本发明涉及一种用于治疗癌症的药物。
发明背景
现在治疗癌症药物，大多是选用杀死癌症细胞或抑制癌症细胞的药物。但是，由于癌症细胞产生的耐药性，治疗癌症的效果都不理想。
本发明不是选用杀死癌症细胞或抑制癌症细胞的药物，是选用从调理人体自身的免疫力和自愈力着手，靠人体达到正常的自身免疫力和自愈力抑制癌细胞、抗癌细胞转移和分化癌症细胞为正常细胞，这样，癌症细胞的耐药性不起作用，从而治疗好癌症。
技术实现要素：
一种调理人体自身的免疫力和自愈力的抗癌药物，其特征是，由前列地尔(又名前列腺素e1.简称pge1)、前列腺素a1(简称pga1)、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.44g-0.60g
前列腺素a10.44g-0.60g
亚硫酸氢钠1.76g-2.4g
辅料原料重量比为：
前列地尔和前列腺素a1都是活血化瘀物质，可以提高人体免疫力。前列地尔有抑制癌细胞分裂和分化癌细胞向正常细胞转化作用，而不是直接杀死癌细胞。“肿瘤组织中前列腺素和camp有明显的变化。已知，当正常细胞向恶性细胞转化时，camp水平下降。……，当加入pge1后，camp的含量增多，甚至超过正常的5倍，其腺苷酸环化酶的活性也亦提高4倍之多。camp不仅能使肿瘤细胞向正常细胞逆转，并能增强宿主对移植的肿瘤细胞的抵抗能力”(李恩，人民卫生出版社，前列腺素与现代医学，p125)。前列地尔还有改善血液循环作用，尤其改善微循环作用显著，前列腺素a1有加强血液大循环比前列地尔持久，两者结合，优势互补，效力倍增，增强camp的作用。
亚硫酸氢钠是强还原性物质，在体内抗过氧化物质，具有抗癌和消除癌症发生条件的作用，并保护camp、前列地尔和前列腺素a1在体内外不被氧化和过氧化。
赖氨匹林在体内分解成阿司匹林和赖氨酸，阿司匹林具有抗癌细胞作用和抗癌细胞转移作用，赖氨酸是人体必需氨基酸而癌症病人体内不能自身合成营养物质。赖氨匹林还有抗炎作用，增强病人抵抗力，同时还有减少此针剂注射疼痛作用。
2-羟丙基-β-环糊精包含前列地尔和前列腺素a1.保护两者不被氧化和增强两者在水中溶解度。
低分子右旋糖酐40是赋形剂。磷酸氢二钾是缓冲剂。
制备方法如下：
1.辅料液制备：在环境洁净度c级下，用316或316l不锈钢辅料液桶，把上述辅料按重量比加入注射用水中，搅拌均匀。
2.辅料液灭菌：在保持121℃温度下，灭菌15分钟，注意辅料液桶用316或316l不锈钢盖盖住，放在环境洁净度b级蒸汽灭菌柜中灭菌。
3.保持辅料液在60±5℃过滤，用经灭菌的0.22μm膜过滤辅料液，注意在环境洁净度b级下，用经过灭菌的316或316l不锈钢筒式过滤器，2mpa压力以下滤过。
4.辅料滤液用经灭菌的洁净无菌316活16l已称皮重的不锈钢桶装着，316或316l不锈钢盖密封桶口；灭菌辅料液密封下，环境洁净度b级存放室温下自然冷却。
5.把辅料液在316或316l经过灭菌的不锈钢桶中称重，用重量法调整辅料液总重量，实际总重量与辅料计算总重量偏差±1g；如果称辅料液重量不够重量，用灭菌注射用水补足，再把辅料液真空吸入经过灭菌的316或316l不锈钢配料罐中密闭储存，在环境洁净度b级进行操作。
6.在配料罐中，每分钟80至100转速下，在辅料液中加亚硫酸氢钠，搅拌溶解完全。
7.在配料罐中，每分钟80至100转速下，用分析纯配制的重量百分比为8％氢氧化钠水溶液和分析纯配制的体积比为8％盐酸水溶液，滴加到辅料液中，调整辅料液为ph值为5.0-5.5。
8.在配料罐中，用适量的分析纯无水乙醇，溶解完全前列地尔和前列腺素a1至近饱和溶液，在每分钟80至100转速下，滴加前列地尔和前列腺素a1的近饱和乙醇溶液到辅料液中，溶解完全，用分析纯配制的重量百分比为8％氢氧化钠水溶液和分析纯配制的体积比为8％盐酸水溶液，滴加到辅料液中，调整辅料液为ph值为4.5-5.0。
9.用经过灭菌的316或316l不锈钢筒式过滤器，2mpa压力以下滤过，用0.22μm膜滤过；滤液收集到经灭菌的316或316l不锈钢装药液高位罐，密封；高位槽药液接入灌装机加塞机灌装针进液口。环境洁净度a级。
10.在罐装加塞机上，用经灭菌的5ml西林瓶灌装药液，每瓶灌装量1.20ml/瓶，连续称重灌装了的前10瓶药液，称重，计算每瓶净重，计算10瓶药液每瓶的平均重量，以后灌装每瓶药液重量，在每瓶平均药液重量的100％-104％范围内，并加胶塞；在环境洁净度a级操作。
11.把灌装并加塞的药瓶转入冷冻干燥箱内，先在板层温度-45℃以下保持2h冷冻，使药液结成冰，再保持板层温度在-30℃以下，箱内压力10-30帕压力下常规升华；到终点，箱内压力降低到2帕以下时，箱内在压力保持2帕以下前提下，逐步升温，温度升到25-28℃时，再保持4小时以上，最终制品中乙醇和水分总量≤0.5％-1.0％，以制品干燥失重检查。箱内及箱口环境洁净度a级。
12.在轧盖机运转正常下轧盖，每隔五分钟，随机检查瓶盖是否轧紧，不漏气；破损率：小于万分之五；质量检测合格，就制成了冻干针剂。环境洁净度b级。
13.制品在0-10℃下，避光保存。
具体实施方式
实施例1
前列地尔(前列腺素e1)、前列腺素a1、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.44g
