毛乳头细胞生长促进剂、FGF-7产生促进剂、VEGF产生促进剂、IGF-1产生促进剂、HGF产生促进剂及生发剂的制作方法

本发明涉及一种毛乳头细胞(follicledermalpapillacell)生长促进剂、成纤维细胞生长因子-7(fibroblastgrowthfactor-7：fgf-7)产生促进剂、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor：vegf)产生促进剂、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1：igf-1)产生促进剂、肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor：hgf)产生促进剂以及生发剂(hairgrowthagent)。

背景技术：

作为参与生发的因子，已知有成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)、血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)以及肝细胞生长因子(hgf)等。

一般认为米诺地尔及腺苷会促进上述fgf-7、vegf等因子的产生，已知有含有这些作为有效成分的生发剂(专利文献1、2)。另外，已知从灵芝中所提取的某种羊毛甾烷型三萜类具有5α-还原酶抑制作用，而5α-还原酶抑制作用对于预防及治疗男性型脱发有效(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平5-4908号公报

专利文献2：日本特开2000-297015号公报

专利文献3：国际公开第2005/079164号

技术实现要素：

发明想要解决的课题

近年来，为了获得能显示出更加优异的生发效果的生发剂，要求毛乳头细胞生长促进剂、成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂、血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂、胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂及肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂具有更高的效果。

因此，本发明的目的在于提供能发挥比以往更优异的效果的新型毛乳头细胞生长促进剂、成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂、血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂、胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂、肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂及含有这些促进剂中的至少一种的生发剂。

用于解决课题的手段

本发明的毛乳头细胞生长促进剂的特征在于，含有羊毛甾醇(lanosterol)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(3β-hydroxylanosta-8,24-diene-21-al)、桦褐孔菌醇(inotodiol)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(3β,21-dihydroxylanost-8,24-diene)以及栓菌酸(trametenolicacid)中的至少一种作为有效成分。

本发明的成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂的特征在于，含有羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇以及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯中的至少一种作为有效成分。

本发明的血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂的特征在于，含有栓菌酸作为有效成分。

本发明的胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂的特征在于，含有桦褐孔菌醇作为有效成分。

本发明的肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂的特征在于，含有3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛以及桦褐孔菌醇中的至少一种作为有效成分。

本发明的生发剂的特征在于，含有羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸中的至少一种作为有效成分。

本发明的毛乳头细胞生长促进剂的特征在于，含有麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b(inotolactoneb)、过氧化麦角甾醇以及桦褐孔菌素c(inonotusinc)中的至少一种作为有效成分。

本发明的成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂的特征在于，含有麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯以及桦褐孔菌素三醇a(inonotsutriola)中的至少一种作为有效成分。

本发明的血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂的特征在于，含有麦角甾醇、桦褐孔菌内酯b以及桦木醇中的至少一种作为有效成分。

本发明的胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂的特征在于，含有麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、β-谷甾醇、桦褐孔菌素c及3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯中的至少一种作为有效成分。

本发明的肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂的特征在于，含有麦角甾醇、星鱼甾醇以及桦褐孔菌内酯b中的至少一种作为有效成分。

本发明的生发剂的特征在于，含有麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯以及桦褐孔菌素三醇a中的至少一种作为有效成分。

本发明的生发剂的特征在于，含有羊毛甾烷型三萜作为有效成分。

发明效果

本发明的毛乳头细胞生长促进剂含有羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸中的至少一种、或者麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、过氧化麦角甾醇以及桦褐孔菌素c中的至少一种作为有效成分，因此，能够发挥比现有的毛乳头细胞生长促进剂更加优异的促进毛乳头细胞生长的作用。

本发明的成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂含有羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇以及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯中的至少一种、或者麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯以及桦褐孔菌素三醇a中的至少一种作为有效成分，因此，能够发挥比现有的fgf-7产生促进剂更加优异的促进fgf-7产生的作用。

本发明的血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂含有栓菌酸、或者麦角甾醇、桦褐孔菌内酯b以及桦木醇中的至少一种作为有效成分，因此，能够发挥比现有的vegf产生促进剂更加优异的促进vegf产生的作用。

本发明的胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂含有桦褐孔菌醇、或者麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、β-谷甾醇、桦褐孔菌素c及3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯中的至少一种作为有效成分，因此，能够发挥比现有的igf-1产生促进剂更加优异的促进igf-1产生的作用。

本发明的肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂含有3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛以及桦褐孔菌醇中的至少一种、或者麦角甾醇、星鱼甾醇以及桦褐孔菌内酯b中的至少一种作为有效成分，因此，能够发挥比现有的hgf产生促进剂更加优异的促进hgf产生的作用。

本发明的生发剂含有羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸中的至少一种、麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯以及桦褐孔菌素三醇a中的至少一种、或者羊毛甾烷型三萜作为有效成分，而这些成分具有促进毛乳头细胞生长的作用、促进成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生的作用、促进血管内皮生长因子(vegf)产生的作用、促进胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生的作用及促进肝细胞生长因子(hgf)产生的作用中的任意一种或两种以上作用，因此，能够发挥比现有的生发剂更加优异的生发效果。

附图说明

图1是表示五种羊毛甾烷型三萜类化合物及米诺地尔的毛乳头细胞生长促进率的图表；

图2是表示麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇及米诺地尔的毛乳头细胞生长促进率的图表；

图3是表示过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、羊毛甾醇及米诺地尔的毛乳头细胞生长促进率的图表。

具体实施方式

下面，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明人等发现，羊毛甾醇(cas登记号：79-63-0)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(cas登记号：96574-03-7)、桦褐孔菌醇(cas登记号：35963-37-2)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(cas登记号：267649-99-0)及栓菌酸(cas登记号：24160-36-9)这五种羊毛甾烷型三萜类化合物具有促进参与生发的毛乳头细胞生长的作用、促进成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生的作用、促进血管内皮生长因子(vegf)产生的作用、促进胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生的作用及促进肝细胞生长因子(hgf)产生的作用中的任意一种或两种以上的作用。这五种羊毛甾烷型三萜类化合物能够由下述通式(ltt)来表示。

下述通式(ltt)中，r¹和r²的组合选自下面的a)、b)、c)、d)及e)。

a)r¹＝ch3且r²＝h；

b)r¹＝cho且r²＝h；

c)r¹＝ch3且r²＝oh；

d)r¹＝ch2oh且r²＝h；

e)r¹＝cooh且r²＝h。

下述通式(ltt)所表示的五种羊毛甾烷型三萜类化合物例如能够从植株中提取并分离而获得。能够以常用的方法从植株中提取(萃取)。作为植株，可列举白桦茸。使用柱色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法等适当的分离精制方法对从白桦茸的子实体中用溶剂浸提得到的提取物进行分离并精制，由此能够得到上述通式(ltt)所表示的五种羊毛甾烷型三萜类化合物。需要指出，在该例子中，植物作为广义使用，包含菌类在内，植株包含菌类的子实体等。

白桦茸的提取物中包含全部上述五种羊毛甾烷型萜类化合物，因此，能够通过从白桦茸中提取并分离而高效地得到这五种羊毛甾烷型萜类化合物。

前述五种羊毛甾烷型三萜类化合物能够通过任意的方法来获得，不必一定从单植株中提取并分离，例如，可以从不同的植株中分别提取并分离得到五种羊毛甾烷型三萜类化合物。五种羊毛甾烷型萜类化合物也可以化学合成。

