本发明属于医药技术领域，具体涉及小花清风藤不同部位和溶剂提取物的保肝护肝应用。
背景技术：
小花清风藤(sabiaparviflorawall.exroxb.)是清风藤科(sabiaceae)清风藤属(sabia.)的常绿木质攀援缠绕藤本。入药部位包括根、茎、叶，其性味苦，微寒，归肝经。具有清热利湿、利胆、止血之功，为布依族、苗族的民间用药，民间俗称“小黄药”、“黄肿药”、“黄眼药”、“雅希强(布依语)”。具有治疗风湿关节痛、腰痛，止血止痛的作用，对甲型和乙型病毒性肝炎疗效良好。据文献报道，具有抗病毒性肝炎的小花清风藤的主要化学成分为五环三萜类化合物、生物碱类化合物和其他类化合物。五环三萜类化合物由6个异戊二烯结构单元联结而成，是小花清风藤化学成分中种类最多的化合物，文献报道小花清风藤地上部分(1)五环三萜类化合物有19个，均以游离状态存在。其数目类型较多，但主要的结构母核有四种，分别为齐墩果烷型(oleanane)，乌苏烷型(ursane)，羽扇豆烷型(lupane)和木栓烷型(friedelane)。其中①齐墩果烷型五环三萜类化合物有：1α,2β-二羟基齐墩果酸、1α,2α,2β-三羟基齐墩果酸、齐墩果酸、3α-羟基齐墩果酸、阿江三帖酸、3-氧化齐墩果酸、古柯三萜二醇、反山楂酸、3β-羟基-1-齐墩果酸、3-氧化齐墩果酸、3-oxo-hydroxytaraxastare、20-hydroxy-lupan-3-one；②乌苏烷型五环三萜类化合物有：2β,2β,19α-三羟基-乌苏酸、木栓酮；③羽扇豆烷型五环三萜类化合物有：羽扇豆醇、羽扇豆酸、羽扇豆-3-酮、桦木酸、桦木酸甲酯；④木栓烷型五环三萜类化合物有：木栓酮。(2)小花清风藤中生物碱类化合物种类很少，仅有5种共9个，包括吡咯类生物碱和异喹啉类生物碱，①吡咯类生物碱(pyrrrolidines)主要由吡咯或四氢吡咯衍生而成，吡咯环类生物碱为脱美叶绿甲酯酸a；②异喹啉类生物碱包括7个苄基四氢异喹啉类和1个苯酞类四氢异喹啉类生物碱，其中苄基四氢异喹啉类生物碱按骨架分为3种，苄基四氢异喹啉类、阿朴菲类和普罗托品类。(3)其他类化合物主要有槲皮素、二十五烷酸、二十九烷醇、β-谷甾醇、棕榈酸、9-芴酮等。
肝脏在调节各种生理学功能的过程中起到重要的作用。药物滥用、酒精成瘾以及长期暴露于有毒环境都会造成各种肝脏疾病。由于能够刺激肝功能，修复受损肝细胞这类有效的预防手段和药物治疗的缺乏，肝脏疾病已成为全球性的高死亡率疾病。全国多中心急性药物性肝损伤住院病历调查分析结果显示，药物性肝损伤在我国的发病率呈逐年增加趋势，药物性肝损伤发病率占黄疸住院患者的2％～5％，占爆发性肝功能衰竭患者15％～30％，占非病毒性慢性肝炎的20％～50％。肝损伤主要是在短期内由多种原因引起的肝功能突发性异常的疾病，医学科学国际组织委员会表明，肝损伤的确诊标准为肝功能异常持续时间不超过3个月。肝损伤发展至晚期会表现为终末期肝损伤，两者是一个连续渐进的生理病理过程，终末期肝损伤在临床中的表现为肝细胞迅速损害并迅速恶化，病死率极高。为预防急性肝损伤的发生及恶化，在了解肝损伤发病原因的基础上，重中之重是要研发治疗肝脏疾病的有效药物，而近年来中药对于肝损伤的治疗成为了研究热点。
技术实现要素：
本发明发明人经过广泛深入的文献调研和深入布依族、苗族了解，发现小花清风藤提取物可显著改善肝炎患者症状，降低由肝炎引起的黄疸和转氨酶升高体征的效果明显，对重症肝炎亦有较好的疗效；可降低四氯化碳、扑热息痛诱导的肝损伤模型小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性；可降低四氯化碳和d-半乳糖致小鼠急性肝损伤小鼠血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和丙二醛水平和肝脏指数，升高血清中超氧化物歧化酶含量。当前大量的临床和实验研究发现小花清风藤对病毒性肝炎、急性肝损伤具有比较好的疗效，并初步证实与其中的五环三萜类化合物、生物碱类化合物和其他类化合物有关。但是选择茎叶的何种部位比较好，保肝护肝作用与其中的何种成分关系比较密切等未见报道。
本发明采用这样的技术方案来实现：一种小花清风藤提取物，其是以小花清风藤的茎、叶、茎叶自然混合物中的任意一种为原料，采用水、50％乙醇及95％乙醇中的任意一种为溶剂进行提取得到的提取物。
本发明还涉及所述小花清风藤提取物的提取方法，包括以下步骤：
1)将小花清风藤的茎、叶或者茎叶自然混合物干燥至恒重，然后粉碎过筛；
2)将步骤1)的得到的物料加入水、50％乙醇或95％乙醇作为溶剂进行提取，提取完后过滤，收集滤液；其中50％乙醇或95％乙醇均为质量百分数。
3)步骤2)收集到的滤液，回收溶剂后，经减压浓缩，即得小花清风藤提取物的浸膏。
进一步地，所述步骤1)中，采用鼓风箱进行干燥，干燥温度在40-50℃。
进一步地，所述步骤2)中，溶剂与小花清风藤物料的料液体积比为1:15-30；提取时，在30-60℃超声1-3次，每次30-90分钟。
本发明还涉及所述的小花清风藤提取物或者采用上述方法得到的小花清风藤提取物在制备保肝护肝药物中的应用。
本发明还涉及所述的小花清风藤提取物或者采用上述方法得到的小花清风藤提取物在制备治疗肝细胞l-o2损伤药物中的应用。
进一步地，所述的应用中，小花清风藤提取物能降低血清中tc、tg含量，升高肝组织中sod和gsh-px水平，降低肝组织中alt、ast水平及mda含量。
更进一步地，小花清风藤提取物提高l-o2细胞的成活率，降低细胞培养液中ldh和alt、ast水平，升高l-o2细胞内sod和gsh-px水平，降低细胞内mda含量。
本发明提取得到的小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物水提物、50％乙醇提取物和95％的乙醇提取物在四氯化碳(ccl4)致小鼠急性肝损伤、酒精致小鼠急性肝损伤及ccl4致肝细胞l-o2损伤模型上实验，表明它们对多种不同类型的肝损伤具有较好的治疗作用。
