树番茄萃取物用于降低蓝光所致视网膜损伤的用途的制作方法

本发明是关于一种树番茄萃取物的用途，特别是关于树番茄萃取物用于降低蓝光所致视网膜损伤的用途。

背景技术：

在视觉形成的过程中，光线会通过眼睛中透明的角膜及水晶体，并聚焦在视网膜上形成影像，接着视网膜中的感光细胞会将光刺激转换成电讯号，并经由视神经将该电讯号传递至大脑视觉区，于该处神经细胞的讯号处理下形成视觉。

类眼睛可感受到的光线称为可见光，其波长范围为390～700nm，其中波长主峰在425～475nm的蓝光，为可见光中能量最强的光，且无法被角膜与水晶体吸收而可直达视网膜，会破坏视网膜细胞内分子的结构，可能导致视网膜细胞损伤甚至凋亡，且长期于高能量的蓝光的刺激下，亦可能会使代谢物沉积在组织中，或长出微血管修补受损组织，进而产生缺氧性的血管不正常新生，并造成如黄斑部病变等相关眼睛疾病，严重可能导致失明。

为了减少环境中的蓝光对视网膜造成的损伤，以及预防相关眼睛疾病的发生，开发一种可以降低蓝光所造成的黄斑部病变、改善大量血管生长所引起的眼疾以及降低视网膜色素上皮细胞凋亡的产品，着实有其必要性，尤其在现代人经常性地使用手机、平板计算机等3c产品的状况下，保护眼睛免于蓝光伤害尤为重要，因为这些产品的屏幕皆以发射高能量蓝光的发光二极管为光源。

技术实现要素：

缘此，本发明的一目的在提供一种树番茄萃取物用于制备减缓蓝光所致视网膜损伤的医药组合物的用途，其中该树番茄萃取物是以一溶剂萃取一树番茄的果实所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。

在本发明的一实施例中，该树番茄萃取物是减少血管内皮生长因子a(vascularendothelialgrowthfactora，vegfa)基因、凋亡蛋白酶3(caspase3，casp3)基因与凋亡蛋白酶基因8(caspase8，casp8)基因、介白素8(interleukin8，il-8)基因、以及肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，tnf-α)基因的表现，且该树番茄萃取物的浓度为至少0.5mg/ml。

在本发明的一实施例中，该蓝光所致视网膜损伤是视网膜色素上皮细胞的缺氧性的血管不正常新生。

在本发明的另一实施例中，该蓝光所致视网膜损伤是视网膜色素上皮细胞的黄斑部病变。

本发明的又一目的在提供一种树番茄萃取物用于降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞产生的活性氧化物质(reactiveoxygenspecies，ros)的医药组合物的用途，其中该树番茄萃取物是以一溶剂萃取一树番茄的果实所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，且该树番茄萃取物的浓度为至少0.5mg/ml。

在本发明的一实施例中，该溶剂与该树番茄的液固比为2～10∶1～5，且该萃取是在50℃～100℃进行。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明实施例的树番茄萃取物于降低血管内皮生长因子a(vascularendothelialgrowthfactora，vegfa)基因表现量的直方图；

图2是本发明实施例的树番茄萃取物于降低凋亡蛋白酶3(caspase3，casp3)基因表现量的直方图；

图3是本发明实施例的树番茄萃取物于降低凋亡蛋白酶基因8(caspase8，casp8)基因表现量的直方图；

图4是本发明实施例的树番茄萃取物于降低介白素8(interleukin8，il-8)基因表现量的直方图；

图5是本发明实施例的树番茄萃取物于降低肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，tnf-α)基因表现量的直方图；

图6是本发明实施例的树番茄萃取物于降低活性氧化物质累积的直方图。

具体实施方式

本发明提供一种树番茄萃取物用于降低蓝光所致视网膜损伤的组合物的用途。本发明的树番茄萃取物是以一溶剂萃取一树番茄果实而获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，该溶剂与该树番茄的液固比为2～10∶1～5，且该萃取步骤是在50℃～100℃进行，以下将详细说明本发明树番茄萃取物的萃取方法，与分析经树番茄萃取物处理后，视网膜色素上皮细胞内的vegf、casp基因、il-8基因及tnf基因表现量，以及该细胞中的活性氧化物质的累积情形。

