HIF-1α小分子激活剂在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地涉及hif-1α小分子激活剂在治疗神经退行性疾病特别是帕金森病中的应用。

背景技术：

神经退行性疾病又称为神经退化性疾病，通常表现为脑或神经组织的结构或功能的进行性丧失。这是目前世界上尚未解决的主要健康问题之一。神经退行性疾病有若干种类型。以帕金森病(pd)为例，其又名震颤麻痹，是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，主要病变在黑质和纹状体区域，以运动减少、震颤、肌强直等运动症状及嗅觉减退、便秘、快动眼睡眠行为障碍等非运动症状为本病的主要临床特征。此外，脑血管病、脑炎、抗精神病药物、外伤、中毒等也会导致类似运动减少、震颤、肌强直等运动症状为临床特征的帕金森综合征。

wo2004108681a1、cn102977015b公开了下式的化合物以及该化合物用于防治由缺氧诱导因子和/或促红细胞生成素调介疾病的药物的用途：

目前，现有技术中主要公开了该化合物的一些制备方法，但尚未公开其在神经退行性疾病特别是帕金森病中的治疗效果。本领域亟需能够有效治疗神经退行性疾病如pd的新药物。

技术实现要素：

本发明涉及式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的应用：

其中

r¹选自氢、卤素和c1-6烷基；并且

r²选自任选被取代的c6-14芳基-o-基团，其中所述c6-14芳基-o-基团通过其中的氧原子连接至分子的剩余部分。

在优选的实施方案中，式(i)所示化合物具有以下结构式(ia)：

在进一步优选的实施方案中，所述神经退行性疾病是帕金森病、帕金森综合征、帕金森叠加综合征、阿尔茨海默病或肌萎缩性侧索硬化症，优选帕金森病。

在一实施方案中，所述药物可以用于增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡。在又一实施方案中，所述药物可以逆转神经毒性药物引起的细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及呼吸功能的下降。在另一实施方案中，所述药物可以减少纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌。

附图说明

图1：mpp⁺抑制sh-sy5y细胞增殖，促进细胞凋亡，影响hif-1α的表达。

图2：化合物fg-4592增加sh-sy5y细胞中hif-1α的表达并减轻mpp⁺诱导的细胞损伤。

图3：化合物fg-4592处理的多巴胺能神经元中线粒体功能得到明显改善。

图4：化合物fg-4592改善了mptp导致的小鼠行为障碍。

图5：化合物fg-4592减少了小鼠纹状体中mptp诱导的多巴胺能神经元的丢失。

具体实施方式

以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。

除非另有说明，本文使用的所述技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其他值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另有说明，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点和该范围内的所有整数和分数(小数)。

术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。

术语“任选”或“任选存在”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，当某个基团描述为任选地被取代时，其可以是未被取代的，也可以是被取代的，例如被一个或多个独立地选自本文所述的那些取代基取代。本领域技术人员应当理解，任选还涵盖取代基的种类和数目可以任意选择和组合的含义，只要形成的化合物是稳定的。

表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由...组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由...组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由...组成”和“由...组成”。

术语“一种(个)或多种(个)”或“至少一种(个)”可以表示一种(个)、两种(个)、三种(个)、四种(个)、五种(个)、六种(个)、七种(个)、八种(个)、九种(个)或更多种(个)。

本文所用的术语“卤素”是指氟(f)、氯(cl)、溴(br)、碘(i)。

本文所用的术语“取代(的)”指所指定的原子的一个或多个氢被给定的基团的选择代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。取代基和/或变量的组合仅在这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。本文所指的任选被取代的基团的取代基的实例可以是烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、芳基、芳氧基(芳基-o-)、氧代(o＝)、羰基、羧基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硝基、sh、sch3、c(o)ch3、co2ch3等中的一个或多个。

在本文中，“i-j”或类似的表述是指涵盖端点、其中的每个整数以及由其中的整数构成的亚范围的范围。例如，c1-6涵盖c1、c2、c3、c4、c5和c6以及c2-c5、c3-c4等。

本文所用的术语“烷基”，不论单独使用或与其他术语组合使用，是指具有特定碳原子数的支化或直链的饱和脂肪族烃基团。除另有注明外，“烷基”是指c1-6烷基。例如，“c1-6烷基”包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基等。本文所述的烷基可以任选地被取代。

