本发明涉及一种裸花紫珠提取物组合物及其应用，具体涉及一种具有治疗儿童疱疹性咽峡炎作用的裸花紫珠提取物组合物及其应用。
背景技术：
：疱疹性咽峡炎是由肠道病毒引起的以急性发热和咽峡部疱疹溃疡为特征的急性传染性咽颊炎，以粪-口或呼吸道为主要传播途径，传染性很强，传播快，遍及世界各地，呈散发或流行，夏秋季为高发季节，主要侵犯1～7岁小儿。临床以发热、咽痛、咽峡部黏膜小疱疹和浅表溃疡为主要表现。疱疹性咽颊炎患者及隐性感染者是本病的主要传染源。可直接经由肠道、呼吸道传播，也可间接经污染的手、食品、衣服、用具等传播。各年龄段人群均可受到感染，但以1～7岁多发。因婴幼儿呼吸道屏障功能不足，呼吸道黏膜柔嫩，呼吸道分泌抵抗细菌、病毒的免疫物质不足，呼吸道“自洁”功能差，故易发病。潜伏期为2～4天。常急剧发热，热多为低度或中等度，偶见高达40℃以上，甚至引起惊厥。热程大都2～4天。年龄较大的患儿可诉咽痛，咽痛重者可影响吞咽。婴幼儿则表现为流涎、拒食、烦躁不安。有时伴头痛、腹痛或肌痛，5岁以下小儿有1/4可伴发呕吐。人类肠道病毒属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，包含以下四种病毒：脊髓灰质炎病毒(p)、埃可病毒(e)、柯萨奇病毒(cv)和新型肠道病毒(ev)。能导致儿童疱疹性咽峡炎的病原体大多为柯萨奇a组病毒所引起，b组病毒也可致病，但较少见。此外，埃可病毒3、6、9、16、17、25型和肠道病毒70型也可引起本病。柯萨奇病毒a类(cva)，包括cva2、cva4、cva5、cva6、cva7、cva9、cva10、cva16型，柯萨奇病毒b类(cvb)，其中cvb类有cvb1、cvb2、cvb3、cvb4、cvb5型，埃可病毒，肠道病毒71(ev71)型等。目前治疗疱疹性咽峡炎不外乎中药和西药两种，西药治疗见效较快，但药物依赖性强，治标不治本，且还有一定的副作用，而中药治疗基本无副作用。裸花紫珠是马鞭草科紫珠属植物，其药用部位为地上干燥部分，是一种海南大宗性道地药材，同时也是海南黎族医生常用药材之一。其中的有效成分有环烯醚萜类、黄酮类、醌类、挥发油、木聚糖类、有机酸类等，目前裸花紫珠的药理活性主要分为以下五个方面：(1)止血(2)抗炎(3)抑菌(4)细胞毒活性(5)增强免疫。由该味药材浸膏组成的中成药裸花紫珠制剂，如裸花紫珠片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠颗粒等，在临床上应用较广泛，主要用于治疗细菌感染引起的炎症，急性传染性肝炎，呼吸道及消化道等腔道出血等症。部分研究表明裸花紫珠在抗病毒方面也具有一定的疗效，专利申请cn106177381a中公开了一种治疗疱疹性咽峡炎的中西药口服液，专利申请cn104721634a公开了用于疱疹性咽峡炎的中药制剂。但上述现有技术中药物的有效成分复杂，有效成分不明确、质量标准可控性差等缺点，难于满足药物“安全、有效、可控、稳定”的要求。技术实现要素：基于上述现有技术的缺陷，本发明对裸花紫珠进行有效成分的提取纯化，并通过合理的组合，提供一种组分明确的裸花紫珠提取物组合物，该组合物各组分间相互发挥作用，能够显著抑制cva2和cvb2等病毒，为儿童疱疹性咽峡炎的临床诊断和治疗提供科学依据。本发明提供一种治疗儿童疱疹性咽峡炎的组合物，其特征在于，所述组合物按照重量份数计，由40-50份裸花紫珠总黄酮、10-20份裸花紫珠总酚酸、20-30份裸花紫株总苯乙醇苷和2-6份裸花紫珠多糖组成。进一步地，所述组合物按照重量份数计，由44-46份裸花紫珠总黄酮、15-17份裸花紫珠总酚酸、23-25份裸花紫株总苯乙醇苷和3-5份裸花紫珠多糖组成。进一步地，所述组合物按照重量份数计，由45份裸花紫珠总黄酮、16份裸花紫珠总酚酸、24份裸花紫株总苯乙醇苷和4份裸花紫珠多糖组成。进一步地，所述组合物中组分均通过裸花紫珠水提物纯化得到。进一步地，所述裸花紫珠水提物的制备方法为：裸花紫珠加水煎煮1-3次，合并滤液，浓缩至浸膏状，即得裸花紫珠水提物。进一步地，所述裸花紫珠水提取的制备方法为：裸花紫珠加水100-110℃提取1-3次，每次加8-12倍水，第一次提取1-2.5h，第二次提取0.5-3h，合并滤液，过滤，60-90℃减压浓缩至相对密度1.30～1.35的浸膏状，于60-75℃干燥成干浸膏，即得裸花紫珠水提物。进一步地，所述裸花紫珠总黄酮的制备方法包括以下步骤：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，得裸花紫珠乙醇溶液；(2)裸花紫珠乙醇溶液通过ab-8树脂，乙醇为洗脱液，收集洗脱液，真空干燥即得裸花紫珠总黄酮。