，每天)处理，持续3周。在研究结束时，根据适用的伦理法则通过二氧化碳吸入对所有小鼠实施安乐死。临床观察记录每只动物的动物身体状况和临床症状(如果有的话)，在治疗开始前记录一次和在研究期间每天记录一次。每天以相同的时间间隔进行观察。还在分配至其相应组的当天进行体重测量，然后在关节炎评估的每一天进行体重测量。统计分析以平均值±sd表示数据。通过独立-样品t检验进行结果的统计分析。认为p<0.05的值具有显著性。结果化合物b对cia小鼠模型体重的影响从第32天到实验结束，与假治疗小鼠相比，观察到cia对照小鼠的体重显著减轻(p<0.005)。体重减轻或消瘦是该模型cia进展的典型特征。与溶媒处理的cia组相比，化合物b5mg/kg组在第34天和第39～43天显著抑制了体重减轻(p<0.05～0.005)，并且化合物b10mg/kg组在第25天和第32～43天显著抑制了体重减轻(p<0.05～0.005)(表7)。化合物b对cia小鼠模型中关节炎指数(ai)的影响在第32天，观察到cii免疫小鼠的cia发病率为100％，在免疫后第43天观察到最大化的ai(4.18)。从第27天到第43天，所有组的ai和发病率以时间依赖性模式增长。与cia对照组相比，在第41～43天，化合物b10mg/kg组的ai显著降低(p<0.05)。与cia对照组相比，化合物b5mg/kg组的ai指数也降低，然而该降低并没有达到统计学意义(p>0.05)(表8)。用化合物b治疗的动物没有出现其它明显的临床现象或副作用。研究结果表明，除其它状况外，在dba/1小鼠中成功诱导了关节炎。通过皮下给药进行治疗。化合物b减轻关节炎症状并减小疾病评分，并且没有副作用。实施例4采用以下化合物：由于stz糖尿病性肾病模型重现出人类疾病的多种特征，因而经常将其用于临床前糖尿病和肾脏的研究。在该模型中，将链脲佐菌素(stz)(来自霉菌灰色链霉菌(streptomycesgriseus)的具有反应性强的亚硝基脲基团的葡萄糖组织)注射到大鼠(或小鼠)中以诱导选择性破坏胰腺中的产生胰岛素的β细胞。这导致血糖含量升高，在4至6周的时期内(并延长至24周)导致进行性肾脏疾病，其具有肾脏血液动力学改变、肾小球基底膜厚度增加和促进肾脏炎症和纤维化发展的特征。重要的是，可以通过分析多种生物化学标志物(尿蛋白、白蛋白、蛋白质与肌酸酐的比值等)或组织学标志物(a-sma、纤连蛋白等)含量的增加来监测该模型的疾病进展，从而允许直接评估长期给予药物的作用(tesch,nephrology(carlton).2007年6月；12(3):261-6)。测试制品和制剂将化合物b配制成含有2mg/ml化合物b、2mg/mlmct油(lipoid)、2mg/ml聚山梨醇酯80(fluka)和柠檬酸钠缓冲剂10mm(ph7)的纳米乳剂以用于皮下给药。通过过滤将最终的溶液灭菌，并用氩5.0aga进行饱和，然后平均分配至多个10ml管中，储存在-20℃下直至以后使用。还制备单独的不含化合物b和mct油的基于聚山梨醇酯80和柠檬酸钠缓冲剂的溶媒溶液，将其灭菌、等量分装和储存，用作皮下溶媒对照用于stz动物研究。动物5-6周龄雄性sprague-dawley(sd)大鼠来自美国德克萨斯州休斯顿的harlan实验室(研究开始时的平均重量：125-135g)。将动物饲养在设定温度为23±2℃、湿度为40-70％、12小时光照/12小时黑暗周期的动物室中。贯穿整个研究过程，以自由采食的方式提供实验室饮食5001(pminutritioninternational)。水是可以自由获取的。实验仪器和分析使用了以下仪器：化学成分：血糖：relionultima血糖仪和试纸尿蛋白：bradford检测试剂盒：quickbradford染料试剂和bsa标准品。目录#500-0205(bio-radlaboratories，inc.hercules，美国，加州)。