改善疫苗功效的系统和方法与流程
本申请要求2017年1月5日提交的美国临时专利申请号62/442,903的优先权，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文中，就如同在本文中全面陈述一样。
对序列表的引用
2018年1月5日左右创建的文件大小为114kb的名为“f053-0055pct序列表_st25.txt”的计算机可读文本文件包含本申请的序列表，并且以引用的方式整体并入本文中。
本公开提供增加需要t细胞介导的免疫或者在t细胞介导的免疫下变得更有效的疫苗的功效的系统和方法。所述系统和方法利用这样的多核苷酸，其对t细胞进行遗传修饰以使其表达对施用的疫苗抗原有特异性的t细胞受体。
背景技术：
淋巴细胞是参与自身/非自身识别并且基于免疫记忆获得长期免疫的免疫系统的细胞。淋巴细胞可以广泛地表征为b细胞或t细胞。b细胞的特征在于存在膜结合的免疫球蛋白(抗体)分子，所述免疫球蛋白分子充当结合可溶性抗原的受体。t细胞的特征在于存在膜结合的t细胞受体(tcr)。仅当抗原与主要组织相容性复合体(mhc)分子缔合(即，抗原不可溶)时，tcr才结合抗原。t细胞应答的特异性由结合特定抗原的特定tcr赋予。
t淋巴细胞包括cd4+t细胞和cd8+t细胞。这些类型的t细胞部分地通过其分别表达细胞表面分子cd4和cd8来区别。然而，其也具有不同的功能。cd4+t细胞，也称为辅助t细胞(th)，促进其他细胞类型的活动。例如，cd4+th1细胞分泌激活细胞毒性t细胞和巨噬细胞以破坏携带吞噬的微生物的细胞的各种细胞因子。cd4+th2细胞分泌激活b细胞以产生抗体的细胞因子。cd8+细胞是可以直接杀死异常或受感染的细胞的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。
疫苗是通过将免疫系统先发暴露于病原体或异常细胞类型的抗原而产生针对特定病原体(例如，感染性微生物)或异常细胞类型(例如，癌细胞)的免疫系统应答的制剂。病原体抗原可以是病原体的完整但非感染性形式(例如，热灭活的)。抗原也可以是病原体的蛋白质或蛋白质片段或由异常细胞类型优先表达的蛋白质或蛋白质片段。当免疫系统在先发暴露后识别疫苗抗原时，其可以产生长期免疫记忆，因此如果再次遇到抗原，免疫系统则可以快速且有效地装配有效应答。
当将疫苗递送到受试者时，免疫系统的抗原呈递细胞(apc)摄取抗原组分并将其或其片段呈递给b细胞和t细胞。如果在生命的稍后时间再次遇到抗原，则表达对所呈递的抗原有特异性的受体的b细胞将产生并分泌在体内循环以引发快速稳健的免疫应答的抗体。设计标准疫苗以经由通过b细胞产生的这类抗体应答起作用。然而，b细胞免疫的有效性限于可溶性(即，细胞外病原体)。细胞内存在的病原体(例如，引起aids、疟疾、疱疹和衣原体的那些)和与细胞表面结合的病原体(例如，癌抗原)对b细胞抗体不敏感。另外，当疫苗抗原被cd4+辅助t细胞相似地识别时，b细胞免疫的有效性增强。
对于保持细胞缔合的抗原，t细胞介导的免疫是有效免疫所必需的。然而，需要t细胞介导的免疫的疫苗经常失败，因为宿主(例如，人、研究动物)不具有表达识别和结合所呈递的疫苗抗原的特定tcr的t细胞。免疫系统受损的人(例如，老年人)特别容易受到这个问题的困扰，因为他们的新t细胞产量下降导致他们的tcr库中出现“漏洞”。这些问题可能使疫苗无效并使患者对与细胞相关的抗原相关的病况(例如，细胞内感染和癌症)保护不良。
目前，根本没有医生可以用来治疗需要t细胞介导的免疫的感染性疾病和癌症的可靠疫苗。
技术实现要素：
本公开提供增强需要t细胞介导的免疫或在t细胞介导的免疫下变得更有效的疫苗的有效性的系统和方法。所述系统和方法依赖于对t细胞进行遗传修饰以使其表达t细胞受体(tcr)，所述t细胞受体识别并结合施用到受试者的疫苗抗原。通过确保受试者具有表达将识别并结合疫苗抗原的tcr的t细胞，t细胞介导的疫苗接种的有效性得以大大扩展。
特定的实施方案包括向受试者施用多核苷酸，其中所述多核苷酸编码结合施用到受试者的疫苗抗原的tcr。
在特定的实施方案中，将多核苷酸作为纳米粒子(np)的一部分施用到受试者。np可以包含增强多核苷酸的递送和/或表达的特征。例如，在特定的实施方案中，np包含缩合并保护多核苷酸免于酶降解的载剂分子。在特定的实施方案中，np包含包衣，所述包衣屏蔽包封的多核苷酸并降低或防止脱靶结合。
在特定的实施方案中，np包含选择性t细胞靶向和递送剂(t-da)。t-da允许将np施用到受试者并引起多核苷酸选择性递送到选定的t细胞。选择性修饰cd4+t细胞以表达tcr对于改善b细胞介导的疫苗接种的功效特别有用。选择性修饰cd8+细胞毒性t细胞以表达tcr对于改善t细胞介导的疫苗接种特别有用。两种方法都为t细胞提供疫苗抗原识别能力。重要的是，在并入t-da的实施方案中，受试者的现有t细胞可以在例如肌肉内施用np后在体内进行修饰。
np还可以包含其他特征以促进递送到受试者t细胞的多核苷酸的表达。例如，np可以包含内体释放剂和/或核靶向剂。内体释放剂促进递送的多核苷酸从靶向t细胞的内体逃逸。核靶向剂将多核苷酸导向靶向细胞的细胞核和/或将其导入细胞核中。
特定的实施方案组合这些特征的各方面。例如，np可以包含
(i)编码tcr的多核苷酸，所述tcr结合施用到受试者的疫苗抗原；
(ii)缩合载剂分子；(iii)包衣；(iv)将np选择性地导向到确定的t细胞(例如，cd4+或cd8+t细胞)的t-da；(v)内体释放剂；和(iv)核靶向剂。所述np可以在接收疫苗抗原的临床相关时间窗内施用到受试者。
本文公开的系统和方法特别可用于增加治疗需要强t细胞免疫的慢性病况的疫苗的功效。这类慢性病况的实例包括慢性感染(例如，获得性免疫缺陷综合征(aids)、疟疾、疱疹、衣原体、埃巴(epsteinbarr)病毒(ebv)、肺炎球菌和乙型肝炎)和癌症。
附图说明
本文提交的许多附图利用彩色更好地理解。申请人将附图的彩色版本视为原始提交的一部分，并保留在以后的程序中呈递附图的彩色图像的权利。
图1.说明通过合理的t细胞受体编程来预防疫苗失败的总体方法的示意图。纳米粒子(np)用于将工程化的tcr基因引入循环宿主t细胞中，赋予其抗原识别能力，然后使用通过转移的tcr识别的肽疫苗选择性扩增。
图2.说明所公开的系统和方法优于常规疫苗的优点的示意图：上图显示注射疫苗抗原/佐剂如何经常失败，因为免疫的个体具有很少的具有适当受体的t细胞。中图说明np可以如何用于将工程化的tcr基因引入循环t细胞，赋予其抗原识别能力。然后，这些使用通过转移的tcr识别的肽疫苗选择性地扩增。下图显示用疫苗特异性tcr编程cd4辅助t细胞可以如何通过产生高亲和力记忆b细胞来推动保护性抗体的产生。
图3a-3c.肌肉内注射携带dna的纳米粒子(np)可以将疫苗特异性tcr高效地引入外周t细胞库中。(3a)在所述实验中使用的t细胞靶向dna纳米粒子的示意图。np通过将质粒dna与聚(β-氨基酯)聚合物混合来制备，聚(β-氨基酯)聚合物将质粒dna缩合成纳米尺寸的复合体。所述粒子通过将抗cd8抗体与聚谷氨酸(pga)偶联来靶向，形成静电吸附到粒子上的缀合物。插图是np的电子显微照片；比例尺：100nm。还描绘了两种纳米粒子包封的质粒，其编码ova特异性ot-1tcr和极度活跃的ipb7转座酶。(3b)引流淋巴结中淋巴细胞的细胞计数分析。每个图的左下象限和右下象限中的细胞百分比分别为：82.7和17.3(仅疫苗，第0天)；75.1和24.8(仅疫苗，第7天)；85.3和14.7(仅疫苗，第30天)；85.3和14.7(仅ovatcr纳米粒子，第0天)；84.2和15.7(仅ovatcr纳米粒子，第7天)；87.5和12.4(仅ovatcr纳米粒子，第30天)；86.7和13.2(疫苗+ovatcr纳米粒子，第0天)；80.3和16.7(疫苗+ovatcr纳米粒子，第7天)；80.6和19.1(疫苗+ovatcr纳米粒子，第30天)。(3c)显示在第30天np编程的ova反应性记忆t细胞的绝对数量的曲线图。
图4a、图4b.将编码tcr1045的t细胞靶向的np与间皮素(msln)疫苗组合显著延长具有确立的胰腺导管腺癌的kraslsl-g12d/+；trp53lsl_r172h/+；p48cre/+(kpc)小鼠的存活率。(4a)4月龄kpc小鼠的胰腺中的示例性肿瘤质量。(4b)接受编码tcr1045的t细胞靶向的np、msln疫苗或两者的kpc小鼠的存活率。对照组未接受治疗。ms＝平均存活率。
图5.编码cd4跨膜结构域的代表性基因序列(seqidno：40)。
图6.编码鼠科密码子优化的piggybac转座酶的代表性cdna序列(genbank登录号：ef587698；seqidno：142)。
具体实施方式
淋巴细胞是参与自身/非自身识别并且基于免疫记忆获得长期免疫的免疫系统的细胞。淋巴细胞可以广泛地表征为b细胞或t细胞。b细胞的特征在于存在膜结合的免疫球蛋白(抗体)分子，所述免疫球蛋白分子充当结合可溶性抗原的受体。t细胞的特征在于存在膜结合的t细胞受体(tcr)。仅当抗原与主要组织相容性复合体(mhc)分子缔合(即，抗原不可溶)时，tcr才结合抗原。t细胞应答的特异性由结合特定抗原的特定tcr赋予。
t淋巴细胞包括cd4+t细胞和cd8+t细胞。这些类型的t细胞部分地通过其分别表达细胞表面分子cd4和cd8来区别。然而，其也具有不同的功能。cd4+t细胞，也称为辅助t细胞(th)，促进其他细胞类型的活动。例如，cd4+th1细胞分泌激活细胞毒性t细胞和巨噬细胞以破坏携带吞噬的微生物的细胞的各种细胞因子。cd4+th2细胞分泌激活b细胞以产生抗体的细胞因子。cd8+细胞是可以直接杀死异常或受感染的细胞的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)。
疫苗是通过将免疫系统先发暴露于抗原而产生针对特定抗原的免疫系统应答的制剂。病原体抗原可以是病原体的完整但非感染性形式(例如，热灭活的)。抗原还可以是病原体的蛋白质或蛋白质片段或由异常细胞类型(例如，癌细胞)表达的蛋白质或蛋白质片段。当免疫系统在先发暴露后识别抗原时，其可以产生长期免疫记忆，因此如果再次遇到抗原，免疫系统可以快速且有效地装配有效应答。
当将疫苗递送到受试者时，免疫系统的抗原呈递细胞(apc)摄取抗原组分并将其或其片段呈递给b细胞和t细胞。如果在生命的稍后时间再次遇到抗原，则表达对所呈递的抗原有特异性的受体的b细胞将产生并分泌在体内循环以引发快速稳健的免疫应答的抗体。设计标准疫苗以经由通过b细胞产生的这类抗体应答起作用。然而，b细胞免疫的有效性限于可溶性(即，细胞外)病原体。细胞内存在的病原体(例如，引起aids、疟疾、疱疹和衣原体的那些)或保持细胞缔合的病原体(例如，癌细胞抗原)对b细胞抗体不敏感。另外，当疫苗抗原被cd4+辅助t细胞相似地识别时，b细胞免疫的有效性增强。
对于保持细胞缔合的(例如，细胞内或膜结合的)抗原，t细胞介导的免疫是有效免疫所必需的。然而，需要t细胞介导的免疫的疫苗经常失败，因为宿主(例如，人、研究动物)不具有表达识别并结合所呈递的疫苗抗原的特定tcr的t细胞。免疫系统受损的人(例如，老年人)特别容易受到这个问题的困扰，因为他们的新t细胞产量下降导致他们的tcr库中出现“漏洞”。这些问题可能使疫苗无效并使患者对由细胞内病原体和/或癌症引起的感染保护不良。
目前，根本没有医生可以用来治疗需要t细胞介导的免疫的感染性疾病和癌症的可靠疫苗。
本公开提供增强需要t细胞介导的免疫或在t细胞介导的免疫下变得更有效的疫苗的有效性的系统和方法。所述系统和方法依赖于对t细胞进行遗传修饰以使其表达t细胞受体(tcr)，所述t细胞受体识别并结合施用到受试者的疫苗抗原。通过确保受试者具有表达将识别并结合疫苗抗原的tcr的t细胞，t细胞介导的疫苗接种的有效性得以大大扩展。
特定的实施方案包括向受试者施用多核苷酸，其中所述多核苷酸编码结合施用到受试者的疫苗抗原的tcr。
在特定的实施方案中，将多核苷酸作为纳米粒子(np)的一部分施用到受试者。np可以包含增强多核苷酸的递送和/或表达的特征。例如，在特定的实施方案中，np包含缩合并保护多核苷酸免于酶降解的载剂分子。如本文其他地方更详细地公开，此类载剂可以包含带正电荷的脂质和/或聚合物。特定的实施方案利用聚(β-氨基酯)。
在特定的实施方案中，np包含包衣，所述包衣屏蔽包封的多核苷酸并降低或防止脱靶结合。通过将np的表面电荷降至中性或阴性来降低或防止脱靶结合。如本文其他地方更详细地公开，包衣可以包括中性或负性的基于聚合物和/或脂质体的包衣。特定的实施方案利用聚谷氨酸(pga)作为np包衣。当使用时，包衣未必必须涂覆整个np，但必须足以降低np的脱靶结合。
在特定的实施方案中，np包含选择性t细胞靶向和递送剂(t-da)。t-da允许将np施用到受试者并引起多核苷酸选择性递送到选定的t细胞。选择性修饰cd4+t细胞以表达tcr对于改善b细胞介导的疫苗接种的功效特别有用。选择性修饰cd8+细胞毒性t细胞以表达tcr对于改善t细胞介导的疫苗接种特别有用。两种方法都为t细胞提供疫苗抗原识别能力。重要的是，在并入t-da的实施方案中，受试者的现有t细胞可以在例如肌肉内施用np后在体内进行修饰。
np还可以包含其他特征以促进递送到受试者t细胞的多核苷酸的表达。例如，np可以包含内体释放剂和/或核靶向剂。内体释放剂促进递送的多核苷酸从靶向t细胞的内体逃逸。核靶向剂将多核苷酸导向靶向细胞的细胞核和/或将其导向到细胞核中。
特定的实施方案组合这些特征的各方面。例如，np可以包含
(i)编码tcr的多核苷酸，所述tcr结合施用到受试者的疫苗抗原；
(ii)带正电荷的载剂；(iii)中性或带负电荷的包衣；(iv)将np选择性地导向到确定的t细胞(例如，cd4+t或cd8+t细胞)的t-da；(v)内体释放剂；和(vi)核靶向剂。所述np可以在接收疫苗抗原的临床相关时间窗内施用到受试者。
本文公开的系统和方法特别可用于增加治疗需要强t细胞免疫的慢性感染和癌症的疫苗的功效。这类慢性感染的实例包括获得性免疫缺陷综合征(aids)、疟疾、疱疹、衣原体、埃巴病毒(ebv)、肺炎球菌和乙型肝炎。
图2提供本文公开的系统和方法相关的示意图。上面3个图描绘在常规疫苗抗原施用下观察到的差的t细胞引发。中间3个图描绘cd8+t细胞的遗传重编程以识别施用的疫苗抗原，从而产生增加的t细胞引发以支持t细胞介导的免疫。底部3个图描绘cd4+t细胞的遗传重编程以识别施用的疫苗抗原，从而产生增加的t细胞引发以帮助并支持b细胞的稳健抗体产生。因此，特定的实施方案包括向受试者施用多核苷酸，其中所述多核苷酸对t细胞进行遗传重编程以表达结合施用到受试者的疫苗抗原的tcr。
现在更详细地并且按以下顺序描述本公开的各方面：(i)tcr；(ii)编码工程化tcr的多核苷酸(pn)；(iii)纳米粒子(np)；(iv)t细胞靶向和递送剂(t-da)；(v)内体释放剂(era)；(vi)核靶向剂(nta)；(vii)疫苗抗原；(viii)疫苗佐剂；(ix)组合物；(x)试剂盒；以及(xi)使用方法。
i.t细胞受体(tcr)。如所指示，tcr是在t细胞表面上见到的分子，其识别并结合与主要组织相容性复合体(mhc)分子缔合的抗原。
每个tcr包含两种二硫化物连接的异源二聚跨膜蛋白。也就是说，每个tcr都是异源二聚体。在外周血中95％的t细胞中，每个tcr包含阿尔发(α)链和贝塔(β)链。外周血中剩余5％的t细胞包含伽马(γ)链和德尔塔(δ)链。
每个tcr链包含可变结构域，其赋予t细胞的抗原特异性。这些可变结构域与ig可变(v)链的可变结构域相似。
这些链的其他部分包含几个不变结构域，诸如恒定结构域、跨膜结构域和短胞质尾区。膜锚定的c末端结构域类似于ig恒定(c)结构域。
为了实现功能形式，tcr与cd3非共价缔合，形成tcr-cd3膜复合体。cd3，tcr的信号转导元件，由一组称为γ、δ、艾普西龙(∑)、泽塔(z)和埃塔(h)链的不变蛋白组成。γ、δ和∑链在结构上有关，各自含有ig样胞外恒定结构域，其后是跨膜区和超过40个氨基酸的胞质结构域。z和h链具有明显不同的结构：两者都具有仅9个氨基酸的非常短的胞外区、跨膜区和在z和h链中分别包含113和115个氨基酸的长胞质尾区。cd3复合体中的不变蛋白链缔合以形成具有γ链的∑链(∑γ)或具有δ链的∑链(∑δ)的非共价异源二聚体或z链和h链的非共价异源二聚体(zh)，或两个z链的二硫化物连接的同源二聚体(zz)。90％的cd3复合体并入zz同源二聚体。
cd3链的胞质区包含称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的基序。所述基序存在于许多其他受体中，这些受体包括b细胞受体复合体的ig-α/ig-β异源二聚体和ige和igg的fc受体。itam位点与胞质酪氨酸激酶缔合，并在tcr介导的触发后参与信号转导。在cd3中，γ、δ和∑链各自含有单一itam拷贝，而z和h链在其长胞质区中带有三个itam。实际上，z和h链已被认为在t细胞激活信号转导途径中起主要作用。
存在许多方法来鉴定和选择特定的tcr以在所公开的系统和方法的特定应用内使用。例如，结合特定抗原片段的许多tcr的序列是已知的并且是公众可获得的。
还可以通过例如分离结合特定疫苗抗原/mhc复合体的t细胞和测序结合所述复合体的tcr链来鉴定与特定疫苗一起使用的tcr。例如，可以通过在抗原/mhc复合体存在下体外培养分离的人t细胞来诱导抗原特异性t细胞。编码结合抗原/mhc复合体的tcr的tcr基因可以通过例如5′race工序使用对应于对tcrα链基因和tcrβ链基因具有特异性的序列的引物容易地克隆。
已经产生了天然tcr配体的各种类似物，其包含与特异性肽抗原结合的mhc分子的胞外结构域。几种这样的类似物已被纯化为淋巴细胞膜的去污剂提取物或作为重组蛋白产生(参见，例如，sharma等，pnas.88：11465-69，1991；kozono等，nature369：151-54，1994；arimilli等，j.biol.chem.270：971-77，1995；nag，pnas90：1604-08，1993；nag等，j.biol.chem.271：10413-18，1996；rhode等，j.immunol.157：4885-91，1996；fremont等，science272：1001，1996；sharma等，proc.natl.acad.sci.usa88：11405，1991；nicolle等，j.clin.invest.93：1361，1994；spack等，cnsdrugrev.4：225，1998)。这些类似物可以用于分离t细胞，然后对特定应用的目标tcr进行测序。
在特定的实施方案中，可能需要在测序后配对tcr链(即，执行配对链分析)。可以利用各种方法配对结合抗原/mhc复合体的分离的α和β链，使得配对产生当由遗传修饰的t细胞表达时结合抗原/mhc复合体的tcr。在特定的实施方案中，测序后配对可能不是必要的或可能相对简单，例如在其中α和β链配对信息在所述工序中没有丢失的实施方案中，诸如如果要从单个细胞中进行测序。在特定的实施方案中，可以通过计算机方法经计算机模拟辅助链配对。例如，专门的可公开获得的免疫学基因比对软件可以从imgt、joinsolver、vdjsolver、soda、ihmmune-align或用于注释vdj基因区段的其他相似工具得到。
在特定的实施方案中，可以使用vdj抗体执行链配对。例如，可以获得用于鉴定的区段的抗体，并使用所述抗体纯化在其(表面)受体中表达所述基因区段的细胞亚群(例如，使用facs或用微珠进行的免疫磁性选择)。然后可以从已经针对所需基因区段纯化的该细胞亚群进行测序。如果需要，可以比第一轮测序更深入地(即，以更高的分辨率)进行该二级测序。在该第二序列数据集中，将存在少得多的诱导克隆型，大大简化了链配对的任务。根据基因区段，可能只有一个诱导的α链和一个诱导的β链。
在特定的实施方案中，可以使用多孔测序执行链配对。例如，可以将基因片段纯化的细胞或未纯化的细胞分离到微孔板中，其中每个微孔具有非常少量的细胞。可以单独地在每个孔中扩增并测序细胞，这提供通过在单个细胞基础上测序，促进诱导的α和β链配对来配对目标链的另一方法。诸如
在针对特定疫苗应用选择和/或鉴定目标tcr之后，可以使用tcr的任何部分并且可以使用tcr的变体，只要当由遗传修饰的t细胞表达时，表达的tcr结合预期的疫苗/mhc复合体并引起t细胞激活。
在特定的实施方案中，工程化tcr包括单链t细胞受体(sctcr)，所述单链t细胞受体包含vα/β和cα/β链(例如，vα-cα、vβ-cβ、vα-vβ)或包含对目标靶标(例如，肽-mhc复合体)具有特异性的vα-cα、vβ-cβ、vα-vβ对。
在特定的实施方案中，工程化tcr包含与已知或鉴定的tcrvα、vβ、cα或cβ的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，其中每个cdr包含自特异性结合目标靶标的tcr或其片段或衍生物的零变化或最多一处、两处或三处变化。
在特定的实施方案中，工程化tcr包含源自或基于已知或鉴定的tcr(例如，高亲和力tcr)的vα、vβ、cα或cβ的vα、vβ、cα或cβ区，并且，当与已知或鉴定的tcr的vα、vβ、cα或cβ比较时，包含一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)插入、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)缺失、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以在vα、vβ、cα或cβ区中的任何位置，包括在这些区的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个cdr包含零变化或至多一处、两处或三处变化并且条件是含有修饰的vα、vβ、cα或cβ区的靶结合结构域仍然可以以与野生型相似的亲和力和作用特异性结合其靶标。