更进一步地，所述裸花紫珠总黄酮的制备方法为：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5-1mg/ml的裸花紫珠乙醇溶液；(2)裸花紫珠乙醇溶液通过ab-8树脂(径高比为1:8-1:15)，85-95％乙醇为洗脱液，进样速率为1.5-3ml/min，洗脱速率为20-30滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总黄酮含量测定后，确定含量最高的馏分，加入裸花紫珠水提物质量1-1.5倍的氯化锌，在ph6.0-7.0的条件下沉淀，过滤，沉淀物真空干燥即得裸花紫珠总黄酮。进一步地，所述裸花紫珠总酚酸的制备方法包括以下步骤：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，得裸花紫珠乙醇溶液；(2)将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，浓缩干燥后，得到乙酸乙酯相；(3)将乙酸乙酯相浓缩后通过d101大孔树脂，用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空干燥即得裸花紫珠总酚酸。更进一步地，裸花紫珠总酚酸的制备方法为：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5-1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；(2)将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入2-3倍体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取每种试剂萃取2-3次，浓缩干燥后，保留乙酸乙酯相；(3)乙酸乙酯相加水复溶后，配制为0.5-1mg/ml的溶液，通过d101大孔树脂(径高比为1:8-1:20)，用50-80％乙醇溶液洗脱，进样速率为1.5-3ml/min，洗脱速率为20-30滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总酚酸含量测定后，确定含量最高的馏分，真空干燥即得裸花紫珠总酚酸。进一步地，所述裸花紫珠总苯乙醇苷的制备方法包括以下步骤：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，得裸花紫珠乙醇溶液；(2)将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩干燥后，得到正丁醇相；(3)将正丁醇相复溶后，依次通过硅胶柱和hpd100树脂柱，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。更进一步地，所述裸花紫珠总苯乙醇苷的制备方法为：(1)裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5-1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；(2)将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入2-3倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取每种试剂萃取2-3次，浓缩干燥后，保留正丁醇相；(3)正丁醇相加乙醇复溶，配制为0.5-1mg/ml的溶液，通过硅胶柱(径高比为1:10-1:15，硅胶粒径为200-300μm)，以甲醇-二氯甲烷溶剂系统进行洗脱，甲醇-二氯甲烷体积比为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0依次进行洗脱，进样速率为1.2-3ml/min，洗脱速率为8-15滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩干燥后，得馏分1；(4)馏分1加水复溶，配制为0.5-1mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:3-1:9)，水洗脱，进样速率为1.2-3ml/min，洗脱速率为8-15滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩后冷冻干燥即得裸花紫珠总苯乙醇苷。