用于皮肤祛斑修复的化妆品原料及其产品的制作方法

本发明涉及一种用于皮肤祛斑修复的化妆品原料及其制备的产品。特别地，本发明涉及使用黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a从组织中进行培养人成纤维前体细胞，促进成纤维前体细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的细胞通过超声破碎后得到细胞裂解液，及培养液，均富含细胞生长营养因子，对皮肤斑痕、色斑和雀斑具有淡化和修复的功效，制备成皮肤祛斑的生物美容原料，用于祛斑修复精华液、面膜、面霜和眼霜等产品。

背景技术：

由于环境等多种原因导致脸上的色素沉在皮肤表层显现出来的各种斑点，如色素斑、黄褐斑、晒斑或是雀斑。目前，常用的化妆品去斑可以去除位于皮肤表皮浅层的斑点，但对位于皮肤表皮深层或真皮层的色素斑点则无能为力。机械深层处理皮肤，如磨削、激光、冷冻和化学剥脱法，不可避免地要伤及皮肤角质层，使皮肤抵御外界侵害的功能降低，同时也令肌肤水分过度丧失，极易出现老化。食疗中含有大量的营养成分和维生素、微量元素，食用和外敷对增加皮肤弹性和滋润光泽都大有好处，但也是治标不治本。将细胞营养因子经由皮肤和呼吸系统吸收，进入体内，调整身体内分泌，从而对人在生理和心理上进行调整，使得皮肤问题从内部得到解决。身心得到恢复协调，也可消除忧郁、焦虑、烦闷、愤怒等情绪和疲惫感，这样来达到一种内、外、身、心、同疗的方法治疗。也可通过亲和作用直接进入皮下，细胞营养因子刺激神经，最终调节神经活动及内环境，并直接改变了内环境等状态，使体液活动加快，从而改善了内环境，进一步达到调节整个身体的作用。因而祛斑只有调节机体微环境和促进皮肤修复才是最为关键的第一步。

本发明采用天然植物提取活性成分加入到人成纤维前体细胞(fibroblastprecursorcells，fpcs)无血清培养基体系中进行连续培养，促进了人成纤维前体细胞大量表达和分泌细胞生长因子，而这些细胞生长因子与人体具有很好的组织相容性和生物学活性，进入皮肤内调节局部微环境，改善机体炎症反应而减少色素沉着，促进皮肤修复。

综上所述，本发明利用人成纤维前体细胞表达和分泌的细胞生长因子，通过连续培养、浓缩或冷冻干燥后制备成化妆品原料，并添加天然植物生黄芪、当归和血竭的提取物、寡肽-1、寡肽-6和九肽-1组成化妆品原料，制备成各类产品，将对皮肤斑痕、色斑和雀斑等产生更佳的祛斑修复作用。

技术实现要素：

通过我们多年的科研工作和产品研发的结果，证实黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a均能促进人成纤维前体细胞增殖和分泌细胞生长因子；三者在促进成纤维前体细胞细胞增殖与分化、细胞因子分泌具有很好的协同能力。而黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a与成纤维前体细胞共培养后促进表达和分泌的细胞生长因子，从而获得培养液。同时我们也发现人干细胞表达和分泌的细胞生长因子对皮肤的斑痕、色斑和雀斑等产生很好的修复、再生和美白等作用，而且联合美容物理疗法将产生更好功效。本发明通过添加黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a进行培养人成纤维前体细胞的培养液经超浓缩后制备成人干细胞精华液，富含细胞生长因子成分，具有祛斑修复的功效。这些细胞生长因子主要包括：表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)、成纤维生长因子1(fibroblastgrowthfactor1，fgf-1)、干细胞生长因子(stemcellgrowthfactor，scf)等，特别是含有基质细胞衍生因子1(stromalcell-derivedfactor-1，sdf-1)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican1，gpc-1)。

基质细胞衍生因子1是小分子的细胞因子，属于趋化因子蛋白家族。我们前期研究发现其促进成纤维前体细胞增殖生长，体内可招募皮肤内源性干细胞迁移至特定靶位并诱导成分化成纤维细胞和表皮细胞，对斑痕、色斑和雀斑等进行淡化与修复。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1促进人成纤维前体细胞分泌多种细胞生长因子能够协同作用改善皮肤微循环，能促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性，保持皮肤内水分；通过促进肌肤内多种细胞的生长、分化，产生大量的新生细胞，来替代有色细胞；促进真皮层内纤维母细胞的增殖，修复老化的胶原纤维与弹性纤维；改善皮肤微循环，提供良好的营养环境，维持一定量的皮肤脂肪，还原肌肤弹性，使其均匀紧致，减少皱纹；促进细胞新陈代谢，促进细胞的增殖、分化，特别是干细胞。同时我们发现gpc-1具有更好地促进皮肤成纤维细胞增殖，表达胶原蛋白，对改善皮肤肤质，特别是对皮肤斑痕、色斑和雀斑具有很好修复作用。

