本发明涉及人造血管支架的制备方法，具体涉及一种高活性人造血管支架的制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术：
随着人类生活条件的提高，血管类疾病的发病率也日益增加，治疗血管类疾病有效手段之一就是血管移植。但由于用于移植的异体血管数量稀少无法满足医疗需求，故人造血管成为最合适的代替品。20世纪50年代起，科研人员开始了纺织型人造血管的制造历史。目前，纺织型人造血管已广泛地应用于临床，替换人体内已坏损的血管，并取得了较好的医疗效果。
研究表明，血管中的细胞是成一定的取向排列的，其特定排列为血管的功能提供了很多作用，比如血管外层中的平滑肌细胞，其在外层结构中始终是对齐的沿着圆周取向排列的，这对于血管在环境温度响应的条件下的收缩作用至关重要。研究表明人造血管的成分对其细胞生长分化也具有很大影响，血管的生物活性高，则细胞生长速度快，另一方面血管壁中纳米纤维的排列方向也对于细胞生长方向、粘附方向都有很重要的引导作用，纤维的对齐度越高其细胞排列的对齐度也越高，并且随着培养时间的增加，其对齐度在逐渐增加，而无序的纳米纤维则会导致细胞的无序生长。
中国专利公布号cn103590194a，公开日期为2014年2月19日，发明名称为一种生血管微米复合纤维片材料的制备方法，该发明制备了一种生血管微米复合纤维片材料，通过在静电纺聚乳酸(pla)微米纤维上利用静电力结合制备包封血管内皮生长因子(vegf)的聚乳酸-己内酯共聚物(plga)微米颗粒，plga微米颗粒能够持续地释放内皮生长因子(vegf)，而径直排列的pla微米纤维则可以指导细胞沿着纤维的取向粘附，同时沿着排列的纤维释放生长因子从而引导成熟的功能性新生血管的空间和取向排布，达到能够控制其空间和取向、增加血管密度的目的。
中国专利公布号cn107376016a，公开日期为2017年12月24日，发明名称一种重组蛛丝蛋白小口径人造血管支架的制备方法，该发明以大腹园蛛基因组为模板，采用pcr技术得到梨状腺丝重复区，并与plx载体连接，构建重组质粒，转入bl21中进行表达，使用变性纯化手段，获得重组蛛丝蛋白溶液，并进行冻干，得到干蛋白，然后采用静电纺手段，与plcl共混，得到小口径人造血管支架。
以上专利都是通过静电纺丝制备人造血管支架，其中前者血管中排列的纤维释放生长因子从而引导成熟的功能性新生血管的空间和取向排布，后者通过干蛋白与plcl共混制备人造血管支架，制得的血管生物活性较高，但静电纺丝其工作效率低，且工作需高压静电，对纺丝溶液要求也较高，工艺相对复杂。
技术实现要素：
针对上述存在问题，本发明的目的在于提供出一种高活性人造血管支架的制备方法，本发明的具体技术方案为：
一种高活性人造血管支架的制备方法，所述制备方法按照以下步骤进行：
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将胶原蛋白和聚己内酯溶于六氟异丙醇中，溶液质量分数为10％～20％，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
其中，溶液中胶原蛋白和聚己内酯的比例为3:7～7:3；
b.定向纤维层的制备
将纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层。
其中，定向纤维层单位质量为10～20g/m2。
定向纤维层中的纤维为棉或羊毛或蚕丝或聚酯纤维中的一种。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为2000～7000r/min，接收距离为10～20cm，即得到离心纺纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的离心纺纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.1～0.2mm，然后取0.1～0.2g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.04～0.1mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体；
其中，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向垂直或平行；
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.02～0.05mm，即得到制备好的完整的人造血管支架；
本发明是通过结构和功能仿生而设计和制备的功能人造血管支架。人体的血管组织为三层结构，最外层结蹄组织，中间层为取向的平滑肌组织，最内层为内皮细胞组成的薄膜结构。其中取向的平滑肌组织既是血管的支撑层，同时在血液流动中进行动能和势能的快速转化，保证血流的通畅。本发明利用了梳理机对纤维进行梳理，使其进行取向，形成类似于平滑肌取向层的结构，再通过与具有良好生物活性的胶原蛋白材料进行复合，构筑出取向纤维增强高活性胶原蛋白/聚己内酯膜用作人造血管支架的中间层。依靠涂覆法和离心纺丝法在人造血管支架中间层的两侧形成两层不同结构的膜，仿生人造血管支架的内膜和外部结蹄组织。
