治疗多发性硬化的新方法与流程

本发明涉及通过给予有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐治疗有治疗需要的受试者的多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(als)或阿尔茨海默病(ad)的方法。

背景技术：

多发性硬化(ms)是具有进展性神经退行的中枢神经系统(cns)的慢性的免疫介导的多灶性脱髓鞘疾病。肌萎缩侧索硬化(als)是运动神经元的神经退行性疾病。阿尔茨海默病(ad)是最常见的痴呆形式，由淀粉样蛋白β的积累(导致淀粉样蛋白β相关的神经病理学和认知丧失)引起。ms病理被认为主要由适应性免疫系统和/或自身免疫机制驱动，这些机制损害cns中的神经元和少突胶质细胞，导致白质和灰质退行。尚未广泛研究cns的先天免疫在疾病发生和发展中的相关性。在ms患者中观察到活化的小胶质细胞和星形胶质细胞以及神经退行，并且这种神经炎症状态被认为在灰质损伤中起重要作用(综述见(calabrese等人，2015；nylander和hafler，2012)(calabrese等人，2015(doi：10.1038/nrn3900)；nylander和hailer，2012))。尽管白质病变是ms的典型标志，但灰质中观察到的脱髓鞘事件可能对永久性神经功能障碍具有比以前假设的更为深远的贡献。在als(oliveirasantos等人，2017；zhou等人，2017)和ad(nasrabady等人，2018；ropele等人，2012)患者中也观察到了小胶质细胞活化和脱髓鞘病理。

尽管存在可用于主要包含外周炎症的ms的治疗和帮助复发缓解型ms患者再次获得正常的神经功能的治疗，但是相当多的ms患者将遭受不可逆的临床残疾进展。ms的这些进展阶段被认为是小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的中枢功能改变的结果。在这种神经炎症环境中，少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞似乎无法发挥其正常功能(主要是髓鞘再生)，因此灰质和白质中的进一步脱髓鞘事件随着随后的轴突病理发生。ms患者存在高度未满足的医疗需求，以阻止脱髓鞘和增强髓鞘再生，以及防止不可逆的轴突病理。

技术实现要素：

本发明涉及治疗多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病的新方法，所述方法包括对有需要的受试者给予有效量的具有式(i)的化合物：

或其药学上可接受的盐。在本发明的另一方面，所述药学上可接受的盐是hcl。

附图说明

图的1a-1d提供了针对不同处理组的表示皮质(a)、纹状体(b)和胼胝体(c)的磁共振成像(mri)对比，以及在胼胝体中的磁化传递率(d)的图。

图2提供了来自免疫组织学染色的示例图片，其检测了针对不同处理组的皮质中的髓鞘碱性蛋白(mbp)和对gst-π呈阳性的成熟少突胶质细胞。

图的3a-3b提供了相对于对照载体标准化的皮质(a)和纹状体(b)中mbp(染色区域)和gst-π(阳性细胞数)的免疫组织化学的定量分析。

图4提供了来自免疫组织学染色的示例图片，其检测了针对不同处理组的胼胝体(cc)中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)和对gst-π呈阳性的成熟少突胶质细胞。

图5提供了对于mog(光密度)和gst-π(阳性细胞数)的免疫组织化学的定量分析，以及相对于对照载体标准化的胼胝体中的luxol快蓝(lfb)的光密度分析。

图6提供了来自免疫组织学染色的示例图片，其检测了针对不同处理组的皮质中的小胶质细胞标志物ibal和胶质原纤维酸性蛋白(gfap)星形胶质细胞。

图的7a-7c提供了相对于对照载体标准化的皮质(a)、纹状体(b)和胼胝体(c)中iba1阳性小胶质细胞数和gfap阳性星形胶质细胞染色区域的免疫组织化学的定量分析。

图的8a-8c提供了髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽免疫后临床疾病进展的评估，揭示了相似的临床评分(a)、疾病发作/发病率(b)和体重变化(c)。

图的9a-9c提供了针对不同处理组的皮质(图9a)、纹状体(图9b)和胼胝体(图9c)的磁共振成像(mri)对比。

图的10a-10b提供了用blz945(p.o.，qd)处理5天后的野生型小鼠皮质中的剂量依赖性小胶质细胞消耗(ibal阳性小胶质细胞数)(图10a)和用blz945(p.o.，qd)处理5天后的野生型小鼠皮质中的剂量依赖性小胶质细胞活化(相对于远端小胶质细胞突起标准化的ibal阳性小胶质细胞大小)(图10b)。

图11提供了血液和脑中blz945的药代动力学分析。

具体实施方式

多发性硬化(ms)是影响中枢神经系统(cns)的慢性炎性疾病。肌萎缩侧索硬化(als)是运动神经元的神经退行性疾病，阿尔茨海默病(ad)的特征在于淀粉样蛋白β的积累，导致淀粉样蛋白β相关的神经病理学和认知丧失。虽然目前存在多种针对ms有效的免疫调节疗法，但它们缺乏促进中枢神经系统(cns)修复、特别是髓鞘再生的作用范围。脑的先天免疫细胞小胶质细胞在调节髓鞘形成过程中起关键作用，并且集落刺激因子1(csf-1)途径是小胶质细胞分化和存活的关键调节剂。

铜宗(cuprizone)模型是一般的小鼠模型，其用于测试化合物促进髓鞘形成的功效，并且因此用于评估治疗脱髓鞘疾病(例如多发性硬化和肌萎缩侧索硬化以及阿尔茨海默病)的潜在疗法。

出人意料地发现4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺(一种集落刺激因子1(csf-1)受体激酶抑制剂)增强了小鼠铜宗模型中的中枢髓鞘再生修复机制，并且因此可以成为具有脱髓鞘疾病如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和阿尔茨海默病的受试者的有效治疗。

本发明涉及治疗多发性硬化的方法，所述方法包括给予有效量的具有式(i)的化合物

或其药学上可接受的盐。在本发明的另一方面，所述药学上可接受的盐是hcl。在本发明的另一方面，具有式(i)的化合物作为游离碱给予。

所述具有式(i)的化合物的游离碱和盐可以例如根据于2007年4月18日提交的国际专利申请号pct/us2007/066898和于2007年10月25日公开的wo2007/121484中给出的程序制备。具有式(i)的化合物具有化学名称：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺，也称为blz945。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在多发性硬化中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于多发性硬化的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗多发性硬化的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及治疗肌萎缩侧索硬化的方法，所述方法包括给予有效量的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述药学上可接受的盐是hcl。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在肌萎缩侧索硬化中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于治疗肌萎缩侧索硬化的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予有效量的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。优选地，所述药学上可接受的盐是hcl。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在阿尔茨海默病中的用途。

在另一方面，本发明提供了用于治疗阿尔茨海默病的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明提供了具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

具有式(i)的化合物可用于治疗所有表型的多发性硬化，包括临床孤立综合征、复发缓解型多发性硬化、进展性多发性硬化，其中进展性多发性硬化包括从发病中逐渐累积残疾(原发性进展性多发性硬化(ppms))和初始复发过程后逐渐累积残疾(继发性进展性多发性硬化(spms))。