本发明提供了一种用于皮肤祛斑修复的化妆品原料，其中，所述组合物包括使用黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a从组织中培养人成纤维前体细胞，促进成纤维前体细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的细胞通过超声破碎后得到细胞裂解液，及培养液，均富含细胞生长营养因子，具有皮肤祛斑修复的功效；可添加天然植物生黄芪、当归、血竭提取物、寡肽1和寡肽9，成为皮肤祛斑修复的生物美容原料。

本发明提供的人成纤维前体细胞为外伤废弃皮肤、毛囊、尿液、脂肪或骨髓等，无任何病毒感染、遗传性疾病和其他自身免疫疾病等。优选地，选择外伤废弃皮肤，使用生物反应器进行大规模传代培养，获得大量fpcs细胞及其培养液。

一种化妆品原料含有成纤维前体细胞裂解液和培养液，其特征在于，使用黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a培养人成纤维前体细胞获得所述的细胞经超声破碎后的裂解液，以及培养液；所述细胞裂解液与培养液均富含细胞生长因子。

如上所述的化妆品原料，其特征在于，细胞生长因子包括：gpc-1、egf、bfgf、sdf-1、vegf、fgf1、scf。

如上所述的化妆品原料，其特征在于，使用无血清培养基培养人成纤维前体细胞获得所述的细胞及其培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、黄芪多糖、阿魏酸、龙血素a和维生素e。

如上所述的化妆品原料，所述无血清培养基含无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e。

如上所述的化妆品原料，其特征在于，所述细胞裂解液经酶联免疫吸附测定elisa试剂盒检测富含如下细胞生长因子：egf含量超过20ng/ml、bfgf含量超过20ng/ml、sdf-1含量超过5ng/ml、vegf含量超过4ng/ml、fgf1含量超过10ng/ml、scf含量超过4ng/ml、gpc-1含量超过2ng/ml。

如上所述的化妆品原料，优选，所述细胞培养液经酶联免疫吸附测定elisa试剂盒检测富含如下细胞生长因子：egf含量超过3000pg/ml、bfgf含量超过4000pg/ml、sdf-1含量超过1000pg/ml、vegf含量超过500pg/ml、fgf-1含量超过2000pg/ml和scf含量超过500pg/ml，gpc-1含量超过400pg/ml。

一种化妆品原料，所述化妆品原料含有浓缩液或冻干粉，其特征在于，将如上所述成纤维前体细胞裂解液与培养液经透析浓缩获得所述浓缩液，或经冷冻干燥后获得冻干粉。

如上所述的化妆品原料，其特征在于，所述浓缩液经酶联免疫吸附测定elisa试剂盒检测富含如下细胞生长因子：egf含量超过200ng/ml、bfgf含量超过200ng/ml、sdf-1含量超过50ng/ml、vegf含量超过40ng/ml、fgf1含量超过100ng/ml、scf含量超过40ng/ml、gpc-1含量超过20ng/ml。

如上所述的化妆品原料，其特征在于，所述化妆品原料还添加天然植物生黄芪、血竭提取物、寡肽-1、寡肽-6和九肽-1。

一种面膜或精华液，其特征在于，其包括如下成分组成：

1)0.1-5％(质量体积比)的所述成纤维前体细胞裂解与培养液的浓缩液或冻干粉；

2)基础乳化液，含0.1-5％(质量体积比)生黄芪提取物、0.1-5％(质量体积比)当归提取物、0.1-5％(质量体积比)血竭提取物、0.1-2％(质量体积比)寡肽1、0.1-2％(质量体积比)寡肽-6和0.1-2％(质量体积比)九肽-1。

一种成纤维前体细胞及其培养液，其特征在于，使用黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a培养人成纤维前体细胞获得所述的细胞及其培养液；优选，所述细胞裂解液和培养液均富含细胞生长因子；优选，细胞生长因子包括：gpc-1、egf、bfgf、sdf-1、vegf、fgf1、scf。优选，使用无血清培养基培养人成纤维前体细胞获得所述的细胞及其培养液，所述无血清培养基含无血清添加物、黄芪多糖、阿魏酸、龙血素a和维生素e；优选，所述无血清培养基含无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e。