quickstart是基于蛋白质与碱性酒石酸铜溶液和福林试剂反应的比色测定法。尿白蛋白：nephratii定量测定大鼠尿白蛋白试剂盒。目录#nr002酶标板(exocellinc.，美国，宾夕法尼亚州，费城)。nephratii是用于定量测定大鼠样本中的尿白蛋白的直接竞争性elisa。使抗大鼠白蛋白抗体-hrp缀合物与标准品和尿样品稀释液反应。将显色底物tmb加入孔中，随后显色。颜色强度与样品的大鼠白蛋白浓度的对数成反比。尿肌酸酐：肌酸酐伴侣分析试剂盒。目录#1012(exocell，inc.，美国，宾夕法尼亚州，费城)用于测量尿肌酸酐。该方法是碱性苦味酸法的改进，需要测定添加酸之前和之后样品中的吸光度差异，以校正由于干扰物质而产生的颜色。测定仪器：bio-radimark酶标仪免疫组织化学：immpresshrp抗小鼠igg、大鼠吸附(过氧化物酶)聚合物检测试剂盒，mp-7422，vectorlaboratories，inc.加利福尼亚州，伯林盖姆。淬灭内源性过氧化物酶活性：0.3％h2o2过氧化物酶(hrp)底物试剂盒，3,3'-二氨基联苯胺试剂盒，sk-4100采用配备有dp-71数码相机的olympusbx51研究显微镜进行组织病理学分析。将image-proplus软件用于计算机辅助图像分析。分组将50只雄性sprague-dawleysd大鼠分成5组，每组10只，按照下面的设计进行处理。表9.分组和治疗组别描述给药途径给药体积动物数量1假治疗(溶媒)皮下，每天0.67-1.0ml102stz对照(溶媒)皮下，每天0.67-1.0ml103stz+化合物b[2mg/kg]皮下，每天0.67-1.0ml104stz+化合物b[4mg/kg]皮下，每天0.67-1.0ml105stz+化合物b[6mg/kg]皮下，每天0.67-1.0ml10诱导糖尿病性肾病(dn)通过尾部静脉注射50mg/kg剂量(在0.4-0.45ml柠檬酸盐缓冲剂中)的链脲佐菌素(stz)(s0130，sigmaaldrichcorporation，美国，密西根州，圣路易斯)以诱导大鼠的dn(假治疗组-组1除外)。假治疗对照接受类似的不含stz的柠檬酸盐缓冲剂的注射。在第0天给予注射。在第3天开始治疗，并且持续长达6周。分组治疗以上表9总结了该项研究的治疗方案。总之，在诱导糖尿病后，皮下(sc)给予3种不同剂量(2、4和6mg/kg)的化合物b，持续6周。对第1组(未接受stz的动物)和第2组(已经接受stz的动物)给予溶媒对照，每天给予一次，持续6周。定期采集尿液和血液，以允许如下所述多项生化分析。组评估贯穿整个研究过程，对所有组的动物进行以下评估：临床症状：记录每只动物的所有临床症状，在治疗开始前记录一次并且在研究期间每天记录一次。每天以相同的时间间隔进行观察。体重：在分配到其相应组的当天对每只动物称重，然后每次在注射每个测试制品之前进行动物称重以用于剂量体积调整。样品采集和评估临床化学评估血糖：通过采用无菌25g针从尾部的新鲜刺穿端采集一滴血以测量在第0周、第1周、第2周、第4周和第6周时间点的血糖。通过直接测试条分析立即进行血糖测量。尿蛋白：在第0周、第2周、第3周、第4周、第5周和第6周时间点，将大鼠置于代谢笼中以便采集尿液。测量12小时排尿量(在7-16ml范围内)的尿蛋白。将所有12小时尿蛋白值(以mg表示)外推至24小时，以符合本领域的标准实践。尿白蛋白：测量在第0周和第6周的时间点采集的样品的尿白蛋白。与尿蛋白数据一样，将白蛋白值外推至24小时，以符合本领域的标准实践。尿肌酸酐：测量在第0周和第6周的时间点采集的样品的尿肌酸酐。将尿肌酸酐数据用于测定蛋白质和白蛋白的比率，并且表示为毫克肌酸酐:克蛋白质或白蛋白(mg/g)，以符合本领域的标准实践。终末研究安乐死：根据标准道德准则以二氧化碳处理已经完成预定测试期的动物。将所有动物经受尸检，由病理学家监督，详情如下。