一种沙虫多糖在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用的制作方法

本发明涉及天然产物的应用技术领域，具体涉及海产品多糖在药物或保健品的应用。

背景技术：

骨质疏松症(osteoporosis，op)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，同时op又是骨衰老导致的退行性疾病。流行病学调查显示：女性明显高于男性，而且随着我国社会老龄化进程的加速，发病率呈现升高趋势。截止2013年，中国的老年人口已经突破2亿，预计到2020年，我国骨质疏松病人将高达2.866亿。预计到本世纪50年代，因骨质疏松症引起的髋部骨折患者将超过300万/年。因此，骨质疏松已成为不可忽视的重大健康问题。

op分为原发性和继发性两种，其中原发性骨质疏松占骨质疏松的90％，又可分为2种亚型，即i型和ii型(i型又称绝经后骨质疏松，ii型为老年性骨质疏松)。其中，i型骨质疏松又占原发性骨质疏松的绝大多数，i型骨质疏松发病主要由于绝经后妇女合成和分泌雌激素的能力下降、成骨细胞形成减少、成骨功能减退、破骨细胞形成和募集增加、破骨作用(骨吸收)增强。骨形成和骨吸收之间出现负平衡，使骨量减少，从而发生骨质疏松症。目前临床防治骨质疏松药物的主要理论基础包括：1、抑制破骨细胞过量的骨吸收，抑制绝经后骨质疏松症患者和其他的骨代谢障碍所导致的高骨转换率；2、刺激成骨细胞骨形成和矿化成熟，同时也抑制破骨细胞增殖分化，使新骨的形成超过吸收最终使得骨量增加。其作用的靶点主要针对成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收。

传统观点认为，原发性骨质疏松症的发生与内分泌因素相关，尤其是雌激素缺乏相关。但是原发性骨质疏松症也被认为是一种与慢性炎症(比如：类风湿、病毒感染)相关的骨质疾病。由于各种原因导致的原发与继发性骨质疏松症都多与免疫功能失调有关，炎症反应可以导致破骨细胞分化与形成增加，成熟破骨细胞吸收能力增强，从而打破骨吸收与骨形成所处的稳态骨重建，导致骨质的过度吸收和破坏引起骨骼疾病，由开始的骨量减少而最终发展为骨质疏松症，因此，通过抗炎作用而实现抗骨质疏松症的研究成为新的热点。多糖能够在多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用，如促进网状内皮系统的吞噬功能，诱导抗体产生，活化吞噬细胞，调节t、b淋巴细胞和nk细胞的功能，诱导免疫调节因子的表达等。有研究证明防风多糖治疗骨质疏松大鼠能有效降低血清中钙、镁离子及alp浓度，调节细胞因子，缓解去势大鼠的骨高分解状态，提高骨密度；还有研究显示黄精多糖能够减少去卵巢大鼠的骨丢失、骨密度下降，改善骨微结构破坏，促进成骨相关基因而抑制破骨相关基因mrna的表达，并能够促进骨折愈合。此外，锁阳多糖、枸杞多糖、巴戟天多糖、柿叶多糖、茶多糖及牛膝多糖等众多多糖也均具有明显的抗骨质疏松作用。

沙虫又叫海人参，学名方格星虫(sipunculusnudus)，又称为光裸星虫，盛产于广东湛江和广西北部湾地区北海钦州等地。作为著名的海产珍品，沙虫味道鲜美脆嫩，富含多种活性成分，有待开发出更多后续产品，延长沙虫产品的产业链。目前的研究显示：沙虫粗多糖能够恢复环磷酰胺引起的小鼠胸腺萎缩和脾萎缩，明显拮抗白细胞减少，而对正常小鼠免疫器官没有明显的增重作用；能够显著增强正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力；沙虫多糖粗品和精制多糖能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖，且能与刀豆蛋白a协同作用；能够明显提高小鼠细胞免疫和体液免疫功能，促进小鼠碳廓清速率和小鼠肝脏与脾脏对异物的吞噬功能，并提高小鼠肺特异性免疫功能。综上所述，沙虫多糖是一种能够显著增强机体免疫功能的生物活性调节剂。但是目前还没有沙虫多糖具有抗骨质疏松活性的相关报导。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种沙虫多糖在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种沙虫多糖在制备防治骨质疏松药物或保健品中的应用。

作为进一步的方案，本发明所述的沙虫多糖为可通过酶法、溶剂浸提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等手段获得的生物活性物质，是由糖甙键链接起来的醛糖或酮糖组成的天然大分子。

作为进一步的方案，本发明所述的药物或保健品为胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂或口服液。

作为进一步的方案，本发明所述的药物或保健品是由沙虫多糖与制剂允许的辅料或其他任选的活性成分制成。

随着海洋生物资源的进一步开发和对糖类药物研究的日益重视，海洋动物多糖的研究与开发也将越来越受到关注，成为热点之一。对沙虫活性物质的生理活性研究表明，沙虫多糖具有抗辐射、抗疲劳、抗氧化、抗病毒、调节免疫等多种生物学功能。实验结果显示，沙虫多糖能够显著促进体外培养的mc3t3-e1成骨前体细胞的增殖和分化，并能够显著提高10月龄小鼠的骨密度。上述结果表明沙虫多糖具有较好的治疗或预防骨质疏松功能。

本发明具有以下有益效果：

沙虫多糖除了在体外可促进mc3t3-e1成骨前体细胞增殖和分化外，还能够在体内增加10月龄小鼠的骨密度。沙虫作为食材，无毒副作用，因此其多糖在制备治疗或预防骨质疏松药物或保健品中具有较佳的应用潜力。