存在两种类型的可以通过tcr结合的mhc分子：mhci类分子和mhcii类分子。在表达的tcr和本文所述的特定用途的背景下，表达mhci类限制性或mhcii类限制性tcr可能是有用的。因此提供了对这些不同类别的mhc分子的讨论。
mhci类分子包含与12kda的单态性(人)非mhc编码的轻链蛋白(称为β2微球蛋白(β2m))非共价缔合的多态性重链(α)。α重链是45kda的多态性跨膜糖蛋白，其包含3个各自包含90个氨基酸的胞外结构域(α1在n-末端，α2和α3)、40个氨基酸的跨膜区和30个氨基酸的胞质尾区。α1和α2结构域，即远膜结构域，形成具有足够大小以结合8-10个氨基酸的肽的肽结合沟或裂缝，而α3结构域靠近质膜。β2m具有单个免疫球蛋白(ig)样结构域，未锚定到质膜，并且主要与α3链相互作用，α3链也具有特征性ig折叠。在人类中，存在三种α链基因，称为hla-a、hla-b和hla-c，已经对其中的每一个鉴定出多个等位基因。在小鼠中，存在三种α链基因，称为h-2k、h-2d和h-2l。
mhcii类分子包含两条不同的多肽链，33-kdα链和28-kdaβ链，其通过非共价相互作用缔合。与i类mhc分子一样，ii类mhc分子是膜结合糖蛋白，其含有胞外结构域、跨膜区段和胞质尾区。这些非共价异源二聚复合体中的每条链都包含两个胞外结构域：α1和α2结构域以及β1和β2结构域。ii类分子的远膜结构域由α1结构域和β1结构域组成，并且形成具有足以结合通常具有13-18个氨基酸的肽的尺寸的肽结合沟或裂缝。近膜结构域α2和β2与ig恒定(c)结构域具有结构相似性。
已经详尽地研究并描述了在哺乳动物中编码缔合以形成mhc复合体的各种多肽链的基因。在人类中，mhc分子(i类β2m除外)在位于6号染色体上的基因组的hla区中编码。存在三种i类mhcα-链编码基因座，称为hla-a、hla-b和hla-c。在mhcii类蛋白的情况下，存在三对α和β链基因座，称为hla-dr(a和b)、hla-dp(a和b)和hla-dq(a和b)。在大鼠中，i类α基因被命名为rt1.a，而ii类基因被称为rt1.bα和rt1.bβ。关于mhc复合体的结构、功能和遗传学的更详细描述可以在例如免疫生物学：健康与疾病的免疫系统，janeway和travers，currentbiologyltd./garlandpublishing，inc.(1997)以及bodmer等，(1994)″nomenclatureforfactorsofthehlasystem″tissueantigens，第44期，第1-18页中找到。
在t细胞发育期间，胸腺中的t细胞呈现肽/hla复合体并基于该相互作用进行选择。t细胞选择可以产生限于与特定类别的hla分子的相互作用，称为hla-限制的t细胞。例如，在选择期间，由于tcr与肽/hlai类复合体之间的有效相互作用，t细胞可以分化成i类限制性cd8+t细胞，或者由于tcr和肽/hlaii类复合体之间的有效相互作用，t细胞可以成为ii类限制性cd4+t细胞。tcr的互补区1-3(cdr1-3)与肽/hla复合体啮合。因此，cdr1-3的氨基酸序列可以是t细胞是hlai类限制性还是hlaii类限制性的决定子。辅受体表达也是t细胞类别限制的重要特征。为了响应抗原启动t细胞激活的信号传导，hlai类分子可以与cd4+辅受体相互作用，而hlaii类分子可以与cd8+辅受体相互作用。因此，经工程化以表达与肽/hlai类复合体啮合的tcr的t细胞如果表达辅受体cd8，则可以被激活，而经工程化以表达与肽/hlaii类复合体啮合的tcr的t细胞如果表达辅受体cd4，则可以被激活。
因此，在缺少改变以下的基因工程化的情况下，cd8+t细胞识别mhci类分子，而cd4+t细胞识别mhcii类分子。然后，在特定的实施方案中，可以对cd8+t细胞进行遗传修饰以表达hla-i类限制性tcr，并且可以对cd4+t细胞进行遗传修饰以表达hla-ii类限制性tcr。
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
或
在特定的实施方案中，tcr可以包含具有cdr3序列：ldyankmi(seqidno：15)的鼠科vα4链和具有cdr3序列：pqdtqyff(seqidno：16)的vβ9链，描述于stromnes，im等，(2015)，同上。鼠科tcr，称为tcr1045，源自经工程化以表达重组鼠科msln并对msln406-414表位具有特异性的msln-/-小鼠的t细胞克隆。tcr1045以高亲和力结合msln406-414肽(gqkmnaqai，seqidno：17)。在特定的实施方案中，tcr1045的vα4和vβ9基因已经过密码子优化并通过猪捷申病毒属-12a元件连接。
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
在特定的实施方案中，tcr可以包含：α链：
在特定的实施方案中，tcr可以包括工程化tcr，诸如wo2011039507中描述的。这类tcr包含由内部自分裂猪捷申病毒属2a序列分开的α链和β链，并结合人疱疹病毒-5或巨细胞病毒(cmv)抗原。一个实例包括抗cmv人工tcr：
ii.编码tcr的多核苷酸(pn)。pn描述了一种核酸分子，其包含编码结合抗原/mhc复合体的tcr的核酸序列，使得在引入t细胞后，pn引起编码的tcr的表达。施用的pn可以包含基因。术语“基因”是指编码用于本文所述的系统或方法的tcr的核酸序列。“基因”的定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中这类改变不会显著影响编码的tcr的功能。术语“基因”不仅可以包括编码序列，还可以包括调控区，诸如启动子、增强子和终止区。所述术语还可以包括从mrna转录物剪接的所有内含子和其他dna序列，连同由替代剪接位点产生的变体。编码tcr的核酸序列可以是指导tcr表达的dna或rna。这些核酸序列可以是被转录成rna的dna链序列或被转译成蛋白质的rna序列。核酸序列包括全长核酸序列以及源自全长蛋白质的非全长序列。这些序列还可以包含可以引入以在特异性t细胞中提供密码子优选性的一种或多种天然序列的简并密码子序列。编码tcr的许多基因序列可在公开可获得的数据库和出版物中获得。本领域普通技术人员还可以基于目标tcr的鉴定得到这类基因序列。
“编码”是指pn如质粒、基因、cdna或mrna中的核苷酸序列用作合成tcr的模板的性质。如果由基因产生的mrna的转录和转译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则pn可以例如编码蛋白质。
在特定的实施方案中，pn包含质粒、cdna或mrna，其包含用于表达tcr的基因。合适的质粒包含标准质粒载体和可以用于将基因转移到t细胞的小环质粒。pn(例如，小环质粒)还可以包含任何额外的序列信息，以促进遗传物质(例如，编码对抗原有特异性的tcr的序列)向t细胞的转移。例如，pn可以包含启动子，诸如一般启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子和/或对细胞核或细胞质具有特异性的启动子。启动子和质粒(例如，小环质粒)通常是本领域熟知的，并且可以使用常规技术制备。
如本文进一步描述，pn可以用于转染t细胞。除非另有说明，否则术语转染或转染的可以用于指示t细胞中存在外源pn或由其表达的多肽。已知许多载体能够介导pn向淋巴细胞的转移，正如本领域已知的。
在特定的实施方案中，转染的pn可以编辑t细胞的抗原特异性而不影响脱靶的旁观者细胞(即，提供如本文定义的选择性递送)。例如，递送的基因可以在t细胞特异性启动子的控制下表达。在特定的实施方案中，此类启动子可以包含在小环质粒中，所述小环质粒是用于非病毒基因转移的超螺旋dna分子形式，其既不具有细菌复制起点，也不具有抗生素抗性标志。因此，它们比目前用于基因疗法的标准质粒更小并且可能更安全。
为了维持转移的tcr基因例如在快速分裂的t细胞中的表达，也可以将支架/基质附着区插入pn中。包含与s/mar元件连接的表达盒的pn可以在分裂细胞中自主地染色体外复制。在特定的实施方案中，含piggybac或睡美人转座酶的质粒也可以用于将tcr基因稳定地整合到转染细胞的基因组中。维持表达的其他选择包括智人转座子衍生的buster1转座酶样蛋白基因；人内源性逆转录病毒h蛋白酶/整合酶衍生的orf1；智人cas-br-m(鼠科)亲嗜性逆转录病毒转化序列；智人内源性逆转录病毒序列k；智人内源性逆转录病毒家族w；智人line-1型转座酶结构域；和智人pogo可转座元件。特定的实施方案可以利用极度活跃的ipb7转座酶。
当递送的pn是mrna时，骨架修饰可以增加mrna的稳定性，从而对过早的裂解具有抗性。
在特定的实施方案中，自复制mrna构建体可以用于确保持久的转基因表达而无需宿主基因组整合。自复制rna可以指编码rna复制机制的rna分子，因此在转译时，顺式编码的基因可以从原始模板分子产生新的rna拷贝。可以使用衍生自rna病毒如甲病毒和瘟病毒的序列设计自复制rna。设计和使用自复制rna分子用于递送mrna的技术可以在例如wo/2011/005799、wo/2009/146867和geall，a等，2012.procnatlacadsciusa.109(36)：14604-14609中找到。
在特定的实施方案中，pn包含合成mrna。在特定的实施方案中，使用5′-加帽使合成mrna工程化以增加细胞内稳定性。多个不同的5′-帽结构可以用于产生合成mrna分子的5′-帽。例如，抗反转帽类似物(arca)帽含有5′-5′-三磷酸鸟嘌呤-鸟嘌呤键，其中一个鸟嘌呤含有n7甲基以及3′-o-甲基。合成mrna分子也可以使用负责产生5′-帽结构的酶在转录后加帽。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2′-o-甲基转移酶可以在mrna的5′-最核苷酸和鸟嘌呤核苷酸之间产生经典的5′-5′-三磷酸键，其中鸟嘌呤含有n7甲基化且最终的5′-核苷酸含有产生cap1结构的2′-o-甲基。这产生具有更高的转译能力和细胞稳定性以及细胞促炎细胞因子的激活降低的帽。
合成mrna或其他pn也可以是环状的。pn可以是环化或连环化的，以产生转译能力分子，以辅助poly-a结合蛋白和5′-端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环化的机制可以通过至少3种不同的路径发生：1)化学，2)酶，和3)核酶催化。新形成的5′-/3′-键可以是分子内或分子间键。
在第一路径中，pn的5′-端和3′-端可以含有化学反应性基团，当它们靠近在一起时，在分子的5′-端和3′-端之间形成新的共价键。5′-端可以含有nhs-酯反应基团，且3′-端可以含有3′-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中在合成pn分子的3′-端上的3′-氨基末端的核苷酸将在5′-nhs-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5′-/3′-酰胺键。
在第二路径中，t4rna连接酶可以用于将5′-磷酸化pn酶连接到核酸的3′-羟基，形成新的磷酸二酯键。在一种示例性反应中，根据制造商的方案，可以将1μg核酸分子用1-10单位的t4rna连接酶(newenglandbiolabs，ipswich，mass.)在37℃下孵育1小时。连接反应可以在能够与并列的5′-区和3′-区碱基配对的分裂低聚核苷酸存在下发生，以辅助酶连接反应。
在第三路径中，cdna模板的5′-端或3′-端编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得核酸分子可以含有能够连接核酸分子的5’-端到核酸分子的3′-端的活性核酶序列。连接酶核酶可以源自i组内含子、i组内含子、δ肝炎病毒、发夹状核酶或者可以通过selex(通过指数富集进行的配体的系统演化)选择。核酶连接酶反应可以在0℃至37℃之间的温度下进行1至24小时。
在特定的实施方案中，pn编码特异性结合目标抗原/mhc复合体的tcrα和β链，也就是说pn编码tcrα和β链可变区。在特定的实施方案中，pn另外可以编码tcr恒定结构域、跨膜结构域和/或胞质尾区。tcr的这些部分的序列和结构是本领域技术人员已知的，并且可以容易地在公共数据库中访问。作为一个实例，seqidno：40提供编码cd4跨膜结构域的代表性基因序列(参见图5)。在特定的实施方案中，pn可以编码不变的cd3链(即，γ、δ、∑、z、h)和/或itam基序(源自例如cd3-z、fer-γ、cd3-γ、cd3-δ、cd3-∑、cd5、cd22、cd79a、cd79b和/或cd66d)。
在特定的实施方案中，pn可以包含编码间隔区的序列。间隔区的长度可以针对个别抗原/mhc复合体定制，以优化靶识别、结合和t细胞激活。在特定的实施方案中，可以基于抗原/mhc复合体表位的位置、tcr对表位的亲和力和/或t细胞表达tcr以响应抗原/mhc复合体识别在体外和/或在体内增殖的能力来选择间隔子长度。
通常，在tcr的α链和β链与tcr的跨膜结构域之间见到间隔区。间隔区可以提供α链和β链的柔韧性，并允许遗传修饰的t细胞中的高表达水平。在特定的实施方案中，间隔区可以具有至少10至250个氨基酸，至少10至200个氨基酸，至少10至150个氨基酸，至少10至100个氨基酸，至少10至50个氨基酸或至少10至25个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在特定的实施方案中，间隔区具有250个或更少的氨基酸；200个或更少的氨基酸；150个或更少的氨基酸；100个或更少的氨基酸；50个或更少的氨基酸；40个或更少的氨基酸；30个或更少的氨基酸；20个或更少的氨基酸；或10个或更少的氨基酸。
在特定的实施方案中，间隔区可以源自免疫球蛋白样分子的铰链区，例如来自人igg1、人igg2、人igg3或人igg4的铰链区的全部或一部分。在特定的实施方案中，铰链区的全部或一部分可以与免疫球蛋白的恒定区的一个或多个结构域组合。例如，铰链区的一部分可以与ch2或ch3结构域的全部或一部分或其变体组合。
在特定的实施方案中，可以通过本领域已知的任何方法进行pn至t细胞的引入，所述方法包括转染、电穿孔、微注射、脂质转染、磷酸钙介导的转染、用含有基因序列的病毒或噬菌体载体感染、受体介导的内吞作用、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。本领域已知用于将外源基因引入细胞中的许多技术(参见，例如loeffler和behr，meth.enzymol，217，599-618(1993)；cohen等，meth.enzymol，217，618-644(1993)；cline，pharmac.ther，29，69-92(1985))并且可以根据本公开使用，条件是t细胞的必需的发育和生理功能未被破坏。在特定的实施方案中，所述技术提供基因到t细胞的稳定转移，使得所述基因可由细胞表达，并且优选可通过其细胞后代遗传和表达。在特定的实施方案中，所述技术提供细胞内基因的瞬时表达。可以用于遗传修饰t细胞的重组dna技术领域中通常已知的方法描述于例如ausubel等(编)，1993，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，ny；和kriegler，1990，genetransferandexpression，alaboratorymanual，stocktonpress，ny中。
iii.纳米粒子(np)。在特定的实施方案中，使用纳米粒子(np)将pn施用到t细胞。特定的np实施方案包含带正电荷的载剂。载剂起到缩合并保护pn免于酶降解的作用。用作载剂的特别有用的材料包括带正电荷的脂质和/或聚合物，包括聚(β-氨基酯)。
带正电荷的脂质的另外实例包括磷脂酸与氨基醇的酯，诸如二棕榈酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸与羟乙基二胺的酯。带正电荷的脂质的更特定实例包括3β-[n--(n′，n′-二甲基氨基乙基)氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)；n，n′-二甲基-n，n′-二辛基溴化铵(ddab)；n，n′-二甲基-n，n′-二辛酰基氯化铵(ddac)；1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基氯化铵(dori)；1，2-二油酰氧基-3-[三甲基铵基]-丙烷(dotap)；n-(1-(2，3-二油酰氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)；二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)；1，2-二-十八烷氧基-3-[三甲基铵基]-丙烷(dstap)；和如martin等，currentpharmaceuticaldesign2005，11，375-394中描述的阳离子脂质。
可以用作本公开内的载剂的带正电荷的聚合物的实例包括多胺；聚有机胺(例如，聚乙烯亚胺(pei)、聚乙烯亚胺纤维素)；聚(酰胺基胺)(pamam)；聚氨基酸(例如，聚赖氨酸(pll)、聚精氨酸)；多糖(例如，纤维素、葡聚糖、deae葡聚糖、淀粉)；精胺、亚精胺、聚(乙烯基苄基三烷基铵)、聚(4-乙烯基-n-烷基-吡啶鎓)、聚(丙烯酰基-三烷基铵)和tat蛋白。
在不限制前述内容的情况下，本文公开的特定实施方案还可以利用由能够形成多孔网络的任何材料构建的多孔np。示例性材料包括生物相容性聚合物、金属、过渡金属和准金属。示例性生物相容性聚合物包括琼脂、琼脂糖、藻酸盐、藻酸盐/磷酸钙水泥(cpc)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、(1，2，3，4，6-五乙酰基a-d-半乳糖)、纤维素、甲壳质、壳聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟磷灰石、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基-己酸酯)(phbhhx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(pcl)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)、聚(乙烯醇)(pva)、丝、大豆蛋白和大豆蛋白分离物，其单独或与任何其他聚合物组合物以任何浓度和任何比率组合。使用各种等级以不同比率共混不同聚合物类型可以产生从每种贡献聚合物借用的特征。也可以采用各种末端基团化学。
在特定的实施方案中，np包含屏蔽包封的pn并降低或防止脱靶结合的包衣。通过将np的表面电荷降至中性或阴性来降低或防止脱靶结合。包衣可以包括基于中性或带负电荷的聚合物和/或脂质体的包衣。在特定的实施方案中，包衣是亲水性和/或不带电荷的亲水性聚合物的致密表面包衣，其足以防止包封的核酸在释放到选定的细胞中之前暴露于环境。在特定的实施方案中，包衣覆盖np表面的至少80％或至少90％。在特定的实施方案中，包衣包含聚谷氨酸(pga)。
可以用作包衣的另外不带电荷的聚合物的实例包括聚乙二醇(peg)；聚(丙二醇)；和聚环氧烷共聚物(
不带电荷的聚合物还包括两性离子聚合物。两性离子是指总电荷中性，同时具有正电荷和负电荷的性质。两性离子聚合物可以表现得像抵抗细胞和蛋白质粘附的细胞膜的区域一样。
两性离子聚合物包含两性离子构成单元，其包含具有两性离子基团的侧基(即，自聚合物主链侧挂的基团)。示例性的两性离子侧基包括羧基甜菜碱基团(例如，-ra-n+(rb)(rc)-rd-co2-，其中ra是将聚合物主链共价偶联至羧基甜菜碱基团的阳离子氮中心的连接基团，rb和rc是氮取代基，并且rd是将阳离子氮中心与羧基甜菜碱基团的羧基共价偶联的连接基团)。
带负电荷的聚合物的实例包括海藻酸；羧酸多糖；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素-半胱氨酸；角叉菜胶(例如，
在特定的实施方案中，本文公开的聚合物可以包括“星形聚合物”，其是指支化聚合物，其中两个或更多个聚合物支链从核延伸。所述核是具有两个或更多个官能团的原子团，其中支链可以通过聚合而扩展。
在特定的实施方案中，支链是两性离子或带负电荷的聚合物支链。对于星形聚合物，支链前体可以通过水解、紫外线照射或加热转化为两性离子或带负电荷的聚合物。聚合物也可以通过任何有效聚合不饱和单体的聚合方法获得，所述聚合方法包括原子转移自由基聚合(atrp)、可逆加成-断裂链转移聚合(raft)、光聚合、开环聚合(rop)、缩合、迈克尔加成、支链产生/传播反应或其他反应。
脂质体是包括至少一个同心脂质双层的微观囊泡。选择形成囊泡的脂质以实现最终复合体的特定程度的流动性或刚性。在特定的实施方案中，脂质体提供脂质组合物，其是围绕粒子的外层。
