一种杂交水牛同期发情-定时输精的处理方法与流程

本发明属于畜牧业水牛繁殖技术领域，具体涉及一种杂交水牛同期发情-定时输精的处理方法。

背景技术：

同期发情技术是现代畜牧生产中重要的繁殖控制技术之一，有助于人工授精技术的进一步推广，也是胚胎移植工作的重要环节。gnrh-pg-gnrh(gpg，ovsynch)同期发情方案是在家畜繁殖中已广泛应用，同期发情效果相对较好，但在水牛繁殖方面同期发情效果还不理想，主要有以下三个原因：(1)我国奶水牛主要为当地水牛与地中海、摩拉、尼里-拉菲水牛的杂交后代，国内本地水牛属于沼泽型水牛(2n＝48)，国外大多数水牛如摩拉流型水牛、尼里水牛和地中海水牛等均为江河型水牛(2n＝50)，杂交后代染色体产生非整倍性(2n＝50，2n＝49和2n＝48)，杂交后代包含49条染色体，染色体成单，引起杂交水牛繁殖性能更低；(2)水牛繁殖性能易受环境和气候的影响，呈季节性发情，在非繁殖季节不但受胎率低，而且产后乏情发病率比较高；(3)水牛产犊间隔时间长，达到性成熟的年龄较晚，发情持续时间较长(4～64h)，且发情症状不易被察觉，发情不规律，受胎率低等，造成了产奶量和繁殖力“双低”的问题，严重限制了奶水牛产业的发展。

近些年逐渐发展起来的同期发情定时输精技术在奶牛和水牛上已有广泛的应用，通过生殖激素不同组合，人为调控卵巢活动和控制排卵时间。同期发情-定时输精技术无需发情鉴定，操作简单，可显著提高受胎率和繁殖率。但已有的同期发情-定时输精技术，如gnrh-pg-gnrh(ovsynch)在杂交水牛上应用效果不太理想，主要表现为同期发情率低、受胎率低等。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种杂交水牛同期发情-定时输精的处理方法，可控制水牛发情周期，提高水牛同期发情率和配种受胎率。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种杂交水牛同期发情-定时输精的处理方法，其包括如下步骤：

s1、向一个或多个健康的处于发情周期的母牛肌肉注射促性腺素释放激素(gnrh)，以诱导发情；

s2、肌肉注射氯前列醇钠(pgf2ɑ)，以启动发情；

s3、第二次注射促性腺素释放激素(gnrh)，同时注射米非司酮以促进排卵；

s4、注射米非司酮后24小时，实施人工输精；

s5、人工输精后第5天肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)，以促进早期胚胎存活。

如上所述的方法，优选地，所述促性腺素释放激素的注射剂量为400μg/头。

如上所述的方法，优选地，在步骤s2中，所述注射前列腺素是在步骤s1后第7天注射。进一步地，所述氯前列醇钠的注射剂量为0.5mg/头。

如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述第二次注射促性腺素释放激素与第一次间隔9天。

如上所述的方法，优选地，在步骤s3中，所述米非司酮的注射剂量为0.4mg/kg体重。

如上所述的方法，优选地，在步骤s5中，所述hcg的注射剂量为2000iu/头。

如上所述的方法，优选地，在步骤s5，之后，在人工输精后第30天，第一次用b超确定牛只妊娠情况，在人工输精后第40天，第二次利用b超确定牛只妊娠情况。

如上所述的方法，优选地，所述第一次用b超确定牛只妊娠情况，对未妊娠的牛只肌肉注射氯前列醇钠，隔天再肌肉注射gnrh，同时注射米非司酮，第三天进行人工输精，人工输精后第5天，肌肉注射hcg；人工输精后第47天，第三次利用b超确定牛只妊娠情况，以此可循环整个过程。

也就是说，杂交水牛第0天下午肌肉注射gnrh，第7天下午肌肉注射氯前列醇钠pgf2ɑ，第9天下午第二次肌肉注射gnrh，同时注射米非司酮，第10天下午进行人工输精，第15天(即人工输精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射hcg，第40天(即人工输精后第30天)第一次用b超确定牛只妊娠情况，对确定妊娠的牛只进行分栏；对未妊娠牛只肌肉注射pgf2ɑ。第42天下午第二次肌肉注射gnrh，同时注射米非司酮，第43天下午进行人工输精。第48天(即人工输精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射hcg，第90天(即人工输精后第47天)第三次利用b超确定牛只妊娠情况；以此可循环整个过程，即为杂交水牛同期发情-定时输精循环方法。