虽然可以用于本发明的治疗方法中，具有式(i)的化合物及其药学上可接受的盐可以作为原料化学品给予，但是可能将具有式(i)的化合物作为药物组合物提供。因此，本发明还提供了可以在本发明的治疗方法中施用的药物组合物。

对于约50kg-70kg的受试者，本发明的药物组合物或组合可以处于具有约1mg-1000mg的一种或多种活性成分的单位剂量，或约1mg-500mg或约1mg-250mg或约1mg-150mg或约0.5mg-100mg或约1mg-50mg的活性成分。具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐的治疗有效剂量，该药物组合物取决于受试者的种类、体重、年龄和个体状况、所治疗的病症或疾病或其严重程度。具有普通技能的医师、临床医生或兽医可以容易地确定预防、治疗或抑制病症或疾病进展所必需的每种活性成分的有效量。

使用有利的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、狗、猴)或其分离的器官、组织和制品在体外和体内测试中证明上述剂量特性。本发明的化合物可以溶液的形式(例如，水溶液)活体外施用，及肠内、非经肠、有利地静脉内，例如，作为悬浮液或在水溶液中活体内施用。体外剂量可以在约10^-3摩尔浓度和10^-9摩尔浓度之间的范围内。取决于给予途径，体内治疗有效量可以在约0.1-500mg/kg之间，或约1-100mg/kg之间的范围内。

多发性硬化(ms)是影响中枢神经系统(cns)的慢性炎性疾病。虽然目前存在多种针对ms有效的免疫调节疗法，但它们缺乏促进中枢神经系统(cns)修复、特别是髓鞘再生的作用范围。在ms中，功能失调的免疫系统和由此产生的慢性(神经)炎症状态诱导轴突的脱髓鞘。所述脱髓鞘是少突胶质细胞(cns的形成髓鞘的细胞)受损的结果。基于以下给出的生物学测定和数据部分中描述的铜宗诱导的脱髓鞘小鼠模型的发现，给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐可以诱导多发性硬化患者的脱髓鞘轴突的髓鞘再生。来自铜宗小鼠模型的数据显示，在60mg/kgblz945情况下的原初动物中观察到的改变的小胶质细胞形态可以通过释放针对增强的少突胶质细胞前体细胞分化的因子而导致增强的吞噬作用和髓鞘碎片的清除以及增加的少突胶质细胞。此外，60mg/kgblz945剂量情况下轻度减少的小胶质细胞数量与改变的小胶质细胞表型相结合可以保护神经元/轴突免于在如多发性硬化的炎症性环境中受损。60mg/kg的剂量对应于人体中约300mg剂量。

为治疗多发性硬化，将4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐以每天约250mg至约350mg的剂量给予至有其需要的人类患者。在另一个实施例中，所述剂量为每天约275mg至约325mg。在另一个实施例中，所述剂量为约300mg。在另一个实施例中，连续4至6天给予所述剂量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，然后4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或药学上可接受的盐的给予停止。在另一个实施例中，连续4天给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或药学上可接受的盐，然后4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或药学上可接受的盐的给予停止。在另一个实施例中，治疗开始于多发性硬化的第一次诊断或复发性疾病的诊断。

所述药物组合物包括具有式(i)的化合物或其盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。在另外的实施例中，组合物包含至少两种药学上可接受的载体(例如本文描述的那些)。所述药物组合物可以配制用于特定的给药途径，例如口服给药、肠胃外给药(例如通过注射、输注、透皮或局部给药)和直肠给药。局部给药也可以涉及吸入或鼻内给药。本发明的药物组合物可以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)制成。片剂可以根据本领域已知的方法添加薄膜包衣或肠溶包衣。典型地，药物组合物是包含活性成分及以下中的一个或多个的片剂或明胶胶囊：a)稀释剂，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；

b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；就片剂而言还包含

c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果希望

d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；以及

e)吸附剂、着色剂、调味剂及甜味剂。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指引发受试者的生物或医学应答的药物或药剂的量，例如，减少或抑制酶或蛋白质活性，或改善症状、减轻病症、减缓或延迟疾病进展，或预防疾病等。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指当给予至受试者时，药物或药剂的量对以下是有效的，(1)至少部分缓解、抑制、预防和/或改善(i)由csf-1受体介导的病症、或障碍或疾病或(ii)与csf-1受体活性有关的病症、或障碍或疾病，或(iii)以csf-1受体的活性(正常或异常)为特征的病症、或障碍或疾病；或(2)降低或抑制csf-1受体的活性；或(3)降低或抑制csf-1受体的表达。在另一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指药物或药剂的以下量，当给予至细胞、或组织、或非细胞生物材料、或介质时，所述量有效地至少部分减少或抑制csf-1受体的活性；或至少部分地减少或抑制csf-1受体的表达。

如本文所用，术语“受试者”是指灵长类动物(例加，人、男性或女性)、狗、兔、豚鼠、猪、大鼠和小鼠。在某些实施例中，受试者为灵长类。在又其他的实施例中，受试者是人。

如本文所用，术语“抑制(inhibit、inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病状、症状或病症、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。

如本文使用的，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”是指缓解或改善疾病或障碍(即，减慢或阻止疾病或其至少一种临床症状的发展)；或缓解或减轻与该疾病或障碍相关的至少一种物理参数或生物标记，包括患者可能无法辨别的那些物理参数或生物标记。

如本文所用，术语任何疾病或障碍的“预防(prevent、preventing或prevention)”是指疾病或障碍的预防性治疗；或延迟疾病或障碍的发作或进展。

术语“药学上可接受的盐”是指保留具有式(i)的化合物的生物有效性和性质的盐，并且其典型的不是生物学上或其他方面不合需要的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。

可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。

可以衍生出盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可以衍生盐的有机酸包括，例如，乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。

可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。

可以衍生出盐的无机碱包括例如铵盐和来自元素周期表第i至xii列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。

可以衍生出盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代的胺(包括天然存在的取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

在另一个方面，本发明提供了呈以下形式的具有式i的化合物：乙酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、癸酸盐、氯化物/盐酸盐、氯脲鎓酸盐(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、谷氨酸盐、戊二酸盐、乙醇酸、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、黏酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八烷酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、癸二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐三氟甲磺酸盐、三氟乙酸盐或昔萘酸盐形式。

4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐可以与一种或多种其他治疗剂同时或在其之前或之后给予。4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐可以与其他药剂分开给予或通过相同或不同的给药途径给予。治疗剂是例如化学化合物、肽、抗体、抗体片段或核酸，当将该治疗剂与本发明的化合物组合给予至患者时，该治疗剂具有治疗活性或增强治疗活性。

在一个实施例中，本发明提供了产品，其包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种其他治疗剂作为组合制剂，用于在治疗多发性硬化中同时、分开或顺序使用。作为组合制剂提供的产品包括含有4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和其他一种或多种在相同的药物组合物中的治疗剂的组合物，或4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和以分开形式(例加以试剂盒的形式)的其他一种或多种治疗剂。

在一个实施例中，本发明提供药物组合物，其包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和另一种或多种治疗剂。任选地，该药物组合物可以包含如上所述的可药用载体。