本文所用的术语“烷氧基”，不论单独使用或与其他术语组合使用，是指上文所述的烷基，其通过氧原子连接到分子的其他部分(烷基-o-)。除另有注明外，“烷氧基”是指c1-6烷氧基。例如，“c1-6烷氧基”包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。本文所述的烷氧基可以任选地被取代。

本文所用的术语“环烷基”，不论单独使用或与其他术语组合使用，是指具有特定碳原子数的饱和脂肪族环状烃基团。除另有注明外，“环烷基”是指c3-6环烷基。例如，包括但不限于环丙基、甲基-环丙基、2，2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基和环己基等。本文所述的环烷基可以任选地被取代。

本文所用的术语“芳基”，不论单独使用或与其他术语组合使用，是指表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳族或部分芳族的单环、双环或三环烃环(“c6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“c6芳基”)，例如苯基；或者具有9个碳原子的环(“c9芳基”)，例如二氢化茚基或茚基；或者具有10个碳原子的环(“c10芳基”)，例如萘基；或者是具有13个碳原子的环(“c13芳基”)，例如芴基；或者具有14个碳原子的环(“c14芳基”)，例如蒽基。优选c6-14芳基，特别是c6-10芳基，最优选c6芳基。本文所述的芳基可以任选地被取代。芳基可以任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：c1-6烷基、卤素、c1-6烷氧基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、芳基-o-、卤代芳基-o-、硝基、氰基、羟基、羧基和氨基。

本文所用的术语“芳基-o-”基团表示上文所述的“芳基”，其通过氧原子连接至分子的剩余部分或核心部分。例如c6-14芳基-o-，特别是c6-10芳基-o-，最优选c6芳基-o-。“芳基-o-”基团可以任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：c1-6烷基、卤素、c1-6烷氧基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、芳基-o-、卤代芳基-o-、硝基、氰基、羟基、羧基和氨基。任选被取代的“芳基-o-”基团可以选自苯氧基、2，6-二甲基苯氧基、3，4-二氟苯氧基、3，5-二氟苯氧基、3-氯-4-氟苯氧基、3-甲氧基-4-氟苯氧基、3-甲氧基-5-氟苯氧基、4-cf3-o-苯氧基、4-cf3-苯氧基、4-氯苯氧基、4-氟苯氧基、4-(4-氟苯氧基)苯氧基、4-甲氧基苯氧基和4-硝基苯氧基，优选苯氧基。

本文所用的术语“氨基”表示“nh2”基团。氨基还涵盖任选地被取代的氨基，例如被一个或多个上文所述的取代基取代，例如nh(c1-6烷基)或n(c1-6烷基)2。

术语“药学可接受的盐”指本发明化合物的相对无毒的、无机酸或有机酸加成盐。本发明化合物的合适的药学可接受的盐可以是例如在链或环中包含氮原子的具有足够碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如与以下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸；或者与以下有机酸形成的酸加成盐：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。

具有足够酸性的本发明化合物的另一种合适的药学可接受的盐是碱金属盐如钠盐或钾盐，碱土金属盐如钙盐或镁盐，铵盐，或者与提供生理学可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与以下物质形成的盐：n-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1，6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇等。此外，碱性含氮基团可以用以下试剂季铵化：低级烷基卤，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。本领域技术人员会进一步认识到，本发明化合物的酸加成盐可以通过多种已知方法中的任意一种使所述化合物与适当的无机酸或有机酸反应来制备。或者，本发明的呈酸性的化合物的碱金属盐和碱土金属盐通过各种已知的方法使本发明的化合物与适当的碱反应来制备。

神经退行性疾病及其治疗

本发明涉及式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的应用：

其中

r¹选自氢、卤素和c1-6烷基；以及

r²选自任选被取代的芳基-o-基团，其中所述芳基-o-基团通过其中的氧原子连接至分子的剩余部分。

在又一方面，本发明涉及式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗神经退行性疾病。

在进一步的方面，本发明还涉及一种治疗神经退行性疾病的方法，其包括向有此需要的个体给药式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐。

在优选的实施方案中，式(i)所示的化合物具有结构式(ia)：

式(ia)的化合物在本文中又称为化合物fg-4592、fg-4592或4592。

不意图为任何理论所束缚，认为通过增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡，本发明的化合物能够实现对神经退行性疾病的治疗效果。在另一方面，通过逆转神经元细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及呼吸功能的下降(这些病况可以由神经毒性药物引起)，本发明的化合物能够实现对神经退行性疾病的治疗效果。而在又一方面，通过减少纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌，本发明的化合物能够实现对神经退行性疾病的治疗效果。