进一步地，所述裸花紫珠多糖的制备方法包括以下步骤：(1)裸花紫珠水提物，加入三氯乙酸，离心，上清液浓缩；(2)加入乙醇沉淀24-48h，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得裸花紫珠粗多糖；(4)裸花紫珠粗多糖复溶后，通过hpd100树脂，水洗脱，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。更进一步地，所述裸花紫珠多糖的制备方法包括以下步骤：(1)裸花紫珠水提物，加入2-5倍8-15％三氯乙酸(w/v)，4-8℃静置20-30h，重复2-3次，离心15-20min，减压浓缩至上清液体积的1/5-1/10；(2)向步骤(1)中的浓缩液加入90％-100％乙醇，4-8℃沉淀24-48h，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2-3次，真空干燥得裸花紫珠粗多糖；(3)裸花紫珠粗多糖加水复溶后，配制为0.5-1mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:3-1:9)，水洗脱，进样速率为1.2-3ml/min，洗脱速率为8-15滴/min，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。本发明还提供一种治疗儿童疱疹性咽峡炎的药物制剂，由上述的组合物和药学上可接受的辅料组成。进一步地，所述制剂为口服液、颗粒冲剂、胶囊、片剂、分散剂。本发明进一步提供所述治疗儿童疱疹性咽峡炎组合物在制备治疗和/或预防儿童疱疹性咽峡炎中的应用。进一步地，所述组合物在制备治疗和/或预防由cva2和/或cvb2引起的儿童疱疹性咽峡炎药物中的应用。本发明的有益效果为：(1)对裸花紫珠中的有效成分进行提取和提纯，选取裸花紫珠总黄酮、裸花紫珠总酚酸、裸花紫珠总苯乙醇苷和裸花紫珠多糖进行合理的组合，制备的组合物通过影响病毒的复制周期，表现为在抑制肠病毒方面相比于裸花紫珠水提取、醇提取具有更好的作用，具有良好的治疗儿童疱疹性咽峡炎的疗效。(2)裸花紫珠总黄酮、裸花紫珠总酚酸、裸花紫珠总苯乙醇苷和裸花紫珠多糖四种组分相互协同发挥作用，并对其含量进行调整，其治疗儿童疱疹性咽峡炎的疗效明显优于单一组分或裸花紫珠提取物。(3)本发明提供的裸花紫珠提取物组合物，其成分和含量明确，疗效显著，质量稳定，制备方法简单，克服了单纯水提取、醇提物等组分不明确，治病机理不清楚的问题。具体实施方式实施例1裸花紫珠总黄酮、总酚酸、苯乙醇苷和裸花紫珠多糖的提取(1)裸花紫珠水提物的制备：裸花紫珠加水100℃提取3次，每次加8倍水，第一次提取2.5h，第2和3次提取0.5h，合并滤液，过滤，60℃减压浓缩至相对密度1.30～1.35的浸膏状，于60℃干燥成干浸膏，备用；(2)裸花紫珠总黄酮的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5mg/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②裸花紫珠乙醇溶液通过ab-8树脂(径高比为1:15)，95％乙醇为洗脱液，进样速率为1.5ml/min，洗脱速率为20滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总黄酮含量测定后，确定含量最高的馏分，加入裸花紫珠水提物质量1.5倍的氯化锌，在ph7.0的条件下沉淀，过滤，沉淀物真空干燥即得裸花紫珠总黄酮。(3)裸花紫珠总酚酸的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5-1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入2倍体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取每种试剂萃取2次，浓缩干燥后，保留乙酸乙酯相；③乙酸乙酯相加水复溶后，配制为0.5mg/ml的溶液，通过d101大孔树脂(径高比为1:8)，用50％乙醇溶液洗脱，进样速率为1.5ml/min，洗脱速率为20滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总酚酸含量测定后，确定含量最高的馏分，真空干燥即得裸花紫珠总酚酸。