一种温度敏感型的重组人胸腺素β4眼用原位凝胶制剂的制作方法

本发明涉及一种药物
技术领域：
的眼用药物新剂型-温度敏感型的眼用原位凝胶制剂，具体的说，是一种温度敏感的高分子水溶液，室温条件下为液体状态，给药后在眼角膜形成凝胶状态，延缓药物消除，提高局部生物利用度。
背景技术：
干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。常见的临床表现是眼部干涩，可能伴有眼痒，工作时间长后，眼睛疲劳。当眼睛总是分泌出黏稠白色的丝状物质，扒开眼皮能够发现里面粘著一些白色的物质，甚至能够从眼睛里拉出丝来，并伴有眼痒和异物感等症状时。通常出现这种情况的人可能是患有干眼症或急性过敏性结膜炎。干眼症的发病率在不断攀升，这与在电脑前工作时注意力集中，眨眼减少有密切联系。面神经瘫的患者，可能出现眼睑闭合困难，特别是在晚上睡觉时，此时角膜暴露在空气中，眼泪蒸发过强，也可能引起干眼症。干眼症也可能是全身免疫性疾病的一种，如干燥综合症的表现。干眼症的发病机制主要有炎症、细胞凋亡、性激素水平失调等，其中炎症是导致干眼症发病的重要因素。干眼症治疗的终极目标是保护患者的视功能，抑制眼表的炎性反应，恢复眼表面的正常结构及功能。目前的干眼症治疗方法有药物治疗和手术治疗，主要以药物治疗为主。常用药物有人工泪液或自体血清、抗炎药物等，以滴眼液为主，如重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液，玻璃酸钠滴眼液等。虽然临床上使用药物很多，但都不能达到满意的治疗效果。胸腺素β4(以下简称tβ4)是人体内天然存在的一种小肽类物质，tβ4在人脾脏、胸腺、肺和腹膜巨噬细胞中的含量最高，其次是脑、肝、肾脏、睾丸和心脏。天然的tβ4含有43个氨基酸，分子量约5kda，等电点为5.1。近年来胸腺素β4(tβ4)为药物研究的热点。深入研究已经证明：tβ4是一种多功能分子，在促进创伤和角膜损伤愈合、心肌修复、促进组织再生、血管生成、促心外膜祖细胞分化、促进细胞迁移、抗细胞凋亡和抗炎症等方面起到重要作用，tβ4可通过增加眼内杯状细胞的数量从而保护眼表泪膜层从而达到治疗干眼症的目的。cn100360174c中公开了胸腺素β4(tβ4)在促进眼睛退化逆转或抑制眼睛退化的药物中的应用。sosneg等人报道了胸腺素β4在小鼠干眼症模型能降低干眼症状(expertopiniononbiologicaltherapy，15：sup1，155-161)，动物试验剂量为0.1％。已有报道的胸腺素β4是采用化学合成方法合成的，其结构与天然tβ4一致，均含有43个氨基酸。其缺点在于化学合成纯度低，含有结构类似的有机杂质及无机杂质，会产生毒副作用。同时，化学合成的胸腺素β4临床上使用剂量大，临床效果一般。同时，化学合成的多肽产量低，工业化生产难度大，不能满足临床使用。本发明人采用基因工程的方法对天然胸腺素β4的n-末端加以定点修饰，易于规模化制备，成本较低，对环境不造成污染，足以满足临床需求。同时，我们出乎意料地发现，本发明中的重组人胸腺素β4在治疗干眼症方面活性明显高于天然胸腺素β4。另外，临床上应用的眼科制剂通常为固体和液体，据统计，已上市的眼用制剂中，液体型滴眼剂约占眼用制剂70％，因其使用方便，溶液配制，成本低廉，广泛被人们接受，但是药液在眼部停留时间短，在滴入眼睛时需要仰头，并尽量保持姿势，但液体仍避免不了流出影响药效，同时，药液还有可能经眼部流入咽喉或鼻腔，引起不舒适和不必要的副作用，因此凝胶制剂的用眼药物得以开发，眼用凝胶主要是指将药物与可制备成凝胶的辅料混合，得到混悬液或半固态，以及乳剂型的乳胶状粘稠液体。本发明主要以伯洛沙姆、卡波姆等辅料作为制备眼用凝胶的凝胶基质材料。这种剂型眼药可以延长药物与角膜的接触时间，减少刺激性，并保证药效。眼用温敏凝胶即为温度敏感性眼用原位凝胶，同时具有凝胶制剂和液体的双重优点，温度敏感性凝胶药物在结膜囊内存留较长时间，减少滴眼的频率，提高患者的依从性，延缓药物的释放，并且没有眼凝胶剂的油腻感，眼部温敏原位凝胶可以作为存储和管理液体的系统。温敏凝胶的制备一般采用生物兼容性较好，温敏特点比较突出的伯洛沙姆p407和p188作为温敏凝胶基质材料，由于伯洛沙姆p407在浓度超过20％时对眼睛有一定的刺激性，在低浓度时丧失凝胶化能力，所以需要与其他伯洛沙姆混合使用，经过研究表明，当伯洛沙姆188浓度升高，凝胶的温度变高，当伯洛沙姆407的浓度升高，凝胶的温度降低。理想的眼部温敏凝胶温度在温度25～30℃时为流动的液体，在34～35℃时发生相变形成半固体，眼内温度一般为34～35℃，通过对凝胶温度的影响来调整伯洛沙姆p407和p188的比例。