本发明涉及栀子叶提取物应用技术领域，具体涉及一种栀子叶提取物在日化领域中的新用途。
背景技术：
近年来随着生活工作节奏的加快以及环境污染的加剧，人们面对的皮肤问题也越来越多，由各种原因引起的色斑、色素沉着等已成为普遍问题，美白和抗氧化化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种。随着人们消费观念的日益成熟，消费者对美白化妆品的关注重点不仅仅在于其功效性同时也更注重其安全性。
研究结果表明，黑色素主要由人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞产生，它的含量及分布决定了皮肤的颜色。进一步地，酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶，通过将酪氨酸羟化，产生l-3,4-二羟基苯丙氨酸(l-dopa)，然后再将l-dopa进一步氧化成多巴醌，从而形成黑色素。它的过量表达是导致色素沉着过度的主要原因，因此，抑制酪氨酸酶的活性可以阻断黑色素的生物合成反应链，减少黑色素的生成进而实现美白的效果。
皮肤美白剂就是作用于皮肤黑色素生成、代谢过程，抑制黑色素生成且符合规范的物质。但传统的皮肤美白剂，往往采用化学性物质，采用过氧化氢、氯化氨基汞以及各种酚类衍生物，它们能使黑色素组织迅速瓦解，达到快速美白功效，但其对皮肤具有很大的腐蚀性细胞毒性和过敏性，在许多国家的卫生规范中已禁用。因此，“回归大自然”要求的化妆品，特别是绿色、安全、无副作用的美白产品成为21世纪化妆品的主题，天然美白化妆品，特别是加有中草药活性成分的化妆品越来越受到消费者的青睐。目前，在日本含天然中草药的化妆品已占整个化妆品市场的50％以上。人们开始期待无毒、无污染化妆品的出现。研制以中草药为原料的功能性化妆品是化妆品业未来的必然发展趋势，此类新产品有着巨大的经济发展空间。
目前，从植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制剂备受关注，已报道了很多天然产物来源的酪氨酸酶抑制剂，其大部分含有酚类结构或能够鳌合酪氨酸酶的铜离子。但这些酪氨酸酶抑制剂都有这样那样的缺点，如活性低、毒性高、穿透能力弱等。因此，从天然产物中提取化合物以安全、有效的抑制黑色素生成是化妆品研究的热点。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即提供一种更为安全有效的美白祛斑活性成分-栀子叶提取物，以充分发挥栀子叶提取物在日化领域中的价值。
为了解决本发明所要解决的上述技术问题，本发明的发明人进行了深入研究和反复实验，发现栀子叶提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的作用，从而完成了本发明。
栀子叶来源于茜草科植物栀子(gardeniajasminoidesellis)的干燥叶。栀子分布于我国大部分地区，生于海拔10-1500米处的旷野、丘陵、山谷、山坡、溪边的灌丛或林中，其原植物的果实作为栀子已广泛应用于临床，并收入《中国药典》。而其叶在我国四川、广西等地民间广泛应用,有治疗跌打损伤、血淤、烫伤等症。有报道栀子叶及叶柄含栀子苷、去羟栀子苷。但到目前为止，国内外对该属植物的化学和药理研究工作还不够系统和深入，而且栀子叶中有效成分的作用机制尚未揭示,有关其药理活性的物质基础还不明确,且至今为止，还没有发现任何有关栀子叶提取物具有皮肤美白功效的报道。
为此，本发明的一个目的在于提出一种栀子叶提取物的用途。
为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了一种栀子叶提取物的用途，该栀子叶提取物用作皮肤美白的活性成分。
根据本发明的栀子叶提取物，其通过在民间治疗跌打损伤、血淤、烫伤等，以证明无毒。通过实验证明栀子叶提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，能有效地抑制皮肤的色素沉积，药理作用强，对皮肤没有副作用，可用作皮肤美白的活性成分；为栀子叶提取物发掘了一个全新的美白用途，以充分发挥栀子叶提取物在日化领域中的价值。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种栀子叶提取物的用途，还可以具有如下附加的技术特征：
该栀子叶提取物的用途是以栀子叶提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备皮肤美白或/和祛斑的化妆品。对于化妆品，可采用常规的方法，将有效量的栀子叶提取物与化妆品常用辅料(如油性成分、粉末、表面活性剂、保湿剂、增粘剂、香料和水等)混合制备各种形式的化妆品。
所述栀子叶提取物是通过以下方法制备的：以栀子叶为原料，用提取溶剂对栀子叶进行提取，提取液经干燥后制得栀子叶提取物。就栀子叶而言，其作为原料使用的部位不受限制，可以是叶、茎等。
所述栀子叶提取物是将栀子叶干燥粉碎，加入乙醇冷浸，经回流提取，得提取液，提取液经减压浓缩干燥，而制得栀子叶提取物。