在本发明一具体实施方案中，神经退行性疾病包括帕金森病、帕金森综合征、帕金森叠加综合征、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症等。在优选的实施方案中，神经退行性疾病为帕金森病(pd)。

在一特别优选的实施方案中，本发明涉及式(ia)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗帕金森的药物中的应用

在一实施方案中，所述药物包括式(ia)所示的化合物和药学上可接受的载体。在进一步的实施方案中，所述药物包括式(ia)所述的化合物的药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

在本发明的一实施方案中，所述药物用于增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡。在本发明的又一实施方案中，所述药物逆转神经毒性药物引起的细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及呼吸功能的下降。在进一步的实施方案中，所述药物减少纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌。

在本发明的一实施方案中，所述药物的给药途径包括口服、经直肠、经粘膜、鼻或肠内投药、肠胃外输送。在另一实施方案中，所述药物的剂型为口服或注射制剂。

药物组合物和给药

本发明所用的化合物可以以治疗有效量经由任何本领域已知可接受方式，单独或与一种或多种其他治疗药物合用给药。治疗有效量可以变化，这取决于疾病严重性、年龄和健康状况、药效、待治疗的具体病症和所需效果等因素。

本发明所用的化合物可以以药物组合物的形式给药，通过任何常规途径给药，包括但不限于包括口服、经直肠、经粘膜、鼻或肠内投药、肠胃外输送。

用于口服给药的药物组合物可以通过，例如，通过将活性成分与一种或多种载体混合，若需要，将所得的混合物制粒，并通过加入其他赋形剂来加工混合物或颗粒，以获得片剂或片芯。合适的载体包括但不限于填充剂，例如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；粘合剂，例如淀粉，如玉米，小麦，大米或马铃薯淀粉，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮；若需要，还可以使用崩解剂。

用于口服给药的药物组合物还可以包括胶囊，如甘油或山梨醇的密封胶囊。胶囊剂可含有活性成分的颗粒的形式，例如与填充剂如玉米淀粉、粘合剂和/或助流剂如滑石粉或硬脂酸镁，以及任选存在的稳定剂混合。在胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的液体赋形剂如脂肪油、石蜡油中，其中可以包含稳定剂。

适用于直肠给药的药物组合物，例如栓剂，其包含活性成分和栓剂基质的组合。合适的栓剂基质有，例如，天然或合成的甘油三酯、石蜡烃、聚乙二醇或高级链烷醇。

适于胃肠外输送的药物组合物可包含水溶性形式的活性成分，例如水溶性盐或包含增加粘度的物质的含水注射悬浮液，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇的水溶液和/或葡聚糖和/或稳定剂。胃肠外给药也可以使用输注溶液。

本发明涉及以下方案：

[1].式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的应用：

其中

r¹选自氢、卤素和c1-6烷基；并且

r²选自任选被取代的c6-14芳基-o-基团，其中所述c6-14芳基-o-基团通过其中的氧原子连接至分子的剩余部分。

[2].第[1]项的应用，其特征在于，

所述任选被取代的c6-14芳基-o-基团的取代基是烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基、芳基、芳氧基、氧代、羰基、羧基、氰基、氢、卤素、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、硝基、sh、sch3、c(o)ch3、co2ch3中的一个或多个。

[3].第[1]或[2]项的应用，其特征在于，

式(i)所示的化合物具有式(ia)的结构：

[4].第[1]-[3]项中任一项的应用，其特征在于，

所述神经退行性疾病是帕金森病、帕金森综合征、帕金森叠加综合征、阿尔茨海默病或肌萎缩性侧索硬化症。

[5].第[1]-[4]项中任一项的应用，其特征在于，

所述神经退行性疾病是帕金森病。

[6].第[1]-[5]项中任一项的应用，其特征在于，

所述药物用于增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡。

[7].第[1]-[6]项中任一项的应用，其特征在于，

所述药物逆转神经毒性药物引起的细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及呼吸功能的下降。

[8].第[1]-[7]项中任一项的应用，其特征在于，

所述药物减少纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌。

[9].第[1]-[8]项中任一项的应用，其特征在于，

所述药物的给药途径包括口服、经直肠、经粘膜、鼻或肠内投药、肠胃外输送。

[10].第[1]-[9]项中任一项的应用，其特征在于，

所述药物的剂型为口服或注射制剂。

[11].式(ia)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗帕金森的药物中的应用

[12].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物包括式(ia)所示的化合物和药学上可接受的载体。

