本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可提高肺部黏膜免疫应答水平的免疫佐剂及其应用。
背景技术：
炭疽病是一种人畜共患烈性传染病，其临床类型分为三种：皮肤炭疽、吸入性炭疽、胃肠炭疽。吸入性炭疽又称肺炭疽，其病死率在以上三种类型中最高。由于炭疽芽孢对外环境高度耐受，可以以气溶胶形式通过呼吸道感染人群引起高死亡率，因此炭疽被认为是最危险的生物战剂。炭疽疫苗作为预防炭疽病的主要手段，在炭疽病的控制中发挥了重要的作用。而炭疽芽孢被制成生物战剂的可能性使得人们迫切需求预防吸入性炭疽的安全有效的疫苗。
目前世界上获得许可的人用炭疽疫苗主要有两类：①减毒活芽孢疫苗。该疫苗由无荚膜的减毒株芽孢制成，主要通过皮肤划痕接种，我国使用的是a16r株，对肺炭疽的保护效果不佳，并具有一定的不良反应。②炭疽弱毒株无菌培养滤液佐剂吸附/沉淀苗。包括美国fda批准的ava(anthraxvaeeineabsorbted)和英国批准的avp(anthraxvaccineprecipitated)。ava、avp疫苗虽然有效，但其成分复杂，免疫接种程序繁琐且持续时间长，效力持续时间短，引起高比率的局部及全身不良反应，很难在普通群体中推广接种。
现有疫苗安全性和效力持续性等方面的缺陷促使了第二代炭疽疫苗得以发展。第二代疫苗是基于pa保护性抗原的基因工程重组pa亚单位疫苗(recombinantpa，rpa)，rpa疫苗克服了第一代疫苗抗原成分复杂的问题，能降低疫苗接种时的反应原性。rpa与铝佐剂联合免疫兔和非人灵长类动物模型也显示出较高的保护效力。但是rpa疫苗的最佳剂型、免疫程序以及免疫佐剂方案都需进一步进行研究。
炭疽疫苗的常规免疫途径为注射接种，然而以诱导全身免疫应答为主的注射接种途径不能在吸入性炭疽芽孢最先侵入的部位——呼吸道及时有效地诱导局部特异性抗体的产生。而疫苗通过呼吸道黏膜免疫，模拟了自然感染的过程，可以同时诱导黏膜局部和全身免疫应答，理论上是吸入性炭疽的最佳免疫途径。黏膜免疫除了可以诱导机体同时产生系统和局部免疫应答以外还具备以下优点：避免了注射接种可能引发的局部不良反应；避免了大人群免疫接种时产生大量的一次性废弃物如注射器等；避免了血液传播病原体如艾滋病毒、乙肝病毒等通过注射交叉污染；可以更有效的预防通过气道传播病原体的感染。因此近年来，用黏膜免疫途径(包括鼻、肺、胃肠道、生殖道黏膜)替代传统免疫途径接种炭疽疫苗受到广泛关注。
目前炭疽疫苗肺吸入免疫仅限于前苏联时期对安全性差的炭疽活菌苗的研究，第二代rpa疫苗以及第三代疫苗免疫途径的研究目前主要集中在较容易操作的其他黏膜免疫途径方面(如鼻、胃肠道黏膜)并且未达到理想的免疫保护效果，而肺吸入途径免疫的研究仍处于空白状态。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种免疫佐剂组合物。
本发明提供的免疫佐剂组合物由免疫佐剂tmc60和免疫佐剂c48/80组成。
上述免疫佐剂组合物中，所述免疫佐剂tmc60和免疫佐剂c48/80的质量比为6:(20-30)；所述免疫佐剂tmc60和免疫佐剂c48/80的质量比具体为6:25。
本发明的另一个目的是提供上述免疫佐剂组合物的新用途。
本发明提供了上述免疫佐剂组合物在制备炭疽疫苗中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种炭疽疫苗。
本发明提供的炭疽疫苗包括rpa抗原蛋白和上述免疫佐剂组合物。