(4)裸花紫珠总苯乙醇苷的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入2倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取每种试剂萃取2次，浓缩干燥后，保留正丁醇相；③正丁醇相加乙醇复溶，配制为0.5mg/ml的溶液，通过硅胶柱(径高比为1:10，硅胶粒径为200-300μm)，以甲醇-二氯甲烷溶剂系统进行洗脱，甲醇-二氯甲烷体积比为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0依次进行洗脱，进样速率为1.2ml/min，洗脱速率为8滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩干燥后，得馏分1；④馏分1加水复溶，配制为0.5mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:3)，水洗脱，进样速率为1.2ml/min，洗脱速率为8滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩后冷冻干燥即得裸花紫珠总苯乙醇苷。(5)裸花紫珠多糖的制备①裸花紫珠水提物，加入2倍15％三氯乙酸(w/v)，4℃静置20h，重复3次，离心15min，减压浓缩至上清液体积的1/5；②向步骤(1)中的浓缩液加入90％乙醇，4℃沉淀24h，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2次，真空干燥得裸花紫珠粗多糖；③裸花紫珠粗多糖加水复溶后，配制为0.5mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:3)，水洗脱，进样速率为1.2ml/min，洗脱速率为8滴/min，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。实施例2裸花紫珠总黄酮、总酚酸、苯乙醇苷和裸花紫珠多糖的提取(1)裸花紫珠水提物的制备：裸花紫珠加水105℃提取2次，每次加10倍水，第一次提取2h，第二次提取1h，合并滤液，过滤，80℃减压浓缩至相对密度1.30～1.35的浸膏状，于70℃干燥成干浸膏，备用；(2)裸花紫珠总黄酮的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.8mg/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②裸花紫珠乙醇溶液通过ab-8树脂(径高比为1:10)，90％乙醇为洗脱液，进样速率为2ml/min，洗脱速率为25滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总黄酮含量测定后，确定含量最高的馏分，加入裸花紫珠水提物质量1.5倍的氯化锌，在ph6.5的条件下沉淀，过滤，沉淀物真空干燥即得裸花紫珠总黄酮。(3)裸花紫珠总酚酸的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5-1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入3倍体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取每种试剂萃取3次，浓缩干燥后，保留乙酸乙酯相；③乙酸乙酯相加水复溶后，配制为1mg/ml的溶液，通过d101大孔树脂(径高比为1:15)，用65％乙醇溶液洗脱，进样速率为2ml/min，洗脱速率为25滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总酚酸含量测定后，确定含量最高的馏分，真空干燥即得裸花紫珠总酚酸。(4)裸花紫珠总苯乙醇苷的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入3倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取每种试剂萃取3次，浓缩干燥后，保留正丁醇相；③正丁醇相加乙醇复溶，配制为1mg/ml的溶液，通过硅胶柱(径高比为1:12，硅胶粒径为200-300μm)，以甲醇-二氯甲烷溶剂系统进行洗脱，甲醇-二氯甲烷体积比为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0依次进行洗脱，进样速率为1.5ml/min，洗脱速率为10滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩干燥后，得馏分1；④馏分1加水复溶，配制为1mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:6)，水洗脱，进样速率为2ml/min，洗脱速率为13滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩后冷冻干燥即得裸花紫珠总苯乙醇苷。