[13].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物包括式(ia)所述的化合物的药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

[14].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物用于增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡。

[15].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物逆转神经毒性药物引起的细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及呼吸功能的下降。

[16].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物减少纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌。

[17].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括口服、经直肠、经粘膜、鼻或肠内投药、肠胃外输送。

[18].第[11]项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服或注射制剂。

有益效果

在本发明中，发明人采用mpp⁺处理神经母细胞瘤细胞作为帕金森病的细胞模型和mptp处理小鼠作为帕金森病的动物模型，发现相对于模型组，本发明的化合物预处理组可以增加神经元细胞活力，减少细胞凋亡。并且发现本发明的化合物预处理组可以部分逆转神经毒性药物引起的细胞线粒体膜电位的下降、atp含量的下降以及其呼吸功能的下降；可以减少神经毒性药物(mptp)对小鼠黑质其纹状体区域多巴胺能神经元的损伤，增加损伤区域多巴胺及其代谢物的分泌，最终达到缓解其运动功能降低的水平。

从而证实，本发明的化合物可以有效地治疗以pd为代表的神经退行性疾病。并且本发明的化合物(如在人中的)安全性好，毒性低，临床药理学表现优异，具有广阔应用前景。

实施例

以下将通过具体实施例来进一步描述本发明的技术方案。应注意，所述实施例仅为示例性，而非对本发明保护范围的限制。本发明还可有其他实施方案，或能够以多种方式实践或进行。除非另有说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。

在文本的实施例中，所有试剂和仪器都是可商购的。

例如，化合物fg-4592购于selleck中国，目录号：s1007。cas号：808118-40-3。

细胞及动物模型种类及来源

sh-sy5y细胞为人神经母细胞瘤细胞，是研究pd最常用的细胞模型之一，具有普遍性及可靠性。与过表达a53t突变型α-synuclein的sh-sy5y细胞均获得自上海复旦脑科学研究院。

实施例中使用的小鼠为雌性c57bl/6小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，所有动物实验均按照上海生命科学研究院动物保护与使用委员会批准的方案进行。

主要仪器设备：

仪器名称厂商

4℃，-20℃冰箱海尔

超低温冰箱thermofisherscientific

pcr仪bio-rad

倒置显微镜olympus

恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司

多功能酶标仪perkinelmer

细胞培养用超净台thermofisherscientific

冰冻离心机eppendorf

高内涵细胞成像thermofisherscientific

激光共聚焦显微镜olympus

海马胞外流变分析仪seahorse

冰冻切片机美国thermoscientific公司

tanon5200全自动化学发光图像分析系统上海天能科技有限公司

开场实验视频分析系统(小鼠自主活动仪)上海移数信息科技有限公司

主要试剂：

试剂名称试剂商

mptpsigmaaldrich

mpp⁺sigmaaldrich

细胞培养基(dmem)hyclone

胎牛血清hyclone

fg-4592selleckchem

脂质体2000invitrogen

小干扰rnabiotend

细胞增殖活性检测试剂盒sab

hif-1α抗体novus

α-synuclein抗体cst

th抗体sigma

β-actin抗体proteintechgroup

bax抗体proteintechgroup

bcl-2抗体proteintechgroup

sybr-green实时pcrmastermixtoyobo

annexinv-fitc/pi试剂盒bd

atp试剂盒sigma

mitostresskitseahorsebioscience

超氧化物阴离子荧光探针(dhe)beyotime

主要实验方法

1.cck-8检测细胞活性

sh-sy5y细胞接种于96孔板中，细胞的接种密度为5000个/孔，每个孔的培养基的量为100微升。待细胞长至对数增长期时(80％左右时)，加用对应浓度的mpp+处理相应时间。待药物处理细胞至相应时间，每孔加入10微升的cck-8，取三个未接种细胞的孔加入等量的含有cck-8的培养基作为空白对照。放入培养箱内孵育大约1小时，最后使用酶标仪，在450nm的波长下测定吸光度，根据od值，计算mpp⁺对sh-sy5y的细胞毒性。

