一种球形酮的应用及其制备方法与流程

本发明涉及微生物萃取物及其应用技术领域，具体是一种球形酮的应用及其制备方法。

背景技术

爱美是人的天性，因此化妆保养品是经久不衰的产业，且随着高科技制造技术和美学包装设计的发展，化妆保养品开始与这两者结合，使其成为低污染，高利润，高附加值，重视形象和品牌的产业。

目前，化妆品的研发有三个趋势，化妆品原料，加强皮肤吸收的新剂型或者原料制造技术及相关功能性/安全性/品管检测技术，而化妆品原料是灵魂，随着生物科技的快速发展，以组织培养、遗传工程及微生物发酵等方法制备出来的天然成份，已成为高价位化妆品原料的主流。

皮肤变黑或者出现斑点，主要是由于黑色素(melanin)沉着在皮肤上的原因，因此抑制黑色素生成，增强皮肤抗氧化能力是预防和治疗黑色素沉着在皮肤上的一个重要的课题。

目前，抑制黑色素生成是通过抑制酪胺酸酶(tyrosinase)来达到减少皮肤色素的沉着与淡化斑点，且大多数是以试管方式测定，仅能做为初步参考之用，真正成为有价值且具疗效的抗黑色素沉着原料，应用于市场上尚有一段距离。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种解决上述技术问题的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种球形酮的应用，所述的球形酮为用作抑制黑色素生成的添加物。

优选地，所述的球形酮为用作对抗黑色素沉着的添加物。

优选地，所述的球形酮为用作抑制酪胺酸酶活性的添加物。

优选地，所述的球形酮为用于制备动物饲料、人类食品、化妆品或保养品的添加物。

优选地，所述的球形酮可用作化妆品或保养品的添加物。

本发明还提出了一种用于制备上述球形酮的方法，包括如下步骤：

(a)将野生原生光合菌放入培养皿中培养出含有球形酮的光合菌；

(b)将含有球形酮的光合菌接种到发酵槽进行大量培养；

(c)采用油脂萃取方法，从上述大量培养出的含有球形酮的原生光合菌中萃取出球形酮。

优选地，所述的油脂为植物油，包括葡萄籽油、橄榄油、葵花油、花生油的一种或几种混合物。

本发明的有益效果是，球形酮具有抗色素沉着的功效，且具有抑制黑色素瘤细胞的毒性、黑色素生成及细胞内酪胺酸酶活性的效果，另外，本发明的球形酮可以大量生产，解决了球形酮产量小，仅用作试管方式测定，做为初步参考之用的难题，为稳定生产饲料、食品、化妆品或保养品等提供有力保障，同时，生产工艺操作简单，适应于工业化生产，具有很强的实用价值。

附图说明

图1是本发明的现有技术，原生光合菌的传统生产流程图；

图2是本发明不同浓度的球形酮与b16细胞株细胞存活率的关系；

图3是本发明不同浓度的球形酮对b16细胞形态影响的显微镜图片，其中，a是未处理的b16细胞形态，b是四氢呋喃(thf)的细胞形态，c是浓度为2μm的细胞形态，d是浓度为10μm的细胞形态，e是浓度为20μm的细胞形态；

图4是本发明不同浓度的球形酮培养24小时与b16细胞中黑色素颗粒量的关系；

图5是本发明不同浓度的球形酮培养24小时与b16细胞中黑色素沉着的关系；

图6是本发明与不同浓度的球形酮培养24小时与b16细胞中酪氨酸酶(tyrosinase)活性的关系。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1：

参见图1，原生光合菌的传统生产流程，甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate)在菌种b的作用下，生成八氢番茄红素(phytoene)，该八氢番茄红素在菌种i的作用下，生成六氢番茄红素(phytofluene)，接着生成ζ-胡萝卜菌(ζ-carotene)，然后生成四氢番茄红素(neurosporene)，最后生成茄红素(lycopene)，该茄红素在菌种c的作用下，生成紫菌红素(rhodopin)，该紫菌红素在菌种d的作用下，生成3，4-二脱氢紫菌红素(3，4-didehydrorhodopin)，该3，4-二脱氢紫菌红素在菌种f的作用下，生成脱水紫菌红醇(anhydro-rhodovibrin)，该脱水紫菌红醇在菌种c的作用下，生成紫菌红醇(rhodovibrin)，该紫菌红醇在菌种d的作用下，生成单脱甲基螺菌黄素(monodemethyl-spirilloxanthin)，该单脱甲基螺菌黄素在菌种f的作用下，生成螺菌黄素(spirilloxanthin)。其中四氢番茄红素在菌种c的作用下，还可以生成羟基四氢番茄红素(hydroxyneurosporene)，该羟基四氢西红柿红素在菌种f的作用下，生成甲氧基四氢番茄红素(methoxyneurosporene)，该甲氧基四氢番茄红素在菌种d的作用下，生成球形烯(spheroidene)，该球形烯在菌种c的作用下，生成羟基球形烯羟(hydroxyspheroidene)。在菌种a的作用下，生成球形酮(spheroidenone)。

