二甲双胍和多西环素的组合物及其在制备细菌感染性疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于二甲双胍在细菌感染疾病中的潜在应用，具体涉及二甲双胍和多西环素在体内外的协同抗菌作用。

背景技术：

抗生素在现代医学中起到了举足轻重的作用，其对细菌性疾病的良好治疗效果挽救了无数生命。然而，近年来抗生素的大规模和不合理使用导致了细菌耐药性的大量产生、扩散和传播，这给人类的安全和畜禽养殖业的健康发展造成了巨大的威胁。迫切需要新型的抗菌策略去应对日益严重的抗生素危机。抗生素增效剂是指通过抑制细菌耐药或互补杀菌机制，从而增强抗生素抗菌活性的一类物质。最经典的增效剂是克拉维酸，它是β-内酰胺酶的抑制剂。克拉维酸和β-内酰胺类抗生素的联合使用可以有效治疗产β-内酰胺酶耐药细菌引起的感染。

多西环素又名强力霉素，是由土霉素6号位上脱氧而制成的半合成四环素类抗生素。其对多种革兰阳性菌和革兰阴性杆菌均具有较好的抗菌活性，属于广谱类抗生素。目前在人医临床中主要用于敏感细菌引起的呼吸系统、尿路感染及皮肤软组织感染。此外，因其具有良好的组织渗透性和较高的口服生物利用度等优点而被广泛应用于兽医临床，用于防治畜禽的细菌感染性疾病。然而，目前在人医或者兽医临床中都发现多西环素的耐药情况非常严重。大量细菌耐药性流行病学调查研究表明临床菌株的多西环素耐药率已经超过50％。多西环素耐药性的大量产生和快速传播严重影响了其在临床的使用疗效。本发明中，拟通过棋盘肉汤稀释法从已批准上市且非抗菌用途的化合物中筛选多西环素的增效剂，以恢复其对耐药细菌的抗菌活性。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供一种二甲双胍和多西环素的组合物及其在制备细菌感染性疾病的药物中的应用，以恢复多西环素对耐药细菌的抗菌活性。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种多西环素增效剂，其特征在于，是由二甲双胍和多西环素组成的组合物，二甲双胍和多西环素的质量比为1-150：1。

优选的，二甲双胍和多西环素的质量比为1-2：1。增效剂的有效剂量为50mg/kg以上(即≥50mg/kg)。

本发明还提供二甲双胍和多西环素的组合物在生物体内或体外的协同抗菌的应用。所述的生物指畜禽。

本发明还提供二甲双胍和多西环素的组合物在制备细菌感染性疾病的药物中的应用。

相对于现有技术，本发明阐明了人用降糖药二甲双胍可以恢复耐药细菌对多西环素的敏感性，并系统评价了两者联合使用在体内外的有效性，有助于开发出一类新型的抗生素增效剂，缓解危害日趋严重的多重耐药菌(mdr)问题。

附图说明

图1为多西环素和二甲双胍联合使用的时间杀菌曲线；dox,多西环素(32μg/ml)；met,二甲双胍(5mg/ml)；dox+met,多西环素(32μg/ml)+二甲双胍(5mg/ml)；

图2为多西环素和二甲双胍联合使用治疗大蜡螟幼虫细菌感染，可知多西环素和二甲双胍联合使用可以显著提高大蜡暝的存活率；

图3为多西环素和二甲双胍联合使用治疗小鼠大腿肌肉细菌感染，可知多西环素和二甲双胍联合使用在小鼠感染模型中的有效性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

icr雌性小鼠为扬州大学实验动物中心提供。

mhb肉汤培养基为含牛肉粉1.5g/l、可溶性淀粉1.5g/l和酸水解酪蛋白17.5g/l的水溶液。

实施例1、多西环素与二甲双胍的协同抗菌作用

采用棋盘分析法测定多西环素和二甲双胍对耐药细菌的协同抗菌活性，测试菌株见表1。

表1测试菌株

注：^a文献1为liuy，dings，dietrichr，e，zhuk.abiosurfactantinspiredheptapeptidewithimprovedspecificitytokillmrsa[j].angewandtechemieinternationaledition，2017，56(6)，1486-1490.