另外，本发明人等发现，麦角甾醇(cas登记号：57-87-4)、星鱼甾醇(cas登记号：2465-11-4)、桦褐孔菌内酯b(cas登记号：1587735-79-2)、桦木醇(cas登记号：473-98-3)、β-谷甾醇(cas登记号：83-46-5)、过氧化麦角甾醇(cas登记号：2061-64-5)、桦褐孔菌素c(cas登记号：1889275-09-5)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(cas登记号：106483-69-6)、桦褐孔菌素三醇a(cas登记号：374797-72-5)(下面，有时将这九种类的化合物统称为“九种化合物”)也具有促进参与生发的毛乳头细胞生长的作用、促进成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生的作用、促进血管内皮生长因子(vegf)产生的作用、促进胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生的作用及促进肝细胞生长因子(hgf)产生的作用中的任意一种或两种以上的作用。九种化合物中的桦褐孔菌内酯b、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯、桦褐孔菌素三醇a为羊毛甾烷型萜类化合物。

与上述通式(ltt)所表示的五种羊毛甾烷型三萜类化合物(下面，有时将这五种类化合物统称为“五种化合物”)相同，九种化合物分别也能够从例如植株中提取获得，并能够通过常用方法从植株中提取。关于九种化合物，作为植株，也可列举白桦茸。使用柱色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法等适当的分离精制方式对从白桦茸的子实体中用溶剂提取得到的提取物进行分离并精制，由此得到九种化合物。白桦茸的提取物中包含九种化合物中的全部的化合物，因此，能够通过从白桦茸中提取而高效地得到九种化合物中的每种化合物。能够从白桦茸中同时获得五种化合物中的全部化合物以及九种化合物中的全部化合物，因此，将白桦茸作为材料是非常有用的。

九种化合物中的每种化合物能够通过任意的方法来获得，不必一定从单植株中得到，例如，可以从不同的植株分别提取获得九种化合物中的每种化合物。另外，九种化合物也可以化学合成。

也可以将上述五种化合物的化合物与九种化合物的化合物组合使用。在该情况下，被组合的五种化合物的化合物和九种化合物的化合物可以从不同植株中提取，也可以将其中的一方或双方由化学合成。

下面，有时将成纤维细胞生长因子-7产生促进剂称为fgf-7产生促进剂或成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)。另外，有时将血管内皮生长因子产生促进剂称为vegf产生促进剂或血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂，将胰岛素样生长因子-1产生促进剂称为igf-1产生促进剂或胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂，将肝细胞生长因子产生促进剂称为hgf产生促进剂或肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂。

通过使用羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸，麦角甾醇、星鱼甾醇、桦褐孔菌内酯b、桦木醇、β-谷甾醇、过氧化麦角甾醇、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯、桦褐孔菌素三醇a中的至少一种，能够得到诸如下面所说明的本发明的毛乳头细胞生长促进剂、成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂、血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂、胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂、肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂及生发剂。

在上述十四种化合物中，通式(ltt)所表示的五种羊毛甾烷型三萜类化合物和桦褐孔菌内酯b、桦褐孔菌素c、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯、桦褐孔菌素三醇a为羊毛甾烷型萜类，本发明人等发现，在羊毛甾烷型萜类化合物中，特别是羊毛甾烷型萜类能够用作生发剂。即，发现羊毛甾烷型萜类具有促进参与生发的毛乳头细胞生长的作用、促进成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生的作用、促进血管内皮生长因子(vegf)产生的作用、促进胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生的作用及促进肝细胞生长因子(hgf)产生的作用中的任意一种或两种以上作用。

需要指出，在下面的说明中，将羊毛甾醇称为化合物z1；3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛称为化合物z2；桦褐孔菌醇称为化合物z3；3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯称为化合物z4；栓菌酸称为化合物z5；麦角甾醇称为化合物z6；星鱼甾醇称为化合物z7；桦褐孔菌内酯b称为化合物z8；桦木醇称为化合物z9；β-谷甾醇称为化合物z10；过氧化麦角甾醇称为化合物z11；桦褐孔菌素c称为化合物z12；3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯称为化合物z13；桦褐孔菌素三醇a称为化合物z14，另外，有时附注它们的名称。

<毛乳头细胞生长促进剂>

本发明的毛乳头细胞生长促进剂含有羊毛甾醇(化合物z1)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)栓菌酸(化合物z5)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)中的至少一种作为有效成分，并根据需要进一步含有其它成分。作为有效成分，能够单独使用前述十种化合物中的一种、或并用两种以上。当并用两种以上时，可以将五种化合物的化合物彼此、九种化合物的化合物彼此组合使用，也可以将五种化合物和九种化合物组合使用。需要指出，关于这种化合物的组合，对于其它促进剂、生发剂也是相同的。

毛乳头细胞生长促进剂中的有效成分的含量能够根据目的适当选择，不作特别限定。有效成分的含量能够采用例如每单位投药量剂型为1μg～100mg左右。本发明的毛乳头细胞生长促进剂也可以为前述的有效成分本身。

作为毛乳头细胞生长促进剂中的其它成分，只要不损害本发明的效果，则不作特别限定，能够根据目的适当选择。作为其它成分，例如，可列举药学上可接受的载体。例如，当将前述有效成分作为各种剂型使用时，载体能够根据该剂型适当选择。

剂型不作特别限定，能够根据给药方法适当选择。作为剂型，例如，可列举：口服固形剂(片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、含片等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)、注射剂(溶液、悬浮液、用时溶解用固形剂等)、吸入散剂、软膏剂、外用液剂、贴片剂、涂布剂、滴眼剂、滴鼻剂及滴耳剂。

作为口服固形剂，例如，能够通过该向前述的有效成分中添加赋形剂、根据需要使用的偶合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味-调香剂等添加剂，并通过常用的方法来制造。作为赋形剂，例如，可列举：乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、淀粉、碳酸钙、高岭土、微晶纤维素及硅酸等。

添加剂不作特别限定，能够根据目的适当选择。作为偶合剂，例如，可列举：水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、甲基纤维素、乙基纤维素、虫胶、磷酸钙及聚乙烯吡咯烷酮等。

作为崩解剂，例如，可列举干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉、碳酸氢钠、碳酸钙、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯及乳糖等。作为润滑剂，例如，可列举精制滑石粉、硬脂酸盐、硼砂及聚乙二醇等。作为着色剂，例如，可列举二氧化钛、氧化铁等。作为调味-调香剂，例如，可列举白糖、橙皮、柠檬酸及酒石酸等。

作为口服液剂，例如，能够向前述的有效成分中加入调味-调香剂、缓冲剂、稳定剂等添加剂，并通过常用方法来制造。添加剂不作特别限定，能够根据目的适当选择。作为调味-调香剂，例如，可列举白糖、橙皮、柠檬酸及酒石酸等。作为缓冲剂，例如，可列举柠檬酸钠等。作为稳定剂，例如，可列举黄蓍胶、阿拉伯胶及明胶等。

作为注射剂，例如，能够向前述的有效成分中添加ph调节剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、局部麻醉剂等，并通过常用方法来制造。注射剂为皮下注射剂、肌肉注射剂或静脉注射剂。作为ph调节剂及缓冲剂，例如，可列举：柠檬酸钠、醋酸钠及磷酸钠等。

作为稳定剂，例如，可列举焦亚硫酸钠、edta、巯基乙酸及硫代乳酸等。作为等渗剂，例如，可列举氯化钠、葡萄糖等。作为局部麻醉剂，例如，可列举盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因等。