本发明中，首先将野生原生光合菌(rhodobactersphaeroides)选至培养皿中进行培养，再将繁殖出含有球形酮(spheroidenone)的光合菌接种到发酵槽进行大量培养，最后利用油脂萃取方法，萃取出球形酮。

细胞株与培养条件

以黑色素瘤细胞株(b16)作为模式。将b16加入到含10％fbs的dmem培养基，放置在37℃含有5％的co2培养箱中培养，至8分满后，分别加入不同浓度的球形酮，16-24h后，对b16细胞进行癌细胞存活率及抑制黑色素生成分析。

细胞存活率分析(mttviabilityassay)

利用mtt细胞存活率分析球形酮对b16细胞的生长影响，mtt是经细胞内粒腺体去氢酶(dehydrogenase)的分解，由透明无色产生蓝色甲臜(formazan)晶体，细胞死亡则酵素失活，故蓝色结晶的多寡可判断细胞的存活力。首先将细胞置于24孔微量平盘，每孔有1ml新鲜的培养液约含10⁴cells，培养隔夜后，经过不同的处理再进行细胞存活力的测定。在测定前，先将mtt以未含有fbs的dmem培养液稀释成0.2mg/ml，将1mlmtt稀释液加入到每孔细胞中，在37℃下培养1小时，在显微镜下，可观察到细胞内有蓝色结晶生成。将24孔的微量平盘倒盖，移去培养液，用1ml的二甲基亚砜(dmso)溶解，均匀摇晃5分钟直到看不到晶体后，在492nm读取其吸光值。由图2可知，在b16细胞中，分别加入浓度为2μm，10μm及20μm的球形酮，培养24小时后，浓度为2μm时，b16细胞的存活率为95％以上，浓度为10μm时，b16细胞的存活率为80％以上，浓度为20μm时，b16细胞仍有78％以上存活率，由此可知，低浓度的球形酮对b16细胞生长基本没有影响，当球形酮浓度达10μm以上时，才会抑制细胞生长。图3是在200倍显微镜下，经过不同处理的b16细胞存活率分析后的形态，其中a是未处理的b16细胞形态，b是四氢呋喃(thf)处理的细胞形态，c是浓度为2μm处理的细胞形态，d是浓度为10μm处理的细胞形态，e是浓度为20μm处理的细胞形态，由图可知，高浓度球形酮处理24小时后，细胞的形态没有显著变化，由此可知，球形酮对细胞生长有一定的抑制作用，但对细胞无毒性影响。

黑色素分析(melaninassay)

参考egilandtyrrell(1999)的方法，将取50μl的b16细胞处理后，置入离心机(eppendorf)中，测定蛋白质含量，再将细胞以3000rpm离心10min，所得的沉淀物加入1ml1n的naoh以溶出黑色素，测定400nm之吸光值。由图4可知，b16细胞在300nm的-msh培养3天，黑色素含量增加近3倍，当加入浓度为2μm，5μm，10μm和15μm的球形酮时，黑色素含量呈降低趋势，并呈明显的剂量关系，与α-msh培养3天后的黑色素相比，球形酮的浓度达到10μm时，b16细胞中的黑色素含量从40μg/mgprotein降至22μg/mgprotein，球形酮的浓度达到15μm时，黑色素含量降低到未用α-msh培养的b16细胞中黑色素含量。

黑色素沉着分析(observationofdepigmentation)

将b16细胞培养在24孔微量平盘，每个孔的细胞数约2×10⁵，以球形酮(spheroidenone)与200μm曲酸培养24小时，取1倍的te缓冲液的细胞，置入离心机(eppendorf)中，以10000rpm离心10min，观细胞色素察沉淀(hyunjungetal.，2005)。结合图5可知，球形酮能显著降低黑色素沉着(depigmentation)。

酪氨酸酶分析(tyrosinaseassay)(angelettietal.，2004；siegristetal.，1986)

将密度为3x10⁴/孔b16细胞培养在96孔的培养盘中，放置在37℃、5％co2的培养箱中16小时以上，分别加入浓度为2μm和10μm的球形酮，24h后，每孔用200μl的pbs清洗，再分别加入20μl0.5％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x-100)/50mm磷酸钠缓冲溶液(ph＝6.9)，放置在-80℃的冰箱中，30min后，取出，室温下，放置25min，最后放置在37℃的培养箱中5min后，在温度为37℃时，每个孔中加入190μl受质溶液(6.3mmmbth，3-methyl-benzothizaolinonehydrazone)，1.1mm左旋多巴(l-dopa)，48mm磷酸钠缓冲溶液(ph＝7.1)及4％(v/v)n，n-二甲基甲酰胺(n，n-dimethylforamamide)，反应60min后，利用免疫酵素分析仪测定波长508nm吸光值。由图6可知，球形酮浓度为2μm时，酪胺酸酶抑制率为20±2％，当浓度为5μm时，其抑制率达到30±3％，当浓度为10μm时，其抑制率达到45±4％，当浓度为15μm时，其抑制率达到50±4％，由此可知，球形酮是通过抑制酪胺酸酶(tyrosinase)的活性，达到抑制黑色素生成的作用，并且呈明显的剂量关系。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述的实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可以作出种种的等同的变型或替换，这些等同变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。