上述炭疽疫苗中，所述rpa抗原蛋白、所述免疫佐剂tmc60和免疫佐剂c48/80的质量比为2:(4-8):(20-30)；所述rpa抗原蛋白、所述免疫佐剂tmc60和免疫佐剂c48/80的质量比具体为2:6:25。
上述炭疽疫苗中，所述疫苗采用肺递送气溶胶免疫途径进行接种。所述采用肺递送气溶胶免疫途径进行接种的方法为将所述疫苗通过液体气溶胶肺递送装置递送至动物的肺部。
本发明的炭疽疫苗由rpa抗原蛋白、所述免疫佐剂tmc60、免疫佐剂c48/80和hepes缓冲液组成。具体的，所述炭疽疫苗是将10μgrpa抗原、30μg黏膜免疫佐剂c48/80、125μg黏膜免疫佐剂tmc60和50μlhepes缓冲液混匀得到的。
本发明的最后一个目的是提供上述免疫佐剂组合物或上述炭疽疫苗的新用途。
本发明提供了上述免疫佐剂组合物或上述炭疽疫苗在如下1)-10)中任一种中的应用：
1)预防炭疽病；
2)制备预防炭疽病的产品；
3)增强黏膜免疫应答水平；
4)制备增强黏膜免疫应答水平的产品；
5)提高免疫后动物血清中抗rpa特异性抗体igg滴度；
6)制备提高免疫后动物血清中抗rpa特异性抗体igg滴度的产品；
7)提高免疫后动物肺部中抗rpa特异性抗体s-iga滴度；
8)制备提高免疫后动物肺部中抗rpa特异性抗体s-iga滴度的产品；
9)提高免疫后动物血清和/或肺部中炭疽毒素中和抗体滴度；
10)制备提高免疫后动物血清和/或肺部中炭疽毒素中和抗体滴度的产品。
上述应用中，所述炭疽病为吸入性炭疽病。
上述应用中，所述增强黏膜免疫应答水平为增强肺黏膜免疫应答水平。
本发明的有益效果：1)本发明首次发现黏膜免疫佐剂c48/80与tmc60联用能显著增强黏膜免疫应答，为今后的黏膜免疫研究提供了优秀的佐剂配方参考；2)本发明采用的肺递送气溶胶接种炭疽rpa疫苗的免疫方法既能诱导最强的肺部黏膜免疫应答，又能诱导相等或稍高于皮下注射途径的全身免疫应答，是一种全身与局部免疫诱导兼具的接种途径；在佐剂相同条件下，肺递送气溶胶接种诱导的黏膜免疫反应强度高于其他免疫途径。
本发明使用黏膜免疫佐剂c48/80、黏膜免疫佐剂tmc60、氢氧化铝佐剂三种佐剂配合rpa抗原蛋白通过不同免疫接种途径对小鼠进行免疫，对不同免疫佐剂和不同免疫接种途径的免疫保护性进行了相关评价，最终筛选得到一种炭疽疫苗免疫方法：炭疽疫苗添加免疫佐剂c48/80和tmc60，采用肺递送气溶胶的免疫途径进行接种。本发明的免疫方法可增强黏膜免疫应答，有效预防吸入性炭疽，在炭疽病的控制中可发挥重要作用。
附图说明
图1为血清抗rpa特异性抗体igg的滴度检测结果。注：a、b、c为统计分析两两比较结果分组。
图2为血清抗rpa特异性抗体igg1/igg2a检测结果。注：a、b、c为统计分析两两比较结果分组。
图3为肺灌洗液抗rpa特异性s-iga检测结果。注：a、b、c为统计分析两两比较结果分组。
图4为血清、肺灌洗液炭疽毒素中和抗体检测结果。注：a、b、c为统计分析两两比较结果分组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的黏膜免疫佐剂tmc60记载于文献“张冕，何文，李菁，代文兵，不同季铵化程度的n-三甲基壳聚糖透皮吸收促进作用的研究，中国药学杂志，2006年10月第41卷第19期，1475-1478”中，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。
实施例1、炭疽rpa疫苗多种免疫途径、多种佐剂免疫的免疫原性比较研究