2.免疫印迹和免疫荧光染色

经过特异性处理后，将sh-sy5y细胞和解剖的小鼠脑组织在细胞裂解缓冲液中裂解。使用imagej软件对免疫印迹条带的密度进行半定量。每组4只动物使用水合氯醛麻醉并灌注心脏。等量蛋白质在sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。用含有0.05％tween-20的tris缓冲盐水(tbst)制备5％脱脂牛奶，并使用该液体与pvdf膜室温封闭45分钟，然后将pvdf膜与特定的一抗一同进行孵育4℃过夜。然后将pvdf膜用tbst洗涤3次，每次10分钟。而后将pvdf膜与二抗37℃孵育45min后，再用tbst洗涤3次。使用过氧化氢-辣根过氧化酶显色。取出小鼠脑组织，使用4％多聚甲醛4℃固定24小时，随后4℃下浸泡30％蔗糖溶液直至下沉。用oct包埋小鼠脑组织，然后使用冰冻切片机连续切成厚度为20μm的冠状切片。将脑片破膜、固定并封闭1小时，然后在4℃下与相应的一抗孵育过夜。

3.annexinv-fitc/pi染色后流式细胞术检测细胞凋亡

细胞接种在6cm培养皿中，加药处理完毕后吸出培养基保存于离心管中备用，培养皿中加入1ml的胰酶消化细胞吹打细胞并收集，1500r/min离心5min。弃去离心管中的培养基，用pbs洗一遍。1500r/min，离心5min。取上清，每管加入195微升annexinv-fitc/pi结合液，和5微升annexinv-fitc，取一离心管，按比例混合annexinv-fitc/pi结合液和annexinv-fitc后，每管加入200微升的混合液。室温避光孵育20分钟后进行流式细胞仪检测。

4.rna提取和定量实时pcr分析

使用trizol试剂根据制造商的说明提取总rna。使用sybr-green实时pcrmastermi，使用revertracdna合成试剂盒定量所有rna样品并逆转录成cdna，sybr-green实时pcrmastermix作为检测染料。使用的引物序列如下：

hif-1α-f：gcgcgaacgacaagaaa(seqidno.1)；

hif-1α-r：gaagtggcaactgatgagca(seqidno.2)；

18srna-f：cagccacccgagattgagca(seqidno.3)；

18srna-r：tagtagcgacgggcggtgtg(seqidno.4)；

pgc-1α-f：aaacagcagcagagacaaatgc(seqidno.5)；

pgc-1α-r：ttggtttggcttgtaagtgttgtg(seqidno.6)

5.线粒体膜电位的检测

线粒体膜电位mmp由高内涵细胞成像系统(hcs)筛选确定。将sh-sy5y细胞接种到48孔板中，每孔20000个细胞。经过特定处理后，将细胞置于无血清的含5ng/μlhochest细胞核燃料的无血清的dmem中，避光37℃孵育10min。然后将细胞在5ng/μl线粒体膜电位染料tmrm37℃下孵育30分钟。用dmem轻轻洗涤细胞三次，然后进行hcs检测。

6.atp含量的检测

sh-sy5y细胞经过特定处理后从6cm培养皿刮下，根据atp检测试剂盒的说明测定atp水平。将细胞裂解，在4℃12000g离心10分钟。然后将适量的上清液与反应混合物混合到每个孔中来测量atp水平。使用水平振动器充分混合。37℃避光孵育30分钟。酶标仪测量570nm处的吸光度。使用校正的测量，从标准曲线确定样品中atp的量。

7.线粒体呼吸能力的测定

为了研究线粒体氧耗(ocr)，将细胞铺种在海马24孔板上并进行特定处理24小时。ocr使用seahorsexfe24分析仪和mitostress试剂盒，使用1mmoligomycin和鱼藤酮，500nm羰基化物4-(三氟甲氧基)苯基腙(fccp)，按照制造商的说明书进行测定。

8.氧自由基(ros)含量的测定

在研究当天，用3ml冷pbs缓冲液冲洗10cm培养皿中的细胞三次，然后在37℃下与25μm二氢乙锭(dhe)共同孵育20分钟。从细胞中洗脱dhe，然后收集细胞，加入300μl冷甲醇中，最后在4℃14000g离心5分钟后将上清转移至内插管，进行hplc分析。留下约40μl的上清液用于bca蛋白质测定。