在一个实施例中，本发明提供了包含两个或更多个单独的药物组合物的试剂盒，其中至少一个包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，该试剂盒包含用于分别保留该组合物的装置(例如容器、分开的瓶子、或分开的箔包)。这种试剂盒的实例是泡罩包装，如典型地用于片剂、胶囊及类似物的包装。

本发明的试剂盒可以用于给予不同剂型(例如，经口及肠胃外)，用于以不同剂量间隔给予单独组合物或用于相对在彼此滴定单独组合物。为了有助于依从性，本发明的试剂盒典型地包含用于给予的用法说明书。

在本发明的组合疗法中，4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和其他治疗剂可以通过相同或不同的制造商制造和/或配制。此外，4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和其他治疗剂可组合成组合疗法：(i)在将组合产物释放给医师之前(例如，在包含本发明的化合物和其他治疗剂的试剂盒的情况下)；(ii)在给予之前不久，由医师自身(或在医师的指导下)；(iii)在患者自身中，例如在顺序给予本发明的化合物和其他治疗剂期间。

该其他治疗剂是：

(1)皮质类固醇，例如口服泼尼松和静脉内甲基泼尼松龙

(2)β干扰素，例如或

(3)奥瑞利珠单抗

(4)乙酸格拉默

(5)富马酸二甲酯

(6)芬戈莫德

(7)特立氟胺

(8)那他珠单抗

(9)阿仑单抗或

(10)米托蒽醌。

实施例1：一种治疗多发性硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例2：根据实施例1所述的方法，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例3：根据实施例1所述的方法，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例4：根据实施例1所述的方法，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例5：根据实施例1所述的方法，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例6：根据实施例1所述的方法，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例7：根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例8：根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中口服给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例9：根据实施例8所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例10：根据实施例1-9中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

实施例11：一种治疗多发性硬化的方法，该方法包括向有治疗需要的人给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐以每天约250mg至约350mg的剂量给予。

实施例12：根据实施例11所述的方法，其中该剂量为每天约275mg至约325mg。

实施例13：根据实施例12所述的方法，其中该剂量为每天约300mg。

实施例14：根据实施例11-13中任一项所述的方法，其中连续4至6天给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例15：根据实施例14所述的方法，其中连续4天给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例16：根据实施例14或15所述的方法，其中当该人被首次诊断出患有多发性硬化时，开始给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例17：一种在有治疗需要的受试者中治疗多发性硬化的方法，该方法包括给予包含有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

实施例18：根据实施例17所述的方法，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例19：根据实施例17所述的方法，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例20：根据实施例17所述的方法，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例21：根据实施例17所述的方法，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例22：根据实施例17所述的方法，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例23：根据实施例17-22中任一项所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例24：根据实施例17-22中任一项所述的方法，其中口服给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例25：根据实施例24所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例26：根据实施例17至25中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

实施例27：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于治疗多发性硬化。

实施例28：根据实施例27所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例29：根据实施例27所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例30：根据实施例27所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例31：根据实施例27所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例32：根据实施例27所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例33：根据实施例27-32中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例34：根据实施例27-32中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中口服给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例35：根据实施例34所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例36：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于治疗多发性硬化，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐以每天约250mg至约350mg的剂量给予至人。

实施例37：根据实施例36所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该剂量为每天约275mg至约325mg。

实施例38：根据实施例37所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该剂量为每天约300mg。

实施例39：根据实施例36-38中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中连续4-6天给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例40：根据实施例39所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中连续4天给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例41：根据实施例39或40所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中当该人被首次诊断出患有多发性硬化时，开始给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例42：一种药物组合物，该药物组合物包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂，用于治疗多发性硬化。

实施例43：根据实施例42所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例44：根据实施例42所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例45：根据实施例42所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例46：根据实施例42所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例47：根据实施例42所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例48：根据实施例42-47所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例49：根据实施例42-47所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中口服给予该组合物。

实施例50：根据实施例49所述使用的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例51：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在治疗多发性硬化中的用途。

实施例52：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在制备用于治疗多发性硬化的药物中的用途。

实施例53：根据实施例51或52所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例54：根据实施例51或52所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例55：根据实施例51或52所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例56：根据实施例51或52所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例57：根据实施例51或52所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例58：根据实施例51-57中任一项所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例59：根据实施例51-57中任一项所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺口服给予。

实施例60：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在治疗多发性硬化中的用途，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐以每天约250至约350mg的剂量给予至人。

实施例61：根据实施例60所述的用途，其中该剂量为每天约275mg至约325mg。

实施例62：根据实施例61所述的用途，其中该剂量为每天约300mg。

实施例63：根据实施例60-62中任一项所述的用途，其中连续4至6天将4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐给予至人，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例64：根据实施例65所述的用途，其中连续4天将4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐给予至人，然后停止给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例65：根据实施例63或64所述的用途，其中当该人被首次诊断出患有多发性硬化时，开始给予4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例66：根据实施例65所述的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例67：包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物用于治疗多发性硬化的用途。

实施例68：根据实施例67所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例69：根据实施例67所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例70：根据实施例67所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例71：根据实施例67所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例72：根据实施例67所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例73：根据实施例67-72所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例74：根据实施例67-72所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中口服给予该药物组合物。

实施例75：根据实施例74所述的包含4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的用途，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例76：一种治疗多发性硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐与另一种治疗剂的组合。

实施例77：根据实施例76所述的方法，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐与另一种治疗剂分开给予或通过相同或不同的给药途径给予。

实施例78：根据实施例77所述的方法，其中该另一种治疗剂是皮质类固醇、β干扰素、奥瑞利珠单抗、乙酸格拉默、富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺、那他珠单抗、阿仑单抗或米托蒽醌。

实施例79：根据实施例76-78中任一项所述的方法，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例80：根据实施例76-78中任一项所述的方法，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例81：根据实施例76-78中任一项所述的方法，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例82：根据实施例76-78中任一项所述的方法，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例83：根据实施例76-78中任一项所述的方法，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例84：根据实施例76-83中任一项所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例85：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，与另一种治疗剂组合用于治疗多发性硬化。

实施例86：根据实施例85所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐与该另一种治疗剂分开给予或通过相同或不同的给药途径给予。

实施例87：根据实施例85或86所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该另一种治疗剂是皮质类固醇、β干扰素、奥瑞利珠单抗、乙酸格拉默、富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺、那他珠单抗、阿仑单抗或米托蒽醌。

实施例88：根据实施例85-87中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是临床孤立综合征。

实施例89：根据实施例85-87中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例90：根据实施例85-87中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例91：根据实施例85-87中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例92：根据实施例85-87中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例93：根据实施例85-92中任一项所述使用的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例94：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐与另一种治疗剂组合在治疗多发性硬化中的用途。

实施例95：根据实施例94所述的用途，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐与该另一种药剂分开给予或通过相同或不同的给药途径给予。

实施例96：根据实施例94或95所述的用途，其中该另一种治疗剂是皮质类固醇、β干扰素、奥瑞利珠单抗、乙酸格拉默、富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺、那他珠单抗、阿仑单抗或米托蒽醌。

实施例97：根据实施例94-96中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化在临床孤立综合征。

实施例98：根据实施例94-96中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是复发缓解型多发性硬化。