前列腺素a10.44g
亚硫酸氢钠1.76g
辅料原料重量比为：
按照此实例原料辅料重量比投料。
制备方法同上。
实施例2：
前列地尔(前列腺素e1)、前列腺素a1、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.60g
前列腺素a10.60g
亚硫酸氢钠2.4g
辅料原料重量比：
按照此实例原料辅料重量比投料，制备方法同上。
实施例3：
前列地尔(前列腺素e1)、前列腺素a1、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.44g-0.60g
前列腺素a10.44g-0.60g
亚硫酸氢钠1.76g-2.4g
辅料原料重量比：
按照此实例原料辅料重量比投料，制备方法同上。
实施例4：
前列地尔(前列腺素e1)、前列腺素a1、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.44g-0.60g
前列腺素a10.44g-0.60g
亚硫酸氢钠1.76g-2.4g
辅料原料重量比：
按照此实例原料辅料重量比投料，制备方法同上。
实施例5：
前列地尔(前列腺素e1)、前列腺素a1、亚硫酸氢钠三种原料药以以下重量比组成：
前列地尔0.44g-0.60g
前列腺素a10.44g-0.60g
亚硫酸氢钠1.76g-2.4g
辅料原料重量比：
按照此实例原料辅料重量比投料，制备方法同上。
安全性试验验证：
a、单次给药毒性试验
1专题名称
icr小鼠静脉注射注射用前列地尔-前列腺素a1.或称注射注射用复方前列地尔单次给药毒性试验
2实验目的
注射用前列地尔-前列腺素a1由南昌蔡海德生物科技有限公司试验品，临床主要适应症为心肌梗死、血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症和癌症。本试验目的是通过小鼠静脉注射注射用前列地尔，观察其出现的中毒症状、中毒程度、性质、恢复情况及死亡等，阐明该药的急性毒性作用，了解其急性毒性靶器官，为该药的临床毒副反应监测提供依据。
3材料与方法
3.1供试品
3.1.1名称(英文名，缩写)：注射用复方前列地尔。
3.1.2批号.：20110502。
3.1.3规格：200g/支。
3.1.4纯度：102％。
3.1.5理化性质：白色或类白色粉针剂，水中易溶，ph5.0～6.0。赋形剂为右旋糖酐40、2-羟丙基-β-环糊精、赖氨匹林，添加剂为亚硫酸氢钠。
3.1.6供试品稳定性和保管
3.1.6.1保存条件：室温，避光密封保存。
3.1.6.2有效期：2011年05月16日至2013年04月。
3.1.6.3提供单位：南昌蔡海德生物科技有限公司。
3.1.7溶剂：0.9％氯化钠注射液。
3.1.8操作要求
3.1.8.1供试品配制：临用前，取注射用复方前列地尔(200g/支)加入适量0.9％氯化钠注射液，配制成所需浓度使用。
3.1.8.2供试品质量分析：由委托方承担此项工作。
3.1.9登记程序
3.1.9.1供试品留样：试验完成后留取部分样品于供试品保管室内。
3.1.9.2剩余供试品处理：返还委托方。
3.2实验系统
3.2.1品系：icr小鼠。
3.2.2级别：spf级动物。
3.2.3性别和数量：60只，♀♂各半。
3.2.4动物年龄：约28～35日龄。
3.2.5动物体重：接收时♀17.8±2.2g，♂19.0±2.0g。
3.2.6动物来源
3.2.6.1繁育单位：北京维通利华实验动物技术有限公司。
3.2.6.2地址：北京市昌平区流村镇瓦窑村东。
3.2.6.3许可证号：scxk(京)2006-0009。
3.2.6.4有效期：2011年12月27日。
3.2.6.5发证机关：北京市实验动物管理办公室。
3.2.7实验系统选择说明：(1)小鼠是急性毒性试验常用的啮齿类动物。(2)该动物遗传背景清楚。(3)委托单位同意使用这种动物。(4)实验操作简便，容易管理。(5)本实验室积累了多年工作的基础资料与数据。
3.2.8实验系统接收：动物的接收参照sopa105-2。
3.2.9饲养条件：动物实验设施持续保持屏障环境标准。主要环境指标的控制范围：温度23.2±0.7℃，日温差≤3℃。相对湿度59.7±0.1％。换气次数为10-20次/小时，光照明∶暗＝12h∶12h。动物饲养于标准盒内，每盒5只。由获得资格认证的人员进行饲养管理。每周2次更换消毒后的垫料和笼具，保持盒内环境清洁干燥；每日添加饲料和饮水，保持动物自由饮食活动。
3.2.10检疫及驯化过程：新领到的动物检疫期7天。在检疫期间小鼠皮毛光滑、反应灵敏、无异常分泌物，动物饮水、摄食均正常，健康无病，无死亡，可以使用。
3.2.11饲料
3.2.11.1种类：大小鼠维持饲料。
3.2.11.2制造单位：北京康蓝生物技术有限公司。
3.2.11.3生产许可证号：scxk(京)2006-0003。
3.2.11.4给料方法：每天给1次饲料。
3.2.11.5饲料营养及卫生指标：符合中华人民共和国国家标准gb14924-2001)。
3.2.11.6饲料的保存：保存在专门的饲料间里。
3.2.12饮水
