一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物及中药制剂的制作方法

本发明涉及缺血性脑中风康复治疗技术领域，尤其涉及一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物及中药制剂。

背景技术

脑中风(stroke)，又称中风或脑血管意外，是一种突发疾病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病。脑中风根据其发病特点可分为：出血性脑中风和缺血性脑中风。其中缺血性脑中风是指由于脑血管狭窄或闭塞，导致脑血流阻断而使脑组织发生缺血缺氧、软化甚至坏死，致使脑血管功能障碍，引起相关症状。缺血性脑中风包括缺血性脑中风、脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风、多发性缺血性脑中风和小中风。缺血性脑中风是脑血管疾病的主要类型，约85％的脑中风是缺血性的，缺血性脑中风存活的患者面临的最大的问题是再发作(五年内的平均复发率高达40％以上)和其他缺血性事件的发生。

缺血性脑中风是多病因引起易反复发作的慢性病，饮食等家庭护理康复措施会起到辅助药物治疗的作用，但没针对病因治疗的作用，所以对缺血性脑中风这种慢性病来说，最关键的康复方法就是科学的针对病因的用药防治，在改善缺血性脑中风症状的同时，降低缺血性脑中风的高复发率。目前治疗缺血性脑中风的中成药及西药类药物能够控制缓解病情的恶化发展，但对于缺血性脑中风的康复治疗效果并不理想。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物及中药制剂，该中药组合物及其中药制剂对于康复治疗缺血性脑中风具有良好的功效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物，包括以下重量份的原料：熊胆粉3～5份，冰片1～2份。

优选的，包括以下重量份的原料：熊胆粉4份，冰片1.5份。

优选的，所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的占熊胆粉干重的质量百分数≥23％。

优选的，所述冰片中龙脑占冰片干重的质量百分数≥55％。

本发明提供了上述方案所述的中药组合物在制备康复治疗缺血性脑中风药物中的应用。

优选的，所述缺血性脑中风包括局灶性脑梗死、暂时性缺血造成的脑损伤和缺血再灌注造成的脑损伤。

本发明提供了一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药制剂，包括熊胆粉冰片复合包合物和基质；所述熊胆粉冰片复合物包合物中熊胆粉和冰片的质量比为3～5:1～2；所述熊胆粉冰片复合物包合物中的包合材料为环糊精及其衍生物。

优选的，所述中药制剂的剂型为片剂、口服滴丸剂、舌下给药滴丸剂或滴鼻剂。

优选的，所述熊胆粉冰片复合包合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将蛋白酶与水混合均匀后，得到酶液，酶液再与熊胆粉混合，进行酶解处理，过滤得到混合液；

2)将步骤1)中所得混合液与环糊精混合，进行包合处理，得到熊胆粉包合物；

3)将冰片无水乙醇溶液滴加到羟丙基-β-环糊精的水溶液中，进行包合处理，再依次经过静置、过滤、干燥，得到冰片包合物；

4)将步骤2)得到的熊胆粉包合物和步骤3)得到的冰片包合物进行混合，得到熊胆粉冰片复合包合物；

步骤4)中所述熊胆粉包合物与冰片包合物的重量比为10:1～3:1。

优选的，步骤1)中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。

本发明的有益效果：本发明的中药组合物是在中医朝医理论指导下，结合临床实践设计而成，具有康复缺血性脑中风的功能。本发明针对缺血性脑中风发病机制，提供了所述具有息风止痉，开窍醒神之功效的中药组合物，可达到康复缺血性脑中风的疗效，发挥神经功能障碍恢复和改变脑组织病理学的作用，含有本发明所述中药组合物的中药制剂对缺血性脑中风治疗效果明显优于尼莫地平。

附图说明

图1实施例1中冰片x-射线衍射法物相鉴定结果；

图2实施例1中hp-β-cdx-射线衍射法物相鉴定结果；

图3实施例1中冰片与hp-β-cd的机械物理混合物x-射线衍射法物相鉴定结果；

图4实施例1中冰片包合物x-射线衍射法物相鉴定结果；

图5-1免疫蛋白印迹法对各组bcl-2基因的蛋白表达量进行测定的凝胶电泳图；

图5-2各组bcl-2基因的蛋白表达量的相对比值；

图6-1免疫蛋白印迹法对各组bax基因的蛋白表达量进行测定的凝胶电泳图；

图6-2各组bax基因的蛋白表达量的相对比值。

具体实施方式

本发明提供了一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物，包括以下重量份的原料：熊胆粉3～5份，冰片1～2份。