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

实施例1本发明的树番茄萃取物的制备方法

树番茄(solanumbetaceum)为茄科(solanaceae)的常绿灌木植物，又称为缅茄、洋酸茄、木本西红柿或鸡蛋果，是一种亚热带水果，原产于南美州秘鲁、智利、厄瓜尔多、玻利维亚境内的安地斯山脉一带，中国台湾则种植于海拔700公尺以上的高冷地区。树番茄的果实大约4～10公分长，其果实含有丰富的维他命及铁，已知树番茄具有清热解毒、健脾益胃、促消化等作用。

在本发明一实施例中，取洗净后的树番茄的果实与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂以2～10∶1～5的液固比混合，均质后于50～100℃，较佳为75℃～95℃，分别在溶剂中进行萃取0.5～3小时，以获得粗萃取物。萃取后冷却至室温，将该粗萃取物经由400mesh的滤网过滤以获得滤液。最后，将该滤液于45～70℃进行减压浓缩，得到本发明的树番茄萃取物。

实施例2本发明的树番茄萃取物降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞的vegf基因、casp基因、il-8基因及tnf基因表现

本发明以人类视网膜色素上皮细胞(humanretinalpigmentepithelial，arpe-19)进行照射蓝光的vegf基因、casp基因、il-8基因及tnf基因表现测试。该人类视网膜色素上皮细胞是购自atcc公司(美国)，编号为crl-2302。将该细胞培养于含有10％的胎牛血清(fetalbovineserum)以及90％的dmem/f12培养液，该培养液含有1∶1比例的dmem培养液(dulbecco′smodifiedeaglemedium，购自gibco，美国，12100-046)与汉氏f12培养液(ham′sf12nutrientmixture，购自gibco，美国，12500-026)，其中加入0.5mm的丙酮酸钠(sodiumpyruvate)以及15mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethylpiperazineethanesulfonicacid，hepes)缓冲溶液。

将人类视网膜色素上皮细胞放置于蓝光箱中，于室温下照射蓝光15分钟后再分成二组处理：(1)加入0.5mg/ml本发明的树番茄萃取物的实验组、(2)未加入本发明的树番茄萃取物的正控制组，并以未照射蓝光亦未加入树番茄萃取的细胞为空白控制组，接着将视网膜色素上皮细胞以细胞裂解液(rbbuffer，购自geanaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)回收细胞后，使用rna萃取试剂套组(购自geneaid公司，中国台湾，lotno.fc24015-g)分别收集两组视网膜色素上皮细胞内的rna，接着利用iii反转录酶(购自invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取rna为模板并以引物产生相应的cdna产物，接着利用abisteponeplus^tmreal-timepcrsystem(thermofisherscientific公司，美国)，以及kapasybrfast(购自sigma公司，美国，编号38220000000)将三组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量vegfa基因、casp3、casp8基因、il-8基因及tnf-α基因的mrna表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(ct)，而目标基因的mrna相对量是推导自方程式2^-δct，其中δct＝ct目标基因-ctgapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)，再利用excel软件进行非成对单尾studentt-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。

表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

本发明的树番茄萃取物对于降低视网膜色素上皮细胞中vegfa、casp3、casp8、il-8及tnf-α的基因表现的效果的实验结果分别如图1至图5所示，正控制组细胞内vegfa、casp3、casp8、il-8及tnf-α基因的表现量分别高出空白控制组的0.07、0.11、0.38、0.662及0.99，显示照射蓝光确实会促使视网膜色素上皮细胞中vegfa、casp3、casp8、il-8及tnf-α基因的表现；而经蓝光照射过再以本发明的树番茄萃取物处理后，视网膜色素上皮细胞中vegfa、casp3、casp8、il-8及tnf-α基因的表现量，分别比正控制组降低了0.35、0.16、0.34、0.2及0.71的空白控制组的数值。此结果显示本发明的树番茄萃取物能有效降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞的vegf基因、casp基因、il-8基因及tnf基因表现，先前研究指出vegfa基因表现与组织的血管新生有关，而casp基因表现与细胞凋亡有关，另外il-8与及tnf基因表现与细胞发炎反应有关，因此可推知本发明的树番茄萃取物具有降低视网膜色素上皮细胞照射蓝光导致缺氧性的血管不正常新生、视网膜色素上皮细胞凋亡、减缓视网膜受损，以及降低视网膜黄斑部产生病变的能力。