3.2.12.1种类：经电渗析加多级过滤除菌的自来水。
3.2.12.2供水方法：每日冲洗饮水瓶并换水一次，供动物自由饮用。
3.2.12.3水中污染物含量检测：参照现行中华人民共和国国家标准gb/t14925和gb5749执行。
3.2.13本试验所用动物及相关处置应符合动物福利的要求，实验开展前要经过本机构实验动物管理与动物福利委员会的审查批准。
3.2.14动物识别方法
3.2.14.1实验动物的识别：对动物进行耳号标记，耳号与动物编号一一对应，在笼卡上显示出此笼动物的动物编号。
3.2.14.2实验笼具标号：分组前，用笼子卡片对分组前动物饲养笼进行标记，并注明实验编号、供试品名称、检疫起止日期、动物种系、动物号、性别、专题负责人。分组后，在笼卡上注明实验编号、供试品名称、浓度或剂量、动物组别、种系、性别、动物编号、专题负责人、动物实验起止日期。
3.2.15分组及组别识别方法
分组方法：检疫期最后一天对动物称重，根据动物体重按分层随机化分组法进行分组；雌雄动物分别进行分组。
3.2.16剩余动物的处理：动物分组后，将剩余动物移交动管部门处理。
3.3实验设计
3.3.1实验设计依据：
3.3.1.1采用标准：国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》和《化学药物急性毒性试验技术指导原则》中的有关规定和内容。
3.3.1.2委托单位提供资料：
临床拟用途径：静脉滴注。
临床拟用剂量：
心肌梗死：100g～400g/次。血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、癌症：100g～200g/次。
临床拟用疗程：心肌梗死3～5天/疗程，3～4疗程；血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、癌症15天/疗程，3～4疗程。
临床适应症：心肌梗死、血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、癌症。
3.3.1.3预试验结果
icr小鼠4只，雄性，单次静脉注射给药，给药剂量为5000g·kg-1，给药体积为0.25ml·10g-1，给药浓度为200g·ml-1，给药后3只动物于药后30min后死亡，连续观察至药后1天，无动物继发死亡。
3.3.2剂量与分组：本试验采用bliss法，给药剂量为5000、4475、4000、3584、3200、2560g·kg-1。注射用前列地尔浓度依次为200.0、179.0、160.0、143.4、128.0、102.4g·ml-1，给药体积25ml·kgbw-1。每组小鼠10只，雌雄各半。
表1.icr小鼠静脉注射注射用前列地尔单次给药毒性试验剂量设计
注：组距0.895，最后一组除外。
3.3.3给药方法：
给药途径：尾静脉注射给药(注射速度＜0.5ml·min-1)，按照sopt207-2进行。
给药体积：0.25ml·10g-1。
给药时间：1次(上午8：30～11：30)。
给药期限：给药1次。
3.3.4供试品配制：取注射用复方前列地尔冻干粉针剂，临用前在避菌操作条件下加入适量0.9％氯化钠注射液配制成所需浓度溶液。
3.3.5供试品分析：委托单位承担供试品纯度和稳定性的测定(包括在试验条件下的稳定性)，提供供试品有关纯度和制备方法的信息。
3.3.6各种指标的检测频率及方法
3.3.6.1临床症状观察
3.3.6.1.1观察次数：每天1次。
3.3.6.1.2观察例数：全部动物。
3.3.6.1.3观察方法：连续观察14天，给药后4小时内严密观察动物对供试品的反应。详细记录动物毒性反应情况，中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复时间及动物死亡时间和死亡动物数，死亡动物及时尸检，存活24h以上动物的肉眼观察到的病变组织、器官均需进一步作病理检查。3.3.6.1.4主要观察内容：
3.3.6.2体重测定
3.3.6.2.1测定次数：7次。
3.3.6.2.2测定例数：全部动物。
3.3.6.2.3测定时间：分别于接收时、给药前、给药后d1、d4、d7、d11、d14动物称重，且称重日相同时间(上午8：30～11：30)。
3.3.6.2.4测定方法：使用电子天平，进行称重。
3.3.6.3死亡或濒临死亡动物的处置：对于死亡动物，在临床症状观察记录上记载发现动物死亡的时间，记录相关情况，并填写动物死亡、处死记录。存活24h以上动物的肉眼观察到的病变组织、器官均需进一步作病理检查。对于濒临死亡动物，要记录其状态、症状表现及观察时间。察看动物死亡或濒死前期的实验处理等有关概况。测定体重以后，死亡动物身上贴上标签，记录实验编号、组别、性别、动物编号、体重等，濒死动物也进行相应记录。然后立即将死亡或濒死动物送到解剖室，由病理检查负责人或病理室其他工作人员对其进行检查、解剖，肉眼观察组织、器官有无异常或病变，分析动物死亡或濒死的可能原因。
3.3.6.4剖检及组织病理学检查
全部预定解剖的动物和濒死动物，脱颈安乐死动物后进行解剖。肉眼检查组织器官有无异常，肉眼观察到的病变组织、器官均需进一步作病理检查。
3.4结果统计与分析