本发明的有益效果
本发明提供了一种从布依族、苗族药物---小花清风藤中提取得到的小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物水提物、50％乙醇提取物和95％的乙醇提取物，研究显示小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物水提物、50％乙醇提取物和95％的乙醇提取物对ccl4/酒精诱导的肝损伤，以及ccl4诱导的肝细胞l-o2损伤均具有较好的治疗作用，能减轻ccl4/酒精对肝脏的脂质过氧化损伤，降低血清中tc、tg含量，升高肝组织中sod和gsh-px水平，降低肝组织中alt、ast水平及mda含量，从而减轻ccl4/酒精对肝组织氧化损伤，改善肝脏的组织病理学形态，保护肝细胞并恢复肝功能；小花清风藤提取物可提高l-o2细胞的成活率，降低细胞培养液中ldh和alt、ast水平，升高l-o2细胞内sod和gsh-px水平，降低细胞内mda含量，其可能作用机制是通过增强sod和gsh-px对活性氧簇的清除能力，降低脂质过氧化产物mda含量，从而减轻ccl4对l-o2细胞氧化损伤，保护肝细胞并恢复肝功能。因此，小花清风藤具有毒副作用小、疗效较好的优势，值得开发应用。
附图说明
图1为小花清风藤提取图；
图2小花清风藤不同药用部位的水提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(a：正常组，b：模型组，c：水飞蓟素组，d：sj-l组，e：sj-h组，f：sy-l组，g：sy-h组，h：sjy-l组，i：sjy-h组；放大倍数为：×400)
图3小花清风藤不同药用部位的50％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(a：正常组，b：模型组，c：水飞蓟素组，j：50％aj-l组，k：50％aj-h组，l：50％ay-l组，m：50％ay-h组，n：50％ajy-l组，o：50％ajy-h组；放大倍数为：×400)
图4小花清风藤不同药用部位的95％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(a：正常组，b：模型组，c：水飞蓟素组，p：95％aj-l组，q：95％aj-h组，r：95％ay-l组，s：95％ay-h组，t：95％ajy-l组，u：95％ajy-h组；放大倍数为：×400)
图5小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织病理变化影响(a：正常组，b：模型组，c：水飞蓟素组，d：sjy-l组，e：sjy-h组，f：50％ajy-l组，g：50％ajy-h组，h：95％ajy-l组，i：95％ajy-h组；放大倍数为：×400)
图6小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2形态学的影响(a：正常组，b：模型组，c：sy100μg/ml组，d：50％ay100μg/ml组，e：95％ay100μg/ml组；放大倍数为：×100)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更详细的描述。
实施例1
小花清风藤中一种具有治疗肝损伤作用小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物水提物、50％乙醇提取物和95％的乙醇提取物，具体通过以下方法制备，工艺流程图如1所示。
1)小花清风藤预处理
小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物各220g置于48℃恒温鼓风箱中干燥至恒重，净重200g。
2)小花清风藤的提取
将粉碎后的小花清风藤茎、叶及茎叶自然混合药材分别用水、50％乙醇和95％乙醇的提取。将干燥的茎、叶及茎叶自然混合用粉碎机粉碎后，过3号筛，将小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合物用水、50％乙醇和95％乙醇按照液料比1:15-30，在30-60℃条件下超声1-3次，每次30-90分钟，过滤，收集滤液。
3)提取物的浸膏的制备
将收集到的滤液，回收溶剂后，经减压浓缩，即得小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物的浸膏。
本提取分离制备方法为确定小花清风藤茎叶部位、提取溶剂的选择提供了较好的方法。通过本工艺得到的小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合的水、50％乙醇和95乙醇提取物，该提取过程简单易行、快捷，成本较低。总之，该提取制备工艺非常适合医药企业规模化提取小花清风藤中不同提取部位。
小花清风藤化学成分复杂，目前认为其主要药效成分是五环三萜类化合物、生物碱类化合物和其他类化合物等，其药理活性存在较大差异。本发明人对从小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合后的水、50％乙醇和95乙醇提取物进行了肝损伤的治疗作用研究，发现其对四氯化碳(ccl4)致小鼠急性肝损伤、酒精致小鼠急性肝损伤及ccl4致肝细胞l-o2损伤具有较好的治疗作用。
实施例2
应用下面结合具体的实验例，具体说明本发明实施例1得到的小花清风藤茎、叶、茎叶自然混合后的水、50％乙醇和95乙醇提取物对四氯化碳(ccl4)致小鼠急性肝损伤、酒精致小鼠急性肝损伤及ccl4致肝细胞l-o2损伤的治疗作用。
实验例1
