NBC1的N-氰基硫化酰胺抑制剂S0859的制药用途的制作方法

本发明涉及钠碳酸氢根离子转运体(nbc1)的n-氰基硫化酰胺抑制剂s0859的新用途，特别涉及s0859的制药用途。

背景技术：

心肌梗死是引起心力衰竭并最终导致患者死亡的最常见病因。心肌梗死发生后体内神经、体液发生一系列的变化来维系细胞内达到新的稳态。这些变化包括心脏利用能量的改变、心肌细胞内酸碱平衡的改变。细胞缺氧后体内糖酵解功能增加，细胞内酸性代谢物堆积，ph下调，在心肌缺血等病理状态下，心肌细胞内外的ph值下降，激活nhe、nbc1等离子通道，排出h⁺或转运hco3^-进入细胞，从而调节了细胞ph值。有研究表明，心衰时心肌nbc1的表达升高，提示在病理状态下心肌细胞排h⁺能力增强。有实验通过脉冲式予nh4⁺的方法，中和含hco3^-的细胞缓冲液，造成细胞内外的酸性环境，可使病理状态下心肌细胞nbc1的活性增强，机体通过排酸保碱的方式维持体内酸碱平衡。

细胞收缩是由细胞膜外钙离子通过l型钙通道等离子进入细胞，达到阈值后引起肌浆网内钙离子通过ryr2受体大量释放到胞浆中引起细胞收缩，收缩完成后，钙离子通过肌浆网上的钙-atp酶(serca)重回收至肌浆网中。当胞浆钙离子负载时会影响ryr2受体，减少钙离子释放，降低细胞收缩力；同时钙离子负载也可以影响肌浆网serca将钙离子重吸收回肌浆网功能，影响细胞舒张功能。

既往研究报道，抑制细胞内钠-氢离子交换体(nhe)，可以改善细胞缺氧损伤后心室重构。在细胞缺氧损伤时，细胞内钠-氢离子交换增加，过多的钠离子被交换到细胞内，可以启动钠-钙交换体，引起细胞内钙离子超载，钙离子超载可因上述机制引起心脏收缩功能障碍。nhe抑制剂cariporide和阿米洛利衍生物等在动物心肌缺血再灌注模型中发挥心脏保护作用。因此，抑制nhe是一种改善心脏损伤后心室重构的方法，nbc1和nhe在细胞内病理性刺激的情况下占同等重要的作用，因此，理论上来说抑制nbc1同样能够减轻钙离子超载，改善心脏损伤后心室重构。

nbc1有三种类型，广泛存在生物体内，在心脏、肾脏、骨骼肌等器官有表达，在心脏中至少存在两种，分别是nbce1(nbc1)和nbce2(nbc4)，nbce1是由scl4a4编码。还有一种电中性的钠-碳酸氢根离子交换体nbcn1，是由scl4a7基因编码。

s0859是一种nbc1的n-氰基硫化酰胺抑制剂，其化学式为：c29h24cln3o3s，是一种可逆性nbc1抑制剂，能够可逆的抑制nbc1调节细胞ph值恢复，s0859抑制nbc1的活性并不依赖碳酸酐酶的作用，且s0859对nhe无影响。既往有文献报道大鼠心脏离体接受缺血40分钟再灌注1小时刺激能激活nbce1引起钠-钙离子负载，再灌注前10分钟给予nbce1的细胞外茎环3拮抗剂及n-氰基硫化酰胺s0859抑制剂能够降低梗死面积，并且使用细胞外茎环3抑制剂能够改善心功能，而使用s0859并无此效果。s0859在心梗中是否发挥作用并且是否能调节细胞内钠钙离子平衡目前尚无报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供钠碳酸氢根离子转运体(nbc1)的n-氰基硫化酰胺抑制剂s0859的新用途。

本发明提供了钠碳酸氢根离子转运体(nbc1)的n-氰基硫化酰胺抑制剂s0859用于制备治疗心力衰竭的药物的用途。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述治疗心力衰竭的药物是治疗心梗引起的心力衰竭及心室重构的药物。

根据本发明所述的用途的进一步特征，所述的药物包括：治疗上有效剂量的化合物lb2g，以及药学上可接受的辅料。

本发明通过在体过表达nbc1小鼠上制作心梗模型，证明了过表达nbc1对心梗后小鼠死亡率及心功能有不利的影响，发明人进一步在分离的成年鼠心脏中检测了缺氧损伤后细胞内的钙离子超载现象，并证明了抑制剂s0859具有调节心肌梗死后细胞内钙离子稳态，改善心室重构的作用，能够抑制细胞内钙超载，从而抑制心室重构。因此，本发明能提供一种治疗心力衰竭的新药物，能有效延缓心梗引起的心力衰竭及心室重构，nbc1也有望成为一个治疗心衰的新靶点。