使用dasver1.0统计分析软件，正规bliss法计算出ld50、ld50的95％可信限及回归方程。
4结果与讨论
4.1给药后动物死亡情况(见附表1)
动物尾静脉注射注射用复方前列地尔溶液后，5000g·kg-1剂量组动物出现明显中毒症状，10只动物全部死亡，死亡最早发生于药后2min，多数于30min内死亡。4475g·kg-1剂量组死亡8只动物，死亡最早发生于药后20min。4000g·kg-1剂量组死亡3只动物，均于药后30min左右死亡。3584g·kg-1剂量组1只动物于药后10min死亡。3200g·kg-1剂量组和2560g·kg-1剂量组无动物死亡。观察期14天内无动物继发死亡。5000、4475、4000、3584、3200和2560g·kg-1剂量组的死亡率分别为100、80、30、10、0、0％。
4.2给药后动物中毒症状描述
各组动物在给药后均出现少动、呼吸急促、俯卧笼底等症状，2560g·kg-1剂量组动物均于10min之内症状缓解；3200g·kg-1剂量组动物症状在4h内缓解。5000、4475、4000、3584g·kg-1剂量组除出现上述毒性症状外，多数动物在药后约10min出现强直性抽搐、角弓反张、震颤、竖尾、蹦蹿、尖叫等症状，动物表现极度不适，3584g·kg-1剂量组1只动物鼻部血性分泌物。部分动物在症状持续10min后扭体、痉挛死亡。存活动物在药后1天症状缓解。对死亡动物大体剖检发现，肺部大片新鲜出血灶，其它主要脏器无肉眼可见病变。
观察期，各组动物口、眼、鼻无异常分泌物，毛色、呼吸、运动功能等未见异常，动物饮食、饮水、排便等未见异常。存活动物体重稳定增长，除4475g·kg-1剂量组存活的2只动物因基础体重较低，低于其它各组动物平均体重外，其它4个剂量组间动物体重增长基本一致。
观察期结束对各组存活动物进行尸解检查，心、肝、脾、肺、肾等主要脏器色泽、质地等均正常，未发现肉眼病变。
4.3结果统计与分析：
用dasver1.0统计分析软件，bliss法计算icr小鼠静脉注射注射用前列地尔的ld50为4129.665g·kg-1，ld50的95％可信限为3942.067～4326.191g·kg-1。
使用dasver1.0统计分析软件，bliss法得出回归方程：
y(几率单位)＝-86.573+25.325×log(d)
ld50＝4129.665g·kg-1
注：d为剂量。
5结论
在本实验条件下，icr小鼠静脉注射注射用复方前列地尔ld50为4129.665g·kg-1，95％可信限为3942.067～4326.191g·kg-1，毒性靶器官为肺脏。
b、溶血性试验
1专题名称
注射用前列地尔-前列腺素a1，或称注射用复方复方前列地尔，溶血性试验。
2实验目的
注射用复方前列地尔由南昌蔡海德生物科技有限公司生产，临床主要适应症为心肌梗死、血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、癌症。本实验的目的是观察注射用复方前列地尔在体外条件下能否引起家兔红细胞溶血和凝集，为该药的临床安全使用提供相关资料。
3材料与方法
3.1供试品
3.1.1名称：注射用复方前列地尔。
3.1.2批号：20110502。
3.1.3规格：200g/支。
3.1.4纯度：102％。
3.1.5理化性质：白色或类白色粉针剂，水中易溶，ph5.0～6.0。赋形剂为右旋糖酐40、2-羟丙基-β-环糊精、赖氨匹林，添加剂为亚硫酸氢钠。
3.1.6供试品稳定性和保管
3.1.6.1保存条件：室温，避光密封保存。
3.1.6.2有效期：2011年05月16日至2013年04月。
3.1.6.3提供单位：南昌蔡海德生物科技有限公司。
3.1.7溶剂：0.9％氯化钠注射液。
3.1.7.1批号：110316406。
3.1.7.2生产厂商：石家庄四药有限公司。
3.1.8操作要求
3.1.8.1供试品配制：临用前，将注射用复方前列地尔(200g/支)加入适量0.9％氯化钠注射液中，充分混匀后配制成0.8g·ml-1溶液使用。
3.1.8.2供试品质量分析：由委托方承担此项工作。
3.1.9登记程序
3.1.9.1供试品留样：试验完成后留取部分样品于供试品保管室内。
3.1.9.2剩余供试品处理：返还委托方。
3.2实验系统
3.2.1动物品系：日本大耳白兔。
3.2.2动物级别：普通级动物。
3.2.3动物性别和数量：雄性1只，质量合格证号：0108432。
3.2。4动物年龄：7～8月龄。
3.2.5动物体重：2.5kg左右。
3.2.6动物来源
3.2.6.1繁育单位：北京富豪实验动物养殖中心。
3.2.6.2地址：北京市通州区宋庄镇富豪村西。
3.2.6.3生产许可证号：scxk(京)2010-0010。
3.2.6.4有效期：2010年11月16日至2015年11月16日。
3.2.6.5发证机关：北京市实验动物管理办公室。
3.2.7实验系统选择说明：国家食品药品监督管理局《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》推荐使用该种动物。
3.2.8实验系统接收：动物的接收参照sopa106-2。