实施例99：根据实施例94-96中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是进展性多发性硬化。

实施例100：根据实施例94-96中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是原发性进展性多发性硬化。

实施例101：根据实施例94-96中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该多发性硬化是继发性进展性多发性硬化。

实施例102：根据实施例94-101中任一项的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐的用途，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例103：一种治疗肌萎缩侧索硬化的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例104：根据实施例103所述的方法，其中该受试者是灵长类动物。

实施例105：根据实施例104所述的方法，其中该受试者是人。

实施例106：根据实施例103-105中任一项所述的方法，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺以游离碱给予。

实施例107：根据实施方案103-105中任一项所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例108：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在肌萎缩侧索硬化中的用途。

实施例109：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于治疗肌萎缩侧索硬化。

实施例110：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在制备用于治疗肌萎缩侧索硬化的药物中的用途。

实施例111：一种治疗阿尔茨海默病的方法，该方法包括对有需要的受试者给予有效量的4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐。

实施例112：根据实施例111所述的方法，其中该受试者是灵长类动物。

实施例113：根据实施例112所述的方法，其中该受试者是人。

实施例114：根据实施例111-113中任一项所述的方法，其中4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺以游离碱给予。

实施例115：根据实施方案111-113中任一项所述的方法，其中该药学上可接受的盐是hcl。

实施例116：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在阿尔茨海默病中的用途。

实施例117：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐，用于治疗阿尔茨海默病。

实施例118：4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺或其药学上可接受的盐在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

生物学测定和数据

在下述实例中，使用本领域已知的方法合成4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺hcl盐。在所述测定和结果中，将4-(2-((1r，2r)-2-羟基环己基氨基)苯并噻唑-6-基氧基)-n-甲基吡啶酰胺hcl盐称为或标记为blz945。

实例1铜宗诱导的小鼠脱髓鞘、治疗和尸检

以下描述的研究由瑞士巴塞尔市瑞士州立兽医管理局(swisscantonalveterinaryauthorityofbaselcity，switzerland)批准，许可证号为2711。小鼠(c57bl/6j)商业购自德国查尔斯河实验室(charlesriverlaboratories)，或从诺华制药集团(novartispharmaag)繁殖克隆(8-9周龄，雌性)获得。在实验开始前，允许所有动物适应7天并且饲养在ivc架(最多4只小鼠/xj型笼)中。让动物随意获取食物和水。用铜宗处理动物5周。将铜宗(双(环己酮)氧二氢腙，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))混合到啮齿动物食物颗粒(0.2％w/w)(瑞士普罗维米克里巴公司(provimiklibaag，switzerland))中。铜宗处理后，用含有169mg/kgblz945(qd，p.o.10ml/kg)的正常食物治疗性处理动物2周。blz945在由0.5％甲基纤维素水溶液和0.1％吐温80组成的载体中制备。在最后一次blz945给药后3小时杀死之前，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)经心脏灌注动物，分离脑并在4％多聚甲醛(pfa)中于4℃固定48小时。

磁共振成像(mri)

使用biospec70/30光谱仪(布鲁克医学系统公司(brukermedicalsystems)，埃特林根，德国)在7t下运行进行测量。扫描仪的操作软件为paravision5.1(bruker)。使用小鼠脑圆极化线圈(布鲁克医学系统公司，型号1pt20063v3；内径23mm)从麻醉的、自发呼吸的动物获得图像，用于射频激发和检测；既未应用心脏触发也未应用呼吸触发。在盒子中短时间引入后，用1.5％异氟烷(雅培公司(abbott)，卡姆(cham)，瑞士)在氧气中通过鼻锥给药使动物保持麻醉状态。在mri信号采集期间，将动物以俯卧位置于由树脂玻璃(plexiglas)制成的摇篮中，使用加热垫将体温保持在37土1℃，并监测呼吸。

使用t2加权的二维多层rare(弛豫增强快速采集)序列(hennig等，1986)来确定解剖学取向和评估信号强度。接下来是用于评估磁化转移率(mtr)的二维多层梯度回忆flash(小角度激发梯度回波序列(fastlow-angleshot))采集(haase等人，1986)。由于两个序列具有相同的解剖学参数，因此在rare图像上执行用于评估的目标区域的选择，然后将其转移到flash图像。采集的参数如下：(a)rare序列：有效回波时间80ms，重复时间3280ms，rare因子16、12个平均值，视场20x18mm²，矩阵尺寸213x192，像素尺寸0.094x0.094mm²，切片厚度0.5mm，15个相邻切片。持续时间/带宽1ms/5400hz和0.64ms/5344hz的hermite脉冲分别用于射频激发和重新聚焦。脂肪抑制通过2.61ms/1051hz持续时间/带宽的高斯512脉冲，紧接着2ms长的梯度扰流器实现。总采集时间为7分52.3秒；(b)flash序列：回波时间2.8ms，重复时间252.8ms，4个平均值，视场20x18mm²，矩阵尺寸213x192，像素尺寸0.094x0.094mm²，切片厚度0.5mm，15个相邻切片。0.9ms/6000hz持续时间/带宽和30°翻转角的hermite脉冲用于射频激发。通过15ms/182.7hz持续时间/带宽的高斯脉冲引入mtr对比，其中射频峰值幅度为7.5μt，照射偏移为2500hz。然后使用相同的参数重复采集，但不引入mtr对比。然后使用公式mtr＝(s0-smtr)/s0计算mtr，其中s0和smtr分别表示在没有和有mtr对比引入的情况下flash采集中的信号强度。两组数据的总采集时间为6分31.6秒。

脑切片的组织学

固定后，通过增加乙醇系列脱水处理大脑进行石蜡包埋。在安装在superfrost+载玻片上的3μm石蜡切片上进行石蜡切片的自动免疫组织化学，并使用discoveryxt技术公司(泛塔纳公司(ventana)/罗氏诊断公司(rochediagnostics))自动免疫染色。简而言之，将切片脱石蜡、再水合，通过用cc1细胞调理缓冲液加热进行抗原修复，在室温下与在抗体稀释剂中稀释的一抗孵育1-3小时，与在抗体稀释液中稀释的对应生物素化的二抗一起孵育，使用dabmab试剂盒反应并用苏木精ii和上蓝剂试剂(泛塔纳公司/罗氏诊断公司)复染。在热自来水中用肥皂洗涤载玻片，并在冷自来水下冲洗以除去肥皂，然后脱水并用pertex包埋。