9.动物分组及药物的准备

雄性c57bl/6小鼠(10-12周，22-26g)购自上海slac实验动物公司(中国上海)。首先待小鼠适应环境后，将动物随机分为三组：对照(con)，mptp和mptp+fg-4592组(每组n＝10)。mptp(30mg/kg/天)和fg-4592(10mg/kg/天)连续5天腹腔注射。腹腔注射mptp前6h腹腔注射fg-4592。将mptp(m0896，sigma)溶于生理盐水中，储存浓度为3mg/ml。将fg-4592(s1007，selleck)悬浮在dmso中，储存浓度为1mg/ml。con组注射等量的dmso。所有的动物都提前进行了每项行为测试的训练。在最后一次mptp注射后的2天进行行为测试。

10.旷场实验及爬杆实验

分别将每只小鼠置于金属运动活动室(开放场：80×80×28.5cm)中。使用连接到自动化视频跟踪系统(上海移动基准信息技术有限公司)的小室上方的相机监视小鼠的活动。每次检测持续15分钟。根据之前文献公布的方法进行爬杆实验。简而言之，爬杆测试需要一个55厘米高，直径10毫米的立柱，保证其表面粗糙且立于小鼠的笼子中。小鼠被放置在杆的顶部附近，使其头朝上，记录爬下的时间。

11.用hplc检测小鼠黑质纹状体内多巴胺递质及其主要代谢的含量

各组小鼠颈椎脱位处死。在冰上迅速进行纹状体和黑质(sn)的组织的分离，然后放入液氮中冷冻并在-80℃保存。将冷冻的小鼠纹状体在含有10mmedta的冷0.2m高氯酸中超声处理。置于冰上15分钟后，匀浆液4℃15000g离心15分钟。上清液用于测定神经递质浓度。使用配备有5041型分析细胞和esa584hplc泵的电化学检测器(coulochemiii，esa，usa)，使用hplc测定多巴胺(da)、二羟基苯乙酸(dopac)和高香草酸(hva)的含量。

实施例1：mpp⁺抑制sh-sy5y细胞增殖，促进细胞凋亡，影响hif-1α的表达

在本实施例中，使用：mptp(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)模型来评价评估sh-sy5y细胞(人神经母细胞瘤细胞，广泛运用于pd发病机制的研究)中mpp⁺(甲基苯基吡啶离子)的神经毒性。

我们首先用不同的浓度(0，1，2，3，4，5mm)的mpp⁺处理细胞24小时，然后通过cck-8法检测细胞活力。我们发现，用3.5mm浓度的mpp⁺处理时的细胞活力下降到大约50％(图1a)，因此我们选择3.5mm作为随后的细胞处理浓度。我们的结果还表明，mpp⁺增加sh-sy5y细胞的凋亡(图1b)。然后我们检测了sh-sy5y细胞在不同mpp⁺浓度(0.3，5.5mm)24小时和3.5mm处理不同时间(0，6，12，24，36小时)的hif-1α的蛋白水平。如图1c和1d所示，hif-1α的蛋白水平显著降低并呈现mpp⁺剂量和时间依赖。然而，hif-1α的mrna表达增加(图1e)，表明线粒体抑制剂mpp⁺可能影响hif-1α的降解，而不影响其基因的转录。

实施例2：化合物fg-4592增加sh-sy5y细胞中hif-1α的表达并减轻mpp⁺诱导的细胞损伤

在本实施例中，测试本发明的化合物通过抑制hif-1α的降解引起其积累的效果。

酪氨酸羟化酶(th)是多巴胺(da)能神经元中da合成的限速酶。th表达减少，会导致多巴胺分泌减少，导致帕金森病的临床症状。如果治疗后th表达增加，提示治疗改善。另外，黑质中含有α-synuclein(α-突触核蛋白)聚集体的路易体的存在也是pd主要的病理学特征，α-synuclein是第一个被发现的pd相关基因，其突变体a53t(ala53thr)、a30p(ala30pro)是最常见的被证实与家族性pd的发病密切相关基因型。

我们的实验发现，fg-4592(式ia的化合物)引起hif-1α的剂量依赖性增加，并伴随着th的诱导(图2a，2b)及过表达a53t突变型α-synuclein细胞中α-synuclein蛋白表达的下调(图2c)。然后用fg-4592预处理后，检测sh-sy5y细胞的凋亡情况。通过western-blot测定证实，mpp⁺诱导sh-sy5y细胞中促凋亡蛋白bax的增加和抗凋亡蛋白bcl-2水平的降低被fg-4592预处理逆转(图2d，2e)。

annexinv-fitc/pi实验测定显示，当在fg-4592与mpp⁺共处理24小时时，细胞的凋亡数也显著降低(图2f，2g)。为了进一步研究hif-1α在fg-4592神经保护中的作用，我们用hif-1αsirna转染sh-sy5y细胞抑制hif-1α的表达，用ncsirna转染的细胞作为对照。转染后48小时，将细胞暴露于mpp⁺，有或没有fg-4592预处理。