3.2.9饲养条件：动物饲养于普通环境中。主要环境指标的控制范围：温度24.8±0.5℃，日温差≤4℃。相对湿度62.1±10.1％。换气次数为10-20次/小时，光照明∶暗＝12h∶12h。家兔喂养在标准的兔笼中，每笼1只。由获得资格认证的人员进行饲养管理。每天清洁笼子1次，保持盒内环境清洁干燥；每日添加饲料和饮水，保持动物自由饮食活动。
3.2.10检疫及驯化过程：新领到的动物检疫1周。检疫期间动物饮水、摄食均正常，家兔皮毛光滑，反应灵敏，眼耳鼻及会阴部无异常分泌物，确认动物健康无病，可以使用。
3.2.11饲料
3.2.11.1种类：实验兔维持饲料。
3.2.11.2制造单位：北京华阜康生物科技股份有限公司。
3.2.11.3给料方法：每天给料1次。
3.2.11.4饲料的营养及卫生指标：符合中华人民共和国国家标准(gb14924-2001)。
3.2.11.5饲料的保存：保存在专门的饲料间里。
3.2.12饮水
3.2.12.1种类：生活饮用水。
3.2.12.2供水方法：每日冲洗饮水瓶并换水一次，供动物自由饮用。
3.2.12.3水中污染物含量检测：参照现行中华人民共和国国家标准gb/t14925和gb5749执行。
3.2.13本试验所用动物及相关处置应符合动物福利的要求，实验开展前要经过本机构实验动物管理与动物福利委员会的审查批准。
3.2.14动物识别方法
3.2.14.1实验动物的识别：动物用耳号标记，耳号与动物编号一一对应，并在动物笼卡上显示。
3.2.14.2实验笼具标号：在笼卡上注明实验编号、供试品名称、动物种系、性别、动物编号、专题负责人、动物实验起止日期等。
3.2.15剩余动物的处理：动物采血后，可继续饲养用于其它溶血性实验。
3.3实验设计
3.3.1实验设计依据：
3.3.1.1采用标准：国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》、《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》和《药物非临床研究质量管理规范》。
3.3.1.2委托单位提供的相关资料：
临床拟用途径：静脉滴注。
临床拟用剂量：心肌梗死100g～400g/次。血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症100g～200g/次。
临床拟用疗程：心肌梗死3～5天/疗程，3～4疗程；血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症15天/疗程，3～4疗程。
临床适应症：(1)心肌梗死；(2)血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症。
临床用法用量：100g～200g溶于250ml0.9％氯化钠注射液。
3.3.2供试品配制：临用前，将注射用复方前列地尔(200g/支)加入适量0.9％氯化钠注射液中，充分混匀后配制成0.8g·ml-1溶液使用。
3.3.3供试品分析：委托单位承担供试品纯度和稳定性的测定(包括在试验条件下的稳定性)，提供供试品有关纯度和制备方法的信息。研究单位不承担供试品及其溶液的浓度、溶解度、均匀度和稳定性的分析。
3.3.4实验方法
本试验采用体外试管肉眼观察法进行试验。实验操作按sopl501-2、sopl502-2、sopl503-2、sopl505-2要求进行。
3.3.4.1药物浓度设计：因血管内给药的注射剂，以药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液；非血管内给药的注射剂则以药品使用说明书规定的临床使用浓度，用0.9％氯化钠注射液以1∶3稀释后作为供试品溶液，而本药临床拟用途径为静脉滴注，故选择临床使用浓度作为供试品溶液，本次实验设置注射用前列地尔浓度为0.8g·ml-1。
3.3.4.22％红细胞混悬液的制备
家兔1只，兔耳中央动脉取血约10ml，放入有玻璃珠的三角瓶中振摇10分钟，再加0.9％氯化钠注射液，摇匀，然后将混悬液移入10ml刻度离心管中，每管8ml，以2500rpm离心5min，弃上清。每管加0.9％氯化钠注射液6ml，再离心，反复洗红细胞3～4次，至上清液无色透明为止。将所得红细胞按其容积用0.9％氯化钠注射液配成2％红细胞混悬液，供试验用。
3.3.4.3实验操作
取洁净试管7支，进行编号。按表中配比量依次加入2％红细胞混悬液和0.9％氯化钠注射液，混匀后置37℃恒温水浴箱中孵浴30min，然后向1～5号试管加入不同量的供试品液，6号管不加供试品液，为空白对照，7号管加2.5ml蒸馏水，为溶血阳性对照。以上样品各制备三份，平行测定。
表1溶血试验试管及样品准备
3.3.5各种指标的检测频率及方法
3.3.5.1体外试管肉眼观察
3.3.5.1.1观察次数：6次
3.3.5.1.2观察例数：3套平行样品共21管。
3.3.5.3.3观察时间：加入供试品后15min、30min、45min、1h、2h、3h。
3.3.5.3.4观察内容：各时间点血液的溶血和凝集情况。
3.3.5.2体外试管红细胞计数法
3.3.5.2.1测定次数：1次
3.3.5.2.2测定例数：3套平行样品共21管。
3.3.5.2.3测定时间：加入受试药后3h