下面结合具体的实验例，具体说明本发明实施例1得到的小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有很好的治疗作用。
试验方法
1)实验动物
选择野生型km小鼠168只，雄性，6～8周龄，体重18～20g，购于三峡大学实验动物中心，饲养于三峡大学实验动物中心spf级动物室，许可证号：scxk(鄂)2011-0012，分笼饲养，自由饮水和摄食。
2)实验分组及给药
取昆明雄性小鼠共168只，随机分为21组，每组8只，即正常组、ccl4模型组、水飞蓟素组(200mg/kg)、水提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组、50％乙醇提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组、95％乙醇提取组(茎、叶、茎叶自然混合)低、高剂量组。正常组灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，其余组均按20ml/kg灌胃给药，每日1次，连续7d。于末次给药后2h，除正常组实验小鼠腹腔注射橄榄油外，其余各组均按10ml/kg的剂量腹腔注射0.5％的ccl4橄榄油溶液。实验期间自由饮水和进食。
3)实验动物行为及体征观察
每天观察实验大鼠的活动、进食、精神状态、毛发、排泄物及死亡情况。
4)肝脏和脾脏质量的称量和指数的计算
实验小鼠眼眶取血完毕后，固定小鼠，打开腹腔，分别取肝脏和脾脏进行称量，计算其质量指数。
5)肝组织中alt和ast活性测定
取肝脏组织用生理盐水进行组织匀浆后，用离心机3500rpm/min，离心15min后，收集上清液，用多功能酶标仪检测肝组织中alt和ast含量。具体方法按照试剂盒中说明书介绍的方法进行。
6)肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的测定
取肝脏用生理盐水进行组织匀浆后，用离心机3500rpm/min，离心15min后，收集上清液，用多功能酶标仪检测肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量。具体方法按照试剂盒中说明书介绍的方法进行。
7)肝组织病理形态学分析
取血完毕后，取小鼠肝组织，用4％多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，连续2μm切片，经he染色后，在光镜下观察结肝组织病理学变化。肝损伤病理组织学分级标准如下：①0级：正常肝组织，无肝细胞变性、坏死，无炎症细胞浸润；②i级：肝小叶内肝细胞轻度脂肪变性，偶见肝细胞点状坏死；③ii级：肝小叶内肝细胞中度脂肪变性，可见肝细胞点状坏死，炎症细胞浸润；④iii级：肝小叶内肝细胞重度弥漫性脂肪变性，点状坏死多见或可见大片肝细胞坏死。
8)数据统计分析所有实验结果的数据以均数±标准差
试验结果
1)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致小鼠行为和体征的影响
在ccl4致急性肝损伤的小鼠模型制作过程中，正常组小鼠皮毛紧密、有光泽，活泼，饮食及二便均正常。模型小鼠给予ccl4后出现被毛松散，懒动。小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物用水(茎水提物：sj，叶水提物：sy，茎叶自然混合物水提物：sjy)、50％乙醇(茎50％乙醇提物：50％aj，叶50％乙醇提物：50％ay，茎叶自然混合物50％乙醇提物：50％ajy)和95％乙醇(茎95％乙醇提物：95％aj，叶95％乙醇提物：95％ay，茎叶自然混合物95％乙醇提物：95％ajy)提取物治疗后，均有不同纯度的改善。在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以sjy作用效果最好，95％ajy和50％ay效果次之。
2)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝、脾质量及质量指数的影响
由表1-3可见，模型组小鼠的肝、脾质量及肝、脾质量指数明显增加，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)。用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物治疗后，均有不同程度的降低。在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以sjy、sj和50％ajy作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(p<0.05或p<0.01)。
表1小花清风藤不同药用部位的水提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝、脾质量及质量指数的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表2小花清风藤不同药用部位的50％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝、脾质量及质量指数的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表3小花清风藤不同药用部位的95％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝、脾质量及质量指数的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
3)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中转氨酶活性的影响