在3μm石蜡切片上进行石蜡切片的手动免疫荧光染色。将它们脱蜡并通过在98℃下在0.1m柠檬酸盐缓冲液ph6.0(quartett400300692)中微波15-20分钟进行抗原修复(例外：gst-π)，将带有载玻片的罐冷却至室温持续20-25分钟，并在1xtbs(细胞信号传导公司(cellsignaling)，12498s)中漂洗两次，持续3分钟。用peroxblock(达科公司(dako)s2023)将内源过氧化物酶猝灭10分钟，然后将切片用1xtbs洗涤两次，持续3分钟，并用含有10％正常山羊血清(dakox0907)的1xtbs封闭20分钟。然后将切片在不用一抗冲洗的情况下室温下孵育60分钟(mbp)或室温下孵育过夜(gst-pi，mog)。然后将切片在1xtbs中洗涤两次持续3分钟，然后在室温下用二抗孵育30分钟。然后将切片用1xtbs洗涤两次持续3分钟，并在室温下用vectastainabcelite试剂盒(载体公司(vector)pk6100)孵育30分钟，用1xtbs洗涤两次持续3分钟，用dab溶液(达科公司k3468)孵育1-5分钟。最后将切片用蒸馏水洗涤两次持续2分钟，用苏木精(达科公司s2020)复染3分钟，再次用流动的自来水洗涤5分钟，脱水并包埋在pertex中。

抗体

一抗和抗体稀释液：兔抗小鼠髓鞘碱性蛋白(mbp，达科公司a0623)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶1000，在达科公司稀释剂(dakodiluent)(达科公司s2022)中1∶1500；兔抗小鼠gst-π(mbl312)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶500，在达科公司稀释剂(dakodiluent)(达科公司s2022)中1∶1000；兔抗iba1(和光公司(wako)019-19741，50ug/100ul)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶500；兔抗gfap(达科公司z0334)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶5000；兔抗小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog，艾博抗公司(abcam)ab32760)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶100，在达科公司稀释剂(dakodiluent)(达科公司s2022)中1∶600

二级检测抗体：生物素化的山羊抗兔igg(杰克森免疫研究公司(jacksonimmunoresearch)111-065-144)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶1000，在达科公司稀释剂(dakodiluent)中1∶500；生物素化的山羊抗兔igg(载体公司ba-1000)，在达科公司稀释剂(dakodiluent)中1∶200；生物素化的山羊抗小鼠igg(载体公司ba-9200)，在泛塔纳公司抗体稀释液(ventanaantibodydiluent)中1∶1000，在达科公司稀释剂(dakodiluent)中1∶200。

图像分析

基于来自组织学染色的脑切片的图像分析，对小胶质细胞/星形胶质细胞数量进行定量评估，基于msvisualstudio2010和来自matroxmilv9库(matroxinc公司，魁北克，加拿大)的许多功能开发了专有的图像分析平台(astoria公司，自动存储图像分析(automatedstoredimageanalysis))。

为了检测和分析细胞体，执行以下步骤序列：1.用艾贝欧公司(aperio)的scanscope以20倍的放大倍数扫描带有大脑切片的载玻片，以评估(棕色)ihc染色的小胶质细胞(iba1)或星形胶质细胞(gfap)。2.运行内部开发的imagescope(v12.1.0.5029，美国艾贝欧公司(aperioinc.，usa))插件，用于创建和导出每个切片的3x8位rgbtif图像片(放大20倍)。3.图像处理(对于每个tif图像)：a：对每个tif图像执行颜色反卷积以获得没有蓝色的棕色染色图像。b：通过阈值处理、形态学关闭、填充孔、打开和消除太小的对象，从白色背景中分割有效样本(脑组织)，从而产生当前图像的有效组织和样本区域的二元掩模。c：基于在充分黑暗区域(指示细胞体)的颜色去卷积的棕色图像的蓝色通道的平均灰度值，将自适应阈值技术应用于细胞体的单独分割。计算的阈值用于二值化，并且在大小过滤之后产生细胞体掩模图像(在有效样本区域内)。

结果

图1：与载体对照相比，铜宗中毒后用blz945进行2周治疗性处理降低了皮质和纹状体的mri对比但不降低胼胝体的mri对比，表明髓鞘形成增加。针对不同处理组的皮质(图1a)、纹状体(图1b)和胼胝体(图1c)的磁共振成像(mri)对比。将mri对比标准化为载体对照组(正常食物)的绝对值。组由以下小鼠组成：这些小鼠用正常食物或铜宗食物(0.2％)处理5周，然后转换为正常食物进行2周治疗处理(载体或blz945p.o.，qd，169mg/kg)。在mri中测量胼胝体中不同处理组的磁化传递率(mtr)(图1d)。显示了两个不同实验(灰色和黑色)的单独结果。统计学：turkey的多重比较检验(**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001，n.s.：不显著)。

图2-5：与载体相比，铜宗中毒后用blz945进行的2周治疗性处理增强髓鞘再生并增加皮质和纹状体中的少突胶质细胞数，但不增加胼胝体中的少突胶质细胞数。来自免疫组织学染色的示例图片，其检测了针对不同处理组的皮质(图2)中的髓鞘碱性蛋白(mbp)和对gst-π呈阳性的成熟少突胶质细胞。组由以下小鼠组成：这些小鼠用正常食物或铜宗食物(0.2％)处理5周，然后转换为正常食物进行2周治疗处理(载体或blz945p.o.，qd，169mg/kg)。相对于对照载体标准化的皮质(图3a)和纹状体(图3b)中mbp(染色区域)和gst-π(阳性细胞数)的免疫组织化学的定量分析。来自免疫组织学染色的示例图片(图4)，其检测了针对不同处理组的胼胝体中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)和对gst-π呈阳性的成熟少突胶质细胞。对于mog(光密度)和gst-π(阳性细胞数)的免疫组织化学的定量分析，以及相对于对照载体标准化的胼胝体中的luxol快蓝(lfb)的光密度分析(图5)。在图3a、3b和图5中，显示了两个不同实验(灰色和黑色)的单独结果。统计学：turkey的多重比较检验(*：p＜0.05，**：**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001，n.s.：不显著)。

图6和7：铜宗中毒后用blz945进行的2周治疗性处理减少了小胶质细胞数量但增强了星形胶质细胞。来自免疫组织学染色的示例图片(图6)，其检测了针对不同处理组的皮质中的小胶质细胞标志物ibal和胶质原纤维酸性蛋白(gfap)星形胶质细胞。组由以下小鼠组成：这些小鼠用正常食物或铜宗食物(0.2％)处理5周，然后转换为正常食物进行2周治疗处理(载体或blz945p.o.，qd，169mg/kg)。相对于对照载体标准化的皮质(图7a)、纹状体(图7b)和胼胝体(图7c)中ibal阳性小胶质细胞数和gfap阳性星形胶质细胞染色区域的免疫组织化学的定量分析。统计学：turkey的多重比较检验(**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001，n.s.：不显著)。

铜宗模型是分析髓鞘再生事件的理想模型。我们在啮齿动物饲料中使用0.2％铜宗5周，来诱导强烈的脱髓鞘以及小胶质细胞和星形胶质细胞的大量受累。我们实施了纵向、非侵入性磁共振成像(mri)方法来直接测量脑中的髓鞘形成，并将mri参数与脑中的定量组织学读数相关联。在该模型中，我们以169mg/kgqd，p.o.的高剂量测试了csf1r激酶抑制剂blz945，其在原初动物中5天后，在所有脑区域中几乎完全消耗了小胶质细胞。