附图说明

图1为沙虫多糖对mc3t3-e1前成骨细胞alp活性的影响，与空白对照组比较^ap＜0.05；

图2为沙虫多糖对小鼠骨密度(bmd)的影响，与空白对照组比较^ap＜0.05。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述。

沙虫多糖可以通过任意的、合适的提取方法获得，如：热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、酶法等。在本发明实施例中所使用的沙虫多糖可以通过以下方法获得：采用解剖剪纵向剖开新鲜沙虫(购于湛江东风水产品市场)，蒸馏水洗涤体壁，剪成小段。取上述小段250g，加入1000ml蒸馏水(超纯水仪，milli-q)，高速匀浆5min(组织捣碎机，上海标本模型厂)，4℃静置24h。将上述样品置于90℃水浴中浸提2h，4900r/min离心15min(落地式低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司)，分别收集上清及沉淀。加入3％的三氯乙酸(南京化学试剂股份有限公司)于上清液中，至不出现混浊，静置过夜离心除蛋白。将除蛋白后的上清液加入95％乙醇至终浓度为70％，4900r/min离心，沉淀即为水提多糖。

下面对本发明的优选实施例予以详细描述，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为常规条件。

实施例1沙虫多糖对体外培养的mc3t3-e1前成骨细胞增殖的影响

1.细胞

小鼠前成骨细胞mc3t3-e1(购买于中国科学院上海细胞库)。细胞常规培养于含有10％胎牛血清(美国gibco公司)的α-mem(美国hyclone公司)完全培养基中，5％co2、37℃孵箱(thermo)中培养，待细胞融合度达80％时，0.25％胰酶(美国sigma)消化，并进行传代培养。

2.mtt法检测mc3t3-e1前成骨细胞增殖情况

取对数生长期细胞，采用含10％胎牛血清的α-mem培养液重悬，细胞密度为5×10⁴个/ml。分别接种于3块96孔细胞培养板，每孔100μl，24h后细胞贴壁，除去培养液，以磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤1次，再加入含不同浓度的沙虫多糖(0、6.25、12.5、25、50、100mg/ml)培养液。实验根据沙虫多糖浓度的不同设6组，每组8个复孔。在培养24、36、48h时，分别取出1块培养板，每孔加mtt溶液(5g/l)20μl，37℃继续培养4h，弃培养液。每孔加入dmso100μl，室温振荡10min，采用酶标仪(elx800酶标仪，bio-tek)检测490nm处各孔吸光度(od值)，计算细胞增殖活性，采用spss12软件成组t检验进行统计分析。

3.结果

由表1可知，5个浓度的沙虫多糖在3个不同时间点均可显著促进mc3t3-e1细胞增殖(p＜0.05)，表明沙虫多糖对mc3t3-e1细胞具有增殖促进作用。与空白对照组比较^ap＜0.05。

表1沙虫多糖对前成骨细胞mc3t3-e1增殖活性的影响(n＝8)

实施例2：沙虫多糖对体外培养的mc3t3-e1细胞成骨分化的影响

1.碱性磷酸酶(alp)活性检测

将前成骨细胞mc3t3-e1接种到12孔细胞板，24h细胞贴壁后去除原培养液，再分别加入含有不同沙虫多糖浓度(0、6.25、12.5、25、50、100mg/ml)的α-mem培养液，总计为6组，每组3个复孔。于第6天吸取细胞培养液，2.5×10³r/min离心10min，取上清液，利用alp活性检测试剂盒(南京建成)测定alp活性。制备空白孔(缓冲液50μl，基质液50μl，双蒸水30μl)、标准孔(缓冲液50μl，基质液50μl，0.02mg/ml酚标准应用液30μl)、测定孔(缓冲液50μl，基质液50μl，待测上清液30μl)。充分混匀，37℃水浴15min。每孔加入显色剂150μl，轻轻震摇孔板混匀，波长520nm处测定各孔od值。采用spss12软件成组t检验进行统计分析。

2.结果

alp是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，促进细胞成熟、钙化，alp的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，该酶活性越高，说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化的越明显，因此alp的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。

由图1可知，与空白对照组相比，沙虫多糖能增强前成骨细胞mc3t3-e1的alp活性，提示沙虫多糖能够促进mc3t3-e1前成骨细胞向成骨分化。

实施例3：沙虫多糖对10月龄小鼠骨密度的影响

1、实验动物分组：

8月龄km小鼠(购自广东省医学实验动物中心)40只，适应性饲养2周后，随机分为4组，每组10只。a组为空白对照(con)组，该组小鼠每天灌胃给予生理盐水10ml/(kg/d)；b组为沙虫多糖低剂量组，该组小鼠每天灌胃给予沙虫多糖25mg/(kg/d)；c组沙虫多糖中剂量组，该组小鼠每天灌胃给沙虫多糖50mg/(kg/d)；d组沙虫多糖高剂量组，该组小鼠每天灌胃给予沙虫多糖100mg/(kg/d)。4组小鼠均自由饮水和进食。实验共给药10周，实验结束后取右侧股骨进行micro-ct(vivact40；scancomedicalag)扫描和三维重建。

2、micro-ct测量：

将处理好的小鼠股骨放入micro-ct仪，对股骨的近干骺段进行x射线扫描；扫描条件为：图像矩阵为2048×2048，整合时间为200ms，能量/强度为70kvp、114μa、8w；以0°旋转，进行扫描。扫描完成后，选取生长板远端1.0mm、层厚2.0mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(regionofinterest，roi)进行三维重组，最低阈值为160提取图像信息。获取重组图像后，使用micro-ct自带软件进行定量分析。采用spss12软件成组t检验进行统计分析。

3、实验结果：

如图2所示，与空白对照组相比较，沙虫多糖高、中、低剂量组小鼠骨密度(bmd)均明显上升。

对本领域的技术人员来说，可如以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。