在本发明中，所述中药组合物包括熊胆粉3～5份，优选为4份；所述熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的占熊胆粉干重的质量百分数≥23％；所述牛磺熊去氧胆酸的干重含量的测定方法优选为高效液相色谱法。在本发明中，所述熊胆粉来源于市售；本发明对熊胆粉的粒度没有特殊要求。

在本发明的具体实施过程中，所述熊胆粉由延边熊场提供，规格为1g*5瓶。熊胆为脊椎动物熊科棕熊ursusarctoslinnaeus、黑熊selenarctosthinrtanuscucier的干燥胆汁。夏季猎取最宜，迅速取出胆囊，干燥。去净胆囊皮膜，研细用。现多以活熊导管引流的熊胆汁干燥后入药，称为“熊胆粉”。根据《新修本草》，熊胆苦，寒。归肝、胆、心经。具有清热解毒，息风止痉，清肝明目等功效。研究表明熊胆粉所含的熊去氧胆酸能够降低血液中胆固醇和甘油三酯，并具有很强的解痉作用。且其又具有促进受损细胞的新陈代谢，加快其更新作用，故熊胆粉有利于缺血性脑中风的康复治疗。

在本发明中，所述中药组合物包括冰片1～2份，优选为1.5份；所述冰片中龙脑占冰片干重的质量百分数≥55％；所述冰片中樟脑占冰片干重的质量百分数≤0.5％；所述龙脑的干重含量的测定方法优选为高效液相色谱法。在本发明中，所述冰片来源于市售。

冰片为龙脑香科植物龙脑香dryobalanopsaromaticagaertn.f.树脂加工品，或为龙脑香树的树干、树枝切碎，经蒸馏冷却而得的结晶，称“龙脑冰片”，亦称“梅片”。冰片药性辛、苦，微寒。归心、脾，肺经。具有开窍醒神，清热止痛的功效。且冰片又具有“引药上行，佐使之功”之功能。

在本发明中，所述熊胆粉为君药，注重其息风止痉之功效；所述冰片为臣药，辅佐君药熊胆粉共同发挥减轻由脑局部缺血产生的脑损伤。此外，冰片在本发明中还作为吸收促进剂，使本发明所述中药组合物能透过血脑屏障到达脑缺血梗死部位发挥治疗效果。

本发明提供了上述方案所述的中药组合物在制备康复治疗缺血性脑中风药物中的应用；所述缺血性脑中风包括局灶性脑梗死、暂时性缺血造成的脑损伤和缺血再灌注造成的脑损伤。

本发明提供了一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药制剂，包括熊胆粉冰片复合包合物和基质；所述熊胆粉冰片复合物包合物中熊胆粉和冰片的质量比为3～5:1～2，优选为4:1.5；所述熊胆粉冰片复合物包合物中的包合材料为环糊精及其衍生物；所述环糊精及其衍生物包括但不限于β-环糊精(β-cd)、羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd)和甲基-β-环糊精(m-β-cd)中的一种或多种；所述中药制剂的剂型为滴丸剂，所述滴丸剂优选为口服滴丸剂、舌下给药滴丸剂，更优选舌下给药滴丸剂；所述舌下给药滴丸剂能够达到迅速起效的作用；所述熊胆粉冰片复合包合物易溶于水且无强烈不良气味。

在本发明优选的技术方案中，当所述中药制剂为舌下给药滴丸剂时，能够通过舌下含服给药途径，不经胃肠道吸收能避开首过效应，具有药效发挥快的优点。

在本发明中，当所述中药制剂的剂型为滴丸剂时，所述基质优选的包括peg4000、peg6000和plx188中的一种或几种，更优选包括peg4000、peg6000和plx188中的两种，其中，peg4000或peg6000与plx188混合的质量比优选为4：1～1：3，更优选为3：1～1：2，最优选为2：1～1：1；peg4000和peg600混合的质量比优选为4：1～1：1，更优选为3：1～2：1，最优选为2.5：1。