如上所述的方法，优选地，所述促性腺素释放激素的注射剂量为400μg/头；所述氯前列醇钠的注射剂量为0.5mg/头；所述米非司酮的注射剂量为0.4mg/kg体重；所述人绒毛膜促性腺激素的注射剂量为2000iu/头。

一般促性腺激素释放激素(gnrh)在奶牛上剂量为50-250微克/头，而本发明在研究过程中确定杂交水牛注射促性腺激素释放激素(gnrh)的剂量最佳为400微克/头，剂量过低影响排卵率，剂量过高增加经济投入，过高易导致多卵泡排卵。人绒毛膜促性激素(hcg)肌肉注射，水牛最佳剂量为2000iu/头，剂量过低或过高都不利于早期胚胎存活。本发明中的氯前列醇钠肌肉注射注射剂量为0.5毫克/头为最佳，如果剂量过低，会导致黄体溶解不完全，影响同期发情率。

在本发明在研究过程中米非司酮设计了三个不同的注射剂量(0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg)，用以筛选最佳的米非司酮注射剂量。结果表明，米非司酮的注射剂量多于或少于0.4mg/kg体重，会降低发情率及受胎率，同时也会导致卵泡囊肿等卵巢疾病，所以优选米非司酮注射剂量为0.4mg/kg。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的一种杂交水牛同期发情-定时输精的处理方法，将gpg和米非司酮的有机结合，从而有效控制水牛发情周期，提高杂交水牛同期发情率和配种率及受胎率；本发明方法能有效提高早期胚胎存活率；且不需要检测发情，定时输精，操作方便。

本发明方法能够较为准确地控制排卵时间和进行定时人工授精(tai)程序，无需进行发情鉴定。

附图说明

图1为本发明方法的流程图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本发明为了解米非司酮注射剂量对水牛卵泡发育和发情排卵及受胎的影响，提高同期发情方案的同期发情效果，选择了120头，无生殖道疾病的健康母牛，设计了三个米非司酮剂量进行筛选(0.3mg/kg，0.4mg/kg，0.5mg/kg)，米非司酮注射时间与第二次注射gnrh为同一时间；同时以公认较好的方案gpg+cidr(阴道栓)为对照。

具体操作如下：

杂交水牛第0天下午肌肉注射gnrh，按400μg/头进行注射，b超检查从第6天(pgf2ɑ注射前一天)至第12天排卵为止(即第二次注射gnrh后72h)，记录卵泡发育及发情、排卵状况。第7天下午肌肉注射氯前列醇钠pgf2ɑ，按0.5mg/头注射，第9天下午(注射氯前列醇钠后48小时)第二次肌肉注射gnrh(400μg/头)，同时注射米非司酮，第10天下午(第二次注射gnrh后24小时)进行人工输精，第15天(即人工输精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射hcg。因为考虑胚胎早期死亡的问题，妊娠诊断是在人工输精后第40天，第二次利用b超确定牛只妊娠情况并记录。

表1.不同剂量米非司酮对卵泡发育和排卵的影响

续表1

注射不同剂量的米非司酮对同期发情效果的影响和比较gpg+cidr方案见表1，试验结果表明：本发明的同期发情方案与gpg+cidr方案相比，中剂量米非司酮的发情率、排卵率、受胎率差异不显著(p>0.05)，但中剂量米非司酮的卵泡囊肿率(4.4％)与其它方案(包括高剂量组和低剂量组)相比为最低(p<0.05)。此外，中剂量组发情率和排卵率显著高于高剂量组(p<0.05)，受胎率显著高于低剂量组(p<0.05)。因此考虑到上述所有指标，米非司酮的中剂量组即0.4mg/kg体重为最优剂量。

实施例2

为筛选最优米非司酮给药时间，选择了52头，无生殖道疾病的健康母牛，本发明设计了3个注射米非司酮的注射时间点，即第二次注射gnrh同时注射米非司酮，比第二次注射gnrh早或晚4小时。实验操作同实施例1，不同之处在于第二次注射gnrh同时注射米非司酮，比第二次注射gnrh早或晚4小时。米非司酮不同的给药时间对同期发情效果的影响见表2，结果表明，与第二次注射gnrh同时注射米非司酮的试验组卵泡囊肿率和不发情率小于其它试验组，显性发情率、总发情率、排卵率及受胎率高于其它试验组(p>0.05)。米非司酮注射第二次注射gnrh后4个小时排卵卵泡发育速度0.2504(mm/days)最大(p>0.05)。综上，第二次注射gnrh同时注射米非司酮试验组同期发情相对于其它试验组最佳。