(5)裸花紫珠多糖的制备①裸花紫珠水提物，加入3倍10％三氯乙酸(w/v)，5℃静置25h，重复3次，离心15min，减压浓缩至上清液体积的1/7；②向步骤(1)中的浓缩液加入95％乙醇，6℃沉淀30h，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，真空干燥得裸花紫珠粗多糖；③裸花紫珠粗多糖加水复溶后，配制为0.8mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:5)，水洗脱，进样速率为2ml/min，洗脱速率为12滴/min，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。实施例3裸花紫珠总黄酮、总酚酸、苯乙醇苷和裸花紫珠多糖的提取(1)裸花紫珠水提物的制备：裸花紫珠加水110℃提取1次，每次加12倍水，第一次提取1h，第二次提取3h，合并滤液，过滤，90℃减压浓缩至相对密度1.30～1.35的浸膏状，于75℃干燥成干浸膏，备用；(2)裸花紫珠总黄酮的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为1mg/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②裸花紫珠乙醇溶液通过ab-8树脂(径高比为1:8)，85％乙醇为洗脱液，进样速率为3ml/min，洗脱速率为30滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总黄酮含量测定后，确定含量最高的馏分，加入裸花紫珠水提物质量1倍的氯化锌，在ph6.0的条件下沉淀，过滤，沉淀物真空干燥即得裸花紫珠总黄酮。(3)裸花紫珠总酚酸的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为1g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入3倍体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取每种试剂萃取3次，浓缩干燥后，保留乙酸乙酯相；③乙酸乙酯相加水复溶后，配制为1mg/ml的溶液，通过d101大孔树脂(径高比为1:20)，用80％乙醇溶液洗脱，进样速率为3ml/min，洗脱速率为30滴/min，收集洗脱液，洗脱液经总酚酸含量测定后，确定含量最高的馏分，真空干燥即得裸花紫珠总酚酸。(4)裸花紫珠总苯乙醇苷的制备：①裸花紫珠水提物，加乙醇溶解，配制为0.5g/ml的裸花紫珠乙醇溶液；②将裸花紫珠乙醇溶液，依次加入3倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取每种试剂萃取3次，浓缩干燥后，保留正丁醇相；③正丁醇相加乙醇复溶，配制为1mg/ml的溶液，通过硅胶柱(径高比为1:15，硅胶粒径为200-300μm)，以甲醇-二氯甲烷溶剂系统进行洗脱，甲醇-二氯甲烷体积比为0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100:0依次进行洗脱，进样速率为3ml/min，洗脱速率为15滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩干燥后，得馏分1；④馏分1加水复溶，配制为1mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:9)，水洗脱，进样速率为3ml/min，洗脱速率为15滴/min，洗脱液经苯乙醇苷含量测定，确定含量最高的馏分，浓缩后冷冻干燥即得裸花紫珠总苯乙醇苷。(5)裸花紫珠多糖的制备①裸花紫珠水提物，加入5倍8％三氯乙酸(w/v)，8℃静置30h，重复2次，离心20min，减压浓缩至上清液体积的1/10；②向步骤(1)中的浓缩液加入100％乙醇，8℃沉淀48h，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，真空干燥得裸花紫珠粗多糖；③裸花紫珠粗多糖加水复溶后，配制为1mg/ml的溶液，通过hpd100树脂(径高比为1:9)，水洗脱，进样速率为3ml/min，洗脱速率为15滴/min，洗脱液浓缩后冷冻干燥即得。