一种应用于肝癌免疫治疗的DC靶向性纳米疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种应用于肝癌免疫治疗的纳米疫苗及其制备方法。

背景技术

以树突状细胞（dendriticcell，dc）为肿瘤疫苗核心的特异性肿瘤免疫治疗受到越来越多的关注，dc是体内已知功能最强的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。

抗原以游离状态进入机体，会被体液稀释、酶降解，使得dc对抗原的摄取量极低，难以诱导机体产生有效的免疫应答。纳米疫苗可以保护抗原不被快速降解和清除，通过对纳米粒子结构进行设计还可以实现对抗原的靶向输送和控制释放，进而提高dc对抗原的摄取量、延长抗原的作用时间，利于激发机体产生有效的免疫应答。

为了进一步提高纳米疫苗的靶向效果，选择dc表面受体的配体分子修饰到纳米疫苗表面，可制备具有主动靶向性纳米疫苗。甘露糖受体属于c型凝集素超家族，可快速循环于dc细胞膜和早期内涵体间，在较短的时间内即可内化大量抗原，诱导免疫应答。

目前，在肝癌的免疫治疗中以dc疫苗为主的应用较少，主要原因之一是缺乏有效的肝肿瘤抗原。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，gpc-3）是一种肝癌胚胎蛋白，通过免疫组化检测发现在蛋白水平，gpc-3在大多数原发性肝癌细胞中过表达，但在正常肝脏和良性肝脏病变检测不到。gpc-3在肝癌与良性肝病的表达差异明显，为拓展肝癌治疗手段提供了新的思路，可以作为肿瘤抗原或治疗靶点。gpc-3144-152多肽同样能够诱导产生细胞毒t细胞（ctl）反应，不产生自身免疫反应，可作为肝癌特异性抗原。且多肽的纯度更高，更易产业化，与蛋白相比，价格也更低廉。

天然多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，对人体无毒无刺激，廉价易得。壳聚糖是自然界中大量存在的唯一一种碱性多糖，具有优良的生物相容性，生物可降解性，已在食品、医疗、生物技术和药学等领域得到了广泛的应用。但壳聚糖在水中溶解性差，而乙二醇壳聚糖在保持壳聚糖特性的同时，增加了在水中的溶解性，更易于实验操作。

技术实现要素：

为了进一步提高纳米疫苗的靶向效果，增加dc对抗原的胞吞量，同时能够保护抗原不被过早降解及被体液稀释，增加免疫治疗效果，本发明设计了一种应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法。

一种应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗，其特征在于：以甘露糖修饰乙二醇壳聚糖为载体材料，以肝癌特异性多肽抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3144-152肽（gpc-3144-152，fvgefftdv）为免疫抗原，通过静电相互作用制备的纳米疫苗；其中，所述的甘露糖的取代度为3%～20％；按照质量分数计，所述的gpc-3144-152的包载量为3%～10％。

进一步，所述的应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗粒径为100nm～1000nm。

一种应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

步骤一、甘露糖修饰乙二醇壳聚糖的制备：

将乙二醇壳聚糖和4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷溶解在水中，室温搅拌反应24h，对水透析，冻干，得到甘露糖修饰乙二醇壳聚糖，得到产品记为man-gcts;

步骤二、纳米疫苗的制备：

将gpc-3144-152溶解在磷酸缓冲盐溶液（pbs）中，磷酸缓冲盐溶液的ph值为7.4；；将步骤一制备所得man-gcts溶于水中，再滴加到溶有gpc-3144-152的pbs中，搅拌0.5h后，冻干，得到纳米疫苗。

进一步，所述步骤一中的乙二醇壳聚糖的浓度为0.5mg/ml～2mg/ml，分子量为5000～50000，脱乙酰度为80%～100%。

进一步，所述步骤一中的乙二醇壳聚糖结构单元与4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷的摩尔比为1:0.03～0.3。

进一步，步骤二所述中的man-gcts与gpc-3144-152的质量比为1:0.1～0.15。

本发明应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法具有以下有益效果：

（1）本发明应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法中，纳米疫苗能够通过主动靶向作用，增加dc对抗原的胞吞量，同时能够保护抗原不被过早降解及被体液稀释，增加免疫治疗效果。

（2）本发明应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法中，制备的纳米粒子原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例制备得到的man-gcts的核磁图；