本发明的毛乳头细胞生长促进剂含有具有促进毛乳头细胞生长的作用的有效成分，因此，能够通过促进毛乳头细胞的生长的作用来激活毛乳头。本发明的毛乳头细胞生长促进剂能够应用于例如毛乳头细胞的生长促进机理、通过促进毛乳头细胞生长而改善的症状的研究、通过促进毛乳头细胞生长而改善的症状的予防及治疗。

作为毛乳头细胞生长促进剂的具体形式，例如，可列举：用作试剂的促进剂及用于予防及治疗症状(包含疾病及脱发等“不优选的症状”)的促进剂。作为症状，例如，可列举：毛发稀疏、脱发及男性型脱发等。

本发明的毛乳头细胞生长促进剂的使用方法不作特别限定，能够根据目的适当选择。例如，能够通过任意的方法使其与毛乳头细胞直接接触而使用。本发明的毛乳头细胞生长促进剂也可以通过任意的方法与毛发及头皮的一方或双方接触而使用。

<成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂>

本发明的成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂含有羊毛甾醇(化合物z1)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)及桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)中的至少一种作为有效成分，并根据需要含有诸如上述那样的其它成分。作为有效成分，能够单独使用前述十三种化合物中的一种、或并用两种以上。

fgf-7产生促进剂中的有效成分的含量能够根据目的适当选择，不作特别限定。有效成分的含量能够采用例如每单位投药量剂型为1μg～100mg左右。本发明的fgf-7产生促进剂可以为前述有效成分本身。

本发明的fgf-7产生促进剂含有具有促进fgf-7产生的作用的有效成分。因此，本发明的fgf-7产生促进剂能够应用于例如fgf-7产生的促进机理、通过促进fgf-7产生而改善的症状的研究、通过促进fgf-7产生而改善的症状的予防及治疗。

<血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂>

本发明的血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂含有栓菌酸(化合物z5)、麦角甾醇(化合物z6)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)及桦木醇(化合物z9)中的至少一种作为有效成分，并根据需要含有诸如上述那样的其它成分。作为有效成分，能够单独使用前述的四种化合物中的一种、或并用两种以上。vegf产生促进剂中的有效成分的含量能够根据目的适当选择。有效成分的含量能够采用例如每单位投药量剂型为1μg～100mg左右。本发明的vegf产生促进剂可以为前述有效成分本身。

本发明的vegf产生促进剂含有具有促进vegf产生的作用的有效成分。因此，本发明的vegf产生促进剂能够应用于例如vegf产生的促进机理、通过促进vegf产生而改善的症状的研究、通过促进vegf产生而改善的症状的予防及治疗。

<胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂>

本发明的胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂含有桦褐孔菌醇(化合物z3)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、β-谷甾醇(化合物z10)、桦褐孔菌素c(化合物z12)及3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)中的至少一种作为有效成分，并根据需要含有诸如上述那样的其它成分。作为有效成分，能够单独使用前述七种化合物中的一种、或并用两种以上。igf-1产生促进剂中的有效成分的含量能够根据目的适当选择。有效成分的含量能够采用例如每单位投药量剂型为1μg～100mg左右。本发明的igf-1产生促进剂可以为前述有效成分本身。

本发明的igf-1产生促进剂含有具有促进igf-1产生作用的有效成分。因此，本发明的igf-1产生促进剂能够应用于例如igf-1产生的促进机理、通过促进igf-1产生而改善的症状的研究、通过促进igf-1而改善的症状的予防及治疗。

<肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂>

本发明的肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂含有3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)及桦褐孔菌内酯b(化合物z8)中的至少一种作为有效成分，并根据需要含有诸如上述那样的其它成分。作为有效成分，能够单独使用前述的五种化合物中的一种、或并用两种以上。hgf产生促进剂中的有效成分的含量能够根据目的适当选择。有效成分的含量能够采用例如每单位投药量剂型为1μg～100mg左右。本发明的hgf产生促进剂可以为前述有效成分本身。

本发明的hgf产生促进剂含有具有促进hgf产生的作用的有效成分。因此，本发明的hgf产生促进剂能够应用于例如hgf产生的促进机理、通过促进hgf产生而改善的症状的研究、通过促进hgf产生而改善的症状的予防及治疗。

<生发剂>

本发明的生发剂含有羊毛甾醇(化合物z1)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)、栓菌酸(化合物z5)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)、桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)中的至少一种作为有效成分。作为有效成分，能够单独使用前述的十四种化合物中的一种、或并用两种以上。例如，当使用包含化合物z1～z5这五种化合物的白桦茸的提取物时，生发剂中的提取物的含量能够采用0.1～5.0质量％左右。另外，当使用包含化合物z1～z14这十四种化合物的白桦茸的提取物时，生发剂中的提取物的含量能够采用0.1～10质量％左右。

另外，本发明的生发剂含有羊毛甾烷型三萜作为有效成分。作为有效成分的羊毛甾烷型三萜这种化合物能够单独含有一种或含有两种以上。

根据需要，能够在本发明的生发剂中配合水、低级醇(甲醇、乙醇、改性乙醇、异丙醇等)、助溶剂、表面活性剂、乳化稳定剂、凝胶化剂、粘合剂、以及为了得到所需的剂型而通常所使用的基剂成分。

也可以根据本发明的生发剂的使用目的，在不损害本发明的效果的范围内配合生发剂中常用的其它成分。作为其它成分，例如，可列举：米诺地尔、卡普氯铵(carproniumchloride)等血管扩张剂；螺内酯、氟他胺(flutamide)、醋酸环丙孕酮(cyproteroneacetate)、异乙诺酮(oxendolone)等雄性激素受体抑制剂；非那雄胺(finasteride)、爱普列特(epristeride)等类固醇-5α-还原酶抑制剂；甘草次酸(glycyrrhetinicacid)、甘菊环(azulene)等抗炎症剂；醋酸氢化可的松、醋酸地塞米松(dexamethasoneacetate)等肾上腺皮质激素；尿素、水杨酸等角质溶解剂；丙二醇、1,3-丁二醇、聚乙二醇(macrogol)、甘油、二丙二醇、乙醇、异丙醇等醇类；甘油单十五酸酯(glycerylmonopentadecanoate)等脂肪酸甘油酯、盐酸二苯胺(diphenhydraminehydrochloride)等抗组胺剂等。

而且，还可列举：葡萄糖酸氯己定(chlorhexidinegluconate)、异丙基戊基苯酚(isopropylmethylphenol)、季铵盐、桧木醇(hinokitiol)、吡罗克酮乙醇胺盐(piroctoneolamine)等杀菌剂；透明质酸钠、甘油、硫酸软骨素等保湿剂；红豆杉(taxus)、牡丹皮(moutanbark)、甘草(licorice)、小连翘(hypericumerectum)、附子、枇杷、茵陈、聚合草、明日叶、藏红花、栀子(gardeniafruit)、迷迭香、鼠尾草、木香(saussureaeradix)、青木香(aristolochiadebilis)、忽布(hop)、胎盘素(placenta)等动植物的提取物；维生素a醋酸酯、盐酸吡哆醇(pyridoxinehydrochloride)、抗坏血酸、硝酸硫胺素、氰基钴胺、生物素、生育酚乙酸酯(tocopherolacetate)等维生素类；肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、角鲨烷、液体石蜡、卵磷脂等油分；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(polyoxyethylenesorbitanfattyacidester)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(sorbitanfattyacidester)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油等表面活性剂；二丁基羟基甲苯、没食子酸异丙酯等抗氧化剂、乙二胺四乙酸酯等螯合剂、薄荷醇、樟脑等清凉剂。一些情况下，还可以配合色素、香料、透皮吸收促进剂等。