由表4-6可见，模型组小鼠肝组织中alt和ast活性明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)，用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物治疗后，alt和ast活性均有不同程度的降低，尤其是alt改善效果最为明显。在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以sjy、95％ajy和50％ajy作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(p<0.05或p<0.01)。
表4小花清风藤不同药用部位的水提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中转氨酶活性的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表5小花清风藤不同药用部位的50％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中转氨酶活性的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表6小花清风藤不同药用部位的95％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中转氨酶活性的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
4)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织形态学的影响
大体病理检查：空白组小鼠肝组织外观红褐色，质软富弹性；模型组小鼠肝脏色泽稍色黄，肝脏稍肿大，边缘钝厚，质脆；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物治疗后，均有显著的改善，其中以sjy、50％jy和90％作用效果较好。病理组织学检查：正常组小鼠肝组织结构正常，肝小叶结构清楚，肝小叶细胞结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝索排列规则有序，肝窦与汇管区成纤维细胞少；模型组小鼠肝组织脂肪变性，肝小叶中肝细胞肿胀，且呈现弥漫性小泡性脂变，细胞胞质中呈现大小不等的脂肪滴，细胞核位于细胞质边缘；小叶内及汇管区可见炎症细胞浸润，肝细胞间界限不清，肝窦狭窄及与汇管区成纤维细胞增多，坏死程度与正常组比较有显著性差异(p<0.01)；sy、50％ay和95％ay组肝内均见多个片状坏死和点状坏死，坏死程度和模型组明显相比无明显差异(p>0.05)；50％aj和95％aj组肝内偶见点状坏死，坏死程度比模型组明显减轻，与模型组比较有显著性差异(p<0.05)；sjy、sy、50％ajy和95％ajy组肝内也可见小片状坏死，但坏死程度与模型组比较具有显著性差异(p<0.01)(表7-9和图2-4)。
表7小花清风藤不同药用部位的水提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表8小花清风藤不同药用部位的50％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表9小花清风藤不同药用部位的95％乙醇提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织病理学的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
5)小花清风藤茎叶药用部位不同溶剂提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的影响
由表10可见，模型组小鼠肝组织中sod和gsh-px活性明显降低，mda含量明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)，用小花清风藤的茎叶混合物的水(sjy)、50％乙醇(50％ajy)和95％乙醇(95％ajy)提取物治疗后，sod和gsh-px活性均有不同程度的升高，mda含量有不同程度降低，尤其是对mda的改善效果最为明显。在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，以sjy的作用效果最为显著，与模型组比较，差异有显著和非常显著性意义(p<0.05或p<0.01)。
表10小花清风藤茎叶药用部位不同溶剂提取物对ccl4致小鼠急性肝损伤模型肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
试验结论
小花清风藤对ccl4致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，可减轻ccl4对肝脏的脂质过氧化损伤，降低肝组织中alt和ast活性，升高肝组织中sod和gsh-px水平，降低肝组织中mda含量，从而减轻ccl4对肝组织氧化损伤，改善肝脏的组织病理学形态，保护肝细胞并恢复肝功能，并证实其作用机制与其抗氧化作用有关。在小花清风藤水提取组(sjy、sj、sy)低、高剂量组、50％乙醇提取组(50％ajy、50％aj、50％ay)低、高剂量组、95％乙醇提取组(95％ajy、95％aj、95％ay)中，以sjy作用效果比较好，依次是50％ajy、95％ajy、sj、50％aj、95％aj、sy、50％ay、95％ay，且呈现明显的量效关系。
实验例2
1)实验动物
选择km雄性小鼠90只，雄性，6～8周龄，体重18～20g，购于三峡大学实验动物中心，饲养于三峡大学实验动物中心spf级动物室，许可证号：scxk(鄂)2011-0012，分笼饲养，自由饮水和摄食。