图2为本发明实施例1获得的纳米疫苗的粒径分布图；

图3为本发明实施例1获得的纳米疫苗对hepa1-6肝癌细胞肿瘤模型小鼠的抑瘤效果曲线图；

图4为本发明实施例2获得的纳米疫苗的粒径分布图；

图5为本发明实施例2获得的纳米疫苗对hepa1-6肝癌细胞肿瘤模型小鼠的抑瘤效果曲线图。

具体实施方式

本发明公开了一种应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法，下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明：

实施例1

步骤一、甘露糖修饰乙二醇壳聚糖的制备：

将乙二醇壳聚糖（205mg，分子量50000）和4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷（91mg）溶解在水中，此时乙二醇壳聚糖结构单元与4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷的摩尔比为1:0.3，加入水后使得乙二醇壳聚糖的浓度为2mg/ml，室温搅拌反应24h，对水透析，冻干，得到甘露糖修饰乙二醇壳聚糖，得到产品记为man-gcts，其核磁表征见图1，由图1可以看出已成功将man引入到gcts中。

步骤二、纳米疫苗的制备：

将gpc-3144-152（1mg）溶解在1ml磷酸缓冲盐溶液（pbs，ph=7.4）中；将步骤一制备所得man-gcts（10mg）溶于5ml水中，再滴加到溶有gpc-3144-152的磷酸缓冲盐溶液pbs中，搅拌0.5h后，冻干得到纳米疫苗，其粒径分布见图2，由图2可以看出纳米疫苗的粒径分布较均一，平均粒径为224nm。

利用本发明纳米疫苗对肝癌的免疫治疗实验：

（1）肝癌的移植瘤动物模型的建立

体外培养hepa1-6肝癌细胞系，分别将细胞接种于8周龄左右的c57小鼠腋部皮下，接种细胞的数目为：1x10⁶个细胞，接种后随机将小鼠分为对照组和治疗组，建立hepa1-6肝癌小鼠肿瘤模型。

（2）研究纳米疫苗对肝癌的免疫治疗效果

在小鼠皮下注射细胞10天后，对治疗组开始使用纳米疫苗或单独gpc-3144-152肽治疗（多肽剂量100μg/只），免疫3次，每次间隔1周，对照组注射磷酸缓冲盐溶液pbs。测量肿瘤的瘤体积，比较各组的治疗效果，见图3。由图3可以看出，纳米疫苗能够抑制肿瘤的生长。

实施例2

步骤一、甘露糖修饰乙二醇壳聚糖的制备：

将乙二醇壳聚糖（205mg，分子量5000）和4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷（9.1mg）溶解在水中，此时，乙二醇壳聚糖结构单元与4-异硫氢酸苯基-alpha-d-甘露糖苷的摩尔比为1:0.03，加入水后使得乙二醇壳聚糖的浓度为0.5mg/ml，室温搅拌反应24h，对水透析，冻干，得到甘露糖修饰乙二醇壳聚糖，得到产品记为man-gcts，其核磁表征结果与图1一致。可以看出已成功将man引入到gcts中。

步骤二、纳米疫苗的制备：

将gpc-3144-152（1.5mg）溶解在1ml磷酸缓冲盐溶液（pbs，ph=7.4）中；将步骤一制备所得man-gcts（10mg）溶于5ml水中，再滴加到溶有gpc-3144-152的磷酸缓冲盐溶液pbs中，搅拌0.5h后，冻干得到纳米疫苗，其粒径分布见图4。由图4可以看出纳米疫苗的粒径分布较均一，平均粒径为167.4nm。

利用本发明纳米疫苗对肝癌的免疫治疗实验：

（1）肝癌的移植瘤动物模型的建立

体外培养hepa1-6肝癌细胞系，分别将细胞接种于8周龄左右的c57小鼠腋部皮下，接种细胞的数目为：1x10⁶个细胞，接种后随机将小鼠分为对照组和治疗组，建立hepa1-6肝癌小鼠肿瘤模型。

（2）研究纳米疫苗对肝癌的免疫治疗效果

在小鼠皮下注射细胞10天后，对治疗组开始使用纳米疫苗或单独gpc-3144-152肽治疗（多肽剂量100μg/只），免疫3次，每次间隔1周，对照组注射磷酸缓冲盐溶液pbs。测量肿瘤的瘤体积，比较各组的治疗效果，见图5。由图5可以看出，纳米疫苗能够抑制肿瘤的生长。

本发明应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法中，纳米疫苗能够通过主动靶向作用，增加dc对抗原的胞吞量，同时能够保护抗原不被过早降解及被体液稀释，增加免疫治疗效果。本发明应用于肝癌免疫治疗的dc靶向性纳米疫苗及其制备方法中，制备的纳米粒子原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，具有良好的应用前景。

上面结合具体实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。