本发明采用离心纺丝技术制备纳米膜。离心纺丝技术是借助离心力将高分子溶液经喷丝孔甩出形成射流，并在惯性力、粘滞力和空气阻力的共同作用下，迅速被拉细固化形成超细纤维，并快速向收集器运动，是一种同时适用于溶液纺和熔融纺的新型高效纺丝技术。其纺丝效率高，且对纺丝原液要求较低，适用范围十分广泛。本发明中离心纺丝原液为胶原蛋白和聚己内酯，主要利用胶原蛋白稳定的分子结构，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性，且胶原蛋白能够诱导细胞分化，促进伤口愈合，使人造血管在人体中保持较高的生物活性；聚己内酯是一种强度较高，具有很好的生物相容性的无毒无害材料。将两种具有不同力学特征的材料混合在一起制备成产品也可以弥补单一材料产品的缺点，添加适量的聚己内酯可增加胶原蛋白材料的强力，提高胶原蛋白材料克服形变的能力。
本发明所选择的总溶质质量分数为10～20％，原因是总质量分数低于上述值会导致溶液粘度太低，纺丝过程中难以形成连续纤维且有效固化纤维含量过低；总质量分数高于上述值会导致溶液粘度太高，在纺丝过程中会堵塞喷丝嘴导致无法纺出纤维。本发明所选择的胶原蛋白与聚己内酯质量比为3:7～7:3，原因是质量比低于上述值会导致支架材料中胶原蛋白含量过低，于后续应用中难以发挥其作用；胶原蛋白与聚己内酯质量比高于上述值会导致聚己内酯含量低难以形成力学性能良好的连续纤维。
本发明中定向纤维层起着引到细胞有序生长的作用，选取棉纤维，羊毛，蚕丝和聚酯纤维来定向排列以增加血管取向度，是由于这些纤维强度较好，无毒无害且生物相容性好，对人体不会产生不良反应。本发明制备取向纤维层时，使用梳棉机作为常用的纤维梳理和除杂的机器，可以很好的控制纤维取向性，形成完全取向的纤维层。选择的取向纤维层规格为10～20g/m2，是因为如果纤维层单位克重小于10g/m2，则会导致纤维层非常薄，单位面积内含有的纤维的根数少，无法起到增强的作用。如果纤维层单位克重大于20g/m2时，会导致单位面积内含有的纤维根数较多，增强后的人造血管膜材料较硬，与人体血管的性能不符。定向纤维层所有纤维伸直方向与圆柱体模具轴向平行或垂直，可以分别引导细胞沿着血管轴向和径向生长。
本发明人造血管的制备中，由于纤维直径在0.1-10μm有利于促进细胞的贴服和增殖，而离心纺丝纤维的直径是由离心纺丝工艺参数决定，故为得到以上直径的纤维，控制离心纺丝参数如下：，离心管转速为2000～7000r/min，接收距离为10～20cm，离心纺纳米膜的厚度为0.1～0.2mm。如果离心纺纳米膜的厚度超出0.2mm以后，人造血管的总厚度将加大，导致人造血管的弹性下降，不利于能量的转化。如果离心纺纳米膜的厚度小于0.1mm，容易导致血管的防渗漏能力下降，易出现渗血的现象，给病人生命带来危险。
本发明中制备人造血管支架时，先将离心纺纳米膜在圆柱体模具上卷绕成管状，再在其表面均匀贴附定向纤维层，通过在定向纤维层外表面先后涂刷和喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液，使离心纺纳米膜和定向纤维层紧密结合，避免血管分层，影响使用。
本发明人造血管的制备中，为完全模拟人体血管的结缔组织层，在涂覆外层溶液时，考虑到成膜后收缩等原因，故选择涂覆的厚度为0.04～0.1mm，干燥后即可得到10μm左右厚度的膜。
本发明人造血管支架制备时，可选择不同直径的圆柱体模具来满足不同直径人造血管支架的要求，也可选择不同离心纺丝纳米膜厚度和定向纤维排列厚度来满足不同厚度的人造血管支架的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
一种高活性人造血管支架的制备方法，制备步骤如下：
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将胶原蛋白和聚己内酯溶于六氟异丙醇中，溶液质量分数为10％～20％，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
其中，溶液中胶原蛋白和聚己内酯的比例为3:7～7:3。
b.定向纤维层的制备
将纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层。
其中，定向纤维层单位质量为10～20g/m2。
定向纤维层中的纤维为棉或羊毛或蚕丝或聚酯纤维中的一种。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为2000～7000r/min，接收距离为10～20cm，即得到离心纺纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的离心纺纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.1～0.2mm，然后取0.1～0.2g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.04～0.1mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体。
其中，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向垂直或平行。
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.02～0.05mm，即得到制备好的完整的人造血管支架。
具体实施例
实施例一
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将3g胶原蛋白和7g聚己内酯置于90g六氟异丙醇中，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
b.定向纤维层的制备