优选地，所述方法包括如下步骤，

(1)通过培养获得的人成纤维前体细胞经超声破碎后的裂解液及培养液；

(2)将蛋白悬液经透析浓缩后制备成浓缩液；

优选地，进一步包括

(3)将精华液通过冷冻干燥后，获得冻干粉。

其中，所述步骤(1)中使用无血清培养基，优选其含无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e；

所述浓缩液或冻干粉可为皮肤祛斑修复的生物美容原料；

其中，所述人成纤维前体细胞裂解液、培养液或其浓缩液均富含如下细胞生长因子：gpc-1、egf、bfgf、sdf-1、vegf、fgf1、scf等，优选地分泌sdf-1和gpc-1。

优选地，所述人成纤维前体细胞来源外伤废弃的皮肤，经75％(体积比)医用酒精浸泡消毒后，用1×pbs(ph7.4)洗涤三次后，使用眼科剪剪碎取出血丝和结缔组织，放入5-20ml100iu/mli型胶原酶中消化过夜；第二天去除表皮组织，留下真皮组织用眼科剪剪碎成1mm³大小在无血清培养基(含1×无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e)培养条件下进行原代培养，在75cm²培养瓶中生长7-14天；通过0.25％胰酶(含0.02％edta)消化，获得的成纤维前体细胞转移到25ml175cm²培养瓶进行扩增培养。

使用500ml转瓶，微载体浓度为3g/l，用补加无血清培养基(含1×无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e)，细胞接种密度为2.0×10⁵cells/ml。当微载体上细胞长到一定程度后，补加微载体2g/l，最终微载体浓度为5g/l。新球与老球的比例为2∶3，补加新的微载体后，停止搅拌，每隔45min转动2min，3h后正常运行，观察细胞生长状态对球转球的影响。用1.5l细胞培养用生物反应器，当微载体上细胞已长成致密单层时，补加一定的微载体，使新老微载体的比例为3∶1进行球转球培养。以5l细胞培养用生物反应器进行球转球培养，通过换液和灌注新鲜培养液，培养5-7天。整个培养过程为自动控制，温度控制在37±0.1℃，溶解氧为50％空气饱和度，转速为20～32转每分钟。

一次性处理3mm×5mm的皮肤通过上述微载体大规模传代培养后可获得超过5×10¹⁰的成纤维前体细胞，以及超过5l细胞培养液。

优选地，所述的无血清培养基含无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e，我们发现可以促进细胞生长因子的分泌和表达，提高细胞生长因子的含量，特别是促使了sdf-1和gpc-1的表达。

获得成纤维前体细胞1×10¹⁰用10ml1×pbs(ph7.4)重悬后，通过超声破碎仪进行裂解，释放出大量细胞生长因子，高速离心后获取上清，即为成纤维前体细胞裂解液。

将获得成纤维前体细胞裂解液添加到收集的细胞培养液中，两者混合液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩5倍以上，使用去离子水将浓缩液蛋白浓度调整为50mg/ml，获得成纤维前体细胞裂解也与培养液混匀后的浓缩液。

优选地，本发明制备的人成纤维前体细胞裂解液与培养液经酶联免疫吸附测定elisa试剂盒检测富含细胞生长因子；

优选地，所述细胞裂解液含如下细胞生长因子：egf含量超过20ng/ml、bfgf含量超过20ng/ml、sdf-1含量超过5ng/ml、vegf含量超过4ng/ml、fgf1含量超过10ng/ml、scf含量超过4ng/ml、gpc-1含量超过2ng/ml。

优选地，所述细胞培养液含如下细胞生长因子：egf含量超过3000pg/ml，bfgf含量超过4000pg/ml、sdf-1含量超过1000pg/ml、vegf含量超过500pg/ml、fgf-1含量超过2000pg/ml、scf含量超过500pg/ml、gpc-1含量超过400pg/ml。

将如上所述成纤维前体细胞裂解液与培养液经透析浓缩获得的所述浓缩液，经冷冻干燥后获得冻干粉，保存时间更长久，便于运输。

优选地为选择人成纤维前体细胞裂解液与培养液的浓缩液或冻干粉作为美容原料。

本发明所述的人成纤维前体细胞浓缩液或冻干粉加入到人表皮细胞hacat中进行培养，通过细胞活力检测试剂mtt检测，细胞活力速度比未加入浓缩液或冻干粉显著提高；促进了表皮细胞的增殖。通过蛋白印迹分析，人表皮细胞表达胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1的量比未加入培养液的要高出1-10倍；提高了人表皮细胞表达胶原蛋白。

