本发明涉及生物三维打印半月板支架领域，具体为一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法。
背景技术：
现如今，半月板损伤已经是一种很常见疾病。在美国，每年有超过100万人接受半月板手术治疗。半月板作为软骨组织，缺乏血供导致其自愈合能力较差。对于严重损伤的半月板，临床通常采用半月板切除的治疗方法。尽管半月板切除术具有短期疗效好、功能恢复快等优点，但是半月板切除后再生半月板的质量不能行使正常半月板的生物力学功能，远期将不可避免地加重关节软骨退变。同种异体的半月板移植可以替代缺失的半月板，但供体来源非常有限，远不能满足临床需求。随着组织工程技术和材料学的发展，制备人工半月板支架为半月板修复提供了一种新的治疗模式。
制备人工半月板支架的常用组织工程技术为静电纺丝，浇筑成型等。这些方法制备的半月板支架虽然外观尺寸与半月板组织一致，但是却很难实现半月板微观的结构仿生。单纯的利用材料制备成的半月板支架让细胞很难粘附、增殖和迁移，这并不利于半月板的修复。类似半月板微观的有序排列的胶原纤维结构、足够的孔隙结构不仅对于半月板支架的力学性能具有重要意义，同时对于半月板修复更是极其关键。三维打印技术的发展为组织工程的修复带来了新的希望，尤其它具备可以自由控制支架微观结构与孔隙结构的优点，为真正意义上的半月板结构仿生提供了可能。
然而，当前利用三维打印制备的半月板支架仅仅是将把单纯的材料按照半月板宏观结构进行三维模型构建，却并不包含细胞。作为组织工程的重要要素之一，软骨细胞是半月板组织的主要组成部分，它对于半月板的修复具有重要意义。利用三维打印制备组织工程半月板支架，前期的方式是首先三维打印得到不包含细胞的支架材料，然后直接植入用于半月板修复；后期的改进方式是将不包含细胞的支架材料在体外种植上软骨细胞后，然后体外培养待软骨细胞长入支架后再进行植入。前者因为支架不负载软骨细胞，修复结果不良；而后者由于需要长期的体外培养细胞，不利于操作。本发明拟通过采用生物三维打印技术，打印可降解聚己内酯材料作为半月板框架结构，与此同时打印负载有软骨细胞的水凝胶填充在半月板框架结构的孔隙中。同时生物三维打印得到负载软骨细胞的半月板支架，实现了支架与细胞的完美结合。
半月板损伤通常会给关节带来较为严重的非感染性炎症反应，而这种炎症反应会成为半月板修复的一个重要不利因素。在制备半月板支架的同时兼顾抗炎的需求对于半月板修复也同样重要。而且，目前尚未有可以具备抗炎作用的半月板支架的报道或者应用。本发明拟通过负载软骨细胞的同时在水凝胶中置入可抗炎的富勒烯材料，最终生物三维打印得到负载软骨细胞且兼顾抗炎作用的半月板支架，为临床应用提供了新的治疗方案。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法，该负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法，包括以下步骤：
s1、构建半月板三维模型：
一、数据扫描：首先使用三维扫描电镜对患者健康一侧的膝关节进行扫描，然后将扫描所获得的原始数据，存入数据库；
二、数据处理：将步骤一中所存入的患者健康侧的膝关节模型，通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获得该膝关节半月板外侧或内侧的三维模型，然后通过对半月板三维模型进行镜像处理，获得适用于患者缺损侧的半月板三维模型，然后对镜像处理所得的半月板三维模型进行局部修正以及曲面化处理；
三、数据的保存：将步骤二中数据处理完成后的缺损侧的半月板三维模型进行保存，从而按照模型进行生物三维打印半月板，其中保存格式为stl格式文件。
s2、构建半月板二维模型：
一、三维模型的处理：将s1步骤中构建完成的半月板三维模型进行切片分层处理，从而形成打印聚己内酯材料的打印路径以及打印负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径等两个打印路径；
二、二维模型的构成：将步骤一的两个打印路径分别保存为二维数据模型后，等待下一步骤；
s3、打印材料的制备：
一、材料的选取：材料的选取：量取适量的软骨细胞悬液、富勒烯、胶原蛋白、海藻酸钠以及dmem培养基；
二、材料的混合：将步骤一中的胶原蛋白和海藻酸钠加入dmem培养基中，进行搅拌溶解，从而获得水凝胶溶液，将步骤1中富勒烯适量的加入至混合获得的水凝胶溶液内部，搅拌均匀后，获得富勒烯复合水凝胶，等待下一步骤；