一、炭疽rpa疫苗多种免疫途径、多种佐剂免疫的免疫原性比较试验方法
1、实验分组
本发明比较了炭疽rpa疫苗通过肺递送(intropulmonary，ipl)、滴鼻(intronasal，in)、皮下注射(subcutaneous，sc)三种接种途径免疫，辅以黏膜免疫佐剂c48/80、黏膜免疫佐剂tmc60、氢氧化铝佐剂alum三种佐剂对小鼠免疫效果的差异。其中，肺递送免疫方式采用手持式液体气溶胶肺递送装置(北京慧荣和科技有限公司)将疫苗递送至小鼠肺部。
实验分组：根据接种途径与佐剂的组合不同，分为6个实验组与1个溶剂对照组，共7个组，具体分组情况如表1所示。实验动物为4-6周龄雌性balb/c小鼠，每组动物6只。具体如下：
对照组1(hepesipl)：每只小鼠给予50μlhepes缓冲液(0.005mhepes，0.05mnacl，ph7.5)；无佐剂；ipl免疫途径；
实验组2(rpaipl)：每只小鼠给予50μlrpa溶液，rpa溶液是将10μgrpa抗原(listbiologicallaboratories，inc)与50μlhepes缓冲液混匀得到的；无佐剂；ipl免疫途径；
实验组3(rpa+cipl)：每只小鼠给予50μlrpa+c溶液，rpa+c溶液是将10μgrpa抗原、30μg黏膜免疫佐剂c48/80(sigma)和50μlhepes缓冲液混匀得到的；ipl免疫途径；
实验组4(rpa+c+tipl)：每只小鼠给予50μlrpa+c+t溶液，rpa+c+t溶液是将10μgrpa抗原、30μg黏膜免疫佐剂c48/80(sigma)、125μg黏膜免疫佐剂tmc60和50μlhepes缓冲液混匀的；ipl免疫途径；
实验组5(rpa+c+tin)：每只小鼠给予20μlrpa+c+t溶液，rpa+c+t溶液是将10μgrpa抗原、30μg黏膜免疫佐剂c48/80(sigma)、125μg黏膜免疫佐剂tmc60(武汉大学人民医院药学部)和20μlhepes缓冲液混匀得到的；in免疫途径；
实验组6(rpa+alumin)：每只小鼠给予100μlrpa+alum溶液，rpa+alum溶液是将10μgrpa抗原、1000μg氢氧化铝佐剂(thermo)和100μlhepes缓冲液混匀得到的；sc免疫途径。
表1、动物免疫分组表
2、免疫程序及样本的制备
1)各组动物均采取以下统一的免疫程序进行免疫接种：共进行三次免疫接种，每两周免疫一次，接种时间依次为d0、d14、d28；
2)采血、解剖、样本制备：第一次免疫接种前、每次免疫10天后对小鼠采血取血清样本，采血时间依次为d0、d10、d24、d38；三次免疫后于d38天采血后解剖动物，制备肺灌洗液。血清与肺灌洗液样本均放于-20℃保存。
3、特异性抗体检测
通过直接elisa方法检测免疫动物血清抗rpa特异性igg滴度、血清抗rpa特异性igg1、igg2a滴度、肺灌洗液抗rpa特异性s-iga滴度。具体方法如下：
1)将rpa抗原液用包被液(na2co31.6g，nahco32.9g，h2o100ml，ph9.6)稀释后加入至96孔酶联板，200ng/孔，37℃孵育2h，移除菌液，拍干；
2)加入封闭液(1‰(w/v)干酪素10ml，pbs140ml)，200μl/孔，37℃孵育2h，移除菌液，拍干；
3)待检血清、肺灌洗液样品按1/100、1/5起始浓度加入到酶联板中，之后按倍比稀释的方法系列稀释，37℃孵育30min；
4)取出后洗液(tween200.5ml，pbs1000ml)洗涤5次，拍干；