脂质体可以是中性的(胆固醇)或双极性的，并且包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)和鞘磷脂(sm)以及包括二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)的其他类型的双极性脂质，烃链长度在14-22的范围内，并且是饱和的或具有一个或多个c＝c双键。能够单独或与其他脂质组分组合产生稳定脂质体的脂质的实例是磷脂，诸如氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂(cerebroside)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰基油酰磷脂酰乙醇胺(pope)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)。可以掺入脂质体中的另外的不含磷的脂质包括硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、肉豆蔻酸异丙酯、三乙醇胺-硫酸十二烷酯、硫酸烷基-芳基酯、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六烷基酯、两性丙烯酸聚合物、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、ddab、二-十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)、dotap、dotma、dc-chol、磷脂酸(pa)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰甘油、dopg和磷酸二-十六烷基酯。在特定的实施方案中，用于产生本文公开的脂质体的脂质包括胆固醇、氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)和衍生的形成囊泡的脂质peg-dspe。
形成脂质体的方法描述于例如美国专利号4,229,360；4,224,179；4,241,046；4,737,323；4,078,052；4,235,871；4,501,728；和4,837,028，以及szoka等，ann.rev.biophys.bioeng.9：467(1980)；以及hope等，chem.phys.lip.40：89(1986)中。
np可以是多种不同的形状，包括球形、立方形、金字塔形、椭圆形、圆柱形、环形等。pn可以以各种方式包含在np中。例如，pn可以包封在np中。在其他方面，pn可以与np的表面(例如，共价和/或非共价)缔合或靠近np的表面附近。在特定的实施方案中，pn可以掺入np中，例如，整合在np的材料中。例如，pn可以掺入聚合物np的聚合物基质中。本领域的普通技术人员将了解承载pn的各种方式，以便允许将pn递送到细胞。
np的尺寸可以在宽范围内变化，并且可以以不同的方式测量。例如，np可以具有100nm的最小尺寸。np还可以具有等于或小于500nm，小于150nm，小于100nm，小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm，小于50nm，小于40nm，小于30nm，小于20nm或小于10nm的最小尺寸。在特定的实施方案中，np可以具有在5nm至500nm之间，10nm至100nm之间，20nm至90nm之间，30nm至80nm之间，40nm至70nm之间以及40nm至60nm之间的最小尺寸。在特定的实施方案中，所述尺寸是np或涂覆的np的直径。在特定的实施方案中，np群体可以具有等于或小于500nm，小于100nm，小于90nm，小于80nm，小于70nm，小于60nm，小于50nm，小于40nm，小于30nm，小于20nm或小于10nm的平均最小尺寸。在特定的实施方案中，组合物中的np群体可以具有5nm至500nm之间，10nm至100nm之间，20nm至90nm之间，30nm至80nm之间，40nm至70nm之间和40nm至60nm之间的平均直径。np的尺寸可以使用例如常规技术如动态光散射和/或电子显微镜测定。
iv.t细胞靶向和递送剂(t-da)。在特定的实施方案中，np包含t细胞靶向和递送剂(t-da)，以允许pn在体内或离体选择性递送至选定的细胞类型。
t-da选择性结合目标t细胞。在特定的实施方案中，t-da通过靶向由t细胞类型表达的标志通过受体介导的内吞作用实现np向特定t细胞群的选择性递送。例如，如前所指示，cd4+t细胞在其表面上表达cd4蛋白，并且cd8+t细胞在其表面上表达cd8蛋白。
如本文所用的“原初”t细胞是指表达cd62l和cd45ra的未经历抗原的t细胞，并且与非原初t细胞相比不表达cd45ro。在特定的实施方案中，原初t细胞可以通过包括cd62l、ccr7、cd28、cd127和cd45ra的表型标志的表达进一步表征。t-da可以结合cd62l、ccr7、cd28、cd127和/或cd45ra，以实现pn向原初t细胞的选择性递送。
cd3在所有成熟t细胞上表达。因此，t-da可以结合cd3以实现pn向所有成熟t细胞的选择性递送。激活的t细胞表达4-1bb(cd137)。因此，t-da可以结合4-1bb以实现pn向激活的t细胞的选择性递送。cd5和转铁蛋白受体也在t细胞上表达，并且可以用于实现pn向t细胞的选择性递送。
如本文所用的“中枢记忆”t细胞(或“tcm”)是指经历过抗原的ctl，其在其表面上表达cd62l或ccr7和cd45ro，并且与原初细胞相比不表达cd45ra或具有降低的cd45ra表达。在特定的实施方案中，中枢记忆细胞对于cd62l、ccr7、cd25、cd127、cd45ro和cd95的表达是阳性的，并且与原初细胞相比具有降低的cd45ra表达。t-da可以结合cd62l、ccr7、cd25、cd127、cd45ro和/或cd95，以实现多核苷酸向tcm的选择性递送。
本文所用的“效应记忆”t细胞(或“tem”)是指经历过抗原的t细胞，与中枢记忆细胞相比，其表面上不表达cd62l或具有降低的cd62l表达，并且与原初细胞相比，其不表达cd45ra或具有降低的cd45ra表达。在特定的实施方案中，与原初细胞或中枢记忆细胞相比，效应记忆细胞对cd62l和ccr7的表达是阴性的，并且具有cd28和cd45ra的可变表达。与记忆或原初t细胞相比，效应t细胞对于颗粒酶b和穿孔素是阳性的。t-da可以结合颗粒酶b和/或执行功能以实现pn向tem的选择性递送。
淋巴细胞功能相关的抗原1(lfa-1)由所有t细胞、b细胞和单核细胞/巨噬细胞表达。因此，t-da可以结合lfa-1以实现pn向t细胞、b细胞和单核细胞/巨噬细胞的选择性递送。
“选择性递送”意指pn由一种或多种选定的细胞群递送并表达。在特定的实施方案中，选择性递送仅限于选定的t细胞群。在特定的实施方案中，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的施用的pn由t细胞群递送和/或表达。在特定的实施方案中，选择性递送确保未选择的细胞不表达递送的pn。例如，当pn编码tcr时，可以确保选择性，因为只有t细胞具有tcr表达所需的z链。当pn包含质粒dna时，选择性递送还可以基于缺乏未选择细胞中的pn摄取或基于pn序列内特异性启动子的存在。例如，质粒dna可以包含t细胞特异性启动子，诸如t细胞的远端ick启动子。在特定的实施方案中，由于t-da对靶向t细胞的选择性结合，观察到选择性递送。
如所指示，t-da可以包含在t细胞上见到的基序的结合结构域。t-da还可以包括允许选择性摄取到选定的t细胞中的任何选择性结合机制。在特定的实施方案中，t-da包含以下的结合结构域：t细胞受体基序；t细胞α链；t细胞β链；ccr7；cd3；cd4；cd8；cd28；cd45ra；cd62l；cd127；lfa-1；及其组合。
在特定的实施方案中，结合结构域包含细胞标志配体、受体配体、抗体、肽、肽适体、核酸、核酸适体、镜像体(spiegelmer)或其组合。在t-da的背景内，结合结构域包含与另一种物质结合以形成能够介导内吞作用的复合体的任何物质。
“抗体”是结合结构域的一个实例，并且包括全抗体或抗体的结合片段，例如fv、fab、fab′、f(ab′)2、fc和单链fv片段(scfv)或免疫球蛋白的任何生物学有效片段，所述生物学有效片段特异性结合由选定的细胞表达的基序。抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、小体和线性抗体的全部或一部分。
与非人抗体相比，来自人源的抗体或人源化抗体在人类中具有减低的免疫原性或没有免疫原性，并且具有较低数量的非免疫原性表位。通常选择抗体及其片段以在人受试者中具有降低水平的抗原性或无抗原性。
可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示方法、产生人或人源化抗体的方法或使用工程化以产生抗体的转基因动物或植物的方法来制备特异性结合由t细胞表达的基序的抗体，如本领域的普通技术人员已知(参见，例如美国专利号6,291,161和6,291,158)。可以获得部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库，并且可以筛选可以结合t细胞基序的抗体或其片段。例如，可以通过对于特异性结合目标靶标的fab片段筛选fab噬菌体文库来鉴定结合结构域(参见，hoet等，nat.biotechnol.23：344，2005)。还可获得人抗体的噬菌体展示文库。另外，可以使用在方便的系统(例如，小鼠、humab
在特定的实施方案中，选定的t-da的结合结构域包含t细胞受体基序抗体；t细胞α链抗体；t细胞β链抗体；ccr7抗体；cd3抗体；cd4抗体；cd8抗体；cd28抗体；cd45ra抗体；cd62l抗体；cd127抗体；和/或lfa-1抗体。这些结合结构域也可以由前述抗体的scfv片段组成。
在特定的实施方案中，t-da包含结合cd4的抗体或抗体片段。结合cd4的抗体的实例是tnx-355，其描述于美国公开号us20130195881中。tnx-355抗cd4抗体包含可变重链，所述可变重链包含包含gytftsyvih的cdrh1序列(seqidno：41)、包含yinpyndgtdydekfkg的cdrh2序列(seqidno：42)和包含ekdnyatgawfay的cdrh3序列(seqidno：43)；和可变轻链，所述可变轻链包含包含kssqsllystnqknyla的cdrl1序列(seqidno：44)、包含wastres的cdrl2序列(seqidno：45)和包含qqyysyrt的cdrl3序列(seqidno：46)。在特定的实施方案中，结合cd4的抗体包括市售抗体。市售抗cd4抗体的实例是来自bioxcell(westlebanon，nh)的克隆gk1.5，登录号be0003-1。
在特定的实施方案中，t-da包含结合cd8的抗体或抗体片段。结合cd8的抗体的实例是okt8，其序列描述于美国公开号us20160176969中。okt8抗cd8抗体包含可变重链，所述可变重链包含包含fnikdty的cdrh1序列(seqidno：47)、包含dpandn的cdrh2序列(seqidno：48)和包含gygyyvfdh的cdrh3序列(seqidno：49)；和可变轻链，所述可变轻链包含包含rsisqy的cdrl1序列(seqidno：50)、包含sgstlqs的cdrl2序列(seqidno：51)和包含hnenplt的cdrl3序列(seqidno：52)。在特定的实施方案中，结合cd8的抗体包括市售的抗体。市售的抗cd8抗体的实例是来自bioxcell(westlebanon，nh)的克隆2.43，登录号bp0061。
在特定的实施方案中，t-da包含结合cd3的抗体或抗体片段。结合cd3的抗体的实例是okt3，其序列描述于美国专利号6,491,916中。okt3抗cd3抗体包含可变重链，所述可变重链包含包含rytmh的cdrh1序列(seqidno：53)、包含yinpsrgytnynqkfkd的cdrh2序列(seqidno：54)和包含yyddhycldy的cdrh3序列(seqidno：55)；和可变轻链，所述可变轻链包含包含sasssvsymn的cdrl1序列(seqidno：56)、包含dtsklas的cdrl2序列(seqidno：57)和包含qqwssnpft的cdrl3序列(seqidno：58)。在特定的实施方案中，结合cd3的抗体包括市售的抗体。市售的抗cd3抗体的实例是来自thermofisherscientific(waltham，ma)的克隆kt3，登录号ma5-16763。
在特定的实施方案中，结合结构域vh区可以源自或基于已知单克隆抗体的vh，并且当与已知抗体的vh比较时，可以含有一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)插入、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)缺失、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以在vh区中的任何位置，包括在所述区的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个cdr包含零变化或至多一处、两处或三处变化并且条件是含有修饰的vh区的结合结构域仍然可以以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性结合其靶标。
在特定的实施方案中，结合结构域中的vl区源自或基于已知单克隆抗体的vl，并且当与已知单克隆抗体的vl比较时，含有一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)插入、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)缺失、一处或多处(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10处)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或上述变化的组合。插入、缺失或取代可以在vl区中的任何位置，包括在所述区的氨基末端或羧基末端或两端，条件是每个cdr包含零变化或至多一处、两处或三处变化并且条件是含有修饰的vl区的结合结构域仍然可以以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性结合其靶标。
在特定的实施方案中，结合结构域包含如下序列或者是如下序列，其与轻链可变区(vl)的氨基酸序列或与重链可变区(vh)或两者至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同，其中每个cdr包含自特异性结合目标靶标的单克隆抗体或其片段或衍生物的零变化或最多一处、两处或三处变化。
肽适体包含在两端附接到蛋白质支架的肽环(其对靶蛋白具有特异性)。这种双重结构约束将肽适体的结合亲和力极大地增加到与抗体相当的水平。可变环长度通常为8至20个氨基酸(例如，8至12个氨基酸)，并且支架可以是稳定、可溶、小且无毒的任何蛋白质(例如，硫氧还蛋白-a、stefina三倍突变体、绿色荧光蛋白、水蛭抑制剂(eglin)c和细胞转录因子spi)。肽适体选择可以使用不同的系统如酵母双杂交系统(例如，gal4酵母双杂交系统)或lexa相互作用捕获系统进行。
核酸适体是单链核酸(dna或rna)配体，其通过折叠成特异性球状结构起作用，所述特异性球状结构决定以高亲和力和特异性结合靶蛋白或其他分子，如osborne等，curr.opin.chem.biol.1：5-9，1997；以及cerchia等，febsletters528：12-16，2002中所述。在特定的实施方案中，适体很小(15kd；或在15个至80个核苷酸之间或在20个至50个核苷酸之间)。适体通常通过称为selex(通过指数富集进行配体的系统演化；参见，例如，tuerk等，science，249：505-510，1990；green等，methodsenzymology.75-86，1991；以及gold等，annu.rev.biochem.，64：763-797，1995)的程序从由1014-1015个随机低聚核苷酸序列组成的文库中分离。产生适体的其他方法描述于例如美国专利号6,344,318；6,331,398；6,110,900；5,817,785；5,756,291；5,696,249；5,670,637；5,637,461；5,595,877；5,527,894；5,496,938；5,475,096；和5,270,16中。镜像体与核酸适体相似，不同之处在于至少一个β-核糖单元被β-d-脱氧核糖或选自例如β-d-核糖、α-d-核糖、β-l-核糖的修饰的糖单元置换。
结合结构域也可以选自亲和体；亲和素(ebersbach等，j.mol.biol.372：172，2007)；犰狳重复蛋白(参见，例如，madhurantakam等，proteinsci.21：1015，2012；pct专利申请公开号wo2009/040338)；atrimer；亲和力多聚体(avimer)；c型凝集素结构域(zelenskv和gready，febsj.272：6179，2005；beavil等，proc.natl.acad.sci.(usa)89：753，1992以及sato等，proc.natl.acad.sci.(usa)100：7779，2003)；细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白-4(weidle等，cancergen.proteo.10：155，2013)；设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)(binz等，j.mol.biol.332：489，2003以及binz等，nat.biotechnol.22：575，2004)；纤维蛋白原结构域(参见，例如weisel等，science230：1388，1985)；纤连蛋白结合结构域(adnectin或单抗体(monobody))(richards等，j.mol.biol.326：1475，2003；parker等，proteineng.des.selec.18：435，2005；以及hackel等，(2008)j.mol.biol.381：1238-1252)；fynomers；kunitz结构域(参见，例如美国专利号6,423,498)；富含亮氨酸的重复结构域(stumpp等，j.mol.biol.332：471，2003)；脂笼蛋白结构域(参见，例如wo2006/095164，beste等，proc.natl.acad.sci.(usa)96：1898，1999和schonfeld等，proc.natl.acad.sci.(usa)106：8198，2009)；mab2或fcabtm(参见，例如，pct专利申请公开号wo2007/098934；wo2006/072620)；sctcr(参见，例如，lake等，int.immunol.11：745，1999；maynard等，j.immunol.methods306：51，2005；美国专利号8,361,794)；四环肽重复结构域(main等，structure11：497，2003和cortajarena等，acschem.biol.3：161，2008)；v样结构域(参见，例如，美国专利申请公开号2007/0065431)；或类似物(参见，例如，nord等，proteineng.8：601，1995；nord等，nat.biotechnol.15：772，1997；nord等，euro.j.biochem.268：4269，2001；binz等，nat.biotechnol.23：1257，2005；boersma和pluckthun，curr.opin.biotechnol.22：849，2011)。
还可以使用其他可以促进t细胞内化和/或转染的试剂，诸如聚(乙烯亚胺)/dna(pei/dna)复合体。
v.内体释放剂(era)。内体释放剂(era)包含促进货物从t细胞的内体中排出的任何化合物或肽。示例性era包括咪唑、聚合或低聚咪唑、pei、肽、融合肽、多羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的低聚或聚合阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚酮、原酸酯、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的两亲性嵌段共聚物和树枝状大分子。
许多era改自促进从内体逃逸并将多核苷酸完整地递送到细胞核中的病毒元件。作为一个特定实例，h5wyg肽可以用于在低ph下诱导膜的裂解。富含组氨酸的肽h5wyg是流感病毒血凝素的ha-2亚基的n-末端序列的衍生物，其中5个氨基酸已被组氨酸残基置换。当组氨酸残基被质子化时，h5wyg能够在微酸性ph下选择性地使膜不稳定。来自塞姆利基森林病毒(semlikiforrestvirus)的e1蛋白也是一种有用的era。
在特定的实施方案中，era包含疏水膜易位序列(mts)。示例性的含疏水性mts的肽是具有氨基酸序列aavallpavllallap(seqidno：59)的rfgf。也可以使用含有疏水性mts的rfgf类似物(例如，氨基酸序列aallpvllaap(seqidno：60))。
另外的示例性era包括：
vi.核靶向剂.核靶向剂(nta)是指增强细胞向细胞核转运和/或进入细胞核的序列。通常，nta是一类长度为3至100个氨基酸，3至50个氨基酸、4至30个氨基酸或4至20个氨基酸的短氨基酸序列。
微管相关序列(mtas)nta包括促进与微管相互作用以增强向细胞核的转运的那些。示例性mtas包括plktpgkkkkgkpgkrkeqekkkrrtr(seqidno：81)。
核定位信号(nls)nta包括促进与核转运机制相互作用的那些。示例性nls序列包括gryltqetnkvetykeqplktpgkkkkgkp(seqidno：82)。
特定的实施方案利用衍生自人甲状旁腺激素有关蛋白的nta(pthrp，uniprotid：p12272)，其是包含重叠的mtas和nls序列的蛋白质。在特定的实施方案中，包含重叠mtas和nls序列的nta包含gryltqetnkvetykeqplktpgkkkkgkpgkrkeqekkkrrtr(seqidno：83；参见narayanan等，scirep.2013；3：2184)。