三、材料的过滤：将步骤二中获得的富勒烯复合水凝胶通过过滤器进行过滤除菌处理，处理完成后，等待下一步骤；
四、软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的制备：将步骤一中的适量软骨细胞悬液加入至步骤三中获得的过滤除菌后的无菌富勒烯复合水凝胶内，进行搅拌混合，从而获得软骨细胞与富勒烯复合水凝胶。
s4、负载软骨细胞抗炎半月板支架的打印：
一、打印材料的添加：将s3步骤中获得的软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料以及聚己内酯材料分别加入至生物三维打印机的两个相对应的料筒内部；
二、半月板支架的打印：使用生物三维打印机通过两个料筒内部的打印材料对照s2步骤中相对应的聚己内酯材料的打印路径以及打印负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径等二维数据模型分别进行三维打印，从而获得负载软骨细胞抗炎半月板支架，等待下一步骤；
s5、负载软骨细胞抗炎半月板支架的培养：
一、培养溶液的选取：量取适量的氯化钙溶液以及培养基，且将s4步骤中所获得的负载软骨细胞抗炎半月板支架放置在氯化钙溶液的内部进行交联处理；
二、半月板支架的培养：将由步骤一中交联完成后的负载软骨细胞抗炎半月板支架放入培养基中进行持续培养。
优选的，所述s2步骤中的聚己内酯材料的打印路径和负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径为层层相互交叉设置或同层并列设置。
优选的，所述s3中步骤二的水凝胶溶液的胶原蛋白的浓度为0.1％-0.3％，其海藻酸钠的浓度为0.2％-0.5％，其中混合温度调节为40℃。
优选的，所述s3中步骤二的富勒烯复合水凝胶的富勒烯浓度为1％-5％，搅拌温度调节为40℃。
优选的，所述s3中步骤三的过滤器为0.22微米过滤器。
优选的，所述s3中步骤四的软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的软骨细胞浓度为1x106-5x106个/ml，搅拌温度为37℃，且搅拌速率为低速，其中软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的混合过程为无菌。
优选的，所述s4步骤中聚己内酯打印材料的料筒温度为100-150℃，软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料的料筒温度为25-37℃，其中不同的料筒对应不同的打印头。
优选的，所述打印头的直径为150-400μm，其中打印过程中聚己内酯打印材料的料筒气压为600-1000kpa、软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料料筒气压为50-100kpa，层高为150-400μm。
优选的，所述s4步骤中的生物三维打印机腔内为无菌环境，且温度为25-37℃。
优选的，所述s5步骤中的氯化钙溶液为经过过滤除菌的无菌氯化钙溶液，其浓度为2％-5％，温度为25-37℃，所述负载软骨细胞抗炎半月板支架和氯化钙溶液的交联处理时间为5-10min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法，能够很好的模仿半月板组织的三维宏观形态，内部微观胶原纤维和多孔隙结构，利于细胞的生长与营养物质的交换，促进半月板组织再生。选择聚己内酯打印半月板支架的框架结构，为关节支撑提供了足够的力学。同时负载了软骨细胞，避免了打印支架后体外细胞培养的操作；负载了富勒烯材料，使该支架具有抗炎的效果。
附图说明
图1为本发明的半月板三维模型图；
图2为本发明的两种三维打印路径示意图；
图3为本发明的细胞增殖mtt实验结果示意图
图4为本发明的细胞炎性实验结果示意图
图5为本发明的半月板支架与半月板组织力学测试结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供一种技术方案：
一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法，该负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法，包括以下步骤：
s1、构建半月板三维模型：