5)加入相应二抗100μl/孔，37℃孵育20min。二抗为hrp-羊抗鼠igg、iga、igg2a、igg2b(abcam)，均用稀释液(0.5‰(w/v)干酪素10ml，pbs290ml)稀释10000倍。
6)洗液洗涤5次，拍干；
7)显色液tmb加入酶联板100μl/孔，放入暗处显色10min，之后加入终止液(h2so443.6ml，h2o356.4ml)终止反应，并用酶联仪于od540读吸光度值。
8)每板取三个复孔加入免疫前血清作为阴性对照，同时设置3孔不加血清的空白对照，od540值大于阴性对照3倍者视为阳性结果。
4、毒素中和抗体检测
免疫动物血清、肺灌洗液中炭疽毒素中和抗体滴度水平通过免疫血清或肺灌洗液保护鼠源巨噬细胞j774a.1对抗炭疽毒素(letx)的致死作用的能力来确定。具体方法如下：
1)j774a.1细胞以3×104细胞/孔的密度培养于96孔平底组织培养板中，100μl/孔，37℃过夜培养；
2)次日，在无菌条件下将系列稀释的免疫血清(起始稀释度1/20，每个稀释度做3个复孔)与pa/lf毒素复合物(40ng/mlpa，20ng/mllf)于37℃共同孵育1h；
3)将过夜培养的细胞板内的培养基吸出，并取100μl孵育好的血清毒素复合物加入到无血清的细胞板内，37℃孵育3h；
4)将作用3h后的血清毒素复合物吸出，向每孔加入10μlcck-8溶液，37℃孵育2h；
5)向每孔加入10μl1％(w/v)sds溶液，并用酶联仪于od450处读取吸光度值。
6)每板取三个复孔不加血清，作为无保护的对照，另取三个孔不加血清和毒素作为空白对照，od450值大于无保护对照值3倍者视为阳性结果。
5、数据统计分析
采用sas9.3软件对各组检测数据进行统计分析，所有分析皆按单因素多水平一元定量资料进行统计分析，首先对资料进行正态性和方差齐性分析，在不能同时满足正态性和方差齐性的情况下，采用kruskal-wallis检验，对各组的平均秩进行两两比较，两两比较采用tukey-kramer法。
二、炭疽rpa疫苗多种免疫途径、多种佐剂免疫的免疫原性比较实验结果
1、一、二、三次免疫血清的抗rpa特异性igg检测结果
通过酶联免疫吸附试验(elisa)检测了各组动物一、二、三次免疫后的血清抗rpa特异性抗体igg的滴度。
检测结果如图1所示。三次免疫的检测结果表明，溶剂对照组一、二、三免均无抗rpa特异性igg抗体产生，二免后rpaipl组仅1只动物检出抗体，其他实验组每只动物均有检出抗体，三免后所有实验组每只动物均检出抗体，并各自达到观察时间内的最高值。
二免igg各组间统计分析结果表明，rpa+c+tipl组(滴度：1425)与rpa+c+tin(滴度：2850)组产生的抗体滴度明显高于其他组，其中后者平均值更高，但两组之间无明显差异。rpa+cipl组(滴度：283)与rpa+alumsc(滴度：317)组产生的抗体滴度水平相当，均低于之前两组，但与溶剂对照组有明显差异。rpaipl组产生抗体滴度(滴度：2)低于其他实验组，且与hepesipl溶剂对照组无明显差异。
三免igg各组间统计分析结果表明，rpa+cipl组(滴度：12800)、rpa+c+tipl组(滴度：45614)、rpa+c+tin组(滴度：28735)、rpa+alumsc组(滴度：20318)抗体滴度均明显高于溶剂对照组，其中rpa+c+tipl组平均值最高，四组之间抗体滴度无明显差异。另外，rpaipl组(滴度：2539)虽每只动物均为阳性，但与溶剂对照组相比无明显差异。