2)分组与给药
将实验小鼠随机分为9组，每组10只，即正常组、模型组、水飞蓟素组(200mg/kg)、茎叶自然混合水提取物低、高剂量组、茎叶自然混合50％乙醇提取物低、高剂量组、茎叶自然混合95％乙醇提取物低、高剂量组。给药组分别灌胃给予相应剂量的药物，正常组和模型组分别灌胃给予等体积的0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)，每天1次，连续2周；连续给药1周后，于每次灌胃给药后4h，模型组和给药组灌胃给予12ml/kg的白酒(56％)，正常组小鼠灌胃给予同体积蒸馏水，每天2次，连续1周。实验期间自由饮水和进食。
3)实验动物行为及体征观察
每天观察实验大鼠的活动、进食、精神状态、毛发、排泄物及死亡情况。
4)肝脏的称量和质量指数的计算
实验小鼠眼眶取血完毕后，固定小鼠，打开腹腔，分别取肝脏和脾脏进行称量，计算其质量指数。
5)血液中tc、tg含量测定
实验小鼠的血液用离心机3000rpm/min，离心15min后，收集血清，用多功能酶标仪检测血清中tc和tg含量。具体方法按照试剂盒中说明书介绍的方法进行。
6)肝组织中alt和ast活性测定
取肝脏组织用生理盐水进行组织匀浆后，用离心机3500rpm/min，离心15min后，收集上清液，用多功能酶标仪检测肝组织中alt和ast含量。具体方法按照试剂盒中说明书介绍的方法进行。
7)肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的测定
取肝脏用生理盐水进行组织匀浆后，用离心机3500rpm/min，离心15min后，收集上清液，用多功能酶标仪检测肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量。具体方法按照试剂盒中说明书介绍的方法进行。
8)肝组织病理形态学分析
取血完毕后，取小鼠肝组织，用4％多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，连续2μm切片，经he染色后，在光镜下观察结肝组织病理学变化。每张切片观察5个肝小叶，以平均每个肝小叶内脂肪变性的肝细胞所占百分比表示肝脏脂肪变性程度。依据中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组《酒精性肝病诊疗指南：2010年1月修订》进行肝脏脂肪变性评分分级。具体分级如下：依据脂肪变性肝细胞占肝组织切片的比例，可将脂肪肝分为4度：f0：＜5％肝细胞脂肪变；f1：5％～33％肝细胞脂肪变；f2：33％～66％肝细胞脂肪变；f3：66％～75％肝细胞脂肪变；f4：75％以上肝细胞脂肪变。
9)数据统计分析
所有实验结果的数据以均数±标准差
试验结果
1)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠身体状况的影响
在观察期间动物的精神状态良好、毛色光洁、活动自如、饮食量正常、大小便无异常、口鼻内无异常分泌物、无一只动物死亡。造模后，正常组小鼠皮毛有光泽，行动灵活，食量及大便正常。模型组灌胃酒精后，有的行动不稳，呈惊恐状，有的异常兴奋，上下乱串，易激怒，反抗意识增强，食量较以前明显偏少，皮毛粗糙干枯，大便偏稀不成形，体质量明显下降，小鼠死亡2只。小花清风藤茎叶自然混合的水、50％乙醇和95％乙醇提取物组比模型组症状有明显改善，小花清风藤茎叶自然混合的水提组没有动物死亡，50％乙醇低剂量组和95％乙醇提取物低、高剂量组均有1只小鼠死亡。
2)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝质量和肝质量指数的影响
由表11可知，模型组小鼠肝质量和肝质量指数明显增加，与正常组比较具有显著差异(p＜0.01)，提示肝脏组织存在受损肿胀情况，说明造型成功。用小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(sjy、50％ajy、95％ajy)治疗后，均有不同程度的降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为sjy、50％ajy、95％ajy组，且呈现明显的量效关系。
表11小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝质量和肝质量指数的影响
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
3)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠血液中tc和tg含量的影响
由表12可见，模型组小鼠血液中tc和tg含量明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)。用小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(sjy、50％ajy、95％ajy)治疗后，均有不同程度的降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为sjy、50％ajy、95％ajy组，且呈现明显的量效关系，其中以小花清风藤sjy部位作用的效果最好。实验结果表明小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物可明显改善急性酒精性肝损伤小鼠肝脏的脂肪代谢。
表12小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠血清中tc和tg的影响
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