本发明提供的人成纤维前体细胞培养液浓缩液或冻干粉，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品。

本发明提供的一种人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：

1)0.1-5％(质量体积比)的所述的人成纤维前体细胞的浓缩液或冻干粉；

2)基础乳化液，含0.1-5％(质量体积比)生黄芪提取物、0.1-5％(质量体积比)当归提取物、0.1-5％(质量体积比)血竭提取物、0.1-2％(质量体积比)寡肽1、0.1-2％(质量体积比)寡肽-6和0.1-2％(质量体积比)九肽-1；

3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；

其制备方法为，将取人成纤维前体细胞的浓缩液或冻干粉加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。

本发明提供的一种人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：

取如上所述0.1-5％的人成纤维前体细胞的浓缩液与冻干粉基料(含0.1-5％生黄芪提取物、0.1-5％当归提取物、0.1-5％血竭提取物、0.1-2％寡肽1、0.1-2％寡肽-6和0.1-2％九肽-1)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛斑修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

通过本发明的方法，通过获取的人成纤维前体细胞裂解液、培养液及其浓缩液或冻干粉富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤具有斑痕、色斑和雀斑具有淡化和修复的功效。

附图说明

图1表示由实施例1和2所制备人成纤维前体细胞与对比例各细胞因子分泌水平对比图，a为成纤维前体细胞裂解液表达细胞生长因子对比图；b为成纤维前体细胞培养液表达细胞生长因子对比图。

图2表示由实施例3所制备的成纤维前体细胞浓缩液对人表皮细胞mtt检测活力图

图3表示实施例3所制备的成纤维前体细胞浓缩液对表皮细胞表达胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1的灰度结果比较图

具体实施方式

本发明提供了一种用于皮肤祛斑修复的化妆品原料，其中，所述组合物包括使用黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a从组织中培养人成纤维前体细胞，促进成纤维前体细胞的蛋白质合成与分泌，其培养获得的培养液，其富含细胞生长营养因子，具有皮肤祛斑修复的功效；可添加天然植物生黄芪、当归和血竭的提取物、寡肽1、寡肽-6和九肽-1，成为皮肤祛斑修复的生物美容原料。

所述人干细胞为废弃脐带来源成纤维前体细胞、废弃胎盘来源的成纤维前体细胞、骨髓来源成纤维前体细胞或内皮祖细胞和脂肪来源脂肪干细胞等，优选地，为废弃胎盘来源的成纤维前体细胞，使用多层细胞培养器进行大规模传代培养，获得大量psc细胞液。

所述的人成纤维前体细胞来源外伤废弃的皮肤，经75％(体积比)医用酒精浸泡消毒后，用1×pbs(ph7.4)洗涤三次后，使用眼科剪剪碎取出血丝和结缔组织，放入5-20ml100iu/mli型胶原酶中消化过夜；第二天去除表皮组织，留下真皮组织用眼科剪剪碎成1mm³大小在无血清培养基培养条件下进行原代培养，在75cm²培养瓶中生长7-14天；通过0.25％胰酶(含0.02％edta)消化，获得的成纤维前体细胞转移到25ml175cm²培养瓶进行扩增培养。

使用500ml转瓶，微载体浓度为3g/l，用补加无血清培养基，细胞接种密度为2.0×10⁵cells/ml。当微载体上细胞长到一定程度后，补加微载体2g/l，最终微载体浓度为5g/l。新球与老球的比例为2∶3，补加新的微载体后，停止搅拌，每隔45min转动2min，3h后正常运行，观察细胞生长状态对球转球的影响。用1.5l细胞培养用生物反应器，当微载体上细胞已长成致密单层时，补加一定的微载体，使新老微载体的比例为3∶1进行球转球培养。以5l细胞培养用生物反应器进行球转球培养，通过换液和灌注新鲜培养液，培养5-7天。整个培养过程为自动控制，温度控制在37±0.1℃，溶解氧为50％空气饱和度，转速为20～32转每分钟。

一次性处理3mm×5mm的皮肤通过上述微载体大规模传代培养后可获得超过5×10¹⁰的成纤维前体细胞，以及超过5l细胞培养液。

本发明使用的细胞培养基为无血清培养基，如ultraculture^tm、amms-msc、mesengro和mgro-500等商品化产品。

优选地，所述的fpc无血清培养基含1×无血清添加物、0.1-100μg/ml黄芪多糖、0.1-100μg/ml阿魏酸、0.1-100μg/ml龙血素a和0.1-500ng/ml维生素e。

本发明使用微载体为商品化产品，如美国ge公司、美国sigma公司、美国solohill公司和美国nbs公司等，孔径在60-250μm，可以用于传代大规模贴壁细胞培养使用。