贯穿整个实验直至实验结束，将处死动物的得分包括在组平均得分的计算中。尸检：在结束之日，在最后一次施用之后约5小时进行处死。对所有处死的动物进行动物肉眼检查，并且记录任何异常。肾脏组织采集：采血后立即摘除左右肾脏，将其切成3-4mm厚的冠状切片。将肾脏的中央切片置于福尔马林中，用于随后包埋和常规组织学评估。将几个切片置于铝箔条上并通过浸入液氮以快速冷冻，并置于气密储存瓶中，用于随后的免疫组织化学评估。将所有样品冷冻在-80℃下直至分析。进行了以下分析：组织病理学分析肾小球α-sma染色(用于肾小球系膜细胞活化的区域)：切割冷冻过的肾脏切片，并且使用标准免疫组织化学方法采用单克隆一抗(克隆1a4，sigmachemicalco，密西根州，圣路易斯)分批染色α-sma。根据制造商的说明书，采用immpress聚合物检测试剂检测过氧化物酶缀合的二抗(vectorlaboratories，inc.加利福尼亚州，伯林盖姆)。从分析中省略第3组(stz+化合物b[2mg/kg]皮下)。肾小球纤连蛋白染色(用于肾小球基质的区域)：切割冷冻过的肾脏切片，并且使用probetex进行的标准免疫组织化学方法采用单克隆一抗(克隆ist-9)abcam(马赛诸塞州，剑桥)进行分批染色，用于纤连蛋白染色(参见附图的sop))。从分析中省略第3组(stz+化合物b[2mg/kg]皮下)。计算机辅助图像分析α-sma和纤连蛋白染色：α-sma：(肾小球系膜细胞活化的区域)：通过图像分析评估肾小球α-sma染色。以10倍物镜放大倍数拍摄二十五张随机肾小球的数字图像。采用image-pro成像软件的示踪工具通过计算机辅助图像分析来测量肾小球染色的总面积以捕获肾小球区域。将图像分割并转换成灰度，然后伪色图代表背景(蓝色)区域和阳性染色(红色)区域，并且量化代表α-sma阳性的肾小球系膜细胞的百分比面积。将数据保存在excel电子表格上，计算平均染色面积，并且进行统计学分析。纤连蛋白：(肾小球膜细胞基质积聚的区域)：使用上述用于α-sma的相同方法进行纤连蛋白的肾小球染色图像分析。临床结果血糖：研究开始时的血糖平均值为127mg/dl(在120-131mg/dl的范围内)。除了大鼠#11(第2组)、21，31和32(第4组)和41(第5组)之外，在实验开始时所有接受stz的大鼠变为糖尿病(血糖>200mg/dl)。对于这项研究的剩余部分，这些大鼠中仅有#11进展至大于200mg/dl的值。在第2周时间点，剩余的大多数大鼠发展为高血糖症。然而，尽管在第2周开始时葡萄糖读数升高，但是一些大鼠(分布在各组中)并未维持其糖尿病病状。剩余的所有动物在第4周和第6周具有高于200mg/dl的葡萄糖值。仪表测量的灵敏度最高可达500mg/dl，因而其中的一些值可以处于估算值下。下面的汇总表示出了每组的平均血糖含量。表10.血糖测量值组别第0周第3天第6天第2周第4周第6周g1：柠檬酸盐(静脉内)+溶媒(皮下，每天)129.8111.6111.8122.0112.7110.3g2：stz(静脉内)+溶媒(皮下，每天)130.0288.6362.7359.6311.8293.0g3：stz+化合物b[2mg/kg]皮下，每天129.6300.3339.5340.1239.5210.8g4：stz+化合物b[4mg/kg]皮下，每天120.3285.5349.8327.4272.0251.0g5：stz+化合物b[6mg/kg]皮下，每天129.0305.1372.8370.1321.8304.3尿蛋白：各组在试验前的平均尿蛋白值在0.7至3.7mg/dl的范围内。stz对照组(第2组)示出在2周时的蛋白尿初始峰值为43.5mg/24小时。此后这些值降低，但是在第3周、第4周、第5周和第6周时保持被升高的水平，分别为27.2mg/24小时、33.9mg/24小时、30.2mg/24小时和34.2mg/24小时。