4)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中alt和ast活性的影响
由表13可见，模型组小鼠肝组织中alt和ast活性明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)，实验结果表明酒已对小鼠肝脏造成严重损伤，急性酒精中毒小鼠肝损伤模型建立成功。用小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(sjy、50％ajy、95％ajy)治疗后，均有不同程度的降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为sjy、50％ajy、95％ajy组，且呈现明显的量效关系。表明小花清风藤提取物对急性酒精中毒小鼠肝细胞损伤具有较好的保护作用，其中以小花清风藤sjy部位作用的效果最好。
表13小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中alt和ast的影响
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
5)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的影响
由表14可见，模型组小鼠肝组织中sod和gsh-px活性明显降低，mda含量明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)，说明该模型的造模是成功的。用小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(sjy、50％ajy、95％ajy)治疗后，sod和gsh-px活性明显升高，mda含量明显降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为sjy、50％ajy、95％ajy组，且呈现明显的量效关系，其中以小花清风藤sjy部位作用的效果最好。实验结果表明小花清风藤对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用与其提高机体抗氧化能力有关。
表14小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中sod、gsh-px活性和mda含量的影响
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
6)小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织病理变化影响
由图5所示，正常组小鼠肝组织结构正常、肝小叶结构完整清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝血窦结构规整、排列规则，细胞核染色较深，细胞核圆形，中央位，核质分布均匀，胞质内几乎无脂滴，肝细胞胞浆未见脂肪变性及气球样变，肝细胞无坏死、无炎性浸润等现象。模型组小鼠肝组织损伤严重，肝细胞排列紊乱，肝细胞索排列紊乱，细胞间无明显分界，多数肝细胞出现脂滴，以大泡性脂肪变性为主，肝细胞灶性或片状坏死，伴炎性细胞浸润等病理改变，细胞核被挤向一侧，胞浆出现气球样变，证明急性酒精性肝损伤造型成功。用小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(sjy、50％ajy、95％ajy)治疗后，小花清风藤茎叶自然混合95％ajy溶剂提取物组有部分肝细胞出现脂肪变性，以小泡性脂肪变性为主，胞浆气球样变的现象减少，有少量细胞炎症浸润现象；小花清风藤茎叶自然混合50％ajy溶剂提取物组肝组织形态出现明显的好转，肝索排列较整齐，肝细胞脂滴明显减少，胞浆疏松透亮，细胞核清晰完整，细胞完整性明显好转；小花清风藤茎叶自然混合sjy溶剂提取物组细胞完整排列整齐，肝组织细胞脂肪变轻微，无大泡性脂肪变性的肝细胞出现，核质清晰可见，没有炎症和坏死，具有修复肝细胞，逆转细胞损伤的作用(p＜0.05或p＜0.01)(表15)。
表15小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织脂肪变性评分影响
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
试验结论
小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(茎叶自然混合水提、茎叶自然混合50％乙醇提、茎叶自然混合95％乙醇提)对急性酒精性肝损伤小鼠具有显著的保护作用，可减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤，降低血清中tc、tg含量，升高肝组织中sod和gsh-px水平，降低肝组织中alt、ast水平及mda含量，从而减轻酒精对肝组织氧化损伤，改善肝脏的组织病理学形态，保护肝细胞并恢复肝功能，并证实其作用机制与其抗氧化作用有关。在小花清风藤茎叶自然混合不同溶剂提取物(茎叶自然混合水提、茎叶自然混合50％乙醇提、茎叶自然混合95％乙醇提)组中，其作用效果由高到低依次为茎叶自然混合水提组、茎叶自然混合50％乙醇提组、茎叶自然混合95％乙醇提组，且呈现明显的量效关系。
实验例3
1)实验细胞
人胚肝细胞株l-o2购自中国科学院上海细胞研究所。
2)肝细胞l-o2的复苏与培养