本发明的生发剂优选为外用剂，能够作为通过用作外用剂的任意的剂型来使用。作为剂型，例如，可列举洗剂、乳剂、霜剂、滋养剂(tonicagent)、软膏剂、凝胶剂及气雾剂等，不作特别限定。本发明的生发剂例如能够每天一次～多次适量涂布在头皮上使用。

本发明的生发剂能够应用于例如生发机理、通过生发而改善的症状的研究、通过促进生发而改善的症状的予防及治疗。作为本发明的生发剂的具体形式，例如，可列举用于试剂的生发剂及用于予防及治疗症状的生发剂。作为症状，例如，可列举男性型脱发等。

本发明的生发剂含有羊毛甾醇(化合物z1)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)、栓菌酸(化合物z5)、麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)、桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)中的至少一种作为有效成分，因此，具备促进毛乳头细胞生长的作用、促进fgf-7产生的作用、促进vegf产生的作用、促进igf-1产生的作用及促进hgf产生的作用中的任意一种或两种以上作用。

除上述作用之外，桦褐孔菌醇(化合物z3)及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)进一步具有睾酮5α-还原酶活性抑制作用。因此，例如，通过含有全部五种作为羊毛甾烷型三萜类化合物的化合物z1～z5，能够获得促进毛乳头细胞生长的作用、促进fgf-7产生的作用、促进vegf产生的作用、促进igf-1产生的作用及促进hgf产生的作用优异且具备睾酮5α-还原酶活性抑制作用的生发剂。当然，通过将桦褐孔菌醇(化合物z3)和3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)中的一方或双方与五种化合物及九种化合物中的其中一种或多种化合物的组合也能够得到具备睾酮5α-还原酶活性抑制作用的生发剂。

实施例

下面，对实施例进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

(实施例1)

实施例1为从白桦茸中提取(萃取)提取物的实施例。

1)向白桦茸的子实体的碎末5.0kg(俄罗斯产；批号no.131008、chihaya株式会社)中加入80％乙醇，在室温下提取。

2)将上述1)中得到的提取物通过50％乙醇溶解并抽滤，得到不溶部分(56.1g)和可溶部分(183.0g)。即，将提取物利用50％乙醇溶解处理，并对得到的处理液进行抽滤，由此将其分离为可溶部分和不溶部分。需要指出，通过溶解处理得到的处理液为悬浮状态的悬浮液。

需要指出，80％乙醇、50％乙醇均为乙醇水溶液，乙醇相对于乙醇水溶液的总体积的体积为80％、50％。下面，将相同地表述。

不溶部分中含有极性较低的化合物，即低极性化合物。另一方面，极性较高的化合物，即高极性化合物例如肌醇在25℃的水的溶解度为14g/100ml，因此其包含在可溶部分中。

(实施例2)

实施例2是从实施例1中得到的白桦茸的提取物中分离出羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸(化合物z1～z5)的实施例。

从1g所得到的50％乙醇不溶部分中分离出化合物a(84.8mg)、化合物b(55.0mg)、化合物c(219.9mg)、化合物d(28.1mg)及化合物e(117.6mg)。具体而言，通过硅胶柱色谱法，使用己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(12:1→10:1→9:1→8:1→4:1→2:1)进行梯度洗脱(分级操作1)。

通过¹³c-nmr及¹h-nmr解析分离得到的化合物a、b、c、d及e的分子结构，并将实测值与文献值进行比较。其结果，如下所述，确认化合物a、b、c、d及e均为上述通式(ltt)所表示的羊毛甾烷型三萜类化合物。

需要指出，在该实施例中，可溶部分表示由实际上溶解于乙醇水溶液的物质(化合物)构成的溶解部分，另外，不溶部分或50％乙醇不溶部分表示由实际上未溶解于乙醇水溶液的物质(化合物)构成的非溶解部分。虽然在本实施例中从不溶部分中提取了化合物z1～z5，但并不否定从可溶部分中进行提取。后述的化合物z6～z14的提取也相同。

关于化合物a、b、c、d及e的¹³c-nmr及¹h-nmr的实测值示于下述表1、2，3、4及5。

表1

表2

表3

表4

表5

将上面的实测值与下述文献1)～4)的值进行比较，从而鉴定化合物a～d。

1)秋久俊博、松本太郎、甾醇及三萜醇的¹³c-nmr光谱、油化学、vol.36(5)：301-319，1987

2)satorusawai,tomoyoshiakashi,nozomusakurai,hideyukisuzuki,daisukeshibata,shin-ichiayabe,andtoshioaokisatoru,plantlanosterolsynthase:divergenceofthesterolandtriterpenebiosyntheticpathwaysineukaryotes,plantcellphysiol(may2006)47(5):673-677,supplementarydata

3)zheng-feiyan,yangyang,feng-huatian,xin-xinmao,yuli,andchang-tianli,inhibitoryandacceleratoryeffectsofinonotusobliquusontyrosinaseactivityandmelaninformationinb16melanomacells,evidence-basedcomplementaryandalternativemedicine,vol.2014,1-11.

4)kahlos,kirsti；hiltunen,r.；vonschantz,m.,3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-al,anewtriterpenefrominonotusobliquus,plantamedica(1984),50(2),197-8.

化合物a的实测值与文献1)～3)中记载的值进行比较，化合物b、d的实测值与文献4)中记载的值进行比较。化合物c、e的实测值与文献3)、4)中记载的值进行比较。

化合物a被鉴定为上述通式(ltt)中r¹＝ch3且r²＝h的化合物，即，下述化学式(s1)所表示的羊毛甾醇(化合物z1)。

化合物b被鉴定为上述通式(ltt)中r¹＝cho且r²＝h的化合物，即，下述化学式(s2)所表示的3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)。

化合物c被鉴定为上述通式(ltt)中r¹＝ch3且r²＝oh的化合物，即，下述化学式(s3)所表示的桦褐孔菌醇(化合物z3)。

化合物d被鉴定为上述通式(ltt)中r¹＝ch2oh且r²＝h的化合物，即，下述化学式(s4)所表示的3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)。

化合物e被鉴定为上述通式(ltt)中r¹＝cooh且r²＝h的化合物，即，下述化学式(s5)所表示的栓菌酸(化合物z5)。

(实施例3)

实施例3是针对实施例2中分离的五种羊毛甾烷型三萜类化合物(化合物z1～z5)进行促进毛乳头细胞生长作用的试验的实施例。

首先，培养正常人毛发毛乳头细胞(东洋纺织株式会社制造、商品名“人毛发毛乳头细胞humanfollicledermalpapillacells(hfdpc)(codeno.ca60205a)”)。所使用的培养基是向作为低血清培养基的毛乳头细胞生长培养基(东洋纺织株式会社制造、商品名“毛乳头细胞生长培养基”(pcgm)(code.tmtpgm-250))的基础培养基250ml中添加作为培养基添加物的胎牛血清(fcs)2.5ml、胰岛素-转铁蛋白-三碘甲状腺原氨酸混液(itt)1.25ml、牛垂体提取液(bpe)2.5ml及醋酸环丙孕酮(cyp)1.25ml而成的毛乳头细胞生长培养基。