获得成纤维前体细胞1×10¹⁰用10ml1×pbs(ph7.4)重悬后，放置在冰块上冰浴，将超声探头没入细胞混悬液内，进行超声破碎，一般总超声时间约3min，每次破碎2秒，间隔3秒，总共6个循环，细胞充分裂解后释放出大量细胞生长因子，12000rpm高速离心20分钟后获取上清，即为成纤维前体细胞裂解液。

将获得成纤维前体细胞裂解液添加到收集的细胞培养液中，两者混合液通过100-1000分子量的透析袋进行透析浓缩，或者通过100-1000分子量的醋酸纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩5倍以上；使用去离子水将浓缩液蛋白浓度调整为50mg/ml，获得成纤维前体细胞裂解液与培养液混匀后的浓缩液。

本发明制备的人成纤维前体细胞裂解液与培养液经酶联免疫吸附测定elisa试剂盒检测富含细胞生长因子。

优选地，所述细胞裂解液含如下细胞生长因子：egf含量超过20ng/ml、bfgf含量超过20ng/ml、sdf-1含量超过5ng/ml、vegf含量超过4ng/ml、fgf1含量超过10ng/ml、scf含量超过4ng/ml、gpc-1含量超过2ng/ml。

优选地，所述细胞培养液含如下细胞生长因子：egf含量超过3000pg/ml，bfgf含量超过4000pg/ml、sdf-1含量超过1000pg/ml、vegf含量超过500pg/ml、fgf-1含量超过2000pg/ml、scf含量超过500pg/ml、gpc-1含量超过400pg/ml。

将如上所述成纤维前体细胞裂解液与培养液经透析浓缩获得的所述浓缩液，经冷冻干燥后获得冻干粉，保存时间更长久，便于运输。

优选地为选择人成纤维前体细胞的浓缩液或冻干粉作为美容原料。

本发明所述的人成纤维前体细胞浓缩液或冻干粉加入到人表皮细胞hacat中进行培养，通过细胞活力检测试剂mtt检测，细胞活力比未加入浓缩液或冻干粉显著提高；促进了表皮细胞的增殖。

通过蛋白印迹分析，人表皮细胞表达胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1的量比未加入浓缩液或冻干粉的要高出1-10倍；提高了人表皮细胞表达胶原蛋白。

本发明提供的人成纤维前体细胞浓缩液或冻干粉，可以作为生物美容原料，添加到面霜、润肤露和爽肤水等化妆品中生产成相关产品，即取1ml浓缩液加入到50ml面霜、润肤露和爽肤水等中混匀即可。

本发明提供的一种人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容面膜，其特征在于，其由如下成分组成：

1)0.1-5％的所述的人成纤维前体细胞培养液的浓缩液或冻干粉；

2)基础乳化液，含0.1-5％(质量体积比)生黄芪提取物、0.1-5％(质量体积比)当归提取物、0.1-5％(质量体积比)血竭提取物、0.1-2％(质量体积比)寡肽1、0.1-2％(质量体积比)寡肽-6和0.1-2％(质量体积比)九肽-1；

3)面膜原材料：无纺布、生物纤维膜、蚕丝膜或水凝胶膜；

其制备方法为，将取成纤维前体细胞浓缩液或冻干粉加入到面膜基础乳化液中混匀，再灌装到锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

优选地，选择蚕丝膜或水凝胶膜作面膜原材料。

本发明提供的一种人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容精华液，其特征在于，其由如下成分组成：

取如上所述0.1-5％的人成纤维前体细胞培养液的浓缩液或冻干粉与精华液基料(含0.1-5％(质量体积比)生黄芪提取物、0.1-5％(质量体积比)当归提取物、0.1-5％(质量体积比)血竭提取物、0.1-2％(质量体积比)寡肽1、0.1-2％(质量体积比)寡肽-6和0.1-2％(质量体积比)九肽-1)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛斑修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。

本发明提供了通过获取的人成纤维前体细胞裂解液、培养液及其浓缩液或冻干粉富含细胞生长因子，可以制备成面霜、润肤露、爽肤水、面膜和精华液等产品，能够对皮肤斑痕、色斑和雀斑具有淡化和修复的功效。本发明还提供了联合物理美容疗法使用，即高温深蓝射频美容疗法、微针疗法等，能打开表皮毛孔或微创表皮皮层，为细胞因子进入皮肤的通道，将产生更佳的美容疗效。