所述乙醇的体积浓度为30％-95％，栀子叶粉末与乙醇的料液比为1g：10ml-20ml。
所述乙醇的体积浓度为70％；所述冷浸的温度为10℃-30℃；回流的温度为70℃-90℃；回流的时间为60-120min。
所述化妆品为化妆水、乳液、洗剂、凝胶、美容液、粉底霜、面膜、淋雨液和乳霜中的一种。
本发明第二方面实施例提出了一种栀子叶提取物的用途，其以栀子叶提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗色素沉着性疾病的药物。本发明的栀子叶提取物可制成任何给药方式的医药制品，为各种医药制剂形成。医药品制剂包括溶液剂、糖浆剂、注射剂、乳剂、胶囊剂和软膏皮肤外用剂等。
本发明第三方面实施例提出了一种栀子叶提取物的用途，其以栀子叶提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生成的药物。本发明的栀子叶提取物可制成任何给药方式的医药制品，为各种医药制剂形成。医药品制剂包括溶液剂、糖浆剂、注射剂、乳剂、胶囊剂和软膏皮肤外用剂等。
本发明第四方面实施例提出了一种栀子叶提取物的用途，其以栀子叶提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生成的食品。本发明的栀子叶提取物可制成饼干点心、果品、粉末、溶液等。
附图说明
图1为根据本发明实施例二栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16活力的影响示意图；
图2是根据本发明实施例三栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16黑色素的影响示意图；
图3是根据本发明实施例四栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中酪氨酸酶活力的影响示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例和附图说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明提供一种栀子叶提取物的用途，其主要解决的是现有的酪氨酸酶抑制剂存在着活性低、毒性高、穿透能力弱等诸多缺点；为了解决上述问题，本发明提供一种栀子叶提取物的新用途，将栀子叶提取物用作皮肤美白的活性成分，抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，抑制皮肤的色素沉积，药理作用强，对皮肤没有副作用；为栀子叶提取物发掘了一个全新的美白用途，以充分发挥栀子叶提取物在日化领域中的价值。
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例一不同浓度的栀子叶乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用
在化妆品领域中美白性能的优劣通常是用酪氨酸酶抑制活性能力测试来表征的。酪氨酸酶抑制活性能力测试原理如下：
色素沉着是由紫外线激活表皮中的黑色素细胞内的黑色素生成酶产生色素所引起的。在黑色素生成过程中，酪氨酸酶将酪氨酸转化成多巴、多巴醌，经氧化而聚合生成大分子的黑色素。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。
1、制备栀子叶提取物
取四组栀子叶干燥粉末，分别在室温条件下(10℃-30℃)用四种不同体积浓度的乙醇进行冷浸，四种不同的乙醇的体积浓度分别为30％、50％、70％、95％，栀子叶各取30g，乙醇各取480ml；然后在85℃下回流提取120min得提取液，提取液经减压回收溶剂至干，得栀子叶乙醇提取物。取提取物适量，配制成7mg/ml溶液备用，测定其对蘑菇酪氨酸酶抑制作用。
2、试验方法：
s11、使用96孔板设立样品孔、样品对照孔、阳性对照孔、阴性对照孔。
s12、在步骤s11的样品孔和样品对照孔中各加入30μl不同浓度的样品溶液(即上述不同浓度的乙醇提取的栀子叶提取物的溶液)，阳性对照孔和阴性对照孔以磷酸缓冲液(pbs)代替。所述磷酸缓冲溶液是指磷酸氢二钠7.16g，加上磷酸二氢钠3.12g，用200ml去离子水溶解，调其ph值至6.8。
s13、在步骤s12的样品孔、样品对照孔、阳性对照孔、阴性对照孔中各加入60μl的0.15％l-多巴溶液，然后用磷酸缓冲液补至各孔总体积为180μl，混匀。
s14、在步骤s13的样品孔和阳性对照孔中加入30μl酪氨酸酶溶液(酶活为100u/ml)，样品对照孔和阴性对照孔以30μl磷酸缓冲液(ph＝6.8)代替，使样品和酪氨酸酶充分混匀，然后将96孔板置于30℃恒温下、波长475nm处测定吸光度，每5s记一次数，连续测定30s。
s15、以反应时间对吸光度作图并进行直线拟合，根据样品孔与阳性对照孔直线斜率的变化计算抑制率；
抑制率i(％)＝[1－kt/kc]×100％
式中：
kt：样品孔直线斜率；
kc：阳性对照孔直线斜率。
s16、计算半数抑制率(ic50)：
ic50值定义为抑制率为50％时所需酪氨酸酶抑制剂的浓度。以样品的浓度对酪氨酸酶的抑制率作图并进行拟合，读取计算ic50值。
