聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物及其制备和应用的制作方法

本发明涉及高分子抗癌药物技术领域，尤其涉及聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物及其制备和应用。

背景技术：

自从1940年氮芥第一次用于治疗肿瘤，开创了化学治疗肿瘤的新纪元。目前氮芥仍是临床应用治疗恶性肿瘤的一类非常重要药物。氮芥类抗肿瘤药物的作用机理是在人体内能够形成缺电子的乙撑亚胺离子，进而与生物大分子(如 DNA、RNA 或某些重要的酶类)中含有丰富电子的基团发生共价结合，使其使DNA分子发生断裂或丧失活性，从而达到抗肿瘤的目的。氮芥类药物具有抗瘤谱广、对肿瘤细胞杀伤力强等优点，但存在选择性差、治疗效率低、毒副作用大等缺点。因此研究水溶性高、选择性分布较好、生物降解性强的氮芥类抗肿瘤药物受到广泛关注。

聚乙烯醇（PVA）具有良好的生物相容性，可以通过体内水解或酶解反应降解为小分子，易于被机体吸收或代谢，对生物体无毒、无害，是一种具有广泛应用前景的大分子药物载体。因此研究开发PVA为基础的抗肿瘤药物十分必要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的应用。

为解决上述问题，本发明所述的聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物，其特征在于：该抗癌药物的平均分子量为20~40kDa，其结构式如下：

；式中：x = 10~100 mol%，y = 0~ 90 mol%。

该抗癌药物是通过共价键连接在PVA上。

该抗癌药物是通过酸性条件下可断裂的缩醛键连接在PVA上。

如上所述的聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法，其特征在于：将聚乙烯醇（PVA）和催化剂对甲苯磺酸（PTSA）于70℃溶于DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥，搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于60~80℃反应20~26 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；所述沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；所述干燥的沉淀物A溶于DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物；所述对甲苯磺酸（PTSA）的用量为所述聚乙烯醇（PVA）总质量的25%~75%；所述聚乙烯醇（PVA）与所述苯甲醛氮芥的摩尔比为0.9：0.1~1：1；所述聚乙烯醇（PVA）与所述DMSO的质量体积比为1：3~1：5；所述干燥的沉淀物A与所述DMSO的质量体积比为1：3~1：5。

如上所述的聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物在抑制HeLa细胞生长中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明通过苯甲醛氮芥与聚乙烯醇上羟基之间的缩醛反应，将苯甲醛氮芥通过共价键接枝到聚乙烯醇上，得到线性高分子聚合物抗癌药物。

⑴通过核磁共振氢谱分析可以得出（参见图1），化学位移在3.70ppm出现PVA上和-OH相连的-CH-的特征峰，化学位移在0.9-1.3ppm现PVA上-CH2-的特征峰，化学位移在5.02ppm出现缩醛的-CH-的特征峰，化学位移在7.42和7.66ppm出现苯环上的两组-CH-的特征峰，说明用本发明方法得到的产物与本申请的结构一致。

⑵通过氮气气氛中的热失重分析可以得出（参见图2），聚合物中苯甲醛氮芥的含量为9.8%，说明用本发明方法得到的产物与前面本申请的结构一致。

⑶通过在波数1607 和1512 cm^-1分别出现了苯环的特征振动吸收峰（参见图3），聚合物中存在苯甲醛氮芥，说明用本发明方法得到的产物与前面本申请的结构一致。

2、本发明经抗肿瘤活性实验验证，可应用于癌症治疗中。

⑴体外抑制肿瘤细胞生长实验：

采用四氮唑盐还原法（MTT法）对HeLa细胞株进行试验：取处于生长对数期的HeLa细胞，将细胞浓度调为2×10⁴个/mL，在96孔培养板中加入90 µL/孔，边缘孔用无菌PBS填充。在5% CO2，37℃孵育，培养箱中放置待贴壁后再加药。将聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的高分子药物和纯苯甲醛氮芥均设定5个浓度梯度，分别为2.5、5、10、20、40 µg/mL。实验组与对照组均设3个复孔，加药后细胞在CO2培养箱内温度37 ℃继续培养24 h后，取出先离心，后弃去96孔板内的上清培养液，小心用PBS冲洗2~3遍后，每孔加人20 µL MTT （四氮唑，5 mg/ml，即0.5% MTT）溶液，置于CO2培养箱内在37℃继续培养4 h，终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 µL的DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm测定各孔的吸光OD值。细胞生长抑制率按以下公式计算：