技术实现要素：本发明的目的是提供一种以重组人胸腺素β4为主体的温度敏感型的原位眼用凝胶制剂，它含有水溶性的高分子辅料，通过不同比例的伯洛沙姆p407和伯洛沙姆p188组合，制成温度敏感性眼用原位凝胶，同时具有凝胶制剂和液体的双重优点。本发明中的重组人胸腺素β4是通过基因工程技术生产的多肽类蛋白质药物，其结构与天然结构不同，含有44个氨基酸，其n-端序列和天然氨基酸n-端不同，将天然胸腺素β4的n-末端的乙酰化去除，并添加一个gly，得到的天然胸腺素β4的突变体，增加了体内生物活性。本发明所述的重组人胸腺素β4为序列1，即gly-rhtβ4。cn02805917中公开了该衍生物及其氨基酸序列。本发明的目的是通过如下方案实现的：重组人胸腺素β4羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺按照重组人胸腺素β4与羟丙基-β-环糊精摩尔比例，分别称取两种重组人胸腺素β4原液冻干粉和羟丙基-β-环糊精(以下简称hp-β-cd)，加入去离子水进行溶解。将溶解完全的重组人胸腺素β4溶液分别逐滴加入搅拌的hp-β-cd中，继续搅拌2h进行包合；将得到的rh-tβ4-hp-β-cd溶液放入-80℃的冰箱冻存一夜后，使用冷冻干燥机冷冻干燥36h，取出冻干粉置于-4℃冰箱冷藏保存。重组人胸腺素β4环糊精包合物(rh-tβ4-hp-β-cd)温敏凝胶的制备称取总量分别为16％的伯洛沙姆407和14％的伯洛沙姆188，，搅拌后，低温冷藏，使凝胶充分溶胀，分散均匀得到澄清的溶液；将重组人胸腺素β4环糊精包合物与高分子辅料溶于70％的注射用水中，继续搅拌后，低温冷藏，得到重组人胸腺素β4环糊精包合物(以下简称rh-tβ4-hp-β-cd)温敏凝胶。本发明的一个目的在于重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶稳定性优于对照组重组人胸腺素β4，优选的，是重组人胸腺素β4与环糊精包合物摩尔比例为1∶10。本发明的一个目的在于重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对干眼症有疗效，且药效强于重组人胸腺素β4环糊精包合物组及重组人胸腺素β4给药组。在一些实施方案中重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对眼表的修复作用优于对照组重组人胸腺素β4环糊精包合物组和重组人胸腺素β4给药组。在一些实施方案中重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对结膜及角膜的修复作用优于对照组重组人胸腺素β4环糊精包合物组和重组人胸腺素β4给药组。本发明的一个目的在于重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶为局部用药。本发明的一个目的在于重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶优选的为滴眼液。附图说明图1：重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对大鼠干眼症模型治疗后的眼前节照相结果。图2：重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对大鼠干眼症模型治疗后的角膜he染色结果。图3：重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对大鼠干眼症模型治疗后的结膜he染色结果。具体实施方式实施例一：重组人胸腺素β4与羟丙基-β-环糊精不同的摩尔比例(1∶10，1∶20，1∶40)包和比较方法：分别用ft-ir采用溴化钾压片法测定重组人胸腺素β4、羟丙基-β-环糊精与重组人胸腺素β4按照不同比例制备而成的重组人胸腺素β4环糊精包合物及羟丙基-β-环糊精的ir。分别称量质量0.3mg～2mg，加入溴化钾作为承载物，用研钵研磨均匀后，进行压片，放入傅立叶变换红外光谱仪中，光谱扫描范围为4000～400cm-1，测定各基团的红外吸收光谱。根据各物质在扫描范围的吸收峰变化，来判断包合物的形成。称取重组人胸腺素β4冻干品、羟丙基-β-环糊精、不同比例制备的重组人胸腺素β4环糊精包合物及不同比例的羟丙基-β-环糊精与重组人胸腺素β4冻干粉的物理混合物少量，在同步tg-dsc热分析仪上进行测试，n2作为保护气，升温速率为10℃/min，测量范围为20～200℃，以样品与参比物产生温差所需的热量值为纵坐标，以温度为横坐标，记录dsc图谱，绘制出扫描曲线。