结果如表1：可知，栀子叶经体积浓度为70％乙醇回流得到的提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制效果最佳，其ic50为0.157±0.044mg/ml。选取该体积浓度的栀子叶乙醇回流提取物用于后续的实验。
表1栀子叶不同浓度乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶抑制活性ic50(mg/ml)
实施例二栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16细胞活力的影响
mtt(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)能被各种活细胞(除红细胞外)摄取，在线粒体内被脱氢酶还原，由黄色可溶性溶液转变为不可溶性的紫色甲瓒(formazan)颗粒，用一定的裂解细胞并溶解甲瓒，再通过测定溶液的吸光值就可以推测细胞的存活和增殖程度，而死亡细胞则无此活性。
试验方法如下：
s21、培养黑色素瘤细胞b16至对数生长期。
s22、将s21步骤中的黑色瘤细胞b16用1640培养液(加10％血清)稀释成约1×104/孔，然后取96孔细胞培养板，每孔加100μl黑色瘤细胞b16稀释液。
s23、将步骤s22的黑色瘤细胞b16贴壁生长12h-24h，接着，将实施例一中栀子叶70％乙醇回流提取物用1640培养液(加2％血清)呈梯度浓度稀释成栀子叶提取物稀释液，然后，96孔细胞培养板中每孔加200μl上述的栀子叶提取物稀释液，并设置空白对照组{即仅加有1640培养液(加2％血清)，不含有栀子叶提取物}，最后，将96孔细胞培养板置于37℃下5％co2的二氧化碳培养箱中培养72h。
s24、将步骤s23的96孔细胞培养板的培养液弃掉，用pbs清洗两遍，然后在96孔细胞培养板的每孔加100μl培养液和20μlmts混合液，继续培养3h-4h显色。
s25、将步骤s24的96孔细胞培养板置于酶联检测仪上，检测前震荡混匀30s，使其颜色均匀，然后在波长490nm处检测各孔的光吸收值(od)。
s26、计算黑色素瘤细胞b16的增殖抑制率：
增殖抑制率＝(空白对照孔吸光值-栀子叶提取物作用孔吸光值)/空白对照孔吸光值×100。
结果如图1所示，图1为栀子叶乙醇提取物对黑色素瘤细胞b16活力的影响；可知，栀子叶70％乙醇回流提取物从0-400μg/ml孵育72h对黑色素瘤细胞b16无明显毒性。选取该浓度范围内栀子叶提取物用于后续的实验。
实施例三栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中黑素含量的影响
黑素瘤细胞b16是由正常黑素细胞突变所致，其生化代谢与正常黑色素细胞相似，现已成为医药部门进行色素病变研究广泛使用的细胞,国外化妆品生产企业的科研部门,在筛选美白剂的过程中,广泛使用该细胞作为化妆品美白剂功效测定的受试细胞。这种方法,比体外生化法更准确,同时较人体实验更快速、简便,已成为美白化妆品添加剂功效评价的重要手段。
试验方法如下：
s31、培养黑色素瘤细胞b16至对数生长期。
s32、铺板：按密度1×105/孔将步骤s31的黑色素瘤细胞b16接种于6孔细胞培养板，每孔2ml；
s33、药物干预：将步骤s32的6孔细胞培养板于37℃,5％co2培养箱中培养12h。12h后，将细胞培养板的培养液移走，然后再在细胞培养板的每孔加入5ml栀子叶提取物溶液(每孔加入的栀子叶提取物的质量浓度不同，选自实施例二中呈梯度设置的0-400μg/ml的栀子叶70％乙醇回流提取物)和100nm的α-msh(黑素细胞刺激素)，同时设立空白对照(不加栀子叶提取物)，孵育72h；
s34、收集药物处理过的细胞：将步骤s33的细胞培养板移走培养液，用pbs清洗两遍，加200μl的pbs，用细胞刮刀将不同质量浓度的栀子叶提取物处理组和空白组分别收集到不同的ep管中，10000r/min,4℃离心5min收集细胞；
s35、将细胞进行裂解，释放黑色素颗粒：步骤s34收集后的细胞用1000μl含10％dmso(二甲基亚砜)的naoh溶液(1m)溶解，并在90℃下加热2h，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1mnaoh溶液取100μl加入到96孔板中；用酶标仪在405nm处测定各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值。
s36、每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入90μl蛋白染料和10μl步骤s35获得的naoh(1m)溶解的细胞溶液；用酶标仪在562nm处测定各孔的吸光度，得到每孔蛋白浓度的吸光度值；
s37、黑色率合成抑制率的计算：
黑色素合成抑制率＝[1-(各待测孔黑色素含量的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％。