本发明中，所述滴丸剂的制备方法包括以下步骤：

i将熔融状态的基质与熊胆粉冰片包合物复合物进行搅拌混合均匀，得到基质药物混合物；

ii对步骤i中的基质药物混合物进行超声脱气处理，得到滴丸原料；

iii将步骤ii中的滴丸原料滴入冷凝剂中进行滴制操作，得到初级滴丸；

iv对步骤iii中的初级滴丸依次经离心、干燥，得到滴丸剂。

在本发明中，将熔融状态的基质与熊胆粉冰片包合物复合物进行搅拌混合均匀，得到基质药物混合物；所述基质和熊胆粉冰片包合物复合物的质量比优选为2：1～3：1，更优选为2.5:1；所述搅拌混合的温度优选为60～80℃，更优选为70℃；所述搅拌混合的时间优选为15～25min，更优选为20min；本发明对搅拌混合的转速没有特殊限制。

本发明在获得基质药物混合物后，对基质药物混合物进行超声脱气处理，后得到滴丸原料；所述超声脱气处理的频率优选为24～32khz，更优选为28khz；所述超声脱气处理的时间优选为30～60min，更优选为40～50min；所述超声脱气处理的设备优选为超声波清洗机。

本发明中，所述超声脱气处理的作用是除去混合时药物与基质混合中的气泡，便于后面的滴制操作。

本发明在获得滴丸原料后，将滴丸原料滴入冷凝剂中进行滴制操作，得到初级滴丸；所述冷凝剂优选为液体石蜡或二甲硅油；所述滴制处理的滴速优选为40～60滴/min，更优选为50滴/min；所述滴制处理的温度优选为65～75℃，更优选为70℃；所述滴制处理的滴距优选为9～11cm，更优选为10cm。

本发明在获得初级滴丸后，对初级滴丸依次经离心、筛选、干燥，得到滴丸剂；所述离心的转速优选为1000～1300r·min^-1，更优选为1200r·min^-1；所述离心的设备优选为卧式离心机；所述干燥的方式优选为转笼热风干燥；所述干燥的时间优选为10～14h，更优选为12h；所述转笼转速优选为20～40r/min，更优选为30r/min；所述干燥的温度优选为30℃～50℃，更优选为40℃。

本发明中，所述离心的作用是甩去滴丸表明多余的冷凝剂；所述筛选的作用是选出丸型良好的滴丸；所述干燥的作用是定型。

在本发明中，由于熊胆粉具有腥臭，和味苦等不良性状，且冰片也具有易挥发，极不易溶于水等不良性状。故为改善熊胆粉和冰片的这些不良性状，使用环糊精及其衍生物将熊胆粉和冰片制备成熊胆粉冰片复合包合物。

本发明提供了上述方案所述熊胆粉冰片复合包合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将蛋白酶与水混合均匀后，得到酶液，酶液再与熊胆粉混合，进行酶解处理，过滤得到混合液；

2)将步骤1)中所述混合液与环糊精搅拌混合，进行包合处理，得到熊胆粉包合物；

3)将冰片无水乙醇溶液滴加到羟丙基-β-环糊精水溶液中，搅拌进行包合处理，再依次经过静置、过滤、干燥，得到冰片包合物；

4)将步骤2)得到的熊胆粉包合物和步骤3)得到的冰片包合物进行混合，得到熊胆粉冰片复合包合物。

本发明中，将蛋白酶与水混合均匀后，得到酶液，酶液再与熊胆粉混合，进行酶解处理，过滤得到混合液；所述蛋白酶与水的质量体积百分比优选为0.1％～0.3％，更优选为0.2％；所述熊胆粉的酶液的质量体积比优选为0.1～0.3g/500ml，更优选为0.2g/500ml；所述蛋白酶为木瓜蛋白酶或胰蛋白酶；所述酶解处理的时间优选为10～14h，更优选为12h；所述酶解处理的时间优选为16～25℃，更优选为20℃；所述过滤的方式优选为滤膜过滤；所述滤膜的孔径大小优选为6～10μm。在本发明中，上述过程在室温下进行。

本发明中，所述酶解处理的作用是水解熊胆粉中的蛋白质，以去除熊胆粉的腥臭味道。

本发明在得到混合液后，将混合液与环糊精搅拌混合，进行包合处理，得到熊胆粉包合物；所述环糊精与混合液的质量体积比优选为16～20mg/500ml，更优选为18～19mg/500ml；所述搅拌混合的转速优选为800～1600rmp，更优选为1200rmp；所述搅拌混合的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述搅拌混合的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃，最优选为60℃；所述搅拌混合的设备优选为磁力搅拌器。