另外的示例性nls序列包含(i)由sv40大t抗原nls(pkkkrkv)(seqidno：84)例示的单粒子nls；(ii)包含由可变数目的间隔氨基酸分隔的两个碱性结构域并且由爪蟾核质蛋白nls(krxxxxxxxxxxkkkl)(seqidno：85)例示的双粒子nls；和(iii)非经典序列，诸如hnrnpa1蛋白的m9、流感病毒核蛋白nls和酵母ga14蛋白nls(dingwall和laskey，trendsbiochemsci16：478-481，1991)。在特定的实施方案中，nls可以是高度阳离子或碱性的肽。在特定的实施方案中，nls包含两个或更多个arg或lys氨基酸残基。在特定的实施方案中，nls可以结合溶质蛋白，诸如输入蛋白和核转运蛋白，其识别并转运含有nls的序列到核孔复合体。
在特定的实施方案中，为了将递送的pn，特别是质粒dna导入细胞核，可以将pn(例如，纳米粒子包封的质粒)缀合至sv40t-ag衍生的nls肽。示例性sv40t-ag衍生的nls肽包含：pkkkrkv(seqidno：86)；pkkkrmv(seqidno：87)；pkkkrkvedp(seqidno：88)；pkkgskka(seqidno：89)；pktkrkv(seqidno：90)；cggpkkkrkvg(seqidno：91)；pkkkikv(seqidno：92)；cyddeatadsqhstppkkkrkvedpkdfesells(seqidno：93)；和cgygpkkkrkvgg(seqidno：94)。
另外的示例性nls序列包括：
示例性nls还描述于cokol等，2000，emboreports，1(5)：411-415；boulikas，1993，crit.rev.eukaryot.geneexpr.，3：193-227；collas等，1996，transgenicresearch，5：451-458；collas和alestrom，1997，biochem.cellbiol.75：633-640；collas和alestrom，1998，transgenicresearch，7：303-309；collas和alestrom，1996，mol.reprod.devel.，45：431-438；以及美国专利号7,531,624；7,498,177；7,332,586；和7,550,650。
在特定的实施方案中，nta与np的聚合物如pbae共价偶联。
vii.疫苗抗原。在本公开的教导内，对t细胞进行遗传修饰以表达对施用到受试者的疫苗抗原有特异性的tcr。疫苗抗原是在引入体内时刺激免疫应答如t细胞激活和/或抗体产生的物质。疫苗抗原可以包括天然的完整病原体，诸如杀死的细菌或病毒，或减毒的活病毒，或者可以仅包括病原体的部分或亚基，诸如单一病毒或细菌蛋白。疫苗抗原还可以包括癌抗原或其片段。
示例性病毒疫苗抗原可以源于腺病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、冠状病毒、黄病毒、汉坦病毒、嗜肝dna病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、正粘病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、轮状病毒、海绵状病毒或披膜病毒。在特定的实施方案中，疫苗抗原包括由病毒表达的肽，所述病毒包括cmv、ebv、流感病毒、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎、单纯疱疹、hiv、流感、日本脑炎、麻疹、脊髓灰质炎、狂犬病、呼吸道合胞体、风疹、天花、水痘、带状疱疹、西尼罗河(westnile)和/或寨卡(zika)。
源自全病原体的疫苗抗原的实例包括用于opv脊髓灰质炎疫苗的减毒脊髓灰质炎病毒，以及用于ipv脊髓灰质炎疫苗的灭活脊髓灰质炎病毒。
作为另一特定实例，cmv疫苗抗原包括包膜糖蛋白b和cmvpp65；ebv疫苗抗原包括ebvebnai、ebvp18和ebvp23；肝炎疫苗抗原包括乙型肝炎病毒的s、m和l蛋白，乙型肝炎病毒的前s抗原、hbcagdelta、hbvhbe、丙型肝炎病毒rna、hcvns3和hcvns4；单纯疱疹疫苗抗原包括立即早期蛋白和糖蛋白d；人免疫缺陷病毒(hiv)疫苗抗原包括gag、pol和env基因的基因产物，诸如hivgp32、hivgp41、hivgp120、hivgp160、hivp17/24、hivp24、hivp55gag、hivp66pol、hivtat、hivgp36、nef蛋白和逆转录酶；人乳头瘤病毒(hpv)病毒抗原包括l1蛋白；流感疫苗抗原包括血凝素和神经氨酸酶；日本脑炎疫苗抗原包括蛋白质e、m-e、m-e-ns1、ns1、ns1-ns2a和80％e；疟疾疫苗抗原包括疟原虫蛋白环子孢子(csp)、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶；麻疹疫苗抗原包括麻疹病毒融合蛋白；狂犬病疫苗抗原包括狂犬病糖蛋白和狂犬病核蛋白；呼吸道合胞体疫苗抗原包括rsv融合蛋白和m2蛋白；轮状病毒疫苗抗原包括vp7sc；风疹疫苗抗原包括蛋白质e1和e2；水痘带状疱疹疫苗抗原包括gpi和gpii；和寨卡疫苗抗原包括前膜、包膜(e)、e蛋白的结构域iii和非结构蛋白1-5。
另外的特定示例性病毒抗原序列包括：
关于病毒抗原的另外实例，参见fundamentalvirology，第2版，fields，b.n.和knipe，d.m.编(ravenpress，newyork，1991)。
在特定的实施方案中，疫苗抗原由与细菌感染相关的细胞表达。示例性细菌包括炭疽、革兰阴性杆菌、衣原体、白喉杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、结核分枝杆菌、百日咳毒素、肺炎球菌、立克次体、葡萄球菌、链球菌和破伤风。
作为细菌疫苗抗原的特定实例，炭疽疫苗抗原包括炭疽保护性抗原；革兰氏阴性杆菌疫苗抗原包括脂多糖；嗜血杆菌流感疫苗抗原包括荚膜多糖；白喉杆菌疫苗抗原包括白喉杆菌毒素；结核分枝杆菌疫苗抗原包括霉菌酸、热休克蛋白65(hsp65)、30kda主要分泌蛋白和抗原85a；百日咳毒素疫苗抗原包括血凝素、百日咳杆菌粘附素、fim2、fim3和腺苷酸环化酶；肺炎球菌疫苗抗原包括肺炎球菌溶血素和肺炎球菌荚膜多糖；立克次体疫苗抗原包括rompa；链球菌疫苗抗原包括m蛋白；且破伤风疫苗抗原包括破伤风毒素。
在特定的实施方案中，疫苗抗原源自多药抗性“超级细菌”。超级细菌的实例包括屎肠球菌、艰难梭菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科(包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属)。
疫苗抗原还可以包括由癌细胞特异性或优先表达以激活免疫系统以对抗癌症的蛋白质。癌抗原的实例包括a33；bage；b细胞成熟抗原(bcma)；bc1-2；β-连环蛋白；ca19-9；ca125；羧酸酐酶-ix(caix)；cd5；cd19；cd20；cd21；cd22；cd24；cd33；cd37；cd45；cd123；cd133；cea；c-met；cs-1；细胞周期蛋白b1；dage；ebna；egfr；肝配蛋白b2；雌激素受体；fap；铁蛋白；叶酸结合蛋白；gage；g250；gd-2；gm2；gp75、gp100(pmel17)；her-2/neu；hpve6；hpve7；ki-67；l1-cam；lrp；mage；mart；间皮素；muc；mum-1-b；myc；nyeso-1；p53、prame；孕酮受体；psa；psca；psma；ras；rori；存活素；sv40t；腱生蛋白；tsta酪氨酸酶；vegf；和wt1。
作为更特定的实例，癌症疫苗抗原可以包括或源自：
viii.疫苗佐剂.疫苗通常与疫苗佐剂一起施用。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的物质，并且在本文中用于该术语的常规用途。对于所有佐剂都没有理解精确的作用方式，但是这种理解缺乏并不妨碍其对于多种疫苗的临床使用。
示例性疫苗佐剂包括任何种类的toll样受体配体或其组合(例如，cpg、cpg-28(tlr9激动剂)、聚核糖核苷酸聚胞苷酸(poly(i：c))、α-半乳糖神经酰胺、mpla、motolimod(vtx-2337，由ventirx开发的新型tlr8激动剂、imo-2055(emd1201081)、tmx-101(咪喹莫特)、mgn1703(tlr9激动剂)、g100(tlr4激动剂吡喃葡萄糖基脂质a的稳定乳剂)、恩托利莫(entolimod)(嗜碱沙门氏菌的衍生物，也称为cblb502)、hiltonol(tlr3激动剂)和咪喹莫特(imiquimod))和/或热休克蛋白90(hsp90)的抑制剂，诸如17-dmag(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
在特定的实施方案中，可以使用基于角鲨烯的佐剂。角鲨烯是被称为三萜的分子组的一部分，三萜全都是具有30个碳分子的碳氢化合物。角鲨烯可以源自某些植物来源，诸如米糠、小麦胚芽、苋菜籽和橄榄，以及源自动物来源，诸如鲨鱼肝油。在特定的实施方案中，基于角鲨烯的佐剂是
在特定的实施方案中，可以使用佐剂明矾。明矾是指含有两个硫酸盐基团、一价阳离子和三价金属如铝或铬的盐家族。明矾是fda批准的佐剂。在特定的实施方案中，疫苗可以包含1-1000ug/剂或0.1mg-10mg/剂的量的明矾。在特定的实施方案中，可以使用佐剂
在特定的实施方案中，一种或多种sting激动剂用作疫苗佐剂。“sting”是“干扰素基因的刺激物”的缩写，也称为“内质网干扰素刺激物(eris)”、“irf3激活介体(mita)”、“mpys”或“跨膜蛋白173(tm173)”。sting是一种跨膜受体蛋白，并且由人中的基因tmem173编码。sting的激活引起通过irf3(干扰素调控因子3)途径产生i型干扰素(例如，ifn-a和ifn-β)；并且通过nf-κb途径和/或nlrp3炎性体产生促炎细胞因子(例如，tnf-a和il-iβ)。
人和鼠科sting通过两种方式自然激活：通过入侵细菌或古细菌释放的外源(3′，3)环状二核苷酸(c-digmp、c-diamp和c-gamp)的结合；和通过(2′，3′)环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸((2′，3′)c-gamp)的结合，(2′，3′)环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸是在外源双链dna(例如，由入侵的细菌、病毒或原生动物释放)存在下由酶环状gmp-amp合成酶(cgas；也称为作为c6orfl50或mb21d1)产生的内源性环状二核苷酸。
术语“sting激动剂”是指在体外或体内激活sting受体的物质。如果出现以下情况，化合物则可以被视为sting激动剂：(i)在含有sting的人或动物细胞中体外诱导i型干扰素；和(ii)在不含sting或不含sting功能的人或动物细胞中不体外诱导i型干扰素。确定配体是否为sting激动剂的典型测试是将配体在野生型人或动物细胞系和其中sting编码基因已通过少量碱基或更长缺失基因失活的相应细胞系(例如，纯合sting敲除细胞系)中孵育。sting的激动剂将在野生型细胞中诱导i型干扰素，但在sting失活的细胞中不会诱导i型干扰素。
在特定的实施方案中，sting激动剂包含在两个核苷酸之间具有一个或两个磷酸二酯键和/或一个或两个硫代磷酸酯二酯键的环状分子。这包括(3′，5′)-(3′，5′)核苷酸键(缩写为(3′，3′))；(3′，5′)-(2′，5′)核苷酸键(缩写为(3′，2′))；(2′，5′)-(3′，5′)核苷酸连接(缩写为(2′，3′))；和(2′，5′)-(2′，5′)核苷酸键(缩写为(2′，2′))。“核苷酸”是指与糖部分的5′、3′或2′位的磷酸酯基团连接的任何核苷。
在特定的实施方案中，sting激动剂包括下式的化合物：
在特定的实施方案中，r1和r2可以独立地是9-嘌呤、9-腺嘌呤、9-鸟嘌呤、9-次黄嘌呤、9-黄嘌呤、9-尿酸或9-异鸟嘌呤，如下所示：
在特定的实施方案中，sting激动剂可以包括二硫代-(rp，rp)-[环状[a(2′，5′)pa(3′，5′)p]](也称为2′-5′，3′-5’混合磷酸二酯键(ml)rr-s2c-di-amp或mlrr-s2cda)、mlrr-s2-c-di-gmp(ml-cdg)、mlrr-s2cgamp或其任何混合物。
c-digmp的结构包括：
c-diamp的结构包括：
c-gamp的结构包括：
sting激动剂的另外特定实例包括c-aimp；(3’，2’)c-aimp；(2’，2’)c-aimp；(2’，3’)c-aimp；c-aimp(s)；c-(damp-dimp)；c-(damp-2’fdimp)；c-(2’fdamp-2’fdimp)；(2’，3’)c-(amp-2’fdimp)；c-[2’fdamp(s)-2’fdimp(s)]；c-[2’fdamp(s)-2’fdimp(s)](pom)2；和dmxaa。sting激动剂的另外实例描述于wo2016/145102中。
其他免疫刺激剂也可以用作疫苗佐剂。另外的示例性小分子免疫刺激剂包括tgf-β抑制剂、shp-抑制剂、stat-3抑制剂和/或stat-5抑制剂。可以使用能够下调免疫抑制信号或致癌途径(诸如kras)的示例性sirna，而也可以使用编码免疫刺激蛋白的任何质粒dna(诸如小环dna)。
示例性细胞因子包括il-2、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、tnfα、ifn-α、ifn-β、ifn-γ或gm-csf。在特定的实施方案中，免疫刺激剂可以是细胞因子和或细胞因子的组合，诸如il-2、il-12或il-15与ifn-α、ifn-β或ifn-γ或gm-csf的组合，或其任何有效组合，或细胞因子的任何其他有效组合。上面鉴定的细胞因子刺激th1应答，但也可以使用刺激th2应答的细胞因子，诸如il-4、il-10、il-11或其任何有效组合。另外，可以使用刺激th1应答的细胞因子连同刺激th2应答的细胞因子的组合。
也可以使用源自前面段落中提到的分子的免疫刺激剂。例如，rli是il-15-il-15受体-α融合蛋白，其效力比单独的il-15高50倍。il-15特别影响多个点的抗肿瘤免疫应答。其可以将单核细胞分化为刺激性抗原呈递细胞；促进肿瘤反应性t细胞的效应子功能和增殖；并募集且激活nk细胞。
ix.组合物。本文公开的多核苷酸、np、疫苗抗原和/或疫苗佐剂(单独地，共同地或以分组组合称为“活性成分”)可以作为配制用于施用到受试者的组合物的一部分提供。
在特定的实施方案中，活性成分作为组合物的一部分提供，所述组合物可以包含例如至少0.1％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少1％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少10％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少20％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少30％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少40％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少50％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少60％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少70％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少80％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少90％w/v或w/w的一种或多种活性成分；至少95％w/v或w/w的一种或多种活性成分；或至少99％w/v或w/w的一种或多种活性成分。
如果细胞被离体遗传修饰，则组合物可以包含大于102个细胞，大于103个细胞，大于104个细胞，大于105个细胞，大于106个细胞，大于107个细胞，大于108个细胞，大于109个细胞，大于1010个细胞，或大于1011个细胞。在特定的实施方案中，可以校准组合物以在施用到受试者时每千克提供1百万至2千万个遗传修饰的细胞。
本文公开的组合物可以配制用于通过例如注射、吸入、输注、灌注、灌洗或摄取施用。所述组合物还可以配制用于例如静脉内、皮内、动脉内、结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内、经口和/或皮下施用，且更特定地讲，静脉内、皮内、动脉内、结节内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、鞘内、肿瘤内、肌肉内、囊内、经口和/或皮下注射。
对于注射，组合物可以配制成水溶液，诸如在包括汉克氏(hanks′)溶液、林格氏(ringer′s)溶液或生理盐水的缓冲液中。水溶液可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述制剂可以呈冻干的和/或粉末形式，以便在使用前用合适的媒剂如无菌无热原水重构。
对于经口施用，组合物可以配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液剂、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。对于经口固体制剂如粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括粘结剂(黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶)，填充剂，诸如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇；磷酸二钙、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；造粒剂；和粘结剂。如果需要，可以添加崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。如果需要，可以使用标准技术将固体剂型糖包衣或肠溶包衣。还可以使用调味剂，诸如薄荷、冬青油、樱桃调味剂、橙子调味剂等。
对于吸入施用，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，可以将组合物配制成来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾剂。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门以递送经过计量的量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒，其含有治疗剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文公开的任何组合物制剂可以有利地包含任何其他药学上可接受的载剂，所述载剂包括不产生显著不利、过敏或其他不良反应的载剂，无论是对于研究、预防和/或治疗性治疗，这些反应都超过施用的益处。示例性药学上可接受的载剂和制剂公开在remington′spharmaceuticalsciences，第18版，mackprintingcompany，1990中。此外，可以制备制剂以符合美国fda生物标准办公室和/或其他相关外国管理机构所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
示例性的通常使用的药学上可接受的载剂包括任何和所有的增量剂或填充剂、溶剂或共溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、蛋氨酸、维生素e)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，edta)、凝胶、粘结剂、崩解剂和/或润滑剂。
示例性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵、氯化六甲基铵、对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
示例性等渗剂包括多元糖醇，包括三元以上的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
示例性稳定剂包括有机糖、多元糖醇、聚乙二醇；含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水聚合物或多糖。
组合物也可以配制成储备制剂。储备制剂可以用合适的聚合或疏水性材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐来配制。
另外，组合物可以利用含有至少一种活性成分的固体聚合物的半透性基质配制为持续释放系统。已经确立了各种持续释放材料，并且这些材料是本领域普通技术人员所熟知的。持续释放系统根据其化学性质可以在施用数周至超过100天后释放活性成分。
x.试剂盒.活性成分的组合也可以作为试剂盒提供。试剂盒可以包括容器，所述容器包含单独或以各种组合配制的一种或多种或多种本文所述的pn、np、疫苗抗原和/或疫苗佐剂。通常，所述试剂盒将包含pn、np、疫苗抗原和/或疫苗佐剂，其特异性增强针对特定感染剂或癌抗原如本文其他地方描述的那些的疫苗效力。