实施例3本发明的树番茄萃取物降低照射蓝光产生的活性氧化物质的累积

为验证本发明的树番茄萃取物对视网膜色素上皮细胞的氧化压力的影响，进一步测试视网膜色素上皮细胞中活性氧化物累积的情形。首先，将1.5×10⁵个人类视网膜色素上皮细胞种植于含2mldmem/f12培养液的6孔培养盘中，在37℃下培养24小时后，将细胞分成三组(n＝2)：(1)加入本发明的0.5mg/ml树番茄萃取物的实验组、(2)仅照射蓝光的正控制组以及(3)未照射蓝光亦未加入树番茄萃取物的空白控制组，并于37℃下培养1小时后，再以5μg/ml的二氯二氢荧光素二乙酸酯(2，7-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate，dcfh-da，购自sigma，美国，编号si-d6883)于37℃下处理细胞15分钟，接着将细胞放置于蓝光箱中，于室温下照射蓝光15分钟后，在不扰动细胞的情况下将培养液移入15ml试管并置于暗处，同时以1ml磷酸盐缓冲溶液(phosphatebufferedsaline，pbs)冲洗细胞二次，并加入200μl胰蛋白酶(trypsin)在暗处反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，并将细胞收集至先前收集培养液的15ml试管，将该试管以300g离心10分钟后移除上清液，再以1ml磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞一次，接着再以300g离心10分钟并移除上清液，并于暗处以1ml磷酸盐缓冲溶液使细胞悬浮。接着，使用流式细胞仪(购自beckman，美国)侦测细胞中激发波长为450-490nm且放射波长为510-550nm的荧光强度。由于dcfh-da进入细胞后会先被水解为二氯二氢荧光素(2，7-dichloro-dihydro-fluorescein，dcfh)，再被活性氧化物氧化为可发出绿色荧光的二氯荧光素(2，7-dichlorofluorescein，dcf)，因此侦测经dcfh-da处理的细胞的荧光强度，能反映细胞内活性氧物质的含量。

本发明的树番茄萃取物对于降低视网膜色素上皮细胞照射蓝光产生的活性氧化物质累积的实验结果如图6所示。正控制组中带有活性氧化物的视网膜色素上皮细胞的比例约比空白控制组高出95％，显示照射蓝光确实会促使视网膜色素上皮细胞内累积活性氧化物质；而经树番茄萃取物处理后，再照射蓝光的视网膜色素上皮细胞带有活性氧化物的比例约比正控制组低40％，此结果显示本发明的树番茄萃取物能有效降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞的活性氧化物质的累积，能减少对视网膜细胞造成的氧化压力，进而具有降低照射蓝光导致视网膜色素上皮细胞的损伤、凋亡，以及降低视网膜黄斑部产生病变的能力。

综上所述，本发明以水、醇类、或醇水混合物为溶剂所萃取得的树番茄萃取物，能有效降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞的vegf基因、casp基因、il-8基因及tnf基因表现，以及有效降低蓝光所致视网膜色素上皮细胞活性氧化物质的累积，而具有降低视网膜色素上皮细胞照射蓝光导致缺氧性的血管不正常新生、视网膜色素上皮细胞凋亡、与减缓视网膜受损以及降低视网膜色素上皮细胞照射蓝光导致视网膜黄斑部病变的能力。因此，本发明的树番茄萃取物可用于制备降低蓝光所致视网膜损伤的医药组合物的用途，该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。