附图说明

图1是过表达nbc1组及野生型组小鼠心梗后的生存分析图。

图2是过表达nbc1组及野生型组小鼠心梗1天后的梗死面积、心脏功能、血流动力学指标的结果图。

图3是过表达nbc组及野生型组小鼠心梗6周的心脏功能、血流动力学结果图。

图4是过表达nbc1增加缺氧引起的心肌细胞钙超载的结果图。

具体实施方式

下面以具体实施例结合附图的方式对本发明做详细的说明。

1.实验目的

在体观察过表达nbc1对小鼠心梗后心脏功能、血流动力学及梗死面积的影响；离体观察成年鼠心肌细胞缺氧损伤后钙离子动力学的变化。

2.实验材料

nbc1的n-氰基硫化酰胺抑制剂s0859，购自美国西格玛奥德里奇公司，是一类选择性高亲和力nbc1抑制剂，但其对钠-氢离子交换体没有影响。

3.实验动物

心脏特异性nbc1过表达小鼠。发明人制作了一个包含人nbc1(slc4a4)的开放阅读框片段，该片段两侧都有sali，该片段插入到α-myhc克隆26载体的sali位置，连接小鼠α-myosin重链启动子，然后将包括α-myhc启动子和nbc1开放阅读框在内的整个9.3千碱基对片段从质粒序列中去除，并微注射到小鼠受精卵中。用pcr验证心脏特异性过表达小鼠的成功，从其中选择一种心脏特异性过表达nbc1最成功的小鼠来繁殖，用于本实验研究，该小鼠纯合子后面简称nbc1过表达小鼠(tg)，野生型简称wildtype小鼠(wt)。发明人比较了相同周龄tg组与wt组小鼠心功能、血流动力学及形态学没有明显差异。

4.实验方法

(1)小鼠心梗模型的建立

选取8到10周tg及wt小鼠，使用甲苯噻嗪(5mg/kg)及克他明(100mg/kg)联合腹腔注射麻醉小鼠，取仰卧位固定于实验台上。用pe-50或pe-90器官导管给小鼠插管，使用小动物呼吸机给小鼠通气。于小鼠第3或第4肋间开胸暴露心脏，使用9-0线结扎位于左心耳下2-3毫米的左冠状动脉，用心电图st段抬高来判断心梗模型制作成功。小鼠心梗模型制作成功后每天观察小鼠的状态，记录死亡的小鼠及存活的天数。

(2)心脏超声

制作心梗模型1天及6周小鼠，异氟烷麻醉后固定在操作台上，使用sonos5500及15-6兆赫兹探头对小鼠进行m型超声检测，计算出左室后壁厚度、左室收缩/舒张末期内径，根据这些值计算出左室射血分数及左室短轴缩短率。

(3)左室血流动力学

小鼠麻醉后固定于操作台。使用米勒导管经右侧颈动脉插到左心室测量左室压(lvsp)及左室舒张末压(lvedp)，通过测量压力软件模块得到左室压力最大上升速率及最大下降速率±dp/dtmax、收缩指数(contractilityindex)等参数值。

(4)成年小鼠心室肌细胞分离

8到10周的c57bl/6小鼠腹腔注射肝素钠肝素化并麻醉后，快速取出心脏挂在灌注针上并固定，然后用灌注液开始灌注3分钟左右，灌注液成分如下：130mmnacl,5mmkcl,1mmmgcl2,10mmhepes,0.5mmnah2po4,10mmglucose,10mm2,3-butaneodionemonoxime,10mmtaurine,ph7.4。接着灌注胶原酶(0.3mg/gcollagenased,0.4mg/gbodyweightcollagenaseb,0.05mg/gbodyweightproteasetypexiv)灌注约10分钟，快速取下心脏用尖蹑撕碎，过滤并梯度恢复钙离子。

(5)钙离子动力学

采用fluo-4am(5μm)孵育成年鼠心肌细胞半小时，灌注液洗3次，在倒置激光共聚焦显微镜下以488激发光，采用xyt模式行线扫描，线扫描速度为：4.92ms/线，每次扫描3000线。获得的线扫描图像使用idl软件进行分析得出钙瞬变(△f/f0)、钙瞬变上升期时间tpeak及衰减期时间常数τd,肌节缩短率及细胞内静息期钙离子。