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)215(lzd^r+cfr)和粪肠球菌(enterococcusfaecalis)vrea4在文献1中的名称依次为、mrsat144、staphylococcusaureus215(lzd^r+cfr)和enterococcusfaecalisvrea4。

^b金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144为甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)215(lzd^r+cfr)携带有耐药基因cfr且对利奈唑胺耐药。粪肠球菌(enterococcusfaecalis)vrea4为万古霉素的耐药菌株。

棋盘分析法具体步骤如下：

1)用mhb肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液。

2)取二甲双胍，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为80mg/ml的二甲双胍溶液。

3)取多西环素，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为128μg/ml的抗菌药物溶液。

4)取96孔板，每孔加入100μlmhb肉汤培养基，最后一行每孔加入100μl步骤2)制备的多西环素溶液，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入步骤3)制备的抗菌药物溶液(每孔100μl)，倍比稀释至第十列，之后每孔加入100μl步骤1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h，观察二甲双胍和多西环素联合使用抑制细菌生长时二者的最低浓度组合。设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入100μlmhb肉汤培养基和100μl步骤1)制备的菌悬液。分级抑菌浓度fic指数按照以下公式进行计算：

fic＝mic(a联合应用)/mic(a单用)+mic(b联合应用)/mic(b单用)

试验结果见表2。结果表明二甲双胍可以显著增强多西环素对包括革兰氏阳性和阴性等多种耐药细菌的抗菌活性，增效倍数为8到32倍。联合使用的分级抑菌浓度指数(ficindex)小于0.5，表明两者联合使用具有显著的协同作用。

表2二甲双胍增强多西环素对多种耐药菌的抗菌活性。

^a多西环素单独使用时对耐药菌的最小抑菌浓度；^b加入二甲双胍后多西环素对

耐药菌的最小抑菌浓度；^c多西环素的抗菌活性提高倍数。

实施例2、多西环素与二甲双胍的时间杀菌曲线

分别在大肠杆菌e.colib2于bhi肉汤中培养2h(指数生长期)和5h(稳定期)后加入等体积的0.01mol/lpbs(ph＝7.2)、多西环素、二甲双胍和两者混合液，使得药物终浓度为多西环素(32μg/ml)、二甲双胍(5mg/ml)和混合浓度(32μg/ml多西环素+5mg/ml二甲双胍)。而后，分别于4h、8h、12h和24h取菌液100μl涂布于mha培养基上，培养过夜后进行菌落计数。

实验结果见图1。结果表明，与多西环素相比，两者联合使用对指数生长期和稳定期细菌都具有显著的杀菌作用，细菌数降低了至少2log10cfu/ml。

实施例3、多西环素与二甲双胍联合使用治疗大蜡螟幼虫细菌感染

多西环素溶液：将15mg多西环素溶于10ml无菌水得到。

二甲双胍溶液：将15mg二甲双胍溶于10ml无菌水得到。

混合溶液：将15mg多西环素和15mg二甲双胍溶于10ml无菌水得到。

大肠杆菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬大肠杆菌(escherichiacoli)b2，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(escherichiacoli)b2的浓度为1.0×10⁸cfus/ml。

1、大蜡螟幼虫分组处理

取32只体重为300mg的大蜡螟幼虫，随机分成vehicle组、多西环素治疗组、二甲双胍治疗组和协同治疗组(每组10只)，分别进行如下处理：

vehicle组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01mlpbs缓冲液；

多西环素治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01ml多西环素溶液；

二甲双胍治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01ml二甲双胍溶液；

协同治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01ml混合溶液。

2、统计存活率

分别于完成步骤1后第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，统计大蜡螟幼虫的存活率。

实验结果见图2。结果表明，与多西环素治疗组相比，协同治疗组的大蜡螟幼虫存活率显著提高；第5天时多西环素治疗组的大蜡螟幼虫存活率仅为30％，而第5天协同治疗组的大蜡螟幼虫存活率可达到80％。

实施例4、多西环素与二甲双胍联合使用治疗小鼠大腿肌肉细菌感染

多西环素溶液：将150mg多西环素溶于10ml无菌水得到。

二甲双胍溶液：将150mg二甲双胍溶于10ml无菌水得到。

混合溶液1：将150mg多西环素和30mg二甲双胍溶于10ml无菌水得到。

混合溶液2：将150mg多西环素和150mg二甲双胍溶于10ml无菌水得到。

大肠杆菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬大肠杆菌(escherichiacoli)b2，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(escherichiacoli)b2的浓度为1.0×10⁷cfus/ml。

1、小鼠分组处理

取48只体重为27-30g的icr雌性小鼠，随机分成vehicle组、多西环素治疗组、二甲双胍治疗组和协同治疗组(每组8只)，分别进行如下处理：

pre-treatment组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液，1h后将小鼠安乐死，取小鼠右侧大腿肌肉进行菌落数目测定；

vehicle组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.1mlpbs缓冲液；

多西环素治疗组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.1ml多西环素溶液；

二甲双胍治疗组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.1ml二甲双胍溶液；

协同治疗组1：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.1ml混合溶液1。

协同治疗组2：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.1ml混合溶液2。

2、测定小鼠大腿感染的菌落数

将完成步骤1后第24h的小鼠安乐死，取右侧大腿肌肉，将肉块匀浆、混匀，然后取适量涂布于mha培养基上，测定菌落数。

实验结果见图3。结果表明，与多西环素单独治疗组相比，协同治疗组均能有效的降低小鼠大腿感染的菌落数，且至少降低2log10cfu/thigh。

以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。