在整个研究过程中，溶媒对照(第1组)中的蛋白尿在17.0-24.6mg/24小时的范围内。如下表11所示，与stz+溶媒相比，化合物b处理导致蛋白尿减少。尿蛋白与肌酸酐的比值提供更加准确的尿蛋白排出率估计值，并且不受水合作用的影响。因此，在第0周和第6周时间点测定尿蛋白与尿肌酸酐的比值。结果表明与单独的蛋白质测量值具有相似的趋势，但是组间差异性更明显。例如，在第6周时间点，与柠檬酸盐对照相比，stz+溶媒示出up/cr增加70％(1715:2919)。所有治疗组(低剂量化合物b除外)的比值均低于stz+溶媒的比值；遵循剂量依赖模式减小。表11.蛋白尿和蛋白质/肌酸酐比值(第0周至第6周)尿白蛋白：尿白蛋白比尿蛋白能更敏感地测量肾小球通透性缺陷，特别是对于糖尿病性肾病。与尿蛋白/肌酸酐相比，白蛋白与肌酸酐的比值提供更准确的尿白蛋白排出率估计值，并且不受水合作用的影响。因此，在第0周和第6周时间点测量尿白蛋白和尿白蛋白:肌酸酐比值。结果表明，对于尿蛋白数据观察到相似的趋势，其中各组在试验前的基线尿白蛋白:肌酸酐的平均比值在128至387之间。在糖尿病第6周时，柠檬酸盐对照组(第1组)中的白蛋白:肌酸酐的比值平均为457。在糖尿病第6周时，在stz+溶媒(第2组)中观察到最高的白蛋白:肌酸酐比值，并增加至1584。用stz+化合物b处理大鼠的所有组的白蛋白:肌酸酐比值小于stz+溶媒的白蛋白:肌酸酐比值(表12)。表12.尿白蛋白和尿白蛋白/肌酸酐比值尿白蛋白和ua/肌酸酐比值体重、化合物毒性和死亡率假治疗-溶媒(第1组)大鼠按预期体重逐渐增加。基于每组的平均体重测量值，相对于假治疗组，用stz处理的所有动物的生长发育迟缓。在整个研究过程中，动物健康状况看上去非常良好，并且对于化合物b处理组未观察到毒性或死亡率。结果-组织病理学肾小球α-sma染色(肾小球系膜细胞活化)在许多肾病(包括糖尿病性肾病)中，在活化后基底肾小球系膜细胞α-sma染色增强。假对照组(第1组)具有最小程度的肾小球系膜α-sma，其中平均染色面积为肾小球面积的2.1％。溶媒处理的stz对照(第2组)示出肾小球系膜α-sma染色的最高含量达到肾小球面积的4.6％。用化合物b治疗缓解了与肾小球系膜细胞活化相关的stz，并且所有治疗组的α-sma染色小于stz-溶媒对照(表13)。表13.肾小球α-sma染色(每个视野的染色百分比)α-sma染色第1组第2组第4组第5组平均值2.104.633.573.21sd0.951.761.211.16肾小球纤连蛋白染色(肾小球系膜基质扩张)用作基质积累指数的肾小球纤连蛋白染色显示出与a-sma观察到的类似趋势。与α-sma一样，在活化后在肾病(包括糖尿病性肾病)中的肾小球系膜fn染色增强。假对照组(第1组)中的基底fn表达的平均值为肾小球面积的18.2％。溶媒处理的stz对照(第2组)显示肾小球系膜fn染色的较高含量达到肾小球面积的22.8％。与溶媒对照相比，用化合物b处理导致fn表达显著降低(表14)。表14.肾小球fn染色(每个视野的染色百分比)fn染色第1组第2组第4组第5组平均值18.222.813.115.3sd2.94.34.53.1链脲佐菌素(stz)诱导糖尿病和糖尿病性肾病，相对于假对照，所示这种模型的典型特征为血糖、蛋白尿、白蛋白尿升高和表征为肾小球系膜细胞活化(通过获得α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)进行评估)和基质蛋白(纤连蛋白)积聚的组织病理学变化。以皮下制剂给药的化合物b(特别是在高剂量下)在该模型中能有效地减少蛋白尿、白蛋白尿、尿蛋白:肌酸酐和尿白蛋白:肌酸酐比值。类似地，通过免疫组织化学评估，化合物b减少估计的肾小球α-sma的肾小球表达和fn-蛋白表达。总之，在6周的治疗过程中，化合物b没有诱导副作用。当前第1页12