以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。

实施例1人成纤维前体细胞的培养

收集外伤废弃的皮肤，经75％(体积比)医用酒精浸泡消毒后，用1×pbs(ph7.4)洗涤三次后，使用眼科剪剪碎取出血丝和结缔组织，放入5-20ml100iu/mli型胶原酶中消化过夜；第二天去除表皮组织，留下真皮组织用眼科剪剪碎成1mm³大小在mesengro无血清培养基(美国stemrd公司，含1×无血清添加物、10μg/ml黄芪多糖、0.5μg/ml阿魏酸、2μg/ml龙血素a和20ng/ml维生素e)培养条件下进行原代培养，在75cm²培养瓶中生长7-14天；通过0.25％胰酶(含0.02％edta)消化，获得的成纤维前体细胞转移到25ml175cm²培养瓶进行扩增培养。

使用500ml转瓶(美国wheaton公司)，cytodex2微载体(美国ge公司)浓度为3g/l，用补加上述mesengro无血清培养基，细胞接种密度为2.0×10⁵cells/ml。当微载体上细胞长到一定程度后，补加微载体2g/l，最终微载体浓度为5g/l。新球与老球的比例为2∶3，补加新的微载体后，停止搅拌，每隔45min转动2min，3h后正常运行，观察细胞生长状态对球转球的影响。用1.5l细胞培养用生物反应器(美国nbs公司)，当微载体上细胞已长成致密单层时，补加一定的微载体，使新老微载体的比例为3∶1进行球转球培养。以5l细胞培养用生物反应器(美国nbs公司)进行球转球培养，通过换液和灌注新鲜培养液，培养5-7天。整个培养过程为自动控制，温度控制在37±0.1℃，溶解氧为50％空气饱和度，转速为20～32转每分钟。

一次性处理3mm×5mm的皮肤通过上述微载体大规模传代培养后可获得5.47×10¹⁰的成纤维前体细胞，以及6.56l的细胞培养液。

实施例2人成纤维前体细胞裂解液制备

获得成纤维前体细胞1×10¹⁰用10ml1×pbs(ph7.4)重悬后，放置在冰块上冰浴，将超声探头没入细胞混悬液内，进行超声破碎，一般总超声时间为3min，每次破碎2秒，间隔3秒，总共6个循环，细胞充分裂解后释放出大量细胞生长因子，12000rpm高速离心20分钟后获取上清，即为成纤维前体细胞裂解液，共获得54.7ml的细胞裂解液。

将实施例2制备的细胞裂解液添加到实施例1中制备的细胞培养液中，混匀得到两者混合液。分别取50μl实施例1中制备的细胞培养液、50μl实施例2中细胞裂解液和50μl混合液，其中细胞裂解液使用无菌去离子水稀释20倍，使用nanodrop2000(美国thermo公司)进行蛋白浓度测定，具体操作方法按照使用说明书进行，具体结果如下：

表1

实施例3人成纤维前体细胞来源美容原料制备

将实施例2制备的细胞裂解液与实施例1中制备的细胞培养液的混合液，放入49mm透析袋中4℃冰箱中进行浓缩，每2小时更换一次吸水剂聚乙二醇20000，浓缩过夜后，取50μl样本进行蛋白浓度测定，浓缩液中蛋白浓度为68.67mg/ml；添加去离子水调整浓缩液到50mg/ml蛋白浓度，即获得浓缩液，制备成了可用于肌肤祛斑修复的原料，4℃冷藏冰箱短期保存，长期放置-20℃冷冻冰箱长期保存。

将浓缩液加入到托盘或茄形瓶中通过冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)进行冷冻干燥，即获得冻干粉，制备成了可用于肌肤祛斑修复的原料；能更好保持细胞生长因子的活性，保存时间更长并便于运输。

实施例4人成纤维前体细胞中细胞因子表达与分泌水平检测

取实施例3中制备的人成纤维前体细胞裂解液、培养液和两者混合后的浓缩液经elisa试剂盒(美国r&d系统公司)检测其中细胞因子分泌水平，使用步骤参照使用说明书。

实验分组如下：

实验组a为使用无植物活性成分培养人成纤维前体细胞，即mesengro无血清培养基(含1倍无血清添加物和20ng/ml维生素e)；

实验组b为使用含黄芪多糖培养人成纤维前体细胞，即mesengro无血清培养基(含1倍无血清添加物、20μg/ml黄芪多糖和20ng/ml维生素e)；

实验组c为使用含阿魏酸培养人成纤维前体细胞，即mesengro无血清培养基(含1倍无血清添加物、5μg/ml阿魏酸和20ng/ml维生素e)；

实验组d为使用含龙血素a培养人成纤维前体细胞，即mesengro无血清培养基(含1倍无血清添加物、10μg/ml龙血素a和20ng/ml维生素e)；

实验组e为通过实施例1方法培养人成纤维前体细胞，即mesengro无血清培养基(含1倍无血清添加物、10μg/ml黄芪多糖、0.5μg/m阿魏酸、2μg/ml龙血素a和20ng/ml维生素e)；