由以上结果可以得知，第三次免疫后能激发更高水平的抗rpa特异性igg抗体，佐剂对抗体激发速度和强度均有影响。同时添加c48/80+tmc60两种佐剂实验组，无论是ipl还是in免疫途径，其抗体激发速度均优于只添加一种佐剂组，表现在二免时两组的抗体滴度明显高于其他组，但三免后所有添加佐剂组抗体水平均达到观察期最高水平且无明显差异，说明三免后只要添加佐剂的实验组均能产生无明显差异的较高滴度抗体。然而，不添加佐剂的rpaipl组无论抗体激发速度和强度均明显落后。
2、一、二、三次免疫血清的抗rpa特异性igg1/igg2a检测结果
通过elisa方法对igg的亚型进行分型检测，观察各个实验组的igg1/igg2a比值，以此判断动物免疫反应类型趋向。
结果图2所示。各实验组的二免、三免结果igg1均高于igg2a，实验组除rpa+c+tin之外，每组均有igg2a检测为零的动物1至4只，因此比值的统计分析结果不准确，但能判断出所有实验组的免疫反应均趋向于th2型。
3、三次免疫后肺灌洗液抗rpa特异性s-iga检测结果
通过酶联免疫吸附试验(elisa)检测各组动物三免后的肺灌洗液抗rpa特异性抗体s-iga滴度。
结果如图3所示。三免后肺灌洗液的iga统计分析结果如下：rpa+c+tipl组(滴度：1140)所激发的抗体滴度最高。rpa+cipl组(滴度：6)与rpa+c+tin组(滴度：11)激发的抗体滴度次之，但其滴度均值很低，与rpa+c+tipl组相差两个数量级。而rpaipl组与溶剂对照无明显差异，rpa+alumsc组未检出s-iga抗体。
肺灌洗液s-iga是肺局部粘膜免疫的重要指标。从统计结果可知，仅rpa+c+tipl组诱导出滴度较高的s-iga。佐剂、接种途径比较研究结果如下：ipl和in黏膜免疫途径均能激发肺局部s-iga抗体，而皮下注射途径则不能激发s-iga抗体产生。比较两种黏膜免疫途径，同样的佐剂配方条件下，ipl途径免疫反应强度要高于in途径。从ipl途径的佐剂比较可知，rpa+c+tipl组免疫反应强度高于rpa+cipl组，而rpa+cipl组则高于无佐剂添加组。由此可知，黏膜局部分泌型抗体s-iga的激发强度同时受免疫途径和佐剂的影响，sc途径无法激活该抗体产生，ipl和in途径均能激发该类抗体，相同佐剂配方条件下ipl途径激发强度要高于in途径。另外黏膜免疫佐剂配方按效力排序结果为：c48/80+tmc60>c48/80>无佐剂。
4、三次免疫后血清、肺灌洗液炭疽毒素中和抗体检测
通过血清、肺灌洗液样本对小鼠巨噬细胞j774a.1对抗炭疽毒素致死作用的保护能力来检测各实验组产生的毒素中和抗体滴度水平。
结果如图4所示。由第三次免疫后血清毒素中和抗体检测统计分析结果可知，除溶剂对照组之外，所有免疫实验组的血清均能检测出毒素中和抗体，其中rpa+c+tipl组平均值最高，但各组间中和抗体水平无明显差异。
由第三次免疫后肺灌洗液毒素中和抗体检测统计分析结果可知，仅rpa+c+tipl组和rpa+c+tin组有中和抗体检出，其中rpa+c+tipl组的中和抗体水平明显高于溶剂对照组，而rpa+c+tin组抗体水平与溶剂对照组无明显差异。
由血清和肺灌洗液毒素中和抗体检测可知，只有rpa+c+tipl组能同时在血清和肺部检出明显高于溶剂对照组的毒素中和抗体，而其他组仅能在血清中检出毒素中和抗体。毒素中和抗体是提示免疫保护效力的关键指标，因此可推断，仅rpa+c+tipl组能同时产生全身和肺局部的免疫保护效力。