试剂盒还可以包括由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映制造、使用或销售机构对人类施用的批准。所述通知可以声明所提供的活性成分可以施用到受试者。试剂盒可以包括使用所述试剂盒的另外说明，例如关于pn、np、疫苗抗原和/或疫苗佐剂的制剂用于施用的说明书；有关废物的妥善处置；等。所述说明书可以呈试剂盒内提供的印刷说明书的形式，或者所述说明书可以印刷在试剂盒本身的一部分上。说明书可以呈表格、小册子、手册、cd-rom或计算机可读装置的形式，或者可以在远程位置如网站提供指示说明书。在特定的实施方案中，试剂盒还可以包括有效使用试剂盒所需的一些或全部的必需医疗用品，诸如注射器、安瓿、导管、面罩、注射帽、海绵、无菌粘合带、chloraprep、手套等。可以进行本文所述的任何试剂盒的内容的改变。试剂盒的说明书将指导活性成分的使用以实现本文所述的新临床用途。
xi.使用方法.一旦形成，所述组合物则可以用于受试者的许多应用中。受试者包括人受试者、兽医动物(犬、猫、爬行动物、鸟类等，并且还包括动物园内见到的动物)、牲畜(马、牛、山羊、猪、鸡等)和研究动物(猴、大鼠、大鼠、鱼等)。“有需要的受试者”包括需要治疗的受试者，诸如患有病况(例如，感染、癌症)的那些，以及易于患上或发展病况(例如，感染、癌症)的那些，或者其病况将被预防的那些，诸如处于暴露于病原体或癌症复发的高风险组的那些。
技术人员将了解免疫系统在疫苗接种后产生先天性免疫应答和适应性免疫应答。先天性免疫应答通常可以表征为基本上不是抗原特异性的和/或通常不产生免疫记忆。适应性免疫应答可以表征为基本上抗原特异性，随时间而成熟(例如，增加抗原的亲和力和/或亲合力)，并且可以产生免疫记忆。尽管可以辨别先天性免疫和适应性免疫之间的这些和其他功能区别，但技术人员将了解，先天性和适应性免疫系统可以整合，并且因此可以协同作用。
在特定的实施方案中，适应性免疫应答可以是“初次免疫应答”，其是指在“原初”受试者第一次暴露于疫苗抗原时发生的免疫应答。例如，在初次抗体应答的情况下，在3至14天的滞后或潜伏期后，取决于例如组合物、剂量和受试者，可以产生针对疫苗抗原的抗体。通常，igm产生持续数天，然后产生igg，并且igm应答可以降低。几周后抗体产生可以终止，但可以产生记忆细胞。初次免疫应答还触发cd4+t和cd8+t细胞激活和增殖。在特定的实施方案中，适应性免疫应答可以是“二次免疫应答”、“回忆应答”或“加强应答”，其是指在受试者第二次和随后暴露于本文公开的疫苗抗原时发生的免疫应答。通常，在二次免疫应答中，记忆细胞对疫苗抗原作出应答，因此二次免疫应答可以定性和/或定量地与初次免疫应答不同。例如，与初次免疫应答相比，二次免疫应答的滞后期可以更短，峰值应答可以更高，可以产生更高亲和力的抗体和tcr，和/或应答可以持续更长的时间。在特定的实施方案中，“免疫应答”可以通过记忆t细胞(例如，tcm和/或tem)的扩增、持久性和/或活性来测量。
在特定的实施方案中，改善疫苗接种的功效在临床相关的时间窗内施用治疗有效量的本文公开的组合物后引起以下至少一种：cd4+t和/或cd8+t细胞的激活和/或增殖增加，记忆t细胞(例如，tcm和/或tem)的产生和保留增加，二次免疫应答之前的滞后时间缩短，二次免疫应答期间的峰值应答更高，和/或二次免疫应答的持续时间更长。
在特定的实施方案中，改善疫苗接种的功效在临床相关的时间窗内施用治疗有效量的本文公开的组合物后引起以下至少一种：改善的预防性治疗和/或改善的治疗性治疗。
预防性治疗预防或降低潜在病症或疾病的发生或严重程度，或减缓或减轻其发展。预防性疫苗治疗增加受试者对感染性病原体或癌症类型的免疫力。因此，在特定的实施方案中，疫苗可以预防性施用，例如施用到免疫学上原初的受试者(例如，没有先前暴露或没有感染病原体或癌症的经历)。
所述组合物可以预防性地施用到处于发展病况(例如，由hiv、疟疾、疱疹、衣原体、ebv、肺炎球菌和/或肝炎引起的感染或癌症)风险的受试者，或者已经暴露于导致这种感染的药剂的受试者中，以预防、降低或延迟感染或相关疾病的发展。例如，所述组合物可以施用到可能已经暴露于hiv、疟疾、疱疹、衣原体、ebv、肺炎球菌和/或肝炎的受试者或者处于暴露于hiv、疟疾、疱疹、衣原体、ebv、肺炎球菌和/或肝炎或癌症复发的高风险中的受试者。
治疗性治疗包括降低、消除或减缓现有病症或疾病的进展。在特定的实施方案中，疫苗可以治疗性地施用到已经暴露于感染性病原体或癌症的受试者。因此，疫苗可以用于减轻与感染性病原体相关的症状，诸如在hiv感染和aids的背景下降低的t细胞计数。
在特定的实施方案中，改善疫苗接种的功效提供改善的抗感染效应。抗感染效应可以降低感染细胞的数量，增加细胞感染前的时间，防止更高水平的感染，减少感染细胞的数量，减少感染组织的体积，增加预期寿命，诱导感染细胞对免疫清除的敏感性，降低感染相关的疼痛，和/或预防、降低、延迟或消除与治疗的感染相关的症状。
在特定的实施方案中，改善疫苗接种的功效提供改善的抗癌效应。抗癌效应可以包括癌细胞发生减少、癌细胞数量减少、转移发生减少、转移数量减少、肿瘤体积减少、预期寿命增加、诱导癌细胞对免疫清除的敏感性、抑制癌细胞增殖、抑制肿瘤生长、延长受试者寿命、降低癌症相关疼痛和/或降低或延迟治疗后癌症的复发或再发生。
施用到特定受试者的活性成分的实际剂量可以由医生、兽医或研究人员考虑诸如身体和生理因素的参数确定，所述参数包括靶标、体重、感染或癌症的存在和/或严重程度、感染或癌症的阶段、先前或同时的治疗干预、受试者的特发性和施用路径。
对于施用，可以基于来自体外测定和/或动物模型研究的结果初始估计治疗有效量(在本文中也称为剂量)。
组合物的示例性剂量包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240或250μg/kg体重或mg/kg体重，但可以使用更高和/或更低的剂量。可以随时间而施用的剂量的数量可以是经1、2、3、4、5或6周施用1、2、3、4或5剂，但可以至少部分地视受试者的免疫状态而增加或减少。
当遗传修饰的细胞作为组合物的一部分施用时，施用的示例性治疗有效量可以包含大于102个细胞，大于103个细胞，大于104个细胞，大于105个细胞，大于106个细胞，大于107个细胞，大于108个细胞，大于109个细胞，大于1010个细胞或大于1011个细胞。在特定的实施方案中，治疗有效量包括1百万至2千万个细胞/千克。
在特定的实施方案中，组合物可以在最初施用，此后通过进一步施用来维持。例如，组合物可以通过肌肉内注射给药。然后通过口服剂型维持受试者的水平，但是可以视患者的情况而使用其他施用形式。在疫苗和np组合物的情况下，组合物可以作为单剂量施用，或者所述组合物可以掺入固定加强剂量。例如，加强剂量可以包括疫苗抗原和tcr的变体，以提供针对多分支的感染剂的保护。
在特定的实施方案中，在一种或多种组合物中施用的活性成分可以是(i)pn和/或np内的pn，(ii)疫苗抗原和(iii)疫苗佐剂。在特定的实施方案中，当以组合形式包含时，组合中的取代基可以以诸如以下的示例性比率提供：1∶1∶1；1∶2∶1；1∶3∶1；1∶4∶1；1∶5；1；1∶10∶1；1∶2∶2；1∶2∶3；1∶3∶4；1∶4∶2；1∶5∶3；9∶10∶20；5∶2∶1；5∶3∶11；5∶4∶1；5∶5；1；5∶100∶1；5∶20∶2；5∶2∶3；5∶14∶200；5∶10∶20；或另外有益比率，这取决于组合中取代基的数量和特性，从而达到预期效应。如本领域普通技术人员所理解的，组合中的取代基可以在相同的组合物内或在不同的组合物内提供。
治疗有效量可以通过在治疗方案期间施用单剂量或多剂量(例如，qid、tid、bid、每天、隔天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年)来实现。
在特定的实施方案中，pn(以各种公开形式中的任一种(例如，裸露的或在np内)在疫苗抗原的1个月内，在疫苗抗原的3周内，在疫苗抗原的2周内，在疫苗抗原的1周内，在疫苗抗原的7天内，在疫苗抗原的6天内，在疫苗抗原的5天内，在疫苗抗原的4天内，在疫苗抗原的3天内，在疫苗抗原的2天内，在疫苗抗原的24小时内，在疫苗抗原的22小时内，在疫苗抗原的20小时内，在疫苗抗原的18小时内，在疫苗抗原的16小时内，在疫苗抗原的14小时内，在疫苗抗原的12小时内，在疫苗抗原的10小时内，在疫苗抗原的8小时内，在疫苗抗原的6小时内，在疫苗抗原的4小时内，在疫苗抗原的2小时内或在疫苗抗原的1小时内施用。“在......内”包括在疫苗施用之前或之后，并且这些时间中的每一个可以提供临床相关的时间窗。
在特定的实施方案中，增强的疫苗功效减少受试者的病况发展。病况可以通过临床端值评估，所述临床端值诸如为血液检查、活检样品的评估，以及发烧、寒战、皮疹、关节疼痛、恶心、呕吐、红眼、癌症复发等病症的症状。
除非另外指示，否则本公开的实践可以采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术。这些方法描述在以下出版物中。参见，例如，sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第2版(1989)；f.m.ausubel等编，currentprotocolsinmolecularbiology，(1987)；theseriesmethodsinenzymology(academicpress，inc.)；m.macpherson等，pcr：apracticalapproach，irlpressatoxforduniversitypress(1991)；macpherson等编pcr2：practicalapproach，(1995)；harlow和lane编，antibodies，alaboratorymanual，(1988)；以及r.i.freshney编，animalcellculture(1987)。
由公共数据库提供的序列信息可以用于鉴定可以与本文公开的系统和方法一起使用的另外基因和蛋白质序列。
还包括本文公开并引用的序列的变体。蛋白质的变体可以包括具有一处或多处保守氨基酸取代的蛋白质。如本文所用，“保守取代”涉及在以下保守取代组之一中见到的取代：第1组：丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)；第2组：天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)；第3组：天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)；第4组：精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、组氨酸(his)；第5组：异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、缬氨酸(val)；和第6组：苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)、色氨酸(trp)。
另外，氨基酸可以通过类似的功能或化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族、含硫)分组为保守取代基。例如，出于取代的目的，脂族基团可以包括gly、ala、val、leu和ile。含有被认为是保守取代的氨基酸的其他组包括：含硫：met和半胱氨酸(cys)；酸性：asp、glu、asn和gln；小的脂族、非极性或微极性残基：ala、ser、thr、pro和gly；极性、带负电荷的残基及其酰胺：asp、asn、glu和gln；极性、带正电荷的残基：his、arg和lys；大的脂族、非极性残基：met、leu、ile、val和cys；和大的芳族残基：phe、tyr和trp。其他信息在creighton(1984)proteins，w.h.freemanandcompany中见到。
如其他地方所指示，基因序列的变体可以包括密码子优化的变体、序列多态性、剪接变体和/或突变，其不会在统计学显著的程度上影响编码的产物的功能。
本文公开的蛋白质、核酸和基因序列的变体还包括与本文公开的蛋白质、核酸或基因序列具有至少70％序列同一性，80％序列同一性，85％序列，90％序列同一性，95％序列同一性，96％序列同一性，97％序列同一性，98％序列同一性或99％序列同一性的序列。
“％序列同一性”是指如通过比较序列所确定的在两种或更多种序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指蛋白质、核酸或基因序列之间的序列相关程度，如通过这类序列的串之间的匹配所确定。“同一性”(通常称为“相似性”)可以通过已知方法容易地计算，所述方法包括在下面描述的方法：computationalmolecularbiology(lesk，a.m.编)oxforduniversitypress，ny(1988)；biocomputing：informaticsandgenomeprojects(smith，d.w.编)academicpress，ny(1994)；computeranalysisofsequencedata，parti(griffin，a.m.和griffin，h.g.编)humanapress，nj(1994)；sequenceanalysisinmolecularbiology(vonheijne，g.编)academicpress(1987)；以及sequenceanalysisprimer(gribskov，m.anddevereux，j.编)oxforduniversitypress，ny(1992)。设计确定同一性的优选方法以得到所测试序列之间的最佳匹配。可公开获得的计算机程序中编纂了确定同一性和相似性的方法。序列比对和同一性百分比计算可以使用lasergene生物信息学计算套件(dnastar，inc.，madison，wisconsin)的megalign程序来执行。还可以使用clustal比对方法(higgins和sharpcabios，5，151-153(1989)用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行序列的多重比对。相关程序还包括gcg程序套件(wsconsinpackageversion9.0，geneticscomputergroup(gcg)，madison，wsconsin)；blastp、blastn、blastx(altschul等，j.mol.biol.215：403-410(1990)；dnastar(dnastar，inc.，madison，wisconsin)；以及并入smith-waterman算法的fasta程序(pearson，comput.methodsgenomeres.[proc.int.symp.](1994)，会议日期1992年，111-20。编者：suhai，sandor.出版者：plenum，newyork，n.y.。在本公开的背景内，应当理解，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析结果基于所引用程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”将指任何一组值或参数，其在最初初始化时最初与软件一起加载。
包括以下示例性实施方案和实施例以说明本公开的特定实施方案。本领域的普通技术人员按照本公开应当认识到，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文公开的特定实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或相似的结果。示例性实施方案
1.一种疫苗接种受试者的方法，其包括：
向受试者施用治疗有效量的编码t细胞受体(tcr)的多核苷酸，其中在所述施用的临床相关时间窗内所述编码的tcr特异性结合施用到所述受试者的疫苗抗原，从而疫苗接种所述受试者。
2.如实施方案1所述的方法，其中与单独施用所述疫苗抗原相比，所述施用改善疫苗接种的功效。
3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述受试者由于年龄或免疫状态而需要改善的疫苗功效。
4.如实施方案3所述的方法，其中所述免疫状态包括低t细胞计数。
5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述疫苗接种提供对aids、疟疾、疱疹、衣原体、埃巴病毒、肺炎球菌或乙型肝炎的治疗。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述tcr是i类限制性的。
7.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述tcr是ii类限制性的。
8.如实施方案6所述的方法，其中所述tcr是i类限制性的并且所述改善的疫苗功效归因于改善t细胞细胞毒性应答的cd8+t辅助细胞活性。
9.如实施方案7所述的方法，其中所述tcr是ii类限制性的并且所述改善的疫苗功效归因于改善b细胞抗体应答的cd4+t辅助细胞活性。
10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述tcr包含α链和β链的可变区。
11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述tcr包含α链和β链的恒定区。
12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述tcr包含跨膜结构域和胞质尾区。
13.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述tcr包含选自seqidno：1、4、18、21、23、25、27、29-32、34和36的α链。
14.如实施方案1-13中任一项所述的方法，其中所述tcr包含选自seqidno：2、3、19、22、24、26、28、33、35和37的β链。
15.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述tcr包含选自seqidno：5-12、15、16和39的序列。
16.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述疫苗抗原包括病毒抗原。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述病毒抗原源自腺病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、冠状病毒、黄病毒、汉坦病毒、嗜肝dna病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、正粘病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、轮状病毒、海绵状病毒或披膜病毒。
18.如实施方案16或17所述的方法，其中所述病毒抗原包含由巨细胞病毒、感冒病毒、埃巴病毒、流感病毒(fluvirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒(influenzavirus)、日本脑炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒表达的肽。
19.如实施方案16-18中任一项所述的方法，其中所述病毒抗原包括选自包膜糖蛋白b和/或cmvpp65的巨细胞病毒抗原；选自ebvebnai、ebvp18和/或ebvp23的埃巴抗原；选自s、m和/或l蛋白或乙型肝炎病毒的前s抗原的肝炎疫苗抗原；选自糖蛋白d的单纯疱疹疫苗抗原；选自hivgp32、hivgp41、hivgp120、hivgp160、hivp17/24、hivp24、hivp55gag、hivp66pol、hivtat、hivgp36、nef蛋白和/或hiv逆转录酶的人免疫缺陷病毒(hiv)疫苗抗原；选自l1蛋白的人乳头瘤病毒(hpv)病毒抗原；选自血凝素和神经氨酸酶的流感疫苗抗原；选自蛋白质e、m-e、m-e-ns1、ns1或ns1-ns2a的日本脑炎疫苗抗原；选自环子孢子(csp)、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶或果糖二磷酸醛缩酶的疟疾疫苗抗原；选自麻疹病毒融合蛋白的麻疹疫苗抗原；选自狂犬病糖蛋白或狂犬病核蛋白的狂犬病疫苗抗原；选自rsv融合蛋白或m2蛋白的呼吸道合胞疫苗抗原；选自vp7sc的轮状病毒疫苗抗原；选自蛋白质e1或e2的风疹疫苗抗原；选自gpi或gpii的水痘带状疱疹疫苗抗原；或选自前膜、包膜(e)、e蛋白的结构域iii或非结构蛋白1、2、3、4或5的寨卡疫苗抗原。
20.如实施方案16-18中任一项所述的方法，其中所述病毒抗原选自nef(66-97)、nef(116-145)、gagp17(17-35)、gagp17-p24(253-284)、pol325-355(rt158-188)、csp中心重复区或e蛋白结构域iii。
21.如实施方案16-20中任一项所述的方法，其中所述病毒抗原包含seqidno：128-134中的任一种。
22.如实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述疫苗抗原包括癌抗原。