本发明中，将冰片无水乙醇溶液滴加到羟丙基-β-环糊精水溶液中，搅拌进行包合处理，再依次经过静置、过滤、干燥，得到冰片包合物；所述冰片无水乙醇溶液中的冰片浓度优选为0.1～0.3g/ml，更优选为0.2g/ml；所述羟丙基-β-环糊精水溶液中羟丙基-β-环糊精的浓度优选为1.2～1.8g/70ml，更优选为1.5g/70ml；所述冰片无水乙醇溶液与羟丙基-β-环糊精水溶液的体积比为0.5～1.5:70，更优选为1:70；所述搅拌混合的温度优选为40～80℃，更优选为50～70℃，最优选为60℃；所述搅拌混合的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h；所述搅拌混合的转速优选为800～1600rmp，更优选为1200rmp；所述静置的温度优选为16～26℃，最优选为20℃；所述静置的时间优选为22～26h，更优选为24h；所述过滤的方式优选为垂融漏斗过滤；所述干燥的方式优选为冷冻干燥。

本发明在获得冰片包合物后，对冰片包合物进行物相鉴定，以表征冰片已被包合于环糊精内部；所述物相鉴定的方法优选为x-射线衍射法；所述利用x-射线衍射的测试条件优选为辐射：cukd；滤波：石墨单色器；高压：40kv；管流100ma；扫速：8°/min。

本发明在获得熊胆粉包合物和冰片包合物后，将熊胆粉包合物和冰片包合物进行混合，得到熊胆粉冰片复合包合物；所述熊胆粉包合物与冰片包合物的重量比为10：1～3：1。

在本发明获得熊胆粉冰片复合包合物后，对熊胆粉冰片复合包合物进行物相鉴定；所述物相鉴定方法包括x-射线衍射法、红外光谱法、紫外分光光度法、热分析法。

下面结合实施例对本发明提供的一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物及中药制剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一种熊胆粉冰片复合包合物的制备(熊胆粉和冰片分别进行包合)

1、熊胆粉包合物的制备：称取0.2g熊胆粉，用木瓜蛋白酶处理12小时后，加入超纯水500ml，待其完全溶解后将其均分为10等份。放置于磁力搅拌器上，包合温度为60℃，以1200rmp转速搅拌，边搅拌便加入18mg环糊精，搅拌2h。搅拌完成后，收集包合后的熊胆粉。

2、冰片包合物的制备：称取冰片0.2g，加无水乙醇1ml使其溶解，于磁力搅拌条件下缓慢滴加到质量体积浓度为0.02g/ml的hp-β-cd水溶液中，于60℃条件下继续搅拌1h，包合液室温放置24h。使用垂融漏斗滤过，滤液冷冻干燥得固体包合物。

3、采用了x-射线衍射法对制备所得包合物进行物相鉴定，用以表征冰片已被包合于环糊精内部。将冰片、hp-β-cd、冰片与hp-β-cd的机械物理混合物、以及步骤2得到的冰片包合物进行x线衍射。测试条件为辐射：cukd，滤波：石墨单色器，高压：40kv，管流100ma，扫速：8°/min。结果见图1～4。结果表明，冰片有特异的尖锐晶体衍射峰；hp-β-cd无明显晶体衍射峰；将二者进行机械混合后，二者的衍射峰叠加，由于受hp-β-cd量的影响，冰片的衍射峰下降，但特征峰没有发生改变；冰片包合物的衍射峰小于同比例机械物理混合物冰片的衍射峰，而且峰位发生了改变，这就表明冰片包合物中的冰片的晶型特征发生改变，与环糊精发生相互作用，形成新的物相，冰片已被环糊精包合于其中。

4、将制备好的熊胆粉和冰片包合物，按重量比10：3的比例进行混合，即得熊胆粉冰片复合包合物。

实施例2一种用于缺血性脑中风康复治疗的中药滴丸剂的制备过程

1、配料阶段：称取混合基质(peg4000：plx188＝4：3)400g、熊胆粉冰片包合物复合物按200g，将称量好的基质70℃加热至熔融状态，将熊胆粉冰片包合物复合物分散于混合基质中，搅拌20min，分散均匀。