将在37℃、5％co2下所培养的细胞通过胰蛋白酶/edta溶液(0.05％浓度)进行胰蛋白酶处理。使用含有10％胎牛血清(fbs)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基dmem(dulbecco'smodifiedeagle'smedium)(nacalaitesque株式会社制造、下面简称为“dmem”)将处理后的细胞稀释至1.0×10⁴细胞/ml的浓度。将稀释后的细胞按照200μl/孔接种于96孔的微孔板falcon(注册商标)(bectondickinsonlabware公司制造、商品名“microtesttm96”)。培养3天后，吸除培养基。

将作为测试样品的化合物z1～z5以规定的浓度溶解于无血清dmem。浓度为0.01953μmol/l、0.078125μmol/l、0.3125μmol/l、1.25μmol/l、5μmol/l、20μmol/l。将溶解后的各测试样品以200μl/孔的量添加在接种上述细胞后的96孔微孔板的各孔中。继续培养4天后，吸除上述培养基。通过mtt测定法来测定毛乳头细胞生长作用。即，将mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)以0.4mg/ml的最终浓度溶解于无血清的dmem，并以100μl/孔进行添加。

培养2小时后，确认细胞内生成蓝色甲臜(formazan)。将该蓝色甲臜用50μl2-丙醇提取。提取之后，测定波长570nm处的吸光度，从而得到第一吸光度。同时，测定波长650nm处的吸光度作为浊度，从而得到第二吸光度。将第一吸光度和第二吸光度的差作为蓝色甲臜生成量。通过下述式(1)算得毛乳头细胞生长促进率(％)。

毛乳头细胞生长促进率(％)＝a1/b1×100……式(1)

a1：添加测试样品时的蓝色甲臜生成量

b1：未添加测试样品时的蓝色甲臜生成量

将针对化合物z1～z5分别求出的毛乳头细胞生长促进率总结于下述表6。针对化合物z1～z5的各浓度，分别求得6点的毛乳头细胞生长促进率。并将6点的平均值及标准误差作为(平均值±标准误差)示于表6中。作为对照，使用已知具有促进毛乳头细胞生长的作用的米诺地尔。

表6毛乳头细胞生长促进率

*：p<0.05；***：p<0.001；※：细胞存活率<80％

参考)米诺地尔80μmol/l116.1±3.5*

如上述表6所示可见，3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)在0.3125μmol/l的低浓度下显示出与80μmol/l的米诺地尔匹敌的促进毛乳头细胞生长的作用。另外，3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)在1.25μmol/l的浓度下能够得到超过80μmol/l的米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。

另外，栓菌酸(化合物z5)在0.3125μmol/l的低浓度下也得到了与80μmol/l的米诺地尔相同程度的促进毛乳头细胞生长的作用。0.3125μmol/l的桦褐孔菌醇(化合物z3)及20μmol/l的羊毛甾醇(化合物z1)中也确认到接近80μmol/l的米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。

将五种羊毛甾烷型三萜类化合物(化合物z1～z5)在低浓度下的促进毛乳头细胞生长的作用的试验结果示于下述表7及图1。为了进行比较，该表7及图1中也一并示出了有关米诺地尔的结果。

表7毛乳头细胞生长促进率(低浓度区域)

平均值±标准误差(mean±s.e.),n＝4,*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001

另外，3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)在0.01953μmol/l及0.078125μmol/l的低浓度下也得到了超过80μmol/l的米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。

由实施例3的结果确认，羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸，(化合物z1～z5)能够作为毛乳头细胞生长促进剂的有效成分。这些化合物z1～z5在比米诺地尔更低的浓度显示出超过米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。因此可知，羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯以及栓菌酸(化合物z1～z5)的促进毛乳头细胞生长的作用优于米诺地尔。

(实施例4)

实施例4是针对实施例2中分离的五种羊毛甾烷型三萜类化合物(化合物z1～z5)的混合物进行促进毛乳头细胞生长的作用的试验的实施例。

作为混合物中的各化合物的浓度(选择浓度)，采用羊毛甾醇(20μmol/l)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(0.3125μmol/l)、桦褐孔菌醇(0.3125μmol/l)、3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(5μmol/l)及栓菌酸(1.25μmol/l)。

通过与上述相同的方式针对该混合物进行促进毛乳头细胞生长的作用的试验。将求出的毛乳头细胞生长促进率与各种浓度的米诺地尔的结果一并示于下述表8。

表8毛乳头细胞生长促进率

平均值±标准误差(mean±s.e.),n＝4,*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001

如上述表8所示可见，以规定的浓度包含五种羊毛甾烷型萜类化合物即化合物z1～z5的混合物显示出超过20μmol/l的米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。

(实施例5)

实施例5是针对实施例2中分离的五种羊毛甾烷型三萜类化合物(化合物z1～z5)进行关于参与毛发周期的各种生长因子基因的产生促进试验的实施例。产生促进试验通过针对mrna表达进行评价的mrna表达促进作用试验来进行。

将人正常毛乳头细胞(hfdpc：来自头顶部)接种于60mm培养皿，并使用人正常毛乳头细胞用培养基(pcgm)进行培养。细胞融合之后，将培养基更换为含有10％fbs的dmem培养基并培养2小时。将作为测试样品的化合物z1～z5以规定的浓度溶解于无血清的dmem培养基。浓度采用1.25μmol/l、5μmol/l、20μmol/l。

分别将3ml溶解后的各测试样品添加至培养后的各培养皿。再培养6小时之后，通过常用方法制备总rna(totalrna)。针对不添加测试样品而培养的细胞，同样地制备总rna。利用分光光度计来测定各自的rna量，并制备总rna直至达到200ng/μl。

以该总rna为模板，测定参与毛发周期的各种生长因子及作为内标的gapdh的mrna的表达量。使用实时pcr装置smartcycler(注册商标)(cepheid公司)，通过利用takarasybr(注册商标)primescripttmrt-pcrkit(perfectrealtime)(codeno.rr063a)的实时两步法rt-pcr(2steprt-pcr)反应来进行检测。

各种生长因子的mrna表达量利用gapdhmrna的表达量进行校正后算得。各种生长因子mrna的表达率由下述式(2)算得。

各种生长因子mrna表达率(％)＝a2/b2×100……式(2)

a2：添加测试样品时的校正值

b2：未添加测试样品时(对照)的校正值

作为上述生长因子，对成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)、血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)及肝细胞生长因子(hgf)进行探讨。

将化合物z1～z5的各种生长因子mrna表达率分别总结于下述表9～表13。表9～表13所示的mrna表达率是分别针对1点而言以设定对照为100％时的相对值。而且，我们一直以来就知道腺苷具有促进血管内皮生长因子(vegf)产生的作用，将腺苷的mrna表达率总结于下述表14。

表9

表10

表11

表12

表13

表14

如上述表所示，羊毛甾醇(化合物z1)、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)、桦褐孔菌醇(化合物z3)及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)中可见相当于未添加测试样品时的1.2～1.6倍左右的促进fgf-7mrna产生的作用。

由实施例5的结果确认，羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、桦褐孔菌醇以及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z1～z4)分别能够作为fgf-7产生促进剂的有效成分。以上化合物z1～z4均在5μmol/l的低浓度下显示出大于或等于25μmol/l的腺苷的产生促进作用，因此可知，促进fgf-7产生的作用优于一直以来所熟知的腺苷。