实施例4-9治疗儿童疱疹性咽峡炎的裸花紫珠提取物组合物实施例4-9的组合物配方参见下表。上述组合物可按照常规方法添加相应辅料，制备为口服液、颗粒冲剂、胶囊、片剂或分散剂。对比例1-4治疗儿童疱疹性咽峡炎的裸花紫珠提取物组合物对比例1-4的组合物配方参见下表。上述组合物可按照常规方法添加相应辅料，制备为口服液、颗粒冲剂、胶囊、片剂或分散剂。对比例6裸花紫珠水提物取裸花紫珠，加水煎煮两次，每次加10倍量水，第一次2小时，第2次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，干燥成干浸膏即得裸花紫珠水提物。裸花紫珠水提物可按照常规方法添加辅料，制备为口服液、颗粒冲剂、胶囊、片剂或分散剂。对比例7裸花紫珠醇提物取裸花紫珠，加95％乙醇50℃回流浸提3h，滤过，滤液浓缩，干燥成干浸膏即得裸花紫珠醇提物。裸花紫珠醇提物可按照常规方法添加辅料，制备为口服液、颗粒冲剂、胶囊、片剂或分散剂。实施例10裸花紫珠提取物组合物的体外抗病毒研究待测药物选取实施例6-7、对比例1-7的组合物制备的颗粒制剂，以及市售裸花紫珠颗粒(江西普正药业)进行研究。待测病毒选取cvb2和cva2。10.1病毒的培养hep-2细胞株冻存管从液氮罐取出，立即投入37℃～42℃温水中融化，超净工作台内将冻存管中液体移入离心管中，1000r/min离心5min，弃冻存液，加入8ml浓度为10％的1640细胞培养液轻轻将下层沉淀细胞吹打混匀，用移液管转移到培养瓶内，在37℃、5％co2恒温培养箱中培养。待细胞长成单层后进行传代。将病毒分别接种于己经长成单层的hep-2细胞上，加rpmi-1640维持液8ml置37℃、5％co2病毒培养箱中培养，并设细胞对照，逐日观察。待细胞出现80％以上的病变时，反复冻融3次，用吸管轻轻吹打，1000r/min离心5min，取上清液定量分装于小青瓶中，胶布封口，放于-80℃冰箱冻存备用。10.2病毒毒力的测定将病毒用rpmi-1640维持液做10倍比系列稀释不同浓度，纵向重复4孔，依次接种于己长成单层的hep-2细胞的96孔板中，同时设细胞对照。37℃、5％co2病毒培养箱中培养，倒置显微镜下逐日观察，连续观察5d，将板孔内液体吸弃，加1％中性红50μl，37℃、5％co2培养箱中1小时，弃染液，用洗液将多余染料充分洗漆，加脱色液100μl，室温脱色l0min，用酶标仪在540mn波长测定od值。根据reed-muench公式计算病毒液的半数感染浓度tcid50。细胞存活率＝各组od值/正常细胞od值×100％细胞病变率＝1－细胞存活率细胞比距＝(高于50％病变率－50％)/(高于50％病变率－低于50％病变率)×100％tcid50＝antilog(iog高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距×稀释因子对数)根据tcid50结果，将病毒原液稀释至10-6-10-7使用。10.3药物对细胞毒性测定将待测药物用rpmi-1640维持液按二倍比稀释7个浓度梯度，依次接种于己经长成单层的hep-2细胞的96孔板中，并设4个复孔及细胞对照孔；37℃、5％co2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，连续观察3d，计算药物的最大无毒浓度。细胞出现病变者判为药物毒性，中性红染色，用酶标仪在540nm波长测定od值，应用reed-muench公式计算药物半数中毒浓度(tc50)，并确定最小无毒浓度(tc0)。tc50＝[antilog(log高于50％cpe百分率病毒稀释度+比距)]×c10.4抗病毒实验待测药物从无毒浓度起用rpmi-1640二倍比系列稀释7个浓度，每孔50μl接种于已长成单层hep-2细胞的96板孔中，每孔再加入50μl病毒液，同时设利巴韦林阳性对照组、病毒对照组及空白细胞对照组，每组4个复孔；病毒对照组和空白细胞组加入等量的空白培养基。5％co2培养箱中培养，观察细胞病变，待病毒对照出现90％以上的病变时，1％中性红染色，并用酶标仪在540nm波长测定od值。应用reed-muench方法计算药物半数有效浓度(ec50)和治疗指数(ti)。