一、数据扫描：首先使用三维扫描电镜对患者健康一侧的膝关节进行扫描，然后将扫描所获得的原始数据，存入数据库；
二、数据处理：将步骤一中所存入的患者健康侧的膝关节模型，通过生物三维打印机软件进行分割以及编辑处理，获得该膝关节半月板外侧或内侧的三维模型，然后通过对半月板三维模型进行镜像处理，获得适用于患者缺损侧的半月板三维模型，然后对镜像处理所得的半月板三维模型进行局部修正以及曲面化处理；
三、数据的保存：将步骤二中数据处理完成后的缺损侧的半月板三维模型进行保存，从而按照模型进行生物三维打印半月板，其中保存格式为stl格式文件。
s2、构建半月板二维模型：
一、三维模型的处理：将s1步骤中构建完成的半月板三维模型进行切片分层处理，从而形成打印聚己内酯材料的打印路径以及打印负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径等两个打印路径；
二、二维模型的构成：将步骤一的两个打印路径分别保存为二维数据模型后，等待下一步骤；
s3、打印材料的制备：
一、材料的选取：材料的选取：量取适量的软骨细胞悬液、富勒烯、胶原蛋白、海藻酸钠以及dmem培养基；
二、材料的混合：将步骤一中的胶原蛋白和海藻酸钠加入dmem培养基中，进行搅拌溶解，从而获得水凝胶溶液，将步骤1中富勒烯适量的加入至混合获得的水凝胶溶液内部，搅拌均匀后，获得富勒烯复合水凝胶，等待下一步骤；
三、材料的过滤：将步骤二中获得的富勒烯复合水凝胶通过过滤器进行过滤除菌处理，处理完成后，等待下一步骤；
四、软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的制备：将步骤一中的适量软骨细胞悬液加入至步骤三中获得的过滤除菌后的无菌富勒烯复合水凝胶内，进行搅拌混合，从而获得软骨细胞与富勒烯复合水凝胶。
s4、负载软骨细胞抗炎半月板支架的打印：
一、打印材料的添加：将s3步骤中获得的软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料以及聚己内酯材料分别加入至生物三维打印机的两个相对应的料筒内部；
二、半月板支架的打印：使用生物三维打印机通过两个料筒内部的打印材料对照s2步骤中相对应的聚己内酯材料的打印路径以及打印负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径等二维数据模型分别进行三维打印，从而获得负载软骨细胞抗炎半月板支架，等待下一步骤；
s5、负载软骨细胞抗炎半月板支架的培养：
一、培养溶液的选取：量取适量的氯化钙溶液以及培养基，且将s4步骤中所获得的负载软骨细胞抗炎半月板支架放置在氯化钙溶液的内部进行交联处理；
二、半月板支架的培养：将由步骤一中交联完成后的负载软骨细胞抗炎半月板支架放入培养基中进行持续培养。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s2步骤中的聚己内酯材料的打印路径和负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料的打印路径为层层相互交叉设置或同层并列设置。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s3中步骤二的水凝胶溶液的胶原蛋白的浓度为0.1％-0.3％，其海藻酸钠的浓度为0.2％-0.5％，其中混合温度调节为40℃。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s3中步骤二的富勒烯复合水凝胶的富勒烯浓度为1％-5％，搅拌温度调节为40℃。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s3中步骤三的过滤器为0.22微米过滤器。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s3中步骤四的软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的软骨细胞浓度为1x106-5x106个/ml，搅拌温度为37℃，且搅拌速率为低速，其中软骨细胞与富勒烯复合水凝胶的混合过程为无菌。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s4步骤中聚己内酯打印材料的料筒温度为100-150℃，软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料的料筒温度为25-37℃，其中不同的料筒对应不同的打印头。