如上述表13所示，20μmol/l的栓菌酸(化合物z5)中可见相当于未添加测试样品时的1.5倍左右的促进vegfmrna表达的作用。实施例5的结果显示栓菌酸(化合物z5)能够作为vegf产生促进剂的有效成分。而且，栓菌酸(化合物z5)即使在20μmol/l下也显示出超过25μmol/l的腺苷的促进vegfmrna表达的作用，它促进vegf产生的作用优于一直以来所熟知的腺苷。

而且，桦褐孔菌醇(化合物z3)中确认到相当于未添加测试样品时的1.2倍左右的促进igf-1mrna表达的作用。3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)及桦褐孔菌醇(化合物z3)中确认到促进hgfmrna表达的作用。桦褐孔菌醇(化合物z3)能够用作igf-1产生促进剂的有效成分。3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(化合物z2)及桦褐孔菌醇(化合物z3)分别能够用作hgf产生促进剂的有效成分。

(实施例6)

实施例6是针对实施例2中分离的五种羊毛甾烷型三萜类化合物(化合物z1～z5)进行睾酮5α-还原酶活性抑制作用试验的实施例。

将睾酮溶解于丙二醇，从而制备浓度为4.2mg/ml的溶液。将该溶液20μl及含有1mg/mlnadph的5mmol/ltns-hcl缓冲液(ph7.13)825μl在带盖v底试管中混合。将作为测试样品的化合物z1～z5溶解于乙醇、50％乙醇或精制水，从而制备溶液。

向前述的带盖v底试管中的混合液中加入测试样品的溶液80μl及s-9大鼠肝脏匀浆75μl并再次混合。使试管中的内容物在37℃下反应60分钟之后，加入二氯甲烷1ml停止反应。将反应后的混合物离心分离(1600×g、10分钟)，在下述的条件下对二氯甲烷相进行气相色谱分析。再通过相同的方法进行空白试验。

为了求得睾酮向3α-雄甾烷二醇(3α-androstanediol)及二氢睾酮的转化率，预先对3α-雄甾烷二醇、二氢睾酮及睾酮的标准品的乙醇溶液进行气相色谱分析，并求得这三种化合物的峰面积。

针对利用s-9反应后的3α-雄甾烷二醇、二氢睾酮及睾酮的峰面积，分别按照下述式(3)求得它们相对于标准品的峰面积的相对比。然后，按照式(4)求出测试样品的转化率。

相对比＝测试样品的峰面积/标准品的峰面积……式(3)

转化率(％)＝(a3+b3)/(a3+b3+c3)×100……式(4)

a3：3α-雄甾烷二醇的相对比

b3：二氢睾酮的相对比

c3：睾酮的相对比

基于求出的转化率并按下式(5)求得睾酮5α-还原酶活性抑制率。

睾酮5α-还原酶活性抑制率(％)＝(1-e/d)×100……式(5)

d：空白试验中的转化率

e：添加测试样品时的转化率

需要指出，气相色谱法的条件如下所述。

使用设备：shimadzugc-2010

色谱柱：db-1701

(膜厚：1.0μm)

色谱柱/上样温度：240℃/300℃

检测器：fid

载气：氮气

将有关化合物z1～z5的睾酮5α-还原酶活性抑制率及50％抑制浓度(ic50)与作为阳性对照的β-雌二醇的结果一起总结于下述表15。

表15

由实施例6的结果确认，桦褐孔菌醇(化合物z3)及3β,21-二羟基羊毛甾-8,24-二烯(化合物z4)具有睾酮5α-还原酶活性抑制作用。

(实施例7)

实施例7是从实施例1中得到的白桦茸的提取物中分别提取麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)、桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)的实施例。

通过下面将说明的流程，从实施例1中得到的50％乙醇不溶部分中得到化合物f、化合物g、化合物h1、化合物h2、化合物i、化合物j、化合物k、化合物l、化合物m、化合物n。

从实施例2的分级操作1中所得到的18个组分fa1～fa18中的第5～第7组分fa5～fa7中分别除去洗脱溶剂，从而得到制备物。通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(12：1)”)将从组分fa5～fa7中得到的制备物的混合物分级为9个组分fb1～fb9(分级操作2)。

从分级操作2中得到的组分fb1～fb9中的第6和第7组分fb6、fb7中分别除去洗脱溶剂，从而得到制备物。通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：甲苯→“甲苯：丙酮的混合溶剂(30:1→15：1)”→醋酸乙酯)将从组分fb6、fb7得到的制备物的混合物分级为10个组分fc1～fc10(分级操作3)。

需要指出，上述洗脱溶剂的说明中的箭头表示改变洗脱溶剂的组成及其中所用混合溶剂的比率，这表明进行了梯度洗脱。后述的高效液相色谱法中所使用的洗脱液也相同。

从分级操作3中得到的组分fc1～fc10中的第3组分fc3中除去洗脱溶剂，即获得化合物f(12.0mg)。另外，从第4组分fc4中除去洗脱溶剂，即获得化合物g(4.3mg)。

另外，通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(12:1→11:1→10:1→9:1→8:1→6:1→4:1→2:1)”)将实施例1中得到的50％乙醇不溶部分39.4g分级为8个组分fd1～fd8(分级操作4)。

通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(15:1→13:1→10:1→8:1→6:1→4:1)”)将从组分fd1～fd8中第4组分fd4中除去洗脱溶剂而得到的制备物分级为11个组分fe1～fe11(分级操作5)。

从组分fe1～fe11中的第8和第9组分fe8、fe9中分别除去洗脱溶剂，从而得到制备物。通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“甲苯：丙酮的混合溶剂(20:1→19:1→18:1)”)将从组分fe8、fe9得到的制备物的混合物分级为6个组分ff1～ff6(分级操作6)。

从通过分级操作5得到的组分fe1～fe11中的第6及第7组分fe6、fe7、以及通过分级操作6得到的组分ff1～ff6中的第1组分ff1中分别除去洗脱溶剂，从而分别得到制备物。通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(12:1→10:1→9:1→8:1→7:1)”)将从组分fe6、fe7及组分ff1得到的各制备物的混合物分级为14个组分fg1～fg14(分级操作7)。

从上述分级操作7中得到的组分fg1～fg14中的第8组分fg8中除去洗脱溶剂，即获得化合物j(113.9mg)。

从通过分级操作4得到的组分fd1～fd8中的第6组分fd6中除去洗脱溶剂，从而得到制备物，通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“甲苯：丙酮的混合溶剂(30:1→25:1→20:1→15:1)”)将得到的制备物分级为10个组分fh1～fh10(分级操作8)。

从分级操作8中得到的组分fh1～fh10中的第5组分fh5中除去洗脱溶剂，即获得化合物h1(209mg)。另外，从第6组分fh6中除去洗脱溶剂，即获得化合物h2(120.8mg)。

从组分fh1～fh10中的第7和第8组分fh7、fh8中分别除去洗脱溶剂，从而得到制备物。通过高效液相色谱法(色谱柱：n-2类型，洗脱液：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(8：2)”，流量7.0ml/分)将从组分fh7、fh8得到的制备物的混合液分级为8个组分fi1～fi8(分级操作9)。

从分级操作9中得到的组分fi1～fi8中的第4组分fi4中除去洗脱溶剂，即获得化合物i(10.2mg)。

另外，从通过分级操作8得到的组分fh1～fh10中的第9组分fh9中除去洗脱溶剂，从而得到制备物，通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(6:1→5:1→4:1→3:1)”)将该制备物分级为12个组分fj1～fj12(分级操作10)。