2、准备阶段：将分散均匀的基质药物混合物，进行超声脱气处理，得到滴丸原料；

3、脱气完成后，使用滴管将滴丸原料滴加到液体石蜡中进行滴制操作，滴速为50滴/min，滴制温度为70℃，滴距为10cm。

4、干燥收集阶段：将滴制好的初级滴丸，进行离心操作甩去多余的冷凝剂，擦丸后进行干燥，筛选出丸型良好的滴丸，即得滴丸剂。

按照《药典》对滴丸丸重、圆整度、溶散时限、溶出度、硬度进行检查，均符合规定。

实施例3熊胆粉冰片组合物作用机制研究

为明确熊胆粉冰片组合物(此处组合物为二者简单混合的组合物，是按照包合物中熊胆粉与冰片的质量比进行混合)用于缺血性脑中风康复治疗的作用机制，做了相关的细胞实验。细胞实验选用的细胞有人神经母细胞瘤细胞株和pc12细胞作为实验细胞。人神经母细胞瘤细胞的细胞模型为缺氧缺糖再给氧损伤模型。

1、模型建立：

种板培养24h后，各孔弃去培养液，用无糖earle’s液(氯化钠143mmol/l、氯化钾5.4mmol/l、氯化钙1.8mmol/l、硫酸镁1.0mmol/l、磷酸二氢钠1.0mmol/l、n-2羟乙基哌嗪-n’-2磺酸乙烷2.4mmol/l，ph7.4)轻洗2次，正常对照孔加入无血清的dmem培养液；模型孔加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0mmol/l的earle’s液，体积分数为5％的二氧化碳培养箱37℃孵育6h，取出培养板，吸弃各孔液体，各孔用无糖earle’s液洗细胞2次，换无血清dmem培养液，继续培养12h，造成细胞缺氧缺糖再给氧损伤模型。

2、实验分组：

随机分为正常培养对照组，缺氧缺糖再给药组，熊胆粉给药组(熊胆粉浓度为1.70g/l)，冰片给药组(冰片浓度为1.70g/l)，熊胆粉冰片组合物给药组(熊胆粉浓度为1.7g/l+冰片浓度为0.17g/l)。药物于缺氧缺糖和再给氧处理时加入含连二亚硫酸钠1.0mmol/l的无糖earle’s液和含血清的dmem培养液中，其余同缺氧缺糖再给氧组。

3主要观察指标：①细胞死亡率；②乳酸脱氢酶；③细胞存活率；④细胞坏死率和凋亡率；⑤bcl-2和bax的表达量。

4统计学分析：采用spss19.0软件进行统计学分析，以方差分析法进行组间均数比较。

5各指标检查方法和结果：

5.1用锥虫蓝染色计数法测定细胞死亡率，实验结果见表1。结果表明：给药组细胞死亡率明显低于对照组，且当冰片和熊胆粉合用时，细胞死亡率明显低于其他组。且结果具有统计学差异，因此这证实二者联用比单用的抑制细胞死亡的效果更好。

表1各组细胞死亡率的比较

5.2采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶漏出率，收集培养板上清液于对应编号的试管中，培养板加入无血清dmem培养基1ml，分别置于-86℃低温冰箱保存。需测定时取出，将孔内细胞进行反复冻融2～3次。目的在于使细胞破裂，混匀后以3000r/min的转速离心5min后，按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书进行操作。测定波长为340nm，以该波长处测定的每分钟平均吸光度变化值，计算上清液和相应胞浆中乳酸脱氢酶活性。

测定乳酸脱氢酶漏出率的原因在于缺血和缺血再灌注性脑损伤是急性脑血管疾病的共同病理环节，缺氧缺糖再给氧损伤模型就是在体外模拟了这一情况。正常情况下，脑内只有少量的糖原存在，一旦脑组织缺血失去了葡萄糖供应，脑内糖原迅速耗竭，引起缺氧缺糖状态，代谢紊乱，毒性产物积聚(如乳酸等)，就会导致脑组织神经细胞严重损伤。乳酸脱氢酶的泄露则可用来表征这一情况。乳酸脱氢酶漏出率计算公式如下：乳酸脱氢酶漏出率(％)＝上清液乳酸脱氢酶活性/(上清液乳酸脱氢酶活性+胞浆乳酸脱氢酶活性)*100％。

实验结果见表2，结果表明，缺氧缺糖再给氧组，乳酸脱氢酶的漏出率最高。同时给药组的乳酸脱氢酶漏出率明显低于缺氧缺糖再给氧组，组合组乳酸脱氢酶漏出率最低，熊胆粉单用组其次，冰片单用组次之。