23.如实施方案22所述的方法，其中所述癌抗原包括a33；bage；bcl-2；β-连环蛋白；ca125；ca19-9；cd5；cd19；cd20；cd21；cd22；cd33；cd37；cd45；cd123；cea；c-met；cs-1；细胞周期蛋白b1；dage；ebna；egfr；肝配蛋白b2；雌激素受体；fap；铁蛋白；叶酸结合蛋白；gage；g250；gd-2；gm2；gp75、gp100(pmel17)；her-2/neu；hpve6；hpve7；ki-67；lrp；间皮素；p53、prame；孕酮受体；psa；psma；mage；mart；间皮素；muc；mum-1-b；myc；nyeso-1；ras；rori；存活素；腱生蛋白；tsta酪氨酸酶；vegf；或wt1。
24.如实施方案22或23所述的方法，其中所述癌抗原包括psma、psca、间皮素、cd19、cd20、ror1或wt1。
25.如实施方案22-24中任一项所述的方法，其中所述癌抗原包含seqidno：135-141中的任一种。
26.如实施方案1-25中任一项所述的方法，其还包括施用疫苗佐剂。
27.如实施方案26所述的方法，其中所述疫苗佐剂包括(i)选自cpg、cpg-28、poly(i：c)、α-半乳糖神经酰胺、mpla、vtx-2337、emd1201081)咪喹莫特、mgn1703、g100、cblb502、hiltonol和咪喹莫特的toll样受体配体，和/或(ii)17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
28.如实施方案26所述的方法，其中所述疫苗佐剂包括sting激动剂。
29.如实施方案28所述的方法，其中所述sting激动剂包括c-digmp、c-diamp、c-gamp、c-aimp、(3’，2’)c-aimp、(2’，2’)c-aimp、(2’，3’)c-aimp、c-aimp(s)、c-(damp-dimp)、c-(damp-2’fdimp)、c-(2’fdamp-2’fdimp)、(2’，3’)c-(amp-2’fdimp)、c-[2’fdamp(s)-2’fdimp(s)]、c-[2’fdamp(s)-2’fdimp(s)](pom)2和/或dmxaa。
30.如实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含质粒、小环质粒或自复制的mrna分子。
31.如实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过肌肉内注射。
32.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在纳米粒子内。
33.如实施方案32所述的方法，其中所述纳米粒子包含脂质体、聚合粒子、金属粒子、聚合物胶束、聚乙烯亚胺(pei)/dna复合体或其组合。
34.如实施方案32或33所述的方法，其中所述纳米粒子包含聚(β-氨基酯)聚合物。
35.如实施方案32-34中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含脂质包衣。
36.如实施方案35所述的方法，其中所述脂质包衣包括脂质体、脂质双层或聚合物胶束。
37.如实施方案32-36中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含具有pga包衣的聚(β-氨基酯)。
38.如实施方案32-37中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含t细胞靶向和递送剂(t-da)。
39.如实施方案38所述的方法，其中所述t-da包含在体内选择性结合t细胞的结合结构域。
40.如实施方案38所述的方法，其中所述t-da包含选择性结合t细胞受体基序；t细胞α链；t细胞β链；ccr7；cd3；cd4；cd8；cd28；cd45ra；cd62l；cd127；或lfa-1的结合结构域。
41.如实施方案40所述的方法，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd4。
42.如实施方案41所述的方法，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：41-46中的任一种。
43.如实施方案40所述的方法，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd8。
44.如实施方案43所述的方法，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：47-52中的任一种。
45.如实施方案40所述的方法，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd3。
46.如实施方案45所述的方法，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：53-58中的任一种。
47.如实施方案38-40中任一项所述的方法，其中所述t-da包含在体内和离体选择性结合cd4+t或cd8+t细胞的结合结构域。
48.如实施方案39-47中任一项所述的方法，其中所述t-da结合结构域包含t细胞受体基序抗体；t细胞α链抗体；t细胞β链抗体；ccr7抗体；cd3抗体；cd4抗体；cd8抗体；cd28抗体；cd45ra抗体；cd62l抗体；cd127抗体；lfa-1抗体；或前述抗体的有效片段。
49.如实施方案32-48中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含内体释放剂(era)。
50.如实施方案49所述的方法，其中所述era包含seqidno：40和59-80或其组合中的任一种。
51.如实施方案32-50中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含核靶向剂(nta)。
52.如实施方案51所述的方法，其中所述nta包含seqidno：81-127或其组合中的任一种。
53.如实施方案32-52中任一项所述的方法，其中所述纳米粒子包含ipb7转座酶、s/mar元件、含piggybac转座酶的质粒、含睡美人转座酶的质粒；智人转座子衍生的buster1转座酶样蛋白基因；人内源性逆转录病毒h蛋白酶/整合酶衍生的orf1；智人cas-br-m(鼠科)亲嗜性逆转录病毒转化序列；智人内源性逆转录病毒序列k；智人内源性逆转录病毒家族w序列；智人line-1型转座酶结构域；或智人pogo可转座元件。
54.如实施方案53所述的方法，其中所述ibp7转座酶包含seqidno：142。
55.如实施方案1-54中任一项所述的方法，其中所述施用在施用的10天内；9天内；8天内；7天内；6天内；5天内；4天内；或3天内引起由t细胞选择性地表达所述多核苷酸。
56.一种试剂盒，其包含疫苗抗原和编码t细胞受体(tcr)的多核苷酸(pn)，所述t细胞受体在由t细胞表达时结合所述疫苗抗原。
57.如实施方案56所述的试剂盒，其中所述tcr是i类限制性的。
58.如实施方案56所述的试剂盒，其中所述tcr是ii类限制性的。
59.如实施方案56-58中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含α链和β链的可变区。
60.如实施方案56-59中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含α链和β链的恒定区。
61.如实施方案56-60中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含跨膜结构域和胞质尾区。
62.如实施方案56-61中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含含有seqidno：1、4、18、21、23、25、27、29-32、34和36的α链。
63.如实施方案56-62中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含含有seqidno：2、3、19、22、24、26、28、33、35和37的β链。
64.如实施方案56-61中任一项所述的试剂盒，其中所述tcr包含seqidno：5-12、15、16和39。
65.如实施方案56-64中任一项所述的试剂盒，其中所述疫苗抗原包括病毒抗原。
66.如实施方案65所述的试剂盒，其中所述病毒抗原源自腺病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、冠状病毒、黄病毒、汉坦病毒、嗜肝dna病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、正粘病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、轮状病毒、海绵状病毒或披膜病毒。
67.如实施方案65所述的试剂盒，其中所述病毒抗原包含由巨细胞病毒、感冒病毒、埃巴病毒、流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、西尼罗河病毒或寨卡病毒表达的肽。
68.如实施方案65-67中任一项所述的试剂盒，其中所述病毒抗原包括选自包膜糖蛋白b和/或cmvpp65的巨细胞病毒抗原；选自ebvebnai、ebvp18和/或ebvp23的埃巴抗原；选自s、m和/或l蛋白或乙型肝炎病毒的前s抗原的肝炎疫苗抗原；选自糖蛋白d的单纯疱疹疫苗抗原；选自hivgp32、hivgp41、hivgp120、hivgp160、hivp17/24、hivp24、hivp55gag、hivp66pol、hivtat、hivgp36、nef蛋白和/或hiv逆转录酶的人免疫缺陷病毒(hiv)疫苗抗原；选自l1蛋白的人乳头瘤病毒(hpv)病毒抗原；选自血凝素和神经氨酸酶的流感疫苗抗原；选自蛋白质e、m-e、m-e-ns1、ns1或ns1-ns2a的日本脑炎疫苗抗原；选自环子孢子(csp)、谷氨酸脱氢酶、乳酸脱氢酶或果糖二磷酸醛缩酶的疟疾疫苗抗原；选自麻疹病毒融合蛋白的麻疹疫苗抗原；选自狂犬病糖蛋白或狂犬病核蛋白的狂犬病疫苗抗原；选自rsv融合蛋白或m2蛋白的呼吸道合胞疫苗抗原；选自vp7sc的轮状病毒疫苗抗原；选自蛋白质e1或e2的风疹疫苗抗原；选自gpi或gpii的水痘带状疱疹疫苗抗原；或选自前膜、包膜(e)、e蛋白的结构域iii或非结构蛋白1、2、3、4或5的寨卡疫苗抗原。
69.如实施方案65-68中任一项所述的试剂盒，其中所述病毒抗原包括nef(66-97)、nef(116-145)、gagp17(17-35)、gagp17-p24(253-284)、pol325-355(rt158-188)、csp中心重复区或e蛋白结构域iii。
70.如实施方案65-69中任一项所述的试剂盒，其中所述病毒抗原包含seqidno：128-134中的任一种。
71.如实施方案56-70中任一项所述的试剂盒，其中所述疫苗抗原包括癌抗原。
72.如实施方案71所述的试剂盒，其中所述癌抗原包括a33；bage；bcl-2；β-连环蛋白；ca125；ca19-9；cd5；cd19；cd20；cd21；cd22；cd33；cd37；cd45；cd123；cea；c-met；cs-1；细胞周期蛋白b1；dage；ebna；egfr；肝配蛋白b2；雌激素受体；fap；铁蛋白；叶酸结合蛋白；gage；g250；gd-2；gm2；gp75、gp100(pmel17)；her-2/neu；hpve6；hpve7；ki-67；lrp；间皮素；p53、prame；孕酮受体；psa；psma；mage；mart；间皮素；muc；mum-1-b；myc；nyeso-1；ras；rori；存活素；腱生蛋白；tsta酪氨酸酶；vegf；或wt1。
73.如实施方案71或72所述的试剂盒，其中所述癌抗原包括psma、psca、间皮素、cd19、cd20、ror1或wt1。
74.如实施方案73所述的试剂盒，其中所述癌抗原包含seqidno：135-141中的任一种。
75.如实施方案56-74中任一项所述的试剂盒，其还包括施用疫苗佐剂。
76.如实施方案75所述的试剂盒，其中所述疫苗佐剂包括sting激动剂。
77.如实施方案56-76中任一项所述的试剂盒，其中所述多核苷酸包含质粒、小环质粒或自复制的mrna分子。
78.如实施方案56-77中任一项所述的试剂盒，其中所述多核苷酸在纳米粒子内。
79.如实施方案78所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含脂质体、聚合粒子、金属粒子、聚合物胶束、聚乙烯亚胺(pei)/dna复合体或其组合。
80.如实施方案78所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含聚(β-氨基酯)聚合物。
81.如实施方案78-80中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含脂质包衣。
82.如实施方案81所述的试剂盒，其中所述脂质包衣包括脂质体、脂质双层或聚合物胶束。
83.如实施方案78-82中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含具有pga包衣的聚(β-氨基酯)聚合物。
84.如实施方案78-83中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含t细胞靶向和递送剂(t-da)。
85.如实施方案84所述的试剂盒，其中所述t-da包括选择性结合t细胞受体基序；t细胞α链；t细胞β链；ccr7；cd3；cd4；cd8；cd28；cd45ra；cd62l；cd127；或lfa-1的结合结构域。
86.如实施方案85所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd4。
87.如实施方案86所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：41-46中的任一种。
88.如实施方案85所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd8。
89.如实施方案88所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：47-52中的任一种。
90.如实施方案85所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域选择性结合cd3。
91.如实施方案90所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域包含seqidno：53-58中的任一种。
92.如实施方案84或85所述的试剂盒，其中所述t-da包含在体内和离体选择性结合cd4+t或cd8+t细胞的结合结构域。
93.如实施方案85-92中任一项所述的试剂盒，其中所述t-da结合结构域包含t细胞受体基序抗体；t细胞α链抗体；t细胞β链抗体；ccr7抗体；cd3抗体；cd4抗体；cd8抗体；cd28抗体；cd45ra抗体；cd62l抗体；cd127抗体；lfa-1抗体；或前述抗体的有效片段。
94.如实施方案56-93中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含内体释放剂(era)。
95.如实施方案94所述的试剂盒，其中所述era包含seqidno：40和59-80、或其组合中的任一种。
96.如实施方案56-95中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含核靶向剂(nta)。
97.如实施方案96所述的试剂盒，其中所述nta包含seqidno：81-127或其组合中的任一种。
98.如实施方案56-97中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米粒子包含ipb7转座酶、s/mar元件、含piggybac转座酶的质粒、含睡美人转座酶的质粒；智人转座子衍生的buster1转座酶样蛋白基因；人内源性逆转录病毒h蛋白酶/整合酶衍生的orf1；智人cas-br-m(鼠科)亲嗜性逆转录病毒转化序列；智人内源性逆转录病毒序列k；智人内源性逆转录病毒家族w序列；智人line-1型转座酶结构域；或智人pogo可转座元件。
99.如实施方案98所述的试剂盒，其中所述ibp7转座酶包含seqidno：142。
100.如实施方案1-99中任一项所述的方法或试剂盒用于为受试者的t细胞提供疫苗抗原识别能力的用途。
101.如实施方案1-99中任一项所述的方法或试剂盒使受试者的免疫系统对疫苗抗原作出应答的用途。
102.如实施方案1-99中任一项所述的方法或试剂盒增加受试者的免疫系统对疫苗抗原作出应答的用途。
实施例：如果疫苗与编程t细胞的试剂共同递送以产生与疫苗抗原反应的tcr，则可以增强许多疫苗的影响。通过将cd8靶向的纳米粒子(np)与编码卵清蛋白(ova)特异性ot-itcr的质粒一起加载来测试该假定(图3a)。这些携带dna的np的设计基于开发用于将肿瘤识别能力编程到循环淋巴细胞(在那些研究中)中的版本，证明当np配备有淋巴细胞靶向配体时，嵌合抗原受体基因被转染到宿主t细胞中。该np平台适用于编程宿主t细胞，因此它们表达疫苗特异性tcr。对p14tcr转基因小鼠(仅含有对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒具有特异性的cd8t细胞)肌内注射单剂量的1011个递送编码ova特异性ot-1tcr的基因以及myc-tag和极度活跃的ipb7转座酶的t细胞靶向的np。这些np是单独注射或与ova肽疫苗组合注射的。作为对照，仅用ova疫苗免疫小鼠，或未进行处理。在免疫接种后7天和30天，分离引流淋巴结，因此可以通过流式细胞术定量np程序化(ova-四聚体+)t细胞的百分比。发现肌内注射的np有效地将工程化tcr基因递送到宿主t细胞中，使得它们识别疫苗抗原(图3b)。在其快速疫苗诱导的扩增之后，np编程的t细胞分化成长寿记忆t细胞(图3b、图3c)。
利用kraslsl-g12d/+；trp53lsl-r172h/+；p48cre/+(kpc)小鼠模型以在临床相关的体内测试系统中测试np疫苗策略。kpc模型在已知驱动胰腺肿瘤发生的内源基因座位表达突变体kras和p53。该模型概括了人胰腺导管腺癌(pda)的主要特征，包括分子进展、组织病理学和临床综合征(图4a)。对带有确定的肿瘤负荷(直径2-5mm，如通过高分辨率超声测定)的kpc小鼠肌肉内注射单剂量的1013个递送编码肿瘤抗原间皮素(msln)特异性受体tcr1045的基因以及myc-标签和极度活跃的ipb7转座酶的t细胞靶向的np(stromnes，im等(2015)同上)(以确保通过“剪切和黏贴”机制将载体有效整合到染色体中)。在特定的实施方案中，极度活跃的ipb7转座酶是鼠科密码子优化的piggybac转座酶cdna(genbank登录号：ef587698，
如本领域普通技术人员将理解的，本文所公开的每个实施方案可以包括以下项、基本上由或由以下项组成：其特别陈述的元件、步骤、成分或组分。如本文所用的过渡术语“包含(comprise)”或“包含(comprises)”意指包括但不限于，并且允许包括未指定的元件、步骤、成分或组分，甚至是以较大的量。过渡短语“由......组成”排除未指定的任何元件、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由......组成”将实施方案的范围限制为指定的元件、步骤、成分或组分以及并不实质地影响所述实施方案的那些。如本文所用，实质影响将导致在疫苗施用的7天内增加受试者的免疫系统对疫苗抗原作出应答的能力的统计学显著降低。
除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质如分子量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非指出相反情况，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。在最低限度并且不试图限制对权利要求书范围的等效范围的原则的应用，每个数值参数均应当至少根据报道的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。当需要进一步澄清时，术语“约”在与所述数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理赋予其的含义，即表示稍大或稍小于所述值或范围，在所述值的±20％范围内；在所述值的±19％范围内；在所述值的±18％范围内；在所述值的±17％范围内；在所述值的±16％范围内；在所述值的±15％范围内；在所述值的±14％范围内；在所述值的±13％范围内；在所述值的±12％范围内；在所述值的±11％范围内；在所述值的±10％范围内；在所述值的±9％范围内；在所述值的±8％范围内；在所述值的±7％范围内；在所述值的±6％范围内；在所述值的±5％范围内；在所述值的±4％范围内；在所述值的±3％范围内；在所述值的±2％范围内；或在所述值的±1％范围内。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在特定实施例中所阐述的数值尽可能精确地加以报告。然而，任何数值本身都含有由其各自测试测量中见到的标准偏差必然引起的某些误差。