在两个独立实验中，用0.2％铜宗饲料诱导脱髓鞘5周后用正常饲料进行blz945处理2周，显示出对皮质和纹状体的mri对比具有显著的有益效果(图1a，1b)。mri对比相对于对照小鼠的水平几乎标准化，而铜宗处理的小鼠的mri对比相对于对照仍然显示显著性差异。处理2周后，这种效果非常显著。在两个独立实验(图1c)中，针对mri对比和磁化传递率(mtr)两者，在胼胝体中没有观察到blz945的有益效果。在blz945处理2周后观察到的mri中的积极效果可以在石蜡包埋的脑切片的免疫组织化学和定量图像分析中证实。与载体对照在皮质(图2，图3a)和纹状体(图3b)中相比，blz945处理后髓鞘碱性蛋白(mbp)和少突胶质细胞(gst-π)显著增加。然而，在治疗2周后，mbp阳性髓鞘再生和gst-π阳性少突胶质细胞数量的程度未达到对照水平。此外，可以通过组织学来验证如通过mri观察到的在胼胝体中没有任何髓鞘再生增强。与对照相比，铜宗处理后髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)、少突胶质细胞(gst-π)以及luxolfastblue(lfb)显著减少，但与2周blz945处理相比无差异(图4，图5)。

在所有脑区域中，小胶质细胞和星形胶质细胞在5周铜宗诱导的脱髓鞘(图6)后高度活化并增加。在皮质和纹状体中，iba1+小胶质细胞的数量比对照小鼠高1.5-2倍(图7a，7b)，而在胼胝体中，这种增加为高6倍(图7c)。与分析的所有脑区域中的载体处理的动物相比，blz945显著降低了这种增加(图7a，7b，7c)。此外，与对照相比，blz945处理的小鼠在皮质和纹状体中显示较少数量的iba1+小胶质细胞(图7a，7b)，但在胼胝体中不是这样(图7c)。在皮质和纹状体中，与对照相比，gfap阳性星形胶质细胞增加5-6倍(图7a，7b)，而在胼胝体中，这种增加仅为高2-2.5倍(图7c)。有趣的是，皮质、纹状体和胼胝体中小胶质细胞和星形胶质细胞的增加程度似乎相互发生。在皮层和纹状体中，小胶质细胞(1.5-2倍)的增加不如星形胶质细胞增加(4-6倍)的广泛，而在胼胝体中则相反，相比于星形胶质细胞(2.5倍)，iba阳性小胶质细胞的增加是显著的(6倍)。然而，与载体相比，blz945处理2周甚至进一步增加了所有脑区域中的星形胶质细胞数量(图6和图7a-c)。这种星形胶质细胞在皮层和纹状体中的增加明显高于胼胝体中的星形胶质细胞增加。

实例2mog肽诱导的eae

以下描述的研究由瑞士巴塞尔市瑞士州立兽医管理局(swisscantonalveterinaryauthorityofbaselcity，switzerland)批准，许可证号为2119。

小鼠(c57bl/6jolahsd)商业购自哈兰实验室有限公司(harlanlaboratoriesbv)(9周龄，雌性)。在实验开始前，允许所有动物适应7天并且饲养在ivc架(最多4只小鼠/xj型笼)中。让动物随意获取食物和水。

通过下背部皮下注射在4mg/ml完全弗氏佐剂(cfa，西格玛公司)中乳化的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽(mog1-125；自产；200μg/100μl)免疫小鼠。在第0天和第2天腹膜内施用百日咳毒素(弗卢卡公司(fluka)；每只小鼠200ng)。评估eae：观察小鼠并每天称重。评估它们的临床症状，评分范围为0至5，中间评分为0.5。0：没有临床症状，1：跛尾/完全失去尾巴紧张力；2：明显后肢无力；3：完全双侧后肢瘫痪；4：前肢和后肢瘫痪；5：死亡。一旦出现第一个临床症状，在笼内提供补充食物和凝胶食物。

从免疫后第14至第28天用100和150mg/kg的blz945，qd，p.o.10ml/kg处理动物14天。blz945在0.5％甲基纤维素水溶液和0.1％吐温80中制备。

结果

图8：实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠中的治疗性blz945处理没有改变疾病进展。对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽免疫后的临床评分的评估揭示了所有处理组的类似疾病进展(图8a)，疾病发作/发病率(图8b)和体重变化(图8c)。blz945处理在免疫后14天开始并且接近最大临床评分直至持续14天(灰色阴影区域)。实验在免疫后28天结束。

为了研究小胶质细胞在自身免疫疾病模型中的相关性，我们治疗性地处理了实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)小鼠，一种人类ms的模型。在免疫后14天，在接近最大疾病时开始以两种不同剂量(100和150mg/kg，p.o.，qd)处理小鼠。处理持续至免疫后第28天结束。与载体相比，两个处理组的临床评分没有差异(图8a)。免疫后约11-12天(图8b)的eae临床病理的发作以及体重变化(图8c)在处理组和载体组之间是相似的。总之，csf1r激酶抑制不会改变eae模型中的疾病进展，eae模型是外周驱动的神经炎症模型。

来自实例1和2的上述数据表明，在治疗模式中csf-1受体途径的抑制通过调节神经炎症来增强中枢髓鞘再生修复机制，因此有益于治疗脱髓鞘和神经炎症疾病，例如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和阿尔茨海默病。集落刺激因子1受体(csf1r)信号传导途径对于小胶质细胞(即脑的定居吞噬细胞)存活至关重要。小胶质细胞在模拟cns突触回路和去除病原体和细胞碎片方面发挥重要作用，后者对于通过髓鞘再生开始修复是必不可少的。因此，通过抑制csf-1受体途径，发明人没有预期铜宗模型中的有益效果，因为缺少这些吞噬细胞去除髓鞘碎片。其他研究表明，通过减少慢性神经炎症，csf1r途径的抑制在诸如肌萎缩侧索硬化和阿尔茨海默病等疾病中也具有神经保护作用。然而，长期活化的小胶质细胞似乎是神经毒性的，而在铜宗条件下，小胶质细胞被活化一小段时间以实现某种定向功能，如吞噬作用。然而，看起来铜宗模型中的小胶质细胞似乎出人意料地具有额外的神经毒成分，并且通过用blz945去除小胶质细胞，在消退期中的这种小胶质细胞毒性被消除了。另外，在blz945处理后星形胶质细胞被活化，这似乎接管了吞噬活性，并且对没有小胶质细胞的神经毒性成分情况下的少突胶质细胞发挥了一定的营养作用。此外，小胶质细胞似乎参与少突胶质细胞前体细胞(opc)向少突胶质细胞(od)的分化过程(hagemeyer等人，2017)。通过去除小胶质细胞，似乎启动了快速的分化过程，促进ng2阳性opc分化成od，从而增强髓鞘再生。