实验各组按照相同的处理方法获得人成纤维前体细胞的裂解液、培养液、及浓缩液，然后进行细胞生长因子检测。

表2中为实验各组中人成纤维前体细胞的裂解液的各细胞因子表达水平，浓度单位为ng/ml。

表2中显示人成纤维前体细胞在无天然植物活性成分培养下获得裂解液比其他含有天然植物活性成分培养分泌的细胞生长因子均显著低下；含黄芪多糖的实验组b与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、scf和gpc-1的表达水平(^*p≤0.05，^**p≤0.01)；含阿魏酸的实验组c与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、vegf、fgf-1和gpc-1的表达水平(^#p≤0.05，^##p≤0.01)；含龙血素a的实验组d与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、sdf-1和fgf-1的表达水平(^&p≤0.05，^&&p≤0.01)；在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a的实验e均比在分别含有三者的实验组要明显提高，在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a三者联合培养获得裂解液中均分泌高水平的细胞生长因子。

表3中为实验各组中人成纤维前体细胞的培养液的各细胞因子表达水平，浓度单位为ng/ml。

表3中显示人成纤维前体细胞在无天然植物活性成分培养下获得培养液比其他含有天然植物活性成分培养分泌的细胞生长因子均显著低下；含黄芪多糖的实验组b与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、fgf-1、scf和gpc-1的表达水平(^*p≤0.05，^**p≤0.01)；含阿魏酸的实验组c与实验a组相比，显著提高了bfgf、sdf-1、vegf、fgf-1和gpc-1的表达水平(^#p≤0.05，^##p≤0.01)；含龙血素a的实验组d与实验a组相比，显著提高了egf、sdf-1和fgf-1的表达水平(^&p≤0.05，^&&p≤0.01)；在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a的实验e均比在分别含有三者的实验组要明显提高，在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a三者联合协同培养获得培养液中均分泌高水平的细胞生长因子。

表4中为实验各组中人成纤维前体细胞裂解液与培养液的混合液的各细胞因子表达水平，浓度单位为ng/ml。

表4中显示人成纤维前体细胞在无天然植物活性成分培养下获得混合液比其他含有天然植物活性成分培养分泌的细胞生长因子均显著低下；含黄芪多糖的实验组b与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、fgf-1、scf和gpc-1的表达水平(^*p≤0.05，^**p≤0.01)；含阿魏酸的实验组c与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、sdf-1、vegf、fgf-1和gpc-1的表达水平(^#p≤0.05，^##p≤0.01)；含龙血素a的实验组d与实验a组相比，显著提高了egf、bfgf、sdf-1和fgf-1的表达水平(^&p≤0.05，^&&p≤0.01)；在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a的实验e均比在分别含有三者的实验组要明显提高，在含有黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a三者联合培养获得混合液中均分泌高水平的细胞生长因子。

表明黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a三者联合培养协同促进了细胞生长因子的分泌；将更有助于这些细胞因子在皮肤美容方面将发挥祛斑修复的作用。特别发现在细胞裂解液、培养液、及浓缩液中高表达细胞生长因子sdf-1和gpc-1，其在功能上具有促进细胞增殖和皮肤祛斑修复的作用。

人成纤维前体细胞分泌细胞因子与对比例进行比较，即budell和djabalik发表在2017年11月的《生物学开放》中皮肤来源前体细胞从原代成纤维细胞培养开始的快速分离与扩增，nizyaevanv，nagovitsynamn，kulikovagv，etal.rapidisolationandexpansionofskin-derivedprecursorcellsfromhumanprimaryfibroblastcultures.biolopen.2017nov15；6(11)：1745-1755.所报道的方法进行培养人成纤维前体细胞，获得的培养基与本发明获得人成纤维前体细胞的细胞裂解液及其培养液，检测分析分泌细胞因子的水平。

图1a为人成纤维前体细胞的裂解液中各细胞因子表达水平图，本发明培养的成纤维前体细胞显著表达egf、bfgf、sdf-1、gpc-1，与对比例具有明显的差异(*p≤0.05，**p≤0.01)；图1b为人成纤维前体细胞的培养液中各细胞因子分泌水平图，本发明培养的成纤维前体细胞分泌细胞生长因子显著提高，即egf、bfgf、sdf-1、vegf、scf和gpc-1，与对比例具有明显的差异(*p≤0.05，**p≤0.01)；表明黄芪多糖、阿魏酸和龙血素a三者联合培养协同促进了细胞生长因子的表达水平。