应当理解，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则在描述本发明的背景下(特别是在以下权利要求书背景下)使用的术语“一(a)”、“一(an)”、“所述”和相似指示应解释为涵盖单数和复数。本文中所列举数值的范围仅旨在作为一种对落在所述范围内的每个单独数值单独提及的简便方法。除非本文另外指示，否则每个单独数值都并入本说明书中，如同本文中单独列举每个单独数值一样。可以按任何适合的顺序执行本文所描述的所有方法，除非本文另外指示或明显与上下文矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对另外要求保护的本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应解读为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
本文所公开的本发明的替代性元素或实施方案的分组不应被理解为限制。每个组成员可单独或者以与组中的其他成员或本文发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于便利和/或可专利性的原因，预期组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当出现任何这种包括或删除时，本说明书被认为包含所修改的组，因此满足所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面说明。
本文描述了本发明的特定实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。当然，本领域技术人员在阅读前面的说明后将会明了这些所述实施方案的变型。本发明人预期本领域的熟练技术人员会适时采用此类变型，而且本发明人预期能以除了本文具体描述的方式之外的方式来实施。因此，本发明包括在随附的适用法律允许的权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾，否则在所有可行变型中的上述元素的任何组合都涵盖在本发明内。
此外，整个本说明书对专利和印刷的出版物做了很多引用。上文引用的各参考文献和印刷的出版物的全部内容都单独以引用的方式并入本文。
最后，应当理解，本文所公开的本发明的实施方案是对本发明原理的说明。可用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，例如，但不限于，可根据本文的教义利用本发明的替代性配置。因而，本发明不限于明确示出和描述的方案。
本文示出的细节是作为实施例并且仅出于对本发明的优选实施方案的说明性讨论的目的，并且之所以呈现这些细节，是为了提供认为是本发明的各种实施方案的原理和概念方面的最有用和易理解的描述的内容。在这点上，除对于本发明的基本理解所必需的之外，没有企图更详细地示出本发明的结构细节，借助于附图和/或实施例所作的描述使得本领域技术人员明了如何可以在实践中实施本发明的若干形式。
除非在以下实施例中明确并毫无疑问地修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义，否则在本公开中使用的定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建。如果该术语的构建使其无意义或基本无意义，则该定义应取自韦氏词典，第3版或本领域普通技术人员已知的词典如牛津生物化学和分子生物学词典(anthonysmith编，oxforduniversitypress，oxford，2004)。
序列表
<110>弗莱德哈钦森癌症研究中心
m·斯特凡
<120>改善疫苗功效的系统和方法
<130>f053-0055pct/17-020-wo-pct
<150>us62/442,903
<151>2017-01-05
<160>142
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>263
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>1
metasnserserleuasppheleuileleuileleumetpheglygly
151015
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65707580
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130135140
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145150155160
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245250255
thrleuargleutrpserser
260
<210>2
<211>310
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>2
metglyproglyleuleucystrpvalleuleucysleuleuglyala
151015
glyservalgluthrglyvalthrglnserprothrhisleuilelys
202530
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354045
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505560
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15
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<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>由结合人疱疹病毒-5或巨细胞病毒(cmv)抗原的内部自裂解猪捷申病毒2a序列分隔的α和β链的人工tcr
<400>39
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gly
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aagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgcc300
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<210>41
<211>10
<212>prt
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<220>
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<400>41
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1510
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<212>prt
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<220>
<223>tnx-355抗cd4抗体的重链可变结构域的cdrh2
<400>42
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151015
gly
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<212>prt
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<220>
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<400>43
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1510
<210>44
<211>17
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>tnx-355抗cd4抗体的轻链可变结构域的cdrl1
<400>44
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151015
ala
<210>45
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>45
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15
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<211>8
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>46
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15
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<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>47
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15
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<211>6
<212>prt
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<220>
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<400>48
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15
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<211>9
<212>prt
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<220>
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<400>49
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15
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<211>6
<212>prt
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<220>
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<400>50
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15
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<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>okt8抗cd8抗体的轻链可变结构域的cdrl2
<400>51
serglyserthrleuglnser
15
<210>52
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>52
hisasngluasnproleuthr
15
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<211>5
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>53
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15
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<212>prt
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<220>
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<400>54
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151015
asp
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<220>
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<400>55
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1510
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<220>
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1510
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<212>prt
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<220>
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<400>57
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15
<210>58
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<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
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<400>58
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15
<210>59
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<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>含疏水膜易位序列的肽
<400>59
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151015
<210>60
<211>11
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>含疏水膜易位序列的肽
<400>60
alaalaleuleuprovalleuleualaalapro
1510
<210>61
<211>16
<212>prt
<213>流感病毒(influenzavirus)
<400>61
glyleupheglualailealaglypheilegluasnglytrpglugly
151015
<210>62
<211>11
<212>prt
<213>人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus)
<400>62
tyrglyarglyslysargargglnargargarg
1510
<210>63
<211>16
<212>prt
<213>鸭乙型肝炎病毒(duckhepatitisbvirus)
<400>63
metserglythrpheglyglyileleualaglyleuileglyleuleu
151015
<210>64
<211>16
<212>prt
<213>土拨鼠乙型肝炎病毒(woodchuckhepatitisbvirus)
<400>64
metserproserserleuleuglyleuleualaglyleuglnvalval
151015
<210>65
<211>17
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>合成示例性内体释放剂
<400>65
glyleupheglualaleuleugluleuleugluserleutrpgluleu
151015
leu
<210>66
<211>16
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>合成示例性内体释放剂
<400>66
leulyslysleuleulyslysleuleulyslysleuleulyslysleu
151015
<210>67
<211>16
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>示例性内体释放剂
<400>67
argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys
151015
<210>68
<211>14
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>tat片段-示例性内体释放剂
<400>68
glyarglyslysargargglnargargargproproglncys
1510
<210>69
<211>27
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>示例性内体释放剂
<400>69
glyalaleupheleuglytrpleuglyalaalaglyserthrmetgly
151015
alatrpserglnprolyslyslysarglysval
2025
<210>70
<211>18
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>pvec-示例性内体释放剂
<400>70
leuleuileileleuargargargilearglysglnalahisalahis
151015
serlys
<210>71
<211>26
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>转运子-示例性内体释放剂
<400>71
glytrpthrleuasnseralaglytyrleuleulysileasnleulys
151015
alaleualaalaleualalyslysileleu
2025
<210>72
<211>18
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>两亲性模型肽-示例性内体释放剂
<400>72
lysleualaleulysleualaleulysalaleulysalaalaleulys
151015
leuala
<210>73
<211>9
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>arg9-示例性内体释放剂
<400>73
argargargargargargargargarg
15
<210>74
<211>37
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>ll-37，示例性内体释放剂
<400>74
leuleuglyaspphephearglysserlysglulysileglylysglu
151015
phelysargilevalglnargilelysasppheleuargasnleuval
202530
proargthrgluser
35
<210>75
<211>31
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>天蚕抗菌肽p1-示例性内体释放剂
<400>75
sertrpleuserlysthralalyslysleugluasnseralalyslys
151015
argilesergluglyilealailealaileglnglyglyproarg
202530
<210>76
<211>30
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>α-防御素-示例性内体释放剂
<400>76
alacystyrcysargileproalacysilealaglygluargargtyr
151015
glythrcysiletyrglnglyargleutrpalaphecyscys
202530
<210>77
<211>36
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>β-防御素-示例性内体释放剂
<400>77
asphistyrasncysvalserserglyglyglncysleutyrserala
151015
cysproilephethrlysileglnglythrcystyrargglylysala
202530
lyscyscyslys
35
<210>78
<211>12
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>牛抗菌肽-示例性内体释放剂
<400>78
arglyscysargilevalvalileargvalcysarg
1510
<210>79
<211>42