ec50＝[antilog(log高于50％cpe百分率病毒稀释度的值-比距)]×cti＝半数毒性浓度(tc50)/半数有效浓度(ec50)10.5实验结果表1不同裸花紫珠药物对cvb2和cva2病毒的治疗指数ticvb2cva2实施例670.2a84.1a实施例773.6a85.4a对比例148.6b55.9b对比例254.5b61.3b对比例350.1b58.7b对比例457.9c65.7c对比例564.7c70.2c对比例659.1c66.5c对比例761.4c67.9c市售裸花紫珠颗粒40.7d56.9b利巴韦林阳性对照组67.4a74.4d注：同一列中不同字母间代表具有显著性差异。由表1可知，本发明提供的裸花紫珠提取物组合物在抗cva2和cvb2病毒方面效果显著。在治疗以上2种儿童疱疹性咽峡炎病毒中，本发明提供的裸花紫珠组合物的组分缺一不可，对比例1-4中分别缺少了裸花紫珠总黄酮、裸花紫珠总酚酸、裸花紫珠总苯乙醇苷和裸花紫珠多糖，其抗病毒效果均显著下降，说明四种组分之间存在相互协同的作用。另外，本发明提供的裸花紫珠提取物组何物的含量是经过严格筛选和配比得到的，对比例5中调整了四者的配比，其抗病毒的效果显著下降。裸花紫珠通过常规的水提法和醇提法得到的提取物以及市售的裸花紫珠颗粒，其成分复杂，含量不明确，无法发挥最大的效果，因此其抗病毒的作用也不如本发明提供的组合物。实施例11裸花紫珠提取物组合物治疗cvb2和cva2感染的小鼠取balb/c小鼠，随机分组，分为正常对照组、模型组和给药组(实施例6-7的组合物制备的颗粒制剂、市售裸花紫珠颗粒组)，以4倍tcid50病毒量对大鼠进行腹腔注射，正常组给予等量生理盐水，1小时后立即灌胃给药，模型组和正常组给予等量生理盐水；连续给药14天，14天后处死存活小鼠，眼眶取血测定ldh、sod和mda。表2裸花紫珠提取物对cvb2病毒感染小鼠血清指标的影响ldh(u/l)sod(u/l)mda(umol/l)空白组690.3±111.2a300.1±57.1a11.8±1.6a病毒组1371.8±416.1b104.6±56.1b28.7±4.1b实施例6764.4±271.1a269.7±37.6a13.4±2.7a实施例7731.8±242.6a278.3±34.9a12.7±2.8a裸花紫珠颗粒938.9±286.1c210.7±56.8c18.1±4.9c注：同一列中不同字母间代表具有显著性差异。表3裸花紫珠提取物对cva2病毒感染小鼠血清指标的影响ldh(u/l)sod(u/l)mda(umol/l)空白组620.4±245.9a274.1±50.3a10.4±4.3a病毒组1482.4±450.2b139.4±50.4b36.9±5.2b实施例6678.4±156.6a259.1±60.7a15.1±5.7a实施例7632.1±319.5a265.7±43.1a13.9±3.8a裸花紫珠颗粒890.4±334.8c210.1±53.1c23.1±4.2c注：同一列中不同字母间代表具有显著性差异。由表2-3可知，实施例7在治疗cva2和cvb2病毒感染的小鼠方面效果显著，与市售裸花紫珠相比，市售裸花紫珠的效果明显不如本发明的实施例7，充分说明本发明提供的裸花紫珠提取物组合物，通过纯化后进行合理的含量配比，其相互协同发挥作用，大大提高了其抑制cva2和cvb2病毒的效果。实施例12裸花紫珠提取物组合物临床治疗疗效选择确诊的疱疹性咽峡炎患者500例，其中男性552例，女性448例，平均年龄5岁左右，患者随机分为治疗组(实施例7、对比例1-7制备的裸花紫珠颗粒和市售裸花紫珠颗粒组)和对照组，治疗组每次1袋；每日3次，对照组服用头孢克洛，按体重一日20～40mg/kg，分3次给予，但一日总量不超过1g。30天为一个疗程并观察患者症状改善情况。治疗组和对照组病例的病程、症状轻重程度基本一致，无显著差异，具有可比性。疗效判断：显效：上述症状明显缓解，身体明显好转。有效：上述症状有所缓解，身体有所好转。无效：通过治疗后上述症状无缓解或加重。表4裸花紫珠颗粒治疗儿童疱疹性咽峡炎结果显效(例)有效(例)无效(例)显效率(％)对照组406480实施例7462292对比例122131544对比例226111352对比例324131348对比例427121154对比例53315266对比例63012860对比例73113662裸花紫珠颗粒2082240由表4可知，本发明提供的裸花紫珠提取物的组合物，在治疗儿童疱疹性咽峡炎方面的疗效明显优于市售裸花紫珠颗粒，市售裸花紫珠颗粒由于其成分复杂，含量未知，治疗的疗效出现相应的下降。上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。当前第1页12