实施例5人成纤维前体细胞培养液对表皮细胞的作用

取人表皮细胞hacat(来源于美国sciencell公司)，分为两组进行培养，即对照a组在dmem低糖培养基条件下，2×10³/孔，96孔板中分别进行培养；b组为dmem低糖培养基添加1％实施例3制备的浓缩液，与a组一样进行培养，然后通过细胞增殖检测试剂mtt进行分析，使用酶标仪(美国bio-rad公司)，在450nm波长下检测。

图2为人表皮细胞hacat在含有成纤维前体细胞浓缩液和未含有其的dmem低糖培养基中，两种细胞活力的比较。培养12小时人表皮细胞活力未有显著差异，随着继续培养到24小时人表皮细胞活力显著提高，与对照a组相比具有显著差异(**p≤0.01)；培养到24小时人表皮细胞活力也显著提高，与对照a组相比具有显著差异(**p≤0.05)；表明成纤维前体细胞浓缩液具有促进表皮细胞显著增殖的活力。

同样取人表皮细胞hacat，分为两组进行培养，即a组在dmem低糖培养基条件下，1×10⁵/ml，10ml，在75cm²培养瓶中分别进行培养；b组为dmem低糖培养基添加1％实施例3制备的浓缩液，与a组一样进行培养，即在37℃，5％co2培养箱中培养3天，然后用0.25％胰酶(含0.02％edta)进行消化，获得培养的人表皮细胞hacat。

使用蛋白印迹分析进行检测，蛋白抽提：2-5×10⁶个hacat或3t3-l1细胞悬液分别1000rpm离心10分钟，弃培养液，pbs清洗3次。根据细胞量加入相应的抽提缓冲液，冰上轻摇15min。收集裂解液到ep管中，14,000rpm离心15min。取上清到新的ep管中。蛋白样品浓度测定：参照美国bio-rad公司购买的bca蛋白定量试剂盒说明书进行。将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按5∶1混合，煮沸5min。配制5％积沉胶，8％分离胶，每孔上样量约为10ng。电泳：80v恒压50分钟，120v恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止，pvdf膜甲醇预处理3～5秒，放至转印液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层并去除气泡。低温条件下(4℃)，100v恒压60～120分钟。取出杂交膜，tbst漂洗5分钟，三次；5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时；tbst洗膜5min，三次。加入合适的一抗稀释浓度(anti-coliα1antibody(1∶1000)，anti-coliiα1antibody(1∶1000)，actin作为参照蛋白，4℃过夜。tbst洗膜5min，三次；二抗稀释液37℃孵育1h；tbst洗膜5min，三次；蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体。共洗三次。将杂交膜置于一个透明塑料板上，用干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用滤纸吸去膜表面多余的ecl发光液，暗室中用胶片显影，定影，并拍照。通过软件imagej分析蛋白印迹进行灰度分析。

图3中为通过westernblotting检测的胶原蛋白表达灰度分析结果，显示在含有本发明的成纤维前体细胞浓缩液中培养的hacat细胞均高表达胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1，与不含有的hacat细胞相比，具有显著差异(**p≤0.01)。hacat细胞在含浓缩液中表达胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1分别高于不含浓缩液的为3.72倍和6.40倍。表明本发明的成纤维前体细胞浓缩液对人表皮细胞均促使胶原蛋白iα1和胶原蛋白iiα1的高表达。

实施例6制备人成纤维前体细胞浓缩液或冻干粉的美容产品

制备人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容面膜，如下成分组成：

1)实施例3制备1％的人成纤维前体细胞培养液的浓缩液或冻干粉；

2)基础乳化液，含0.1-5％(质量体积比)生黄芪提取物、0.1-5％(质量体积比)当归提取物、0.1-5％(质量体积比)血竭提取物、0.1-2％(质量体积比)寡肽1、0.1-2％(质量体积比)寡肽-6和0.1-2％(质量体积比)九肽-1；

3)水凝胶膜；

将1％的人成纤维前体细胞培养液的浓缩液在基础乳化液中混匀后，装入25ml锡箔纸袋中，放入1张水凝胶膜，然后热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下，保质期为1个月。

制备人成纤维前体细胞来源的祛斑修复美容精华液，由如下成分组成：

取实施例3制备的1％人成纤维前体细胞养液的浓缩液或冻干粉，加入到精华液基料(含含0.1-5％生黄芪提取物、0.1-5％当归提取物、0.1-5％血竭提取物、0.1-2％寡肽1、0.1-2％寡肽-6和0.1-2％九肽-1)，混匀后装入10ml滴瓶或带喷嘴瓶中，生产成皮肤祛斑修复精华液。

装盒包装后形成产品，保存在4℃条件下，保质期为1个月。