3.3.5.2.4测定内容：混匀各管，每管精确吸取混悬液0.1ml，以0.9％氯化钠注射液稀释适当倍数，混匀后加入计数板的计数池中，加盖玻片，静置片刻，置显微镜下计数，取四角方格，共计4个方格的红细胞数，计算3个平行管的均值。根据下面公式计算各管的溶血度。
3.4结果统计与分析：
3.4.1肉眼观察法：如果上清液出现澄清透亮则无溶血发生，如出现澄清红色代表出现溶血，红细胞如果出现凝集现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管震荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴生理盐水，显微镜下观察，凝聚rbc能被冲散者为假凝聚，供试品可被临床用；若凝聚物不被摇散或冲散者为真凝聚，供试品不宜供临床使用。
3.4.2红细胞计数法：如果红细胞溶血度大于30％则认为发生溶血现象。
3.4.3当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚，则受试物不宜注射使用。
3.4.4以肉眼观察结果和体外红细胞计数法结果确定试验结果，如果二者有冲突以红细胞计数法结果为准。
4结果与讨论
4.1体外试管法
肉眼观察，37℃恒温水浴3h，浓度为0.8g·ml-1的注射用前列地尔溶液各管上清液均为无色透明，无透明红色发生，无棕色絮状沉淀，表明无溶血及红细胞凝集现象发生。
阴性对照管在3h内无溶血现象，阳性对照管在15min观察时即出现溶血现象，表明本实验系统可靠。
4.2体外红细胞计数法
恒温水浴3h后，混匀各管，计数各管红细胞数，计算溶血度。注射用前列地尔测试管1～5号溶血度分别为2.6％、3.8％、1.4％、2.2％、0.8％，均小于30％，表明无溶血发生。
阳性对照管溶血度为87.5％，发生溶血，表明本实验系统可靠。
5结论
在本实验条件下，注射用复方前列地尔在体外条件下对家兔红细胞无溶血作用。
6偏离实验方案的异常情况
动物饲养期间环境相对湿度有6天高于70％，偏离实验方案。因这段期间相对湿度接近70％，结合动物笼旁观察未见异常，认为该偏离不影响。
c、血管及肌肉刺激试验
1专题名称
家兔注射注射用复方前列地尔血管及肌肉刺激试验
2实验目的
注射用复方前列地尔由南昌蔡海德生物科技有限公司生产，临床主要适应症为心肌梗死、血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症。本实验目的是观察注射注射用前列地尔对动物静脉及肌肉是否存在刺激性，为该药的临床使用提供相关资料。
3材料与方法
3.1供试品与对照品
3.1.1供试品
3.1.1.1名称：注射用复方前列地尔。
3.1.1.2批号：20110502。
3.1.1.3规格：200g/支。
3.1.1.4纯度：102％。
3.1.1.5理化性质：白色或类白色粉针剂，水中易溶，ph5.0～6.0。赋形剂为右旋糖酐40、2-羟丙基-β-环糊精、赖氨匹林，添加剂为亚硫酸氢钠。
3.1.1.6供试品稳定性和保管
3.1.1.6.1保存条件：室温，避光密封保存。
3.1.1.6.2有效期：2011年05月16日至2013年04月。
3.1.1.6.3提供单位：南昌蔡海德生物科技有限公司。
3.1.1.7溶剂：0.9％氯化钠注射液。
3.1.1.8操作要求
3.1.1.8.1供试品配制：临用前，1支注射用复方前列地尔(200g/支)加入2ml0.9％氯化钠注射液，充分混匀后使用。
3.1.1.8.2供试品质量分析：由委托方承担此项工作。
3.1.1.9登记程序
3.1.1.9.1供试品留样：试验完成后留取部分样品于供试品保管室内。
3.1.1.9.2剩余供试品处理：返还委托方
3.1.2对照品：0.9％氯化钠注射液。
3.1.2.1批号：110316406。
3.1.2.2生产厂家：石家庄四药有限公司。
3.2实验系统
3.2.1动物品系：日本大耳白兔。
3.2.2动物级别：普通级动物，动物质量合格证号：0108439。
3.2.3动物性别和数量：雄性6只。
3.2.4动物年龄：7～8月龄。
3.2.5动物体重：2.5kg左右。
3.2.6动物来源
3.2.6.1繁育单位：北京富豪实验动物养殖中心。
3.2.6.2地址：北京市通州区宋庄镇富豪村西。
3.2.6.3生产许可证号：scxk(京)2010-0010。
3.2.6.4有效期：2010年11月16日至2015年11月16日。
3.2.6.5发证机关：北京市实验动物管理办公室。
3.2.7实验系统选择说明：国家食品药品监督管理局《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》推荐使用该种动物。
3.2.8实验系统接收：动物的接收参照sopa106-2。
3.2.9饲养条件：动物饲养于普通环境中由获得资格认可的人员饲养。主要环境指标的控制范围：温度24.8±0.5℃，日温差≤3℃。相对湿度68.8±6.8％。换气次数为10-20次/小时，光照明∶暗＝12h∶12h。
3.2.10检疫及驯化过程：新领到的动物检疫9天，在检疫期间动物饮水、摄食正常，家兔皮毛光滑，反应灵敏，眼耳鼻及会阴部无异常分泌物。确认动物健康无病，可以使用。