存活率= [(实验组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％

测试结果见表1及图4。其中共聚物的IC50=33.7 µg/ml，苯甲醛氮芥的IC50=91.9 µg/ml。

表1高分子共聚物与苯甲醛氮芥体外48h抗癌活性数据

从结果可以看出聚合物抗癌药物对HeLa细胞有很好的抑制作用。纯的苯甲醛氮芥一方面是由于在水溶液中的溶解性很小，基本不能接触到细胞的表面，另一方面，纯的苯甲醛氮芥由于分子量小而在细胞中发挥作用的试剂较短，所以限制了苯甲醛氮芥对HeLa细胞的抑制作用。而聚合物药物由于是水溶性的高分子化合物所以能够在HeLa细胞表面聚集，被HeLa细胞内吞，增加了HeLa细胞对聚合物的摄取量，所以明显地增强了对HeLa细胞的抑制作用。从结果分析得出纯的苯甲醛氮芥和聚合物药物对HeLa细胞的IC50值分别为91.9µg/ml和IC50=33.7µg/ml, PVA接枝氮芥的IC50值基本是纯的苯甲醛氮芥的三分之一。说明合成的高分子药物是一种有效的抗癌药物系统。

⑵体外模拟药物释放实验：

聚合物药物是由小分子药物苯甲醛氮芥是通过对酸敏感的缩醛键连接到聚合物链上的。在人体正常的体液中(pH=7.4)，该缩醛键是稳定的，而在肿瘤部位(pH=4.5-6.9)，该缩醛键会水解，从而释放出小分子的药物苯甲醛氮芥。为了测试聚合物药物中小分子药物在不同pH条件下的的释放速率，分别将浓度为0.2 mg/mL的聚合物的水溶液的pH值通过磷酸缓冲液调到7.4、5和4并放置于37 °C的恒温水溶中，在不同的时刻用三氯甲烷萃取释放下来的氮芥苯甲醛，用紫外可见光谱仪在波长为312nm处测量其萃取液的吸光度，最后加一滴浓盐酸使氮芥苯甲醛全部水解，用不同时刻的吸光度与总的吸光度的比值作为不同时刻的释放速率，见图5。结果显示PVA接枝氮芥在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中氮芥苯甲醛的释放缓慢，在100小时里释放量接近20%，而在pH=4和5的条件下释放较快，而且在前40小时里有一个明显的突发式释放，然后释放速率相对放慢，缓释时间延长。结果说明聚合物药物在pH=7.4的缓冲液中能够稳定存在，而在pH=4和5的条件下却能够释放出小分子的氮芥苯甲醛，达到了药物在不同pH条件下缓慢释放的目的。

3、本发明利用聚乙烯醇的无毒性、水溶性好和可生物降解等性能，同时可延长了抗癌药物在肿瘤的停留时间，而且聚乙烯醇也降低了抗癌药物的毒性，从而减少了对正常组织的毒害。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的PVA-Nitrogen mustard的核磁共振氢谱。

图2为本发明聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的PVA-Nitrogen mustard的热重图谱。

图3为本发明聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的PVA-Nitrogen mustard的红外图谱。

图4为本发明聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的PVA-Nitrogen mustard和纯的苯甲醛氮芥对HeLa细胞存活率的影响结果。

图5为本发明聚乙烯醇和苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1时制备的PVA-Nitrogen mustard在不同pH值时对小分子药物的释放曲线。

具体实施方式

聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物，该抗癌药物的平均分子量为20~40kDa，其结构式如下：