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>pr-3，在c-末端酰胺化，示例性内体释放剂
<400>79
argargargproargproprotyrleuproargproargpropropro
151015
phepheproproargleuproproargileproproglyphepropro
202530
argpheproproargpheproglylysarg
3540
<210>80
<211>13
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>indolicidin-示例性内体释放剂，在c-末端酰胺化
<400>80
ileleuprotrplystrpprotrptrpprotrpargarg
1510
<210>81
<211>27
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>微管相关序列(mtas)，示例性内体释放剂
<400>81
proleulysthrproglylyslyslyslysglylysproglylysarg
151015
lysgluglnglulyslyslysargargthrarg
2025
<210>82
<211>30
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>示例性核定位信号(nls)序列
<400>82
glyargtyrleuthrglngluthrasnlysvalgluthrtyrlysglu
151015
glnproleulysthrproglylyslyslyslysglylyspro
202530
<210>83
<211>44
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>重叠的mtas和nls序列的示例性核靶向剂
<400>83
glyargtyrleuthrglngluthrasnlysvalgluthrtyrlysglu
151015
glnproleulysthrproglylyslyslyslysglylysproglylys
202530
arglysgluglnglulyslyslysargargthrarg
3540
<210>84
<211>7
<212>prt
<213>猿猴病毒40(simianvirus40)
<400>84
prolyslyslysarglysval
15
<210>85
<211>16
<212>prt
<213>爪蟾(xenopus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(12)
<223>xaa可以是任何氨基酸
<400>85
lysargxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaalyslyslysleu
151015
<210>86
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>86
prolyslyslysarglysval
15
<210>87
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>87
prolyslyslysargmetval
15
<210>88
<211>10
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>88
prolyslyslysarglysvalgluasppro
1510
<210>89
<211>8
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>89
prolyslysglyserlyslysala
15
<210>90
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>90
prolysthrlysarglysval
15
<210>91
<211>11
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>91
cysglyglyprolyslyslysarglysvalgly
1510
<210>92
<211>7
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>92
prolyslyslysilelysval
15
<210>93
<211>34
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>93
cystyraspaspglualathralaaspserglnhisserthrpropro
151015
lyslyslysarglysvalgluaspprolysasppheglusergluleu
202530
leuser
<210>94
<211>13
<212>prt
<213>人工(artificial)
<220>
<223>sv40t-ag-衍生的nls肽
<400>94
cysglytyrglyprolyslyslysarglysvalglygly
1510
<210>95
<211>7
<212>prt
<213>多瘤病毒(polyomavirus)
<400>95
prolyslysalaarggluasp
15
<210>96
<211>13
<212>prt
<213>多瘤病毒(polyomavirus)
<400>96
cysglytyrglyvalserarglysargproargprogly
1510
<210>97
<211>8
<212>prt
<213>猿猴病毒40(simianvirus40)
<400>97
alaprothrlysarglysglyser
15
<210>98
<211>11
<212>prt
<213>多瘤病毒(polyomavirus)
<400>98
alaprolysarglysserglyvalserlyscys
1510
<210>99
<211>7
<212>prt
<213>猿猴病毒40(simianvirus40)
<400>99
proasnlyslyslysarglys
15
<210>100
<211>12
<212>prt
<213>多瘤病毒(polyomavirus)
<400>100
glugluaspglyproglnlyslyslysargargleu
1510
<210>101
<211>7
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>101
glylyslysargserlysala
15
<210>102
<211>5
<212>prt
<213>腺病毒e1a(adenoviruse1a)
<400>102
lysargproargpro
15
<210>103
<211>11
<212>prt
<213>腺病毒2/5e1a型(adenovirustype2/5e1a)
<400>103
cysglyglyleuserserlysargproargpro
1510
<210>104
<211>12
<212>prt
<213>爪蟾(xenopus)
<400>104
leulysasplysaspalalyslysserlysglnglu
1510
<210>105
<211>10
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>v-rel或p59v-rel，示例性nls
<400>105
glyasnlysalalysargglnargserthr
1510
<210>106
<211>11
<212>prt
<213>甲型流感(influenzaa)
<400>106
propheleuaspargleuargargaspglnlys
1510
<210>107
<211>9
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>107
servalthrlyslysarglysleuglu
15
<210>108
<211>9
<212>prt
<213>爪蟾(xenopus)
<400>108
seralaserlysargargargleuglu
15
<210>109
<211>11
<212>prt
<213>腺病毒5(adenovirus5)
<400>109
proprolyslysargmetargargargileglu
1510
<210>110
<211>28
<212>prt
<213>大鼠(rat)
<400>110
tyrarglyscysleuglnalaglymetasnleuglualaarglysthr
151015
lyslyslysilelysglyileglnglnalathrala
2025
<210>111
<211>54
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>111
arglysaspargargglyglyargmetleulyshislysargglnarg
151015
aspaspglygluglyargglygluvalglyseralaglyaspmetarg
202530
alametileasnalacysileaspasnleutrpproserproleumet
354045
ilelysargserlyslys
50
<210>112
<211>8
<212>prt
<213>兔(rabbit)
<400>112
arglysphelyslyspheasnlys
15
<210>113
<211>8
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>得自c-myb基因产物，示例性nls
<400>113
proleuleulyslysilelysgln
15
<210>114
<211>8
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>得自n-myc基因产物，示例性nls
<400>114
proproglnlyslysilelysser
15
<210>115
<211>7
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>得自p53，示例性nls
<400>115
proglnprolyslyslyspro
15
<210>116
<211>9
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>得自c-erb-a基因产物，示例性nls
<400>116
serlysargvalalalysarglysleu
15
<210>117
<211>14
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>117
metthrglyserlysthrarglyshisargglyserglyala
1510
<210>118
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>118
arghisarglyshispro
15
<210>119
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>119
lysargarglyshispro
15
<210>120
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>120
lystyrarglyshispro
15
<210>121
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>121
lyshisargarghispro
15
<210>122
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>122
lyshislyslyshispro
15
<210>123
<211>6
<212>prt
<213>酵母(yeast)
<400>123
arghisleulyshispro
15
<210>124
<211>33
<212>prt
<213>乙型肝炎(hepatitisb)
<400>124
progluthrthrvalvalargargargglyargserproargargarg
151015
thrproserproargargargargserproargargargargsergln
202530
ser
<210>125
<211>9
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>得自病毒jun，示例性nls
<400>125
alaserlysserarglysarglysleu
15
<210>126
<211>16
<212>prt
<213>人t细胞白血病病毒(humantcellleukemiavirus)
<400>126
glyglyleucysseralaargleuhisarghisalaleuleualathr
151015
<210>127
<211>18
<212>prt
<213>小鼠(mouse)
<400>127
aspthrargglulyslyslyspheleulysargargleuleuargleu
151015
aspglu
<210>128
<211>32
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>128
valglypheprovalthrproglnvalproleuargprometthrtyr
151015
lysalaalavalaspleuserhispheleulysglulysglyglyleu
202530
<210>129
<211>30
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>129
histhrglnglytyrpheproasptrpglnasntyrthrproglypro
151015
glyvalargtyrproleuthrpheglytrpleutyrlysleu
202530
<210>130
<211>19
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>130
glulysileargleuargproglyglylyslyslystyrlysleulys
151015
hisileval
<210>131
<211>32
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>131
asnproproileprovalglygluiletyrlysargtrpileileleu
151015
glyleuasnlysilevalargmettyrserprothrserileleuasp
202530
<210>132
<211>31
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>132
alailepheglnsersermetthrlysileleugluprophearglys
151015
glnasnproaspilevaliletyrglntyrmetaspaspleutyr
202530
<210>133
<211>20
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>133
asnalaasnproasnalaasnproasnalaasnproasnalaasnpro
151015
asnalaasnpro
20
<210>134
<211>81
<212>prt
<213>病毒(virus)
<400>134
alaphethrphethrlysileproalagluthrleuhisthrvalthr
151015
gluvalglntyralaglythraspglyprocyslysvalproalagln
202530
metalavalaspmetglnthrleuthrprovalglyargleuilethr
354045
alaasnprovalilethrgluglythrgluasnserlysmetmetleu
505560
gluleuasppropropheglyaspsertyrilevalileglyvalgly
65707580
glu
<210>135
<211>750
<212>prt
<213>未知(unknown)
<220>
<223>psma癌症疫苗抗原
<400>135
mettrpasnleuleuhisgluthraspseralavalalathralaarg
151015
argproargtrpleucysalaglyalaleuvalleualaglyglyphe
202530
pheleuleuglypheleupheglytrppheilelysserserasnglu
354045
alathrasnilethrprolyshisasnmetlysalapheleuaspglu
505560
leulysalagluasnilelyslyspheleutyrasnphethrglnile
65707580
prohisleualaglythrgluglnasnpheglnleualalysglnile
859095
glnserglntrplysglupheglyleuaspservalgluleualahis
100105110
tyraspvalleuleusertyrproasnlysthrhisproasntyrile
115120125
serileileasngluaspglyasngluilepheasnthrserleuphe
130135140
gluproproproproglytyrgluasnvalseraspilevalpropro
145150155160
pheseralapheserproglnglymetprogluglyaspleuvaltyr
165170175
valasntyralaargthrgluaspphephelysleugluargaspmet
180185190
lysileasncysserglylysilevalilealaargtyrglylysval
195200205
pheargglyasnlysvallysasnalaglnleualaglyalalysgly
210215220
valileleutyrseraspproalaasptyrphealaproglyvallys
225230235240
sertyrproaspglytrpasnleuproglyglyglyvalglnarggly
245250255
asnileleuasnleuasnglyalaglyaspproleuthrproglytyr
260265270
proalaasnglutyralatyrargargglyilealaglualavalgly
275280285
leuproserileprovalhisproileglytyrtyraspalaglnlys
290295300
leuleuglulysmetglyglyseralaproproaspsersertrparg
305310315320
glyserleulysvalprotyrasnvalglyproglyphethrglyasn
325330335
pheserthrglnlysvallysmethisilehisserthrasngluval
340345350
thrargiletyrasnvalileglythrleuargglyalavalglupro
355360365
aspargtyrvalileleuglyglyhisargaspsertrpvalphegly
370375380
glyileaspproglnserglyalaalavalvalhisgluilevalarg
385390395400
serpheglythrleulyslysgluglytrpargproargargthrile
405410415
leuphealasertrpaspalagluglupheglyleuleuglyserthr
420425430
glutrpalaglugluasnserargleuleuglngluargglyvalala
435440445
tyrileasnalaaspserserilegluglyasntyrthrleuargval
450455460
aspcysthrproleumettyrserleuvalhisasnleuthrlysglu
465470475480
leulysserproaspgluglyphegluglylysserleutyrgluser
485490495
trpthrlyslysserproserproglupheserglymetproargile
500505510
serlysleuglyserglyasnaspphegluvalphepheglnargleu
515520525
glyilealaserglyargalaargtyrthrlysasntrpgluthrasn
530535540
lyspheserglytyrproleutyrhisservaltyrgluthrtyrglu
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