表2各组细胞乳酸脱氢酶漏出率的比较

5.3使用mtt法测细胞存活率，具体方法可参考文献进行，其中实验结果见表3，结果表明：联合给药组细胞存活率最高。

表3各组细存活率的比较

5.4hoechst33342和碘化丙啶原味双染法检测细胞坏死率和凋亡率。

在使用这两种方法检测时，用荧光显微镜对细胞进行观察，可发现正常细胞显蓝色荧光，染色质均匀分布；凋亡细胞虽也显示出蓝色荧光，但染色质凝集，核皱缩、破裂；而坏死细胞则显示蓝色荧光。

实验结果见表4，结果表明：正常组只能见到极少数细胞出现凋亡和坏死的现象，模型组则可观察到大量的凋亡细胞和坏死细胞。而给药组可观察到熊胆粉给药组和熊胆粉冰片联合给药组的细胞凋亡率和坏死率明显低于模型组。

表4各组细胞坏死率和细胞凋亡率的比较

5.5前面四个过程的结果显示，熊胆粉冰片组合物可以明显降低神经细胞缺氧缺糖再给氧损伤时的细胞坏死率、凋亡率，显著提高其细胞存活率，以及降低乳酸脱氢酶的漏出。为进一步阐明熊胆粉冰片复合物用于缺血性脑卒中康复治疗的作用机制，使用与之前相同的缺氧缺糖再给氧细胞模型。

将细胞随机分为：第1组(正常培养对照组)、第2组(正常组+给药组)、第3组(缺氧缺糖再给氧组)、第4组(缺氧缺糖再给氧组+给药组)。本过程给药组给药与熊胆粉冰片组合物给药组相同，即给药溶液中熊胆粉浓度为1.7g/l冰片浓度为0.17g/l。对各组细胞凋亡因子bcl-2和bax的表达进行测定，目的在于从分子水平上阐明其作用机制。bcl-2是b淋巴细胞瘤-2的简称。

研究表明，该基因具有抑制细胞凋亡的作用，它可以抑制由多种细胞毒素所引起的细胞死亡。而bax为细胞凋亡诱导因子，其作用与bcl-2相反。采用westernblot技术对各组相应基因的蛋白表达量进行测定，实验结果见图5-1、图5-2、图6-1、图6-2

其中图5-1为westernblot技术对各组bcl-2基因的蛋白表达量进行测定的凝胶电泳图；图5-2为各组bcl-2基因的蛋白表达量的相对比值(与正常组相比**p<0.01,与缺氧组比较**p<0.01)；图6-1为westernblot技术对各组bax基因的蛋白表达量进行测定的凝胶电泳图；图6-2为各组bax基因的蛋白表达量的相对比值(与正常组相比**p<0.01,与缺氧组比较**p<0.01)。结果表明，给药后bcl-2的蛋白表达量增加。这个结果也印证了熊胆粉冰片联合给药组细胞存活率最高的结果。

综合以上所有结果，可得熊胆粉冰片组合物通过干预神经细胞凋亡过程阻止脑组织在发生缺血性脑中风后的进一步损伤的发生而发挥对神经元损伤的保护作用。

实施例4对实施例2中的中药滴丸的主要药效学进行考察

本发明采用尾静脉注射和腹腔注射来进行给药。动物模型为：大鼠右侧大脑中动脉栓塞缺血模型。实验动物为：sd雄性健康成年大鼠。

1、造模方法：

大鼠经10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35ml·100g^-1)，大鼠麻醉成功后仰卧位固定，颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，颈总动脉近心端和颈内动脉搭一根尼龙线系活扣，颈外动脉近心端和远心端分别用一根尼龙线结扎，两根结扎尼龙线之间间距0.5cm。颈总动脉动脉夹加闭后，在颈外动脉上两根结扎的尼龙线之间剪短，后将颈外动脉近心端下翻，与境内动脉成一天直线，从颈外动脉减一个小口，插入线栓，插入长度约为(20.0±0.5)mm时感到有轻微阻力时停止，在颈内动脉处扎紧尼龙线并固定线栓，并扎紧颈总动脉近心端尼龙线，取下动脉夹，缝合皮肤。术后常规护理。待实验动物清醒后，进行zea-longa神经功能评分，神经功能评分标准为:a.无神经功能损伤症状，动物正常活动，进食评0分；b.将动物尾巴提起后，左前肢屈曲1分；c.将动物放置平板上，向左侧转圈2分；d.将动物放置平板上，用手轻推向左侧倾倒3分；e.动物左侧偏瘫，不能自发行走意识朦胧或丧失4分。评分大于或等于2分，则表明模型成功，低于2分则予以去除。