从分级操作10中得到的组分fj1～fj12中的第9组分fj9中除去洗脱溶剂，即获得化合物k(9.4mg)。

从通过分级操作4得到的组分fd1～fd8中的第8组分fd8中除去洗脱溶剂，从而得到制备物，通过硅胶柱色谱法(洗脱溶剂：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(6:1→4:1→2:1→1:1)”)将得到的制备物分级为13个组分fk1～fk13(分级操作11)。

从通过分级操作11得到的组分fk1～fk13中的第10组分fk10中除去洗脱溶剂，从而得到制备物。通过高效液相色谱法(色谱柱：n-6类型，洗脱液：“己烷:醋酸乙酯的混合溶剂(6:1)”，流量3.0ml/分)将从该组分fk10得到的制备物分级为18个组分fl1～fl18(分级操作12)。

通过高效液相色谱法(色谱柱：r-41类型，洗脱液：“乙腈(ch3cn)：水(h2o)的混合溶剂(7：3)”、流量5.0ml/分)将组分fl1～fl18中的第17组分fl17分级为12个组分fl1～fl12(分级操作13)。

从分级操作13中得到的组分fl1～fl12中的第2组分fl2中除去洗脱溶剂，从而获得化合物m(7.7mg)，并从第12组分fl12中除去洗脱溶剂，从而获得化合物n(47.3mg)。

通过¹³c-nmr及¹h-nmr解析如上所述得到的化合物f、g、h1、h2、i～n的分子结构。其结果确认，化合物h1和化合物h2是提取了相同的化合物。另外还确认，化合物l(47.3mg)与从分级操作1中得到的组分fa1～fa18中的第10组分fa10中所获得的化合物是提取了相同的化合物。进一步确认，化合物i与从第12组分fa12中的获得的化合物是提取了相同的化合物，化合物n与从第16组分fa16所获得的化合物是提取了相同的化合物。

将化合物f、g、h1、h2及i～n的¹³c-nmr及¹h-nmr的实测值与文献值进行比较。其结果确认，如下所述，化合物f、g、h1、h2及i～n提取了麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、羊毛甾-8,23e-二烯-3β-,22r,25-三醇(化合物z13)、桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)。

将化合物f、g、h1、h2及i～n的¹³c-nmr及¹h-nmr的实测值示于表16～表24。需要指出，表21中一并示出了其它分级操作中得到的确认与化合物k相同的化合物k0的实测值，而表22中一并示出了从组分fa10所获得的化合物l0的实测值。

表16

表17

表18

表19

表20

表21

表22

表23

表24

通过将实测值与上述文献1)和下面的文献5)～14)中所记载的文献值进行比较来进行化合物的鉴定。

5)seo,hyowon；arch.pharm.res.,2009,32(11),1573-1579

6)jeffreyl.c.wright,can.j.chem.,1979,57,2569-2571

7)alejandrof.barrero,et.al.,a.c.s.anda.s.p,1998,1491-1496

8)you-minying,et.al.,phytochemistry,2014,108,171-176

9)mochammadsholichin,kazuoyamasaki,ryojikasaiandosamu,chem.pharma.bull.,1980,28(3),1006-1008

10)kuo-chingkao,yu-lingho,i-hsinlin,li-kanghoandyuan-shiunchang,j.chin.chem.soc.,2004,51(1),199-204

11)garg.v.k.,andnes,w.r.,phytochemistry,1984,23,2925-2929

12)t.akihisa,s.thakur,f.u.rosenstein,t.matsumoto,lipids,1986,21,39-47

13)zhaofenqin,et.al.fitoterapia,2015,101,34-40

14)staji,etal.,europeanjournalofmedicinalchemistry43(2008),2373-2379

15)sayakataji,takeshiyamadaandreikotanaka,helveticachimicaacta,2008,91,1513-1524

化合物f、g的实测值与文献1)、5)～7)中所记载的值进行比较，化合物h的实测值与文献8)中所记载的值进行比较，化合物i的实测值与文献9)、10)中所记载的值进行比较。另外，化合物j的实测值与文献1)、11)、12)中所记载的值进行比较，化合物k的实测值与文献5)中所记载的值进行比较，化合物l的实测值与文献13)中所记载的值进行比较。而且，化合物m的实测值与文献14)中所记载的值进行比较，化合物n的实测值与文献15)中所记载的值进行比较。

判断化合物f为下述化学式(s6)所表示的麦角甾醇(化合物z6)。

判断化合物g为下述化学式(s7)所表示的星鱼甾醇(化合物z7)。

判断化合物h1、h2为下述化学式(s8)所表示的桦褐孔菌内酯b(化合物z8)。

判断化合物i为下述化学式(s9)所表示的桦木醇(化合物z9)。

判断化合物j为下述化学式(s10)所表示的β-谷甾醇(化合物z10)。

判断化合物k为下述化学式(s11)所表示的过氧化麦角甾醇(化合物z11)。

判断化合物l为下述化学式(s12)所表示的桦褐孔菌素c(化合物z12)。

判断化合物m为下述化学式(s13)所表示的3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)。

判断化合物n为下述化学式(s14)所表示的桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)。

(实施例8)

实施例8是针对实施例7中得到的化合物z6～z12进行促进毛乳头细胞生长的作用的试验的实施例。

通过与上述实施例3相同的方式来进行促进毛乳头细胞生长的作用的试验，并针对实施例7中得到的麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)及桦褐孔菌素c(化合物z12)求得毛乳头细胞生长促进率。作为测试样品的化合物z6～z12的浓度采用0.3125μmol/l、1.25μmol/l、5μmol/l、20μmol/l。化合物z6～z10的试验和化合物z1、z12的试验分开进行。在各试验中，使用化合物z1及米诺地尔作为对照。

毛乳头细胞生长促进率(％)通过上述式(1)算得。将关于化合物z6～z10的毛乳头细胞生长促进率示于表25及图2的图表，将关于化合物z11、z12的毛乳头细胞生长促进率示于表26及图3的图表。表25、表26中一并示出了关于各浓度的羊毛甾醇(化合物z1)及米诺地尔的结果。表25、表26中所示的化合物z6～z12、z1及米诺地尔的每种浓度的毛乳头细胞生长促进率分别为3点的平均值±标准误差。

表25毛乳头细胞生长促进率

n＝3,**：p<0.01；*：p<0.05；平均值±标准误差(mean±s.e.)

表26毛乳头细胞生长促进率

n＝3,**：p<0.01；*：p<0.05；平均值±标准误差(mean±s.e.)