作为本发明的一种技术优化方案，所述打印头的直径为150-400μm，其中打印过程中聚己内酯打印材料的料筒气压为600-1000kpa、软骨细胞与富勒烯复合水凝胶打印材料料筒气压为50-100kpa，层高为150-400μm。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s4步骤中的生物三维打印机腔内为无菌环境，且温度为25-37℃。
作为本发明的一种技术优化方案，所述s5步骤中的氯化钙溶液为经过过滤除菌的无菌氯化钙溶液，其浓度为2％-5％，温度为25-37℃，所述负载软骨细胞抗炎半月板支架和氯化钙溶液的交联处理时间为5-10min。
实施例一
1.对患者左健康侧的膝关节进行纳米级三维扫描电镜，扫描原始数据，存入数据库；在生物三维打印机软件中对膝关节图像进行分割，编辑处理，得到左膝关节间半月板外侧的三维模型。对其进行镜像处理，得到适用于患者右缺损半月板外侧的三维模型。将三维数据导入到生物三维打印机软件中，依次进行局部修正、曲面化处理，保存为stl格式文件。
2.将处理后的半月板三维模型进行切片分层处理，并分别将打印聚己内酯材料与打印负载富勒烯和软骨细胞的水凝胶材料设置成两个打印路径。两个打印路径为层层交叉。
3.将胶原蛋白和海藻酸钠混合后加入到dmem培养基中，40℃条件下搅拌溶解，混合均匀得到水凝胶溶液。胶原蛋白的浓度为0.2％，海藻酸钠的浓度为0.2％。加入富勒烯到该水凝胶溶液中，40℃条件下搅拌分散均匀，使其浓度为5％。利用0.22微米过滤器对富勒烯复合水凝胶进行过滤除菌处理。超净台中，将软骨细胞加入到无菌富勒烯复合水凝胶，37℃条件下低速搅拌得到软骨细胞与富勒烯复合水凝胶，使软骨细胞的浓度为5x106个/ml。
4.将20g聚己内酯加入到生物三维打印的1号料筒内，加热到120℃直至完全熔融，将20ml软骨细胞与富勒烯复合水凝胶加入到的2号料筒内，加热到37℃保温。两个打印头直径均为200μm，层高为200μm，1号料筒气压为800kpa，2号料筒气压为80kpa。生物三维打印机在使用中保持腔内温度为25℃，且使用前紫外灭菌处理1小时。，打印出环形的负载软骨细胞抗炎半月板支架，其中环形外径10mm，环形为4mm，厚度为2mm。
5.配置成浓度为5％的氯化钙水溶液，在无菌超净台中，使用0.22μm过滤除菌。然后将打印得到的负载软骨细胞抗炎半月板支架浸没在无菌氯化钙水溶液中进行交联处理，5min后取出，用新鲜的细胞培养基浸没支架后放入二氧化碳培养箱中持续培养。
实施例二
将上述实施例1中利用生物三维打印技术制备得到的负载软骨细胞抗炎半月板支架进行细胞存活率表征。将该支架放入12孔板中进行培养，然后利用mtt法检测该支架中的软骨细胞活力。分别培养1，3，5，7和9天后,弃旧培养基后加入pbs冲洗一遍去除死细胞，每孔加入500μl的无血清培养基和1500μl的mtt溶液，于37℃条件下孵育处理4h。然后每孔加入500μl的dmso充分溶解甲瓒结晶，取100μl溶解液利用酶标仪在492nm波长处检测吸光值。每个时间点进行三个平行孔实验。
mtt结果如图3所示，显示该支架上的软骨细胞具有良好的增殖行为，其细胞活力较好。
实施例三
将上述实施例1中利用生物三维打印技术制备得到的负载软骨细胞抗炎半月板支架进行抗炎能力表征。利用lps脂多糖构建巨噬细胞raw264.7炎性细胞模型，然后分别将未添加富勒烯的负载软骨细胞半月板支架与添加富勒烯的负载软骨细胞抗炎半月板支架与同等数目的炎性细胞共培养。培养1,2和3天后，利用elasa试剂盒检测tnf-α和il-6的含量，并做柱状图。
抗炎实验结果如图4所示，添加有富勒烯的半月板支架组的tnf-α和il-6的含量要显著低于未添加富勒烯组，这表明添加有富勒烯的支架发挥抗炎作用，降低了raw264.7巨噬细胞的炎性水平。
实施例四
对实施例1中打印所得三维打印半月板支架进行力学性能测试，该测试使用electroforcebiodynamic(bose)测试系统进行，测试中将半月板的前角、后角与中部分别进行测试，并对应部位的人体真实的半月板组织作为对比。最终计算得到支架的前角、中部与后角的瞬时弹性模量、延迟弹性模量和粘滞系数。结果如图5所示，表明该支架的力学性能与人体半月板组织的结果类似。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。