使用激光共聚焦显微镜录下心肌细胞收缩及舒张期视频，使用imagej软件计算心肌细胞收缩及舒张期长度，计算心肌细胞肌节缩短率(ss)公式为：

ss＝(舒张期长度-收缩期长度)/舒张期长度。

(6)观察指标

心梗6周两组小鼠的生存率、心梗1天及6周两组小鼠的心功能、血流动力学、心梗1天的梗死面积及6周纤维化面积、心肌细胞钙瞬变、肌节缩短率、钙瞬变上升期时间(达峰时间)及衰减期时间常数。

5.实验结果

(1)生存分析

心梗6周，tg组小鼠生存率较wt组显著降低，表明过表达nbc1增加心梗小鼠死亡率(图1)。如图1所示，过表达nbc1及野生型小鼠分别制作心梗模型，造模后每天观察小鼠存活，结果显示过表达nbc1小鼠心梗后比野生组死亡率明显增多(p<0.05)。

(2)心功能及血流动力学

心梗后1天，处死小鼠前先行超声及导管检测心脏功能及左室血流动力学。过表达nbc1组及野生型组小鼠心梗1天后，观察两组梗死面积、心脏功能、血流动力学指标，结果如图2所示。a图中，两组ttc染色显示梗死面积，过表达nbc1组的梗死面积比野生型组的梗死面积大，表明过表达nbc1增大梗死面积并使左室内径扩大。b图中，过表达nbc1组小鼠的左室收缩(lveds)、舒张末期内径(lvedd)均比野生型组(wt组)的lvedd、lvesd大；c图中，过表达nbc1组的左室射血分数(lvef)及左室短轴缩短率(lvfs)比野生型组的lvef及lvfs显著降低；d图中，nbc1过表达组的dp/dtmax及收缩指数比野生型组的dp/dtmax及收缩指数低(*p<0.05)，表明过表达nbc1降低左室收缩功能。

心梗后6周，测定±dp/dtmax(图3的a图)、收缩指数、指数松弛时间常数(图3的b图)。结果如图3所示，过表达nbc1组心梗后6周的±dp/dtmax及收缩指数和松弛时间常数比野生型组小鼠低(*p<0.05)，表明过表达nbc1影响心梗后6周心脏收缩功能。

(3)钙离子动力学

在分离的成年小鼠心室肌细胞中，检测各组(对照组、对照+缺氧组、对照+缺氧+s0859组、对照病毒组、对照病毒+缺氧组、对照病毒+缺氧+s0859组、过表达nbc1组，过表达nbc1+缺氧组、过表达nbc1+缺氧+s0859组)钙离子动力学参数。

结果如图4所示，过表达nbc1降低钙瞬变(a小图)，减小肌节缩短率(图b)，缺氧进一步减小肌节缩短率并降低钙瞬变(a，b小图)；缺氧延长钙瞬变上升期时间(tpeak)(c小图)及延长衰减期时间常数τd(d小图)，过表达nbc1增加tpeak的延长而对τd无影响；过表达nbc1及缺氧增加细胞内钙离子负载(图e)，缺氧进一步恶化过表达nbc1引起的钙超载(e小图)；同时使用nbc1抑制剂s0859预刺激后，上述指标都有所改善(a、b、c、d小图)。与相应的常氧组相比，*p<0.05；和缺氧组相比，#p<0.05；与ad-gfp+缺氧组相比，ξp<0.05。因此，缺氧引起的钙瞬变降低及肌节缩短率的降低能够被nbc1抑制剂s0859拮抗；使用nbc1抑制剂s0859同样可以抑制tpeak及τd的改变；使用nbc1抑制剂s0859同样可以部分减轻细胞内钙超载。

研究结论：过表达nbc1能够恶化心梗后小鼠心脏功能，增加梗死小鼠死亡率，这些作用和心肌细胞内钙离子超载有关，s0859能够改善缺氧心肌细胞钙离子超载，从而抑制心室重构。

综上所述，本发明涉及的实验分为在体及离体两部分。在体实验部分采用nbc1过表达小鼠，结扎冠状动脉制作心梗模型，比较过表达nbc1组与野生型组之间的生存分析、心脏功能、血流动力学及纤维化等指标。离体实验使用langendorff离体心脏灌流方法分离成年小鼠心室肌细胞并培养，并使用腺病毒体外过表达nbc1，予各组细胞缺氧损伤，并给予nbc1抑制剂s0859刺激，观测各组钙离子动力学参数，包括钙瞬变、肌节缩短率、钙瞬变上升期时间及衰减期时间常数及静息期细胞内钙离子含量。实验结果表明，nbc1抑制剂s0859能平衡心梗引起的钙离子超载及改善心室重构，对于心梗引起的心室重构具有减轻细胞内钙离子超载及延缓心室重构的作用。