结果如图2所示，图2为栀子叶乙醇提取物对黑色素瘤细胞b16中黑色素的影响。可知，黑色素瘤细胞b16在添加不同质量浓度(0-400μg/ml)的栀子叶70％乙醇回流提取物溶液的培养环境下，细胞形态正常，且存活率均超过90％，说明该浓度下栀子叶提取物对细胞并无毒性作用。并且，栀子叶提取物质量浓度在100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时对黑色素瘤细胞b16的黑色素合成抑制率(％)分别为14.7±4.0、23.3±1.2、35.4±1.1；而阳性药物曲酸在500um时的黑色素抑制率(％)为51.03±0.6。实验证明栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中黑色素含量具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，但低于阳性药物曲酸的抑制率。
实施例四栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中酪氨酸酶活性影响
黑色素合成是一个多步骤的酶促反应，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，许多美白药物通过抑制酪氨酸酶的活性来，栀子叶提取物对细胞酪氨酸酶活性测定方法如下：
s41、培养黑色素瘤细胞b16至对数生长期。
s42、铺板：按密度1×105/孔将步骤s41的黑色素瘤细胞b16接种于12孔细胞培养板中，每孔1ml。
s43、药物干预：将步骤s42的12孔细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱中培养12h。12h后，将细胞培养板的培液移走，然后再在细胞培养板的每孔加入2ml栀子叶提取物溶液(每孔加入的栀子叶提取物的质量浓度不同，选自实施例二中呈梯度设置的0-400μg/ml的栀子叶70％乙醇回流提取物)，同时设立空白对照(不加栀子叶提取物)，孵育72h；
s44、收集药物处理过的细胞：将步骤s43的细胞培养板移走培养液，用pbs清洗两遍，加200μl的pbs，用细胞刮刀将不同质量浓度的栀子叶提取物处理组和空白组分别收集到不同的ep管中，10000r/min,4℃离心1min收集细胞；
s45、将细胞进行裂解：步骤s44收集后的细胞每管加入150μl的1％triton(聚乙二醇辛基苯基醚)，在4℃下溶解0.5h，13000r/min，4℃离心20min，取上清液，上清液是含酪氨酸酶的胞质蛋白；
s46、每孔细胞蛋白浓度分析：在96孔板中每孔加入90μl蛋白染液和10μl步骤s45获得的细胞裂解液溶解的胞质蛋白，用酶标仪在562nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值；
s47、酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90μl步骤s45获得的含胞质蛋白的细胞裂解液，加入10μl0.25％的l-dopa溶液，在37℃反应0.5h-1h。用酶标仪在475nm处测量各孔的吸光度值。
s48、酪氨酸酶活性抑制率的计算：
酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各待测物浓度孔的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％
结果如图3所示，图3为栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中酪氨酸酶活力的影响。可知，黑色素瘤细胞b16在添加不同质量浓度(0-400μg/ml)的栀子叶70％乙醇回流提取物溶液的培养环境下，细胞形态正常，且存活率均超过90％，说明该质量浓度下栀子叶提取物对细胞并无毒性作用。并且，栀子叶提取物质量浓度在100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时对黑色素瘤细胞b16中酪氨酸酶活性的抑制率(％)分别为13.1±2.4、29.6±2.3、48.7±2.0；而阳性药物曲酸在500um时的酪氨酸酶抑制率为64.0±3.2％。实验证明栀子叶提取物对黑色素瘤细胞b16中酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，呈明显的剂量效应关系，但低于阳性药物曲酸对b16酪氨酸酶活性的抑制率。
综上，结果表明，栀子叶提取物对酪氨酸酶、黑色素生成均有抑制作用，对细胞无毒性作用，因此，以栀子叶提取物作为皮肤美白活性成分可望开发成制备治疗色素沉着性疾病的药物、制备皮肤美白或/和祛斑的化妆品、制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生成的药物和制备抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生成的食品。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。