2、分组和给药：

造模成功的实验动物，根据神经功能评分分层随机分为5组，分别为正常对照组(蒸馏水)、假手术组(蒸馏水)、模型组(蒸馏水)、尼莫地平组(尼莫地平研碎蒸馏水溶解，按照临床用量人大鼠体表面折算给药剂量为32.4mg/kg，配制成药物浓度为3.24mg/ml的蒸馏水溶液)、熊胆粉冰片滴丸组(将滴丸蒸馏水溶解，按照临床用量人大鼠体表面折算给药剂量为27mg/kg，配制成药物浓度为2.7mg/ml的蒸馏水溶液)。

以1ml/100g从术后第1天开始给药，以1ml·100g^-1体重体积灌胃给药，每天1次，连续尾静脉给药7d。于术后第1、2、3、5、7天进行narrow-alleycornertest行为学测试。narrow-alleycornertest是被国外学者广泛使用的2种神经行为学实验，主要用以检测大鼠“不对称感觉运动功能障碍”。不对称分值＝(向右侧作站立转身的次数/总的站立转身的次数)×100％，正常基线为50％，分值越高，反映损伤越严重。

3取材及标本制作：

术后第8天每组随机取6只，10％水合氯醛深度麻醉(0.35ml·100g^-1)，迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，快速注入100ml生理盐水冲洗后，再以体积分数为4％的多聚甲醛(ph值调成7.0左右)灌注固定后断头取脑。取得的脑组织入4℃4％多聚甲醛固定液中固定过夜，经过固定、脱水、透明、石蜡包埋处理，连续冠状切片，切片厚度为5μm。

4统计学处理：

实验数据以平均标准差表示，采用spss软件作统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05为有统计学意义。

5测定指标及方法：

①大鼠神经行为学，主要参照前面提到的narrow-alleycornertest行为学测试法。结果表明，正常对照组和假手术组大鼠没有神经学功能缺损症状，模型组、尼莫地平组、熊胆粉冰片滴丸组大鼠神经缺损症状表现明显，与正常对照组和假手术组由显著统计学差异，但会随着缺血时间的延长而逐渐自行恢复，而熊胆粉冰片滴丸组和尼莫地平组大鼠神经学缺损症状的恢复速度快于模型组，与模型组有差异。其中熊胆粉冰片给药组的恢复速度又快于尼莫地平组，且差异有显著统计学意义。

②tunel法测定细胞凋亡，组织切片，常规脱蜡，抗原修复后用0.3％h2o2封闭内源性过氧化物酶活性，滴加tunel反应混合溶液，37℃避光孵育60min，滴加转化剂，37℃孵育30min，dab显色、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。阴性对照不加tdt。首先在40倍光镜下定位缺血侧缺血半暗带额顶叶皮层，每组6只，每只动物取5张相同部位脑片，后在400倍光镜下选取5个相邻视野对阳性神经(胞浆呈棕黄色颗粒)进行观察，采用image-proplus5.0软件计数阳性细胞数。正常对照组和假手术组未见明显凋亡细胞。模型组大鼠缺血半暗带皮层可见大量凋亡细胞。与模型组进行比较，尼莫地平组和熊胆粉冰片组合物给药组给药干预后其凋亡细胞数显著降低，具有明显的抑制细胞凋亡的作用。

③脑梗死面积及病理检查，取模型成功的大鼠脑组织切片，切片置于2％红四氮唑溶液中，37℃水浴30分钟，取出，测定脑梗死面积；其余脑片放入多聚甲醛中固定，做病理学检查，光镜下观察。得各组脑梗塞面积。结果表明，尼莫地平组和熊胆粉冰片组合物给药组的脑梗塞面积与模型组比较有一定的缩小，神经元坏死改变有所减轻。

由以上实施例可知，本发明中的用于缺血性脑中风康复治疗的中药组合物及其中药制剂在缺血性脑中风的康复治疗中，能够发挥神经功能障碍恢复和改变脑组织病理学的作用，且中药制剂的治疗效果优于尼莫地平。这表明本发明中的中药制剂能用于缺血性中风康复治疗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。