实例3：20mg/kg和60mg/kg的铜宗诱导的小鼠脱髓鞘。

以下描述的研究由瑞士巴塞尔市瑞士州立兽医管理局(swisscantonalveterinaryauthorityofbaselcity，switzerland)批准，许可证号为2711。小鼠(c57bl/6j)商业购自德国查尔斯河实验室(charlesriverlaboratories)，或从诺华制药集团(novartispharmaag)繁殖克隆(8-9周龄，雌性)获得。在实验开始前，允许所有动物适应7天并且饲养在ivc架(最多4只小鼠/xj型笼)中。让动物随意获取食物和水。用铜宗处理动物5周。将铜宗(双(环己酮)氧二氢腙，西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))混合到啮齿动物食物颗粒(0.2％w/w)(瑞士普罗维米克里巴公司(provimiklibaag，switzerland))中。铜宗处理后，用含有20mg/kg和60mg/kgblz945(qd，p.o.10ml/kg)的正常食物治疗性处理动物2周。blz945在由0.5％甲基纤维素水溶液和0.1％吐温80组成的载体中制备。在最后一次blz945给药后3小时杀死之前，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)经心脏灌注动物，分离脑并在4％多聚甲醛(pfa)中于4℃固定48小时。

磁共振成像(mri)

使用biospec70/30光谱仪(布鲁克医学系统公司(brukermedicalsystems)，埃特林根，德国)在7t下运行进行测量。扫描仪的操作软件为paravision5.1(bruker)。使用小鼠脑圆极化线圈(布鲁克医学系统公司，型号1pt20063v3；内径23mm)从麻醉的、自发呼吸的动物获得图像，用于射频激发和检测；既未应用心脏触发也未应用呼吸触发。在盒子中短时间引入后，用1.5％异氟烷(雅培公司(abbott)，卡姆(cham)，瑞士)在氧气中通过鼻锥给药使动物保持麻醉状态。在mri信号采集期间，将动物以俯卧位置于由树脂玻璃(plexiglas)制成的摇篮中，使用加热垫将体温保持在37土1℃，并监测呼吸。

使用t2加权的二维多层rare(弛豫增强快速采集)序列(hennig等，1986)来确定解剖学取向和评估信号强度。接下来是用于评估mtr的二维多层梯度回忆flash(小角度激发梯度回波序列(fastlow-angleshot))采集(haase等人，1986)。由于两个序列具有相同的解剖学参数，因此在rare图像上执行用于评估的目标区域的选择，然后将其转移到flash图像。采集的参数如下：(a)rare序列：有效回波时间80ms，重复时间3280ms，rare因子16、12个平均值，视场20x18mm²，矩阵尺寸213x192，像素尺寸0.094x0.094mm²，切片厚度0.5mm，15个相邻切片。持续时间/带宽1ms/5400hz和0.64ms/5344hz的hermite脉冲分别用于射频激发和重新聚焦。脂肪抑制通过2.61ms/1051hz持续时间/带宽的高斯512脉冲，紧接着2ms长的梯度扰流器实现。总采集时间为7分52.3秒；(b)flash序列：回波时间2.8ms，重复时间252.8ms，4个平均值，视场20x18mm²，矩阵尺寸213x192，像素尺寸0.094x0.094mm²，切片厚度0.5mm，15个相邻切片。0.9ms/6000hz持续时间/带宽和30°翻转角的hermite脉冲用于射频激发。通过15ms/182.7hz持续时间/带宽的高斯脉冲引入mtr对比，其中射频峰值幅度为7.5μt，照射偏移为2500hz。然后使用相同的参数重复采集，但不引入mtr对比。然后使用公式mtr＝(s0-smtr)/s0计算mtr，其中s0和smtr分别表示在没有和有mtr对比引入的情况下flash采集中的信号强度。两组数据的总采集时间为6分31.6秒。

血液和脑中blz945的定量测定

基于改进的蛋白质沉淀程序进行样品制备和分析，然后进行液相色谱分离，并结合质谱进行检测。通过添加20％ch3oh至终浓度0.20μg/ml，将小脑在温和的macs^tm解离器(milteniy生物技术公司，#130-093-235)中匀浆。血液-edta样品直接用于进一步制备。通过用已知量的blz945(0.02μg/ml和62.5μg/ml之间)掺入空白血液和空白脑匀浆来准备校准、质量对照和恢复对照样品。对于分析物测定，使用盐酸拉贝洛尔(西格玛奥德里奇公司，#l1011)作为通用内标(is)。将10μl校准标准品、质量对照、回收对照和未知样品的等分试样转移至0.75ml96孔-loborack(vitarisag公司，#51004bc-mic)，并且向每个管中添加3μlis混合物(2.5μg/ml，在50％ch3cn中)。对于蛋白质沉淀和从血液和脑基质中提取，添加200μlch3cn。涡旋10分钟后，将样品在4℃下在3220g离心15分钟。将50μl上层转移至1.2ml96深孔板(赛默飞世尔科技公司(thermoscientific)，#ab-0787)。

lc-ms-ms分析：对于定量分析，每个样品的1.5μl等分试样(包括校准、质量对照和回收对照样品)用冷却的waters^tmacquityurbinary样品管理器和hplc系统注射。将测试制品及其内标用acec18-pfp(50x2.1mmid，3.0μm孔径；#ace-1110-0502)作为柱在40℃下分离。应用在1.7分钟内以0.400ml/min的流速从5％至65％b的线性梯度进行分离。总循环时间为3.5分钟。使用的流动相是a：含0.1％甲酸的水，和b：含0.1％甲酸的ch3cn？。为了检测，柱流出物直接引入配备有turboionspray^tm界面的absciexapi5500三重四极杆质谱仪中。检测在多反应监测(mrm)阳离子模式中进行。基于所选质量转变(对于blz945为399m/z→242m/z，对于拉贝洛尔(is)为329m/z→162m/z)的提取离子色谱图的化合物/is比率进行定量。使用外部校准曲线计算未知样品浓度。该方法的定量下限(lloq)对于血液设定为20ng/ml，对于脑样品设定为100ng/ml，并且从基质中的回收为95土2％。所有计算均使用absciexanalyst软件1.6.2进行。

脑组织学

固定后，通过增加乙醇系列脱水处理大脑进行石蜡包埋。在安装在superfrost+载玻片(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))上的3μm石蜡切片上进行石蜡切片的自动免疫组织化学，并使用discoveryxt技术公司(泛塔纳公司(ventana)/罗氏诊断公司(rochediagnostics))自动免疫染色。将切片脱石蜡、再水合，根据抗体通过用cc1细胞调理缓冲液加热28-68分钟进行抗原修复，在室温下根据抗体用抗体稀释剂(泛塔纳公司)稀释的一抗孵育1-3小时，与在抗体稀释液中稀释的相应生物素化的二抗一起孵育，使用dabmab试剂盒反应并用苏木精ii和上蓝剂试剂(泛塔纳公司)复染。在热自来水中用肥皂洗涤载玻片，并在冷自来水下冲洗以除去肥皂，然后脱水并用pertex包埋。

抗体

一抗是：兔抗ibal(和光纯药工业株式会社(wako)019-19741，50μg/100μl)1∶500；兔抗gfap(达科公司z0334)1∶5000；

二级检测抗体是：生物素化的山羊抗兔igg(杰克森免疫研究公司111-065-144)1∶1000；生物素化的山羊抗兔igg(载体公司ba-1000)1∶200或1∶1000

图像分析

基于来自组织学染色的脑切片的图像分析，对小胶质细胞/星形胶质细胞数量进行定量评估，基于msvisualstudio2010和来自matroxmilv9库(matroxinc公司，魁北克，加拿大)的许多功能开发了专有的图像分析平台(astoria公司，自动存储图像分析(automatedstoredimageanalysis))。