表2不同输精时间对发情率和排卵率的影响

续表2

实施例3

为了筛选最佳的人工授精时间，选择了100头，无生殖道疾病的健康母牛，本试验对人工授精时间进行了筛选和优化。设计单次和双次定时输精时间，单次配种时间设计了三个点(第二次注射gnrh后20，24，28小时定时输精)，双次配种时间是(一组：第二次注射gnrh后16，26小时定时输精，二组：第二次注射gnrh后20，30小时定时输精)

结果见表3，结果显示，第二次注射gnrh后24小时单次人工授精与其它实验组相比卵泡囊肿率(0％)为最低(p<0.05)，且该处理的发情率(93.8％)、受胎率(43.8％)和排卵率(93.8％)高于其他实验组(p>0.05)。另外卵泡生长速度0.258mm/day最高(p>0.05)。综上，在第二次gnrh后24小时单次人工授精对水牛同期发情效果最好。

表3.不同的定时输精时间对同期发情受胎率的影响结果

续表3

实施例4

一种杂交水牛同期发情-定时输精方案，选择健康，没有生殖道疾病的水牛母牛387头，可按流程如图1所述进行，具体方案如下：

第0天：第一周，星期一下午16：00pm肌肉注射gnrh，注射剂量为400μg/头。

第6天：b超检查从第6天(pgf2ɑ注射前一天)至第12天排卵为止(即注射gnrh后72h),记录卵泡发育及发情、排卵状况。

第7天：第二周，星期一下午16：00pm肌肉注射氯前列醇钠pgf2ɑ，注射剂量为0.5mg/头。

第9天：第二周，星期三下午16：00pm肌肉注射gnrh(400μg/头)，同时肌肉注射米非司酮(0.4mg/kg)。

第10天：第二周，星期四下午16：00pm进行人工输精。

第15天：第三周，星期二下午16：00pm(即人工授精后第5天)，对接受配种的牛只肌肉注射hcg(2000iu/头)。

第33天：第五周，星期五下午16：00pm(即人工授精后的第23天)肌肉注射gnrh，注射剂量为400μg/头。

在第33-40天之间(即配种后第23-30天)观察记录牛只返情情况。

第40天：第六周，星期五(即人工授精后第30天)上午10：00利用b超进行妊娠诊断，对确定妊娠的牛只进行分栏；对未妊娠牛只下午16：00pm肌肉注射氯前列醇钠，注射剂量为0.5mg/头。

第42天：第七周，星期一下午16：00pm对未妊娠牛只肌肉注射gnrh(400μg/头)和米非司酮(0.4mg/kg体重)。

第43天：第七周，星期二下午16：00pm进行人工输精。

第48天：第八周，星期一下午16：00pm(即第二次人工授精后第5天)对接受配种的牛只肌肉注射hcg(2000iu/头)。

第50天(即第二次人工输精后第7天)第二次用b-超进行妊娠诊断。

第90天(即第二次人工输精后第47天)第三次用b-超进行妊娠诊断，以再次判断母牛妊娠状况。对仍未妊娠的牛只，再次循环以上整个过程。

需要注意的是：

1.试验前做直肠检查，有生殖道疾病的牛(两侧子宫角大小不对称、子宫角较大、有炎症)不能用于试验。

2.每次人工授精之前，用酒精消毒输精抢，高锰酸钾消毒液(0.1mol/l)消毒外阴部分，人工授精人员确保手指甲剪短；切实掌握好输精技术，使用一次性输精枪套。

3.精液解冻时动作迅速，解冻温度为37.5摄氏度，显微镜检查精子活力，解冻后精子活力高于0.3。

4.严禁使用过期的激素；注射使用一次性注射器。

5.注意观察牛的发情、排卵情况，做好记录。

6.严格按方案执行。

上述的同期发情定时输精方案操作，因为考虑胚胎早期死亡的问题，首次妊娠诊断是通过观察牛只是否返情确定，为进一步提高诊断准确率，第二次妊娠诊断是在人工输精后第40天，利用b超再次确定牛只妊娠情况并记录。

上述利用本发明方案处理杂交水牛，母牛排卵率、受胎率和卵泡囊肿率分别为93.8％、43.8％和0。而利用传统的gpg同期发情方案处理杂交水牛，母牛排卵率、受胎率和卵泡囊肿率分别为84.6％、30.8％和3.8％。可见，本发明方法可显著降低卵泡囊肿率，提高杂交水牛排卵率和受胎率及发情率。而且，本发明操作比较方便，不需要进行发情鉴定，是一种程序化的同期发情定时输精方案，便于推广应用。