3.2.11饲料
3.2.11.1种类：实验兔维持饲料。
3.2.11.2制造单位：北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号scxk(京)2009-0008。
3.2.11.3给料方法：每天给料1次。
3.2.11.4饲料的营养及卫生指标：符合中华人民共和国国家标准(gb14924-2001)。
3.2.11.5饲料的保存：保存在专门的饲料间里。
3.2.12饮水
3.2.12.1种类：生活饮用水。
3.2.12.2供水方法：每日冲洗饮水瓶并换水一次，供动物自由饮用。
3.2.12.3水中污染物含量检测：参照现行中华人民共和国国家标准gb/t14925和gb5749执行。
3.2.13本试验所用动物及相关处置应符合动物福利的要求，实验开展前要经过本机构实验动物管理与动物福利委员会的审查批准。
3.2.14动物识别方法
3.2.14.1实验动物的识别：动物用耳号标记，耳号与动物编号一一对应，并在动物笼卡上显示。
3.2.14.2实验笼具标号：分组前，用笼子卡片对分组前动物饲养笼进行标记，并注明实验编号、供试品名称、检疫起止日期、动物种系、动物号、性别、专题负责人。分组后在笼卡上注明实验编号、供试品名称、剂量、动物组别、种系、性别、动物编号、专题负责人、动物实验起止日期等。3.2.15剩余动物的处理：动物分组后，如有剩余动物，对剩余动物给予安乐死处置。
3实验设计
3.3.1.1采用标准：国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》、《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》和《药物非临床研究质量管理规范》。
3.3.1.2委托单位提供的相关资料：
临床拟用途径：静脉滴注。
临床拟用剂量：
心肌梗死：100g～400g/次。血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症：100g～200g/次。
临床拟用疗程：心肌梗死3～5天/疗程，3～4疗程；血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、癌症。15天/疗程，3～4疗程。
临床适应症：(1)心肌梗死；(2)血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化症。
临床用法用量：100g～200g溶于250ml0.9％氯化钠注射液。
3.3.2剂量与分组：
本试验选用临床最大拟用浓度0.8g·ml-1作为受试浓度，采用最大给药体积5ml·kg-1进行静脉注射，故剂量设为4g·kg-1，同时设阴性对照(0.9％氯化钠注射液)，给药体积同注射用前列地尔。考虑到注射有可能接触到肌肉组织，故增加肌肉注射试验，浓度为0.8g·ml-1，给药体积为0.5ml/只，同时设溶剂对照。
实验采用同体左右侧自身对照方法，6只家兔均左侧注射注射用前列地尔、右侧注射0.9％氯化钠注射液。
3.3.3给药方法：
3.3.3.1给药途径：耳缘静脉注射及股四头肌肌肉注射。
3.3.3.2给药体积：静脉注射5ml/kg，肌肉注射0.5ml/只。
3.3.3.3给药时间：每日1次。
3.3.3.4给药期限：给药7次。
3.3.4供试品配制：临用前，将注射用前列地尔(200g/支)加入适量0.9％氯化钠注射液中，充分混匀后配制成0.8g·ml-1溶液使用。
3.3.5供试品分析：委托单位承担供试品纯度和稳定性的测定(包括在试验条件下的稳定性)，提供供试品有关纯度和制备方法的信息。研究单位不承担供试品及其溶液的浓度、溶解度、均匀度和稳定性的分析。
3.3.6供试品的给予：用一次性注射器抽取药液，按sopt209-2进行操作。
3.3.7实验方法
3.3.7.1血管刺激性试验
给予供试品前，将家兔耳缘处毛剪去，即可清楚地看到耳缘静脉，用手指弹动或轻轻揉擦兔耳，促进静脉充血，然后用左手拇指和食指压住耳根端。待静脉显示充盈后，在耳缘静脉周围用碘酒消毒，再用75％酒精脱碘。在耳缘静脉远端1/3处，右手取装有药液的注射器，针头由接近手拇指和食指移至针头刺入部位，如有血液回流，即可进行药液注射，按0.05～0.1ml/sec速度静脉注射。注射完毕后，小心拔出针头，并迅速用棉球压住针孔，以免出血。
3.3.7.2肌肉刺激性试验
给予供试品前，将家兔后肢股四头肌注射局部用婴儿推去毛，去毛区约为3×3cm2，用75％酒精消毒后，左手固定后肢并确认注射部位，右手持装有药液的注射器，将针刺入肌肉内、约2.5cm深，回抽针栓无回血后将药液注入。3.3.8各种指标的检测频率及方法
3.3.8.1临床症状观察
3.3.8.1.1观察次数：每天1次。
3.3.8.1.2观察例数：全部动物。
3.3.8.1.3观察方法：i.隔笼观察：给药前及给药后进行隔笼观察，内容包括外观及被毛、活动状况、神经反应、呼吸状态、姿势等。ii.取出后观察：给药前隔笼观察完毕后将动物从笼内取出，放到固定架后再进行近距离观察，查看颈部、头部(包括眼、耳、口、鼻)、下腹部、肛门、会阴、皮肤颜色、肌肉紧张度等有无异常，以及有无外伤、肿瘤等。