预热培养基，30分钟后，向培养瓶中加入8.0ml已预热的培养基，取出冻存于液氮中的l-o2细胞株，迅速投至37℃的水浴锅中，不断振摇。取出冻存管，75％酒精擦洗消毒，将冻存的细胞悬液吸至培养瓶中，混和均匀后，移入培养箱中37℃、5％co2条件下培养。当细胞单层长到80％时，用0.25％的胰蛋白酶消化，传代。将处于对数生长期的肝细胞l-02用0.25％胰蛋白酶消化，然后用含10％胎牛血清的dmem培养基悬浮，用玻璃管轻轻吹打成单细胞悬液，倒置显微镜下用细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×105个/ml。将细胞接种于96孔板中，每孔100ml，置于37℃、5％co2的孵箱培养24h。
3)ccl4诱导肝细胞l-o2损伤模型的建立
吸取ccl4溶于适量的dmem培养基中，以少量的二甲基亚砜助溶，二甲基亚砜终浓度为0.1％(v/v)，配成终浓度分别为5、10、15、20、25、30mmol/l的ccl4溶液。加入到肝细胞l-o2贴壁后的96孔板中，每个浓度设3个复孔。
4)肝细胞l-o2实验分组
ccl4损伤结束后，弃上清，分别在每个实验孔中加入不同浓度的小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物，每个浓度设6个复孔，药物浓度为药液终浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml，将加好样品溶液的培养板置37℃、5％co2培养箱中分别培养24h。
5)肝细胞l-o2存活率测定
采用四唑盐(mtt)比色法，测定前4h，每孔加入20μl的mtt液(5mg/ml)，终止培养，吸弃上清，加入dmso200μl/孔，待结晶溶解后，于全自动酶标光度计570nm处，测定每孔的吸光度(od值)，计算肝细胞l-o2的存活率。
细胞存活率(％)＝(实验组平均od值-溶剂组平均od值)/(阴性组平均od值-溶剂组平均od值)100％。
6)肝细胞l-o2培养液中ldh活性测定
取对数生长期的肝细胞l-o2经胰酶消化后，分别用dmem培养液吹打制成细胞1×106个/ml悬液，分别加入24孔培养板，在5％co2，37℃培养箱培养24h，待细胞完全贴壁后，用ccl4损伤后，分别加入小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物，它们终浓度为100μg/ml，每个浓度设3个复孔，并设正常组和模型组。培养箱孵育24h后，取上清液，按照试剂盒介绍的方法进行ldh活性检测。
7)肝细胞l-o2培养液中alt、ast活性测定
取对数生长期的肝细胞l-o2经胰酶消化后，分别用dmem培养液吹打制成细胞1×106个/ml悬液，分别加入24孔培养板，在5％co2，37℃培养箱培养24h，待细胞完全贴壁后，用ccl4损伤后，分别加入小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物，它们终浓度为100μg/ml，每个浓度设3个复孔，并设正常组和模型组。培养箱孵育24h后，取上清液，按照试剂盒介绍的方法进行alt、ast活性检测。
8)肝细胞l-o2内sod和gsh-px活性和mda含量测定
取对数生长期的肝细胞l-o2经胰酶消化后，分别用dmem培养液吹打制成细胞1×106个/ml悬液，分别加入24孔培养板，在5％co2，37℃培养箱培养24h，待细胞完全贴壁后，用ccl4损伤后，分别加入小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物，它们终浓度为100μg/ml，每个浓度设3个复孔，并设正常组和模型组。培养箱孵育24h后，收集细胞，用生理盐水配置成相同细胞浓度，超声波破碎后，按试剂盒介绍的mda，sod和gsh-px测定方法，测定细胞内sod和gsh-px活性和mda含量。
9)数据统计分析
所有实验结果的数据以均数±标准差
试验结果
1)不同浓度ccl4对肝细胞l-o2成活率的影响
由表16可见，随着ccl4浓度的升高，肝细胞l-o2存活率逐渐降低。与正常组相比，ccl4浓度为2mmol/l时，镜下细胞形态改变不明显，mtt检测显示l-o2肝细胞存活率为78.7％；从图片中看出在20mmol/l时，肝细胞l-o2存活率在15％至20％之间，可较好的显示ccl4致肝细胞l-o2损伤作用的差异。因此，我们选用20mmol/lccl4作用24h作为肝细胞l-o2的损伤模型。
表16不同浓度ccl4对肝细胞l-o2成活率的影响
与正常组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
2)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2形态学影响
肝细胞l-o2在ccl4损伤用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物培养24h后，倒置显微镜下观察结果，正常组肝细胞l-o2生长良好，细胞贴壁生长，呈多边形，分界清楚，表面光滑。与正常组比较，模型组肝细胞l-o2细胞数明显减少，细胞的生长状况明显不佳，可见l-o2肝细胞出现核溶解、细胞膜破损、结构不清晰，皱缩变圆，死亡脱落，细胞周围出现一些凋亡小泡。各小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物组细胞生长状况明显优于模型组，细胞结构较清晰，皱缩程度较轻，脱落减少，尤其100μg/ml小花清风藤提取物作用效果较好，其作用效果由强到弱依次为：sy,sjy,50％ay,50％ajy,95％ay,95％ajy组，上述组细胞数量和细胞形态已经恢复到正常对照水平。结果提示，小花清风藤对ccl4引起的肝细胞l-o2损伤具有较好的改善作用(图6)。
3)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤影响