当在cck8测定中，细胞在fg-4592预处理后，mpp⁺的细胞抑制作用被逆转。然而，在hif-1αsirna组中，hif-1α蛋白表达下调后(图2i)，在fg-4592预处理组中则没有观察到这种保护作用(图2h)。

这些结果表明，本发明的化合物对mpp⁺诱导的细胞损伤的神经保护作用至少部分由hif-1α介导。

实施例3：化合物fg-4592处理的多巴胺能神经元中线粒体功能得到明显改善

在本实施例中，测试本发明的化合物对线粒体的氧消耗率、最大呼吸和储备呼吸能力方面的效果。

许多研究表明，线粒体功能障碍和氧化应激可能在pd发病过程中起关键作用。多巴胺能神经元由于在da合成或其单胺氧化酶的分解期间产生的高水平的活性氧物质而易于氧化损伤。

我们测量了用fg-4592(式ia的化合物)和mpp⁺共同处理的sh-sy5y细胞中的线粒体膜电位(mmp)。结果表明，hif-1α的增加可部分逆转mpp⁺引起的细胞mmp的降低(图3a，3b)和atp产生的减少(图3c)。为了进一步探究细胞的呼吸功能的变化，我们进行了对多巴胺能神经元线粒体呼吸功能的实时分析(图3d)。

结果表明：与只有mpp⁺处理的细胞相比，fg-4592预处理细胞中线粒体的氧消耗率(ocr)(图3e)、储备呼吸能力(图3f)和最大呼吸(图3g)均显著增加。

实施例4：化合物fg-4592改善了mptp导致的小鼠行为障碍

在本实施例中，测试本发明的化合物对小鼠行为障碍的改善效果。所用的mptp处理的小鼠模型为研究pd常用的动物模型，能够有效地反映药物对pd的效果。

我们通过旷场实验研究了不同处理组小鼠的运动能力，发现mptp处理组小鼠的行走的总距离，平均速度和中心区域逗留的总时间显著降低。其中，中心区域逗留的总时间可以在一定程度上反映小鼠的焦虑程度。fg-4592(式ia的化合物)的给药显著挽救了mptp引起的小鼠的行走的总距离的减少(图4a)，平均速度的降低(图4b)，但不能改善其焦虑状态(图4c)。

我们通过爬杆实验进一步评估了mptp诱导的小鼠运动迟缓和动作协调障碍。我们发现mptp处理后小鼠爬杆所需总时间显著延长，而fg-4592的使用逆转了mptp诱导的爬杆总时间的延长(图4d)。

结果表明，本发明的化合物可以改善由mptp引起的行为障碍。

实施例5：化合物fg-4592减少了纹状体中mptp诱导的多巴胺能神经元的丢失

在本实施例中，测试本发明的化合物对多巴胺能神经元的保护效果。

我们首先通过western-blot的方法检测了纹状体中th蛋白的水平(图5a)。与mptp单独处理的小鼠相比，fg-4592+mptp组的th蛋白水平明显升高。另外，图5b显示，fg-4592也抑制了mptp引起单独hif-1α和bcl-2蛋白水平的降低。

hplc用于研究fg-4592(式ia的化合物)是否影响小鼠神经递质水平。我们发现mptp给药可以明显降低da，二羟苯乙酸(dopac)和高香草酸(hva)的水平(图5c)。通过使用fg-4592，mptp诱导的以上神经递质的减少都会部分恢复。这些结果表明，fg-4592对da的合成和分解代谢都会有影响。然后，我们使用免疫荧光染色检测不同处理组小鼠黑质中的th阳性神经元的丢失情况，并观察到与mptp组相比，fg-4592保护药组增加了黑质th阳性神经元的数量(图5d)。

虽然本发明已阐述并描述了典型的实施方案，但本发明并不限于所述细节。由于各种可能的修改和替换没有背离本发明的精神，本领域技术人员可使用常规试验能够想到的本发明的变型和等同物，因此所有这些变型和等同物都落入由以下权利要求书所定义的本发明的精神和范围内。