将棉纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层，定向纤维层单位质量为10g/m2。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为2000r/min，接收距离为10cm，即得到纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.1mm，然后取0.1g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向垂直，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.04mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体。
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.02mm，即得到制备好的完整的人造血管支架。
实施例二
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将5g胶原蛋白和5g聚己内酯置于90g六氟异丙醇中，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
b.定向纤维层的制备
将羊毛纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层，定向纤维层单位质量为15g/m2。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为5000r/min，接收距离为15cm，即得到纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.15mm，然后取0.15g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向平行，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.06mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体。
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.03mm，即得到制备好的完整的人造血管支架。
实施例三
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将7g胶原蛋白和3g聚己内酯置于90g六氟异丙醇中，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
b.定向纤维层的制备
将蚕丝纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层，定向纤维层单位质量为20g/m2。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为5000r/min，接收距离为20cm，即得到纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.2mm，然后取0.15g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向平行，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.06mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体。
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.05mm，即得到制备好的完整的人造血管支架。
实施例四
a.胶原蛋白/聚己内酯溶液的制备
将10g胶原蛋白和10g聚己内酯置于80g六氟异丙醇中，以200～800r/min的速度在20～60℃环境下进行时间为10～18h的搅拌；溶解完全后得到均匀透明的胶原蛋白/聚己内酯溶液，将搅拌完成后的胶原蛋白/聚己内酯溶液放入真空度为-0.1～-0.05mpa的环境下脱泡2～6h，即得到均匀的胶原蛋白/聚己内酯溶液。
b.定向纤维层的制备
将聚酯纤维材料通过梳棉机进行开松分梳和除杂，使所有呈卷曲的纤维成为伸直且伸直方向一致的定向纤维层，定向纤维层单位质量为20g/m2。
c.离心纺纤维膜的制备
将经a步骤制备的胶原蛋白和聚己内酯溶液置于离心纺丝仪器的离心管中，离心管转速为5000r/min，接收距离为15cm，即得到纤维膜。
d.胚体的制备
将由c步骤制备的纤维膜绕圆柱体模具卷绕成管状，厚度为0.15mm，然后取0.2g经步骤b制备的定向纤维层均匀贴附在管状纤维膜的外表面上，贴附在管状纤维膜的外表面上的定向纤维层其纤维伸直排列方向与圆柱体模具轴向垂直，然后用刷子蘸取适量经步骤a制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液涂刷在定向纤维层外表面上，厚度为0.1mm，即得到内表面为离心纺纳米膜，外表面为定向纤维层的胚体。
e.人造血管支架的制备
将经d步骤制备的胚体安放在卷绕机上，卷绕机主轴以50～100r/min转速转动，将经a步骤制备的胶原蛋白/聚己内酯溶液溶液倒入到喷枪中，并喷涂至胚体表面，喷涂胶原蛋白/聚己内酯溶液的厚度为0.05mm，即得到制备好的完整的人造血管支架。