如表25所示可见，浓度1.25μmol/l的麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)及桦褐孔菌内酯b(化合物z8)比相同及更高浓度的羊毛甾醇(化合物z1)及米诺地尔显示出更强的促进毛乳头细胞生长的作用。另外，如表26所示可见，浓度0.315μmol/l的过氧化麦角甾醇(化合物z11)及桦褐孔菌素c(化合物z12)比相同浓度的羊毛甾醇(化合物z1)以及相同及更高浓度的米诺地尔显示出更强的促进毛乳头细胞生长的作用。这表示羊毛甾烷骨架对于活性很重要。

由实施例8的结果确认，麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)及桦褐孔菌素c(化合物z12)能够作为毛乳头细胞生长促进剂的有效成分。以上化合物z6～z8、z11、z12在比米诺地尔更低的浓度下显示出超过米诺地尔的促进毛乳头细胞生长的作用。因此可知，化合物z6～z8、z11、z12的促进毛乳头细胞生长的作用优于米诺地尔。

(实施例9)

实施例9是针对实施例2中得到的化合物z6～z14进行对于参与毛发周期的各种生长因子基因的产生促进试验的实施例。产生促进试验是通过对mrna的表达进行评价的mrna表达促进作用试验来进行。

将麦角甾醇(化合物z6)、星鱼甾醇(化合物z7)、桦褐孔菌内酯b(化合物z8)、桦木醇(化合物z9)、β-谷甾醇(化合物z10)、过氧化麦角甾醇(化合物z11)、桦褐孔菌素c(化合物z12)、3β,22r,25-三羟基羊毛甾-8,23e-二烯(化合物z13)、桦褐孔菌素三醇a(化合物z14)作为测试样品，通过与上述实施例5相同的方式来进行mrna表达促进作用试验。各测试样品的浓度采用1.25μmol/l、5μmol/l、20μmol/l。

通过上述试验，求得作为生长因子的成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)、血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)及肝细胞生长因子(hgf)各自的mrna表达量。生长因子的mrna表达量通过gapdhmrna的表达量校正，并通过前述的式(2)求得生长因子mrna表达率(％)。将有关化合物z6～z14的各种生长因子mrna表达率分别总结于表27～35。表27～35中所示的mrna表达率(单位：％)是分别针对1点以设定对照为100％时的相对值。另外，针对浓度25μmol/l的腺苷，将成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)及血管内皮生长因子(vegf)的mrna表达率(％)示于表36。

表27

表28

表29

表30

表31

表32

表33

表34

表35

#：内部标准gapdh<70％

表36

如表27～表35所示，化合物z6～z14中可见相当于未添加测试样品时的1.15～1.6倍左右的促进fgf-7mrna产生的作用。由该实施例9的结果确认，化合物z6～z14能够作为fgf-7产生促进剂的有效成分。特别是20μmol/l的化合物z6、化合物z8及化合物z10可见相当于25μmol/l的腺苷的1.01～1.08倍左右的促进fgf-7mrna产生的作用，由此可知，它促进fgf-7产生的作用优于一直以来所熟知的腺苷。

如表27、表29、表30所示，在化合物z6、化合物z8及化合物z9中，例如，在1.25μmol/l下，可见相当于未添加测试样品时的1.1倍～1.2倍左右的促进vegfmrna表达的作用，另外，在20μmol/l下，可见相当于未添加测试样品时的1.2～2.1倍左右的促进vegfmrna表达的作用。由该实施例9的结果确认，化合物z6、化合物z8及化合物z9能够作为vegf产生促进剂的有效成分。而且，化合物z6、化合物z8及化合物z9即使在20μmol/l以下也显示出与25μmol/l的腺苷相当甚至超过腺苷的促进vegfmrna表达的作用，由此可知，它们促进vegf产生的作用优于一直以来熟知的腺苷。

如表27～表29、表31、表33、表34所示，化合物z6～z8、z10、z12、z13确认到相当于未添加测试样品时的1.1～1.55倍左右的促进igf-1mrna表达的作用。由此可知，化合物z6～z8、z10、z12、z13能够用作igf-1产生促进剂的有效成分。

如表27～表29所示，化合物z6～z8确认到相当于未添加测试样品时的1.3～1.4倍左右的促进hgfmrna表达的作用。由此可知，它能够用作hgf产生促进剂的有效成分。

由上面的各实施例的结果可知，化合物z1～z14为作为毛乳头细胞生长促进剂、成纤维细胞生长因子-7(fgf-7)产生促进剂、血管内皮生长因子(vegf)产生促进剂、胰岛素样生长因子-1(igf-1)产生促进剂及肝细胞生长因子(hgf)产生促进剂的新型有效成分。另外，推测化合物z1～z14能够通过不同的机理促进fgf-7、vegf、igf-1及hgf的mrna表达从而刺激毛发生长。我们认为该效果与是否具有羊毛甾烷骨架的8位的双键及4位的二甲基没有关系，但推测这与羊毛甾烷型三萜类化合物的侧链有关。

(实施例10)

实施例10是针对实施例1中得到的80％乙醇提取物(50％乙醇不溶部分及可溶部分)进行与生发相关的活性评价试验而得到的结果。

下述表37中示出促进毛乳头细胞生长的作用的试验的结果。促进毛乳头细胞生长的作用的试验通过实施例3中所述的方式来进行。

表37毛乳头细胞生长促进率

***：p<0.001；**：p<0.01；平均值±标准误差(mean±s.e.),

n＝6,※：细胞存活率<80％

参考)米诺地尔20μm(4.185μg/ml)：104.6±1.4*,*p<0.05

如上述表37所示可见，50％乙醇不溶部分在3.125μg/ml的低浓度下显示超过4.185μg/ml的米诺地尔的毛乳头细胞生长作用。此时的不溶部分的毛乳头细胞生长作用相当于12.5μg/ml的可溶部分的促进毛乳头细胞生长的作用。

下述表38、表39中示出针对参与毛发周期的各种生长基因的产生促进试验的结果。针对各种生长基因的产生促进试验通过实施例5中所述的方式来进行。表38是使浓度为3.125μg/ml时的结果，表39是使浓度为12.5μg/ml时的结果。而且，关于腺苷的结果总结于下述表40。

表38

表39

表40

如上述表所示可见，50％乙醇不溶部分在3.125μg/ml的低浓度下显示出与13.4μg/ml的腺苷匹敌的促进fgf-7产生的作用及促进vegf产生的作用。

下述表41中示出睾酮5α-还原酶活性抑制作用试验的结果。睾酮5α-还原酶活性抑制作用试验通过实施例6中所述的方式来进行。

表41

*：具有较强作用

上述表41中示出了50％乙醇不溶部分具有睾酮5α-还原酶活性抑制作用。

而且，针对50％乙醇不溶部分及可溶部分进行雄激素受体拮抗抑制作用试验。下面，将对试验方法进行说明。

首先，将从小鼠自发性乳腺癌(shionogi癌、sc-115)中所克隆的sc-3细胞用含有2％dcc-fbs及10^-8mol/l睾酮的mem培养基(mem/2培养基)进行培养，然后，通过胰蛋白酶处理回收细胞。将回收后的细胞用mem/2培养基稀释为1.0×10⁵细胞/ml的浓度。将稀释后的细胞以100μl/孔接种于96孔板。

培养过夜之后，除去培养基。并添加溶解于含有0.5％bsa的hamf12+mem(hmb)中的10^-9mol/l二氢睾酮及测试样品100μl。培养48小时之后，以100μl/孔添加mtt，该mtt以最终浓度0.4mg/ml溶解在mem/2中。

培养2小时之后，确认生成了蓝色甲臜。用2-丙醇200μl提取该蓝色甲臜。提取之后，测定波长570nm处的吸光度，从而得到第一吸光度。同时，测定波长650nm处的吸光度作为浊度，从而得到第二吸光度。将第一吸光度和第二吸光度的差作为蓝色甲臜生成量。

作为空白试验，使用仅利用hmb所培养的细胞，作为阳性对照，则使用通过仅含有10^-9mol/l的dht的hmb所培养的细胞，通过相同的方法进行试验并校正。将得到的结果示于下述表42。

表42

*：具有中等的作用

对照)醋酸环丙孕酮

ic50＝5.74nm(0.00239μg/ml),n＝4

上述表42中示出了50％乙醇不溶部分具有中等的雄激素受体拮抗抑制作用。

(实施例8)

下面示出本发明的生发剂的配方例。