；式中：x = 10~100 mol%，y = 0~ 90 mol%。

该抗癌药物是通过共价键连接在PVA上。

该抗癌药物是通过酸性条件下可断裂的缩醛键连接在PVA上。

实施例1 该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法是指：将PVA(0.30g, 6.70 mmol)和PTSA（0.0250g，0.15mmol）于70℃溶于4 mL DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥（0.165g，0.67 mmol），搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于70℃反应24 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；干燥的沉淀物A溶于10 mL DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

Mn=2.2×10⁴，Mw/Mn =1.48. ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, δ, ppm): 3.68 (-CH(OH)-of PVA，-(CH2)2N-) , 1.33-1.80 (-CH2-of PVA), 5.09 (-CH（O）2)，6.83 （CH of benzene），7.76 （CH of benzene）。

实施例2 该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法是指：将PVA(0.20g, 4.50 mmol)和PTSA（0.0250g，0.15mmol mmol）于70℃溶于4mL DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥（0.55g，2.25mmol），搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于70℃反应24 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；干燥的沉淀物A溶于10 mL DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

Mn=2.5×10⁴，Mw/Mn =1.98. ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, δ, ppm): 3.68 (-CH(OH)-of PVA，-(CH2)2N-) , 1.33-1.80 (-CH2-of PVA), 5.09 (-CH（O）2)， 6.83 （CH of benzene），7.76 （CH of benzene）。

实施例3 该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法是指：将PVA(0.10g, 2.20 mmol)和PTSA（0.0250g，0.15mmol）于70℃溶于4 mL DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥（0.55g，2.20 mmol），搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于70℃反应24 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；干燥的沉淀物A溶于DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

Mn=2.9×10⁴，Mw/Mn =1.18. ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, δ, ppm): 3.68 (-CH(OH)-of PVA，-(CH2)2N-) , 1.33-1.80 (-CH2-of PVA), 5.09 (-CH（O）2)， 6.83 （CH of benzene），7.76 （CH of benzene）。

实施例4 该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法是指：将PVA和催化剂对甲苯磺酸（PTSA）于70℃溶于DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥，搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于60℃反应26 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；干燥的沉淀物A溶于DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

对甲苯磺酸（PTSA）的用量为PVA质量的55%；PVA与苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1；PVA与DMSO的质量体积比（g/mL）为1：4；干燥的沉淀物A与DMSO的质量体积比（g/mL）为1：4。

Mn=2.5×10⁴，Mw/Mn =1.68. ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, δ, ppm): 3.68 (-CH(OH)-of PVA，-(CH2)2N-) , 1.33-1.80 (-CH2-of PVA), 5.09 (-CH（O）2)， 6.83 （CH of benzene），7.76 （CH of benzene）。

实施例5 该聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物的制备方法是指：将PVA和催化剂对甲苯磺酸（PTSA）于70℃溶于DMSO中，然后加入苯甲醛氮芥，搅拌直至溶解，抽真空充氮气循环3~5次，密封后在氮气保护下于80℃反应20 h，再经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，得到沉淀物A；沉淀物A过夜风干，得到干燥的沉淀物A；干燥的沉淀物A溶于DMSO中搅拌过夜，经饱和碳酸氢钠溶液沉淀、过滤，除去未反应的PVA和氮芥，得到沉淀物B，该沉淀物B用蒸馏水洗涤3次除去小分子，于40℃真空干燥24 h，即得聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物。

对甲苯磺酸（PTSA）的用量为PVA总质量的75%；PVA与苯甲醛氮芥的摩尔比为1:1；PVA与DMSO的质量体积比（g/mL）为1：5；干燥的沉淀物A与DMSO的质量体积比（g/mL）为1：5。

Mn=2.7×10⁴，Mw/Mn =1.66. ¹H-NMR (400 MHz, d6-DMSO, δ, ppm): 3.68 (-CH(OH)-of PVA，-(CH2)2N-) , 1.33-1.80 (-CH2-of PVA), 5.09 (-CH（O）2)， 6.83 （CH of benzene），7.76 （CH of benzene）。

上述实施例1~5所得的聚乙烯醇-苯甲醛氮芥聚合物抗癌药物在抑制HeLa细胞生长中的应用。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。