为了检测和分析细胞体，执行以下步骤序列：1.用艾贝欧公司(aperio)的scanscope以20倍的放大倍数扫描带有大脑切片的载玻片，以评估(棕色)ihc染色的小胶质细胞(ibal)或星形胶质细胞(gfap)。2.运行内部开发的imagescope(v12.1.0.5029，美国艾贝欧公司(aperioinc.，usa))插件，用于创建和导出每个切片的3x8位rgbtif图像片(放大20倍)。3.图像处理(对于每个tif图像)：a：对每个tif图像执行颜色反卷积以获得没有蓝色的棕色染色图像。b：通过阈值处理、形态学关闭、填充孔、打开和消除太小的对象，从白色背景中分割有效样本(脑组织)，从而产生当前图像的有效组织和样本区域的二元掩模。c：基于在充分黑暗区域(指示细胞体)的颜色去卷积的棕色图像的蓝色通道的平均灰度值，将自适应阈值技术应用于细胞体的单独分割。计算的阈值用于二值化，并且在大小过滤之后产生细胞体掩模图像(在有效样本区域内)。

结果

图9：与载体对照相比，铜宗中毒后用blz945进行2周治疗性处理降低了皮质和纹状体的mri对比但不降低胼胝体的mri对比，表明髓鞘形成增加。针对不同处理组的皮质(图9a)、纹状体(图9b)和胼胝体(图9c)的磁共振成像(mri)对比。将mri对比标准化为载体对照组(正常食物)的绝对值。组由以下小鼠组成：这些小鼠用正常食物或铜宗食物(0.2％)处理5周，然后转换为正常食物进行2周治疗处理(载体或blz945p.o.，qd，201nd60mg/kg)。平均值土sem。统计学：holmsidak的多重比较检验(**：p＜0.01，**：p＜0.005)。

图10：blz945处理以剂量依赖性方式导致小胶质细胞消耗和小胶质细胞活化。用blz945(p.o.，qd)处理5天后，野生型小鼠的皮质中剂量依赖性小胶质细胞消耗(ibal阳性的小胶质细胞数)(图10a)。60mg/kgblz945仅显示小于50％的轻微减少，而20mg/kgblz945显示没有小胶质细胞消耗。用blz945(p.o.，qd)处理5天后，野生型小鼠的皮质中剂量依赖性小胶质细胞活化(iba1阳性的小胶质细胞大小相对于远端小胶质细胞突起标准化)(图10b)。60mg/kgblz945诱导强烈的小胶质细胞活化，而20mg/kgblz945仅轻度诱导。指示各个数据点。平均值土sem。

图11：blz945在血液和脑中的药代动力学分析。血液和脑blz945水平是剂量依赖性的，并且显示出脑/血液比率为0.3-0.6，如上述各图所示。组大小：n＝2-3。数据显示为平均值土sem。

将0.2％铜宗在啮齿动物饲料中使用5周以诱导强脱髓鞘以及小胶质细胞和星形胶质细胞的大量受累。实施纵向、非侵入性磁共振成像(mri)方法以直接测量脑中的髓鞘形成。先前已显示mri参数与脑中的定量组织学读数相关。在该模型中，csf1r激酶抑制剂blz945以20mg/kg和60mg/kgqd，p.o.的剂量进行测试。在原初动物中，较低剂量的blz945处理5天后显示没有小胶质细胞减少，但是在如形态学上测量的活化状态略微增加。在原初动物中60mg/kg剂量的blz945处理5天后，小胶质细胞减少约30％-40％，但也显著增强了小胶质细胞的形态学活化状态。小胶质细胞的这些变化与用169mg/kgblz945处理5天后观察到的变化非常不同，其中可以观察到用高剂量处理的接近完全小胶质细胞消耗。因此，在铜宗模型中以治疗模式测试20mg/kg和60mg/kgblz945。使用较低剂量的blz945进行短期处理仅1周，通过mri检测显示对5周啮齿动物铜宗模型中的髓鞘再生有益。60mg/kgblz945剂量在胼胝体/外囊和皮质中显示出显著增强的髓鞘再生，而在纹状体中仅有增强趋势。这些数据显示，在60mg/kgblz945情况下的原初动物中观察到的改变的小胶质细胞形态可以通过释放针对增强的少突胶质细胞前体细胞分化的因子而导致增强的吞噬作用(吞噬固体颗粒/碎片/死细胞)和髓鞘碎片的清除以及增加的少突胶质细胞。此外，60mg/kgblz945剂量情况下轻度减少的小胶质细胞数量与改变的小胶质细胞表型相结合可以保护神经元/轴突免于在如ms的炎症性环境中受损。

csf1r激酶抑制剂也影响肝脏中的库普弗细胞，从而改变肝酶。必须在临床中密切监测这种中靶效应，并限制剂量和治疗方案。因此，在临床前模型中观察到的仅具有短期治疗范例的较低blz945剂量的有益效果是非常有利的。此外，在具有所选剂量的临床和临床前模型中的类似化合物暴露是预期的。

calabrese，m.，magliozzi，r.，ciccarelli，o.，geurts，j.j.g.，reynolds，r.，andmartin，r.(2015).exploringtheoriginsofgreymatterdamageinmultiplesclerosis.nat.rev.neurosci.16.147-158.

haase，a.，matthaei，d.，hanicke，w.，andfrahm，j.(1986).dynamicdigitalsubtractionimagingusingfastlow-angleshotmrmoviesequences.radiology160，537-541.

hagemeyer，n.，hanft，k.-m.，akriditou，m.-a.，unger，n.，park，e.s.，stanley，e.r.，staszewski，o.，dimou，l.，andprinz，m.(2017).microgliacontributetonormalmyelinogenesisandtooligodendrocyteprogenitormaintenanceduringadulthood.actaneuropathol.

hennig，j.，nauerth，a.，andfriedburg，h.(1986).rareimaging：afastimagingmethodforclinicalmr.magn.reson.med.3，823-833.

nasrabady，s.e.，rizvi，b.，goldman，j.e.，andbrickman，a.m.(2018).whitematterchangesinalzheimer’sdisease：afocusonmyelinandoligodendrocytes.1-10.

nylander，a.，andhafler，d.a.(2012).multiplesclerosis.j.clin.invest.122，1180-1188.

oliveirasantos，m.，caldeira，i.，gromicho，m.，pronto-laborinho，a.，anddecarvalho，m.(2017).brainwhitematterdemyelinatinglesionsandamyotrophiclateralsclerosisinapatientwithc9orf72hexanucleotiderepeatexpansion.mult.scler.relat.disord.17，1-4.

ropele，s.，schmidt，r.，enzinger，c.，windisch，m.，martinez，n.p.，andfazekas，f.(2012).longitudinalmagnetizationtransferimaginginmildtoseverealzheimerdisease.ajnramjneuroradiol33，570-575.

zhou，t.，ahmad，t.k.，gozda，k.，truong，j.，kong，j.，andnamaka，m.(2017).implicationsofwhitematterdamageinamyotrophiclateralsclerosis(review).mol.med.rep.16，4379-4392.