结果：通过比较三种比例谱图差别不大，但比例为1∶10时，1655cm-1处n-h弯曲振动更为明显，所以包合效果最佳。通过dsc差示扫描量热分析结果表明：当重组人胸腺素β4与羟丙基-β-环糊精摩尔比例1∶10投药包合时，重组人胸腺素β4与羟丙基-β-环糊精包合的制剂熔点变化最大，说明此比例下制备重组人胸腺素β与羟丙基-β-环糊精包合物包合的效果最好。实施例二：p407和p188不同的比例对温敏凝胶温度的影响伯洛沙姆407是研究最为深入的温度敏感型聚合物，是制备温度敏感凝胶使用最频繁的高分子辅料，20％～30％的伯洛沙姆407溶液具有反向胶凝的性质，伯洛沙姆188在浓度为10％～30％范围内单独使用不会产生胶凝现象，因此通常将两者复合使用。通过考察伯洛沙姆407和伯洛沙姆188的浓度与胶凝温度的关系，实验结果表明，随着p407的浓度的升高，胶凝温度反而下降，加入p188后，随着p188的浓度升高，胶凝温度也逐渐升高，如表1-1所示。表1-1伯洛沙姆的成分浓度对胶凝温度的影响通过对比不同浓度不同比例的伯洛沙姆407和伯洛沙姆188对温敏凝胶的胶凝温度的影响，确定在16％的伯洛沙姆407和14％的伯洛沙姆188混合使用时，得到的温敏凝胶的胶凝温度为35℃，符合眼用凝胶温度适用范围。实施例三：稳定性比较通过含量测定来比较重组人胸腺素β4水溶液，不同比例制备的重组人胸腺素β4环糊精包合物水溶液及重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶溶液的降解率。结果：通过对药物及制剂稳定性的实验考察，重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶在一个月内稳定性良好，对比重组人胸腺素β4要更加稳定，降解率比重组人胸腺素β4缓慢。对比三种比例的制剂，筛选出比例为1∶10时制备的制剂最稳定。0151030n1：10100％97.6％95.7％90.4％89.6％n1：20100％98.2％96.5％89％68.4％n1：40100％98.2％92％76％64％bh1：40100％100％88.2％71％47％bh1：20100％97.1％97.1％76.5％26％bh1：10100％99.2％95.7％91.3％78.3％原料药100％97.9％97.1％97.1％76.8％实施例四：重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶对大鼠干眼症治疗后结果：选取正常大鼠9只为正常组，选取模型制备成功的大鼠36只随机分为4组，每组9只，配制浓度30ug/ml，重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶及重组人胸腺素β4环糊精包合物(实验组)、重组人胸腺素β4(阳性对照组)、和pbs(阴性对照组)，连续给药7日，每日滴加3次，每次50微升；(1)眼表损伤程度检查：角膜荧光素钠染色评分将荧光素钠滴入麻醉后的大鼠眼结膜囊内，2min后，瞬目三次，使泪液与荧光素钠混合，置于裂隙灯显微镜下观察，将光移至钴蓝光，进行眼角膜上皮荧光素钠染色分级；试验结果显示：正常大鼠在裂隙灯显微镜下观察眼角膜与眼结膜都比较光滑，角膜没有水肿现象，结膜没有充血现象，使用角膜荧光素钠染色后呈阴性，眼表无损伤；经过苯扎氯铵造模成功后有干眼症状的大鼠(pbs组)，眼角膜没有光泽且比较干燥，眼结膜有明显充血现象，使用角膜荧光素钠染色呈阳性，部分造模成功的大鼠眼表有损伤；重组人胸腺素β4温敏凝胶组给药后，大鼠干眼症状有明显的恢复，荧光素钠染色后呈阴性，眼表恢复光泽没有损伤，没有充血的现象，对比重组人胸腺素β4环糊精包合物组和重组人胸腺素β4给药组，效果更佳，如图1所示。(2)he染色结果光镜下he染色结果分析，正常大鼠的角膜上皮表面光滑，上皮细胞层次正常(2～3层上皮细胞)呈扁平，基底细胞排列整齐，基质层无水肿；结膜的上层细胞排列规则，上皮表面也比较光滑，无角化。pbs模型组大鼠的角膜和结膜表层细胞排列不规则，并有不同程度的缺失，基质层有水肿的现象；重组人胸腺素β4和环糊精包合物组给药后，角膜和结膜的上皮有所恢复，缺失减少，但部分细胞排列不规则，仍有缺失；重组人胸腺素β4环糊精包合物温敏凝胶给药后，结膜及角膜有明显的恢复，细胞排列规则，且上皮表面比较光滑，相比重组人胸腺素β4和环糊精包合物组效果更佳，如图2所示。当前第1页12