3.3.8.2注射部位的观察
3.3.8.2.1观察次数和时间：末次给药后72h，以2％的戊巴比妥钠麻醉，颈动脉放血各组处死动物3只动物。解剖注射部位，观察注射部位有无充血、水肿、坏死等刺激反应，血管刺激反应按照表1进行评分，肌肉刺激反应按表2进行评分，并取相应组织进行病理组织学检查。剩余家兔继续观察14天后，麻醉放血处死动物，解剖注射部位，观察注射部位的反应情况，取材进行病理学观察。
3.3.8.2.2观察例数：全部给药动物。
3.3.8.3体重测定
3.3.8.3.1测定次数：每周测定1次体重。
3.3.8.3.2测定例数：全部动物。
3.3.8.3.3测定时间：每周给药前称量体重。
3.3.8.3.4测定方法：使用电子天平，进行称重。
表1血管刺激反应肉眼观察分级标准
表2肌肉刺激反应分级标准
3.4结果统计与分析
根据肉眼观察结果和病理观察结果综合评价药物的局部刺激性。
4结果与讨论
4.1给药后一般情况
家兔血管及肌肉注射注射用复方前列地尔后，笼旁观察未见明显异常。给药期间及恢复期，动物体重稳定增长。
4.2血管刺激反应评分
家兔耳缘静脉注射注射用复方前列地尔，连续给药7天，每日观察并对血管刺激性评分。给药期间每日肉眼观察注射部位血管及肌肉未见红肿、充血、破溃等现象。复方前列地尔给药侧(左侧)血管刺激评分为0级。对照侧(右侧)耳缘静脉无变化，评分0级。
停药后至恢复期结束，家兔左、右侧耳缘静脉均未见充血、肿胀、耳下垂、坏死等刺激症状，血管刺激评分为0级。
4.3肌肉刺激反应评分
家兔肌肉注射注射用前列地尔，连续给药7天，肌肉注射部位未见红肿、破溃等现象。末次给药后72小时，麻醉放血处死3只动物，解剖家兔取股四头肌，纵向切开，分别观察左、右两侧注射部位未见充血、肌肉变性、坏死等刺激反应，肌肉刺激评分为0级。
恢复期结束后处死剩余3只动物，观察左、右两侧注射部位未见充血、肌肉变性、坏死等刺激反应，肌肉刺激评分为0级。
4.4病理组织学检查
4.4.1血管注射刺激性
4.4.1.1末次药后72h
4.4.1.1.1注射用复方前列地尔给药侧
no.1号动物左侧b段血管未见异常，周围组织个别炎细胞浸润，a段、c至f段血管及周围组织未见异常。no.2号动物左侧b段血管血栓形成，周围组织未见异常，a段、c至f段血管及周围组织未见异常。no.3号动物a段血管未见异常，周围组织个别成纤维细胞增生伴炎细胞浸润，c段血管血栓形成，周围组织未见异常；b段、d至f段血管及周围组织未见异常。
4.4.1.1.20.9％氯化钠给药侧
no.1号动物右侧a至f段血管及周围组织未见异常。no.2号动物右侧b段血管局灶性内膜轻微增生、坏死，周围组织未见异常；a段、c至f段血管及周围组织均未见异常。no.3号动物右侧b段血管管腔狭窄，内膜轻微增生，周围组织可见少量炎细胞浸润；a段、c至f段血管及周围组织均未见异常。
4.4.1.2恢复期结束
4.4.1.2.1注射用复方前列地尔给药侧
恢复期结束时，no.4、5、6号动物左侧a至f段血管及周围组织均未见异常。
4.4.1.2.20.9％氯化钠给药侧
恢复期结束时，no.4、5、6号动物右侧a至f段血管及周围组织均未见异常。
4.4.1.3讨论
给药结束时，0.9％氯化钠对照侧3只动物中2只分别可见轻微内膜增生、坏死、或血栓形成，病变局限于b段；复方前列地尔注射液给药侧3只动物中2只可见血管内血栓形成，病变位于耳缘静脉的b段或c段。恢复期结束，注射用复方前列地尔给药侧3只动物血管及周围组织均未见异常。与生理盐水对照侧相比，注射用复方前列地尔给药侧动物血管病变发病率和病变程度无差别，且上述病变多集中于血管进针处，考虑为针头的机械性刺激。
4.4.1.4结论
在本实验室条件下，家兔静脉注射给予注射用复方前列地尔，注射血管无刺激性反应。
4.4.2肌肉注射刺激性试验
4.4.2.1末次药后72h
4.4.2.1.1注射用复方前列地尔给药侧
给药结束时，no.1、2、3号动物左侧肌肉组织未见异常。
4.4.2.1.20.9％氯化钠对照侧
给药结束时，no.1、2、3号动物右侧肌肉组织未见异常。
4.4.2.2恢复期结束
4.4.2.2.1注射用复方前列地尔给药侧
恢复期结束时，no.4、5、6号动物左侧肌肉组织未见异常。
4.4.2.2.20.9％氯化钠对照侧
恢复期结束时，no.4、5、6号动物右侧肌肉未见异常。
4.4.2.3讨论
给药结束和恢复期结束，与0.9％氯化钠对照侧(右侧)肌肉组织相比，注射用复方前列地尔给药侧肌肉组织未见异常。
4.4.2.4结论
注射用复方前列地尔肌肉注射给予家兔，注射部位肌肉未见刺激性反应。
5结论
在本实验条件下，家兔注射注射用复方前列地尔对血管及肌肉无刺激性。
6偏离实验方案的异常情况
试验期间，动物饲养间部分时间环境相对湿度超过70％，偏离实验方案界定的40％～70％。因这段期间相对湿度超标均在+7以内，结合动物笼旁观察未见异常，认为该偏离不影响实验结果。
药效学验证试验：
对肿瘤细胞生长的抑制分化和抗转移试验：到合格的动物试验中心买模型小鼠，试验组为本发明实施例1-5的药品，2ml的0.9％氯化钠注射液溶解，100μg/次，一天2次，给药间隔6小时，对照组给药为2ml的0.9％氯化钠注射液。