由表17-19可见，经ccl4损伤后模型组肝细胞l-o2存活率显著降低，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)，实验提示ccl4致肝细胞l-o2损伤模型复制成功；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物在不同浓度(3.125,6.25,12.5,25,50,100μg/ml)干预后，细胞成活率明显增加，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为50％ajy,95％ajy,50％ay,sy,sjy,95％ay,50％aj,95aj,sj。该实验结果与动物实验略有偏差的原因是由于不同部位的提取物得率不同，按照得率进行换算，其不同部位和提取物的作用效果在细胞实验和动物实验上是一致的。
表17小花清风藤不同药用部位的水提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表18小花清风藤不同药用部位的50％乙醇提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
表19小花清风藤不同药用部位的95％乙醇提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
4)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤培养液中ldh活性的影响
由表20可见，正常肝细胞l-o2培养液中ldh水平很低，模型组中培养液中ldh水平明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物在100μg/ml浓度干预后，细胞培养液中ldh水平明显降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为50％ajy,sjy,95％ajy,50％ay,sy,95％ay,sj,50％aj,95％aj。该实验结果与动物实验略有偏差的原因是由于不同部位的提取物得率不同，按照得率进行换算，其不同部位和提取物的作用效果在细胞实验和动物实验上是一致的。
表20小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤培养液中ldh、alt和ast活性的影响9
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
5)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤培养液中alt和ast活性的影响
由表20可见，正常组肝细胞l-o2培养液中ldh水平很低，模型组中培养液中alt和ast水平明显升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物在100μg/ml浓度干预后，细胞培养液中alt和ast水平明显降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为50％ajy,sjy,95％ajy,50％ay,sy,95％ay,sj,50％aj,95％aj。该实验结果与动物实验略有偏差的原因是由于不同部位的提取物得率不同，按照得率进行换算，其不同部位和提取物的作用效果在细胞实验和动物实验上是一致的。
6)小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤细胞内sod、gsh-px活性和mda含量的影响
由表21可见，正常l-o2肝细胞内sod、gsh-px活性较高，mda含量较低，模型组中细胞内sod、gsh-px活性明显降低，mda含量升高，与正常组比较具有显著性差异(p<0.01)；用小花清风藤的茎、叶及茎叶自然混合物的水(sj,sy,sjy)、50％乙醇(50％aj,50％ay,50％ajy)和95％乙醇(95％aj,95％ay,95％ajy)提取物在100μg/ml浓度干预后，细胞内sod、gsh-px活性明显升高，mda含量降低，与模型组比较具有显著性差异(p＜0.05或p＜0.01)，其作用效果由高到低依次为50％ajy,sjy,95％ajy,50％ay,sy,95％ay,sj,50％aj,95％aj。该实验结果与动物实验略有偏差的原因是由于不同部位的提取物得率不同，按照得率进行换算，其不同部位和提取物的作用效果在细胞实验和动物实验上是一致的。
表21小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物对ccl4致肝细胞l-o2损伤肝细胞内sod、gsh-px活性和mda含量的影响(
与正常组比较，#p＜0.05,##p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05,**p＜0.01
试验结论
小花清风藤水提取物(茎、叶、茎叶自然混合)、50％乙醇提取物(茎、叶、茎叶自然混合)、95％乙醇提取物(茎、叶、茎叶自然混合)对ccl4致人肝细胞l-o2损伤的保护作用，它可提高l-o2细胞的成活率，降低细胞培养液中ldh和alt、ast水平，升高l-o2细胞内sod和gsh-px水平，降低细胞内mda含量，其可能作用机制是通过增强sod和gsh-px对活性氧簇的清除能力，降低脂质过氧化产物mda含量，从而减轻ccl4对l-o2细胞氧化损伤，保护肝细胞并恢复肝功能。在小花清风藤不同药用部位及溶剂提取物中，其作用效果由高到低依次为茎叶自然混合50％乙醇提取物、茎叶自然混合水提物、茎叶自然混合95％乙醇提取物、叶50％乙醇提取物、叶水提取物、95％乙醇叶提取物、茎水提物、茎50％乙醇提取物、茎95％乙醇提取物。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。