阳离子核酸清除剂及其用途的制作方法

该申请要求2017年5月30日提交的美国临时申请号62/512,581的权益，其全部内容通过引用明确合并于此。

本发明公开了作为抗炎剂的阳离子核酸清除剂，用以有效地抑制多种核酸感应模式识别受体(prr)的激活。阳离子核酸清除剂包括水溶性阳离子聚合物、阳离子纳米颗粒和阳离子微粒。

背景技术：

天生的免疫系统(非特异性免疫系统)涉及分子、细胞以及作为自我保护用于保护人体免受诸如受损的细胞、刺激物、病原体或内源性应激信号有害刺激的复杂机制。模式识别受体(prr)可以使免疫细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和树枝化细胞)识别源自各种有害刺激物(例如传染性生物的外源产物或受损细胞的内源性分子)的病原体相关分子模式(pamp)和损伤相关分子模式(damp)。

为了使damp成为可识别的模式，它需要进行结构修饰，例如降解、变性、翻译后修饰和在细胞死亡过程中发生的氧化还原反应。damp具有高度多样的模式，包括小分子和大分子，例如atp(三磷酸腺苷)、尿酸、蛋白质和核酸(dna和rna)。(pisetskyetal.，nucleicacid-bindingpolymersasanti-inflammatoryagents：reducingthedangerofnuclearattack，expertrevclinimmunol，jan2012，8(1)page1-3))。

在病原体入侵期间，诸如tlr(toll样受体)之类的prr被激活从而引发细胞内信号传导事件，进而导致包括炎症和免疫调节细胞因子、趋化因子、免疫刺激受体的免疫反应基因的表达，从而杀死病原体并启动发展获得性免疫的过程(takedaandakira，int.immunol.17：1-14，2005；akiraetal，cell124：783-801，2006)。

不当或过度的prr激活与多种炎性疾病的发展有关，例如自身免疫性疾病、移植免疫和损伤后炎症。tlr家族某些成员的不当激活导致多种疾病的发展，包括：细菌性败血症(wurfeletal，am.j.respir.crit.caremed.178：710-720(2008)；knuefermannetal，circulation110：3693-3698(2004)；cavassanietal，j.exp.med.205：2609-2621(2008)；alves-filhoetal，crit.caremed.34：461-470(2006)；tsujimotoetal，j.hepatol.45：836-843(2006))、非感染性全身炎性反应综合征(tlr4)(breslinetal，shock29：349-355(2008))、多发性硬化症(tlr3，tlr4和tlr9)(chenetal，int.immunopharmacol7：1271-1285(2007))、系统性红斑狼疮(sle)(tlr7和tlr9)(marshak-rothsteinandrifkin，annu.rev.immunol.25：419-441(2007))和类风湿关节炎(tlr3、tlr4、tlr7、tlr8和tlr9)(choeetal，j.exp.med.197：537-542(2003)；o′neil，nat.clin.pract.rheumatol.4：319-327(2008))。临床前和临床研究表明，抑制tlr活性具有治疗某些疾病的治疗优势。例如，已经在动物和临床研究中评估了多种脂多糖中和剂和tlr4拮抗剂来治疗炎性疾病(leonetal，pharm.res.25：1751-1761(2008))。tlr9抑制剂(抑制性cpgdna)(plitasetal，j.exp.med.205：1277-1283(2008))和拮抗性的抗tlr3抗体(cavassanietal，j.exp.med.205：2609-2621(2008))增强了患有多微生物脓毒症的小鼠的存活率。基于寡核苷酸的tlr7和tlr9抑制剂阻止了用来自sle患者的血清刺激的人浆细胞样树突细胞产生ifnα(干扰素α)(barratetal，j.exp.med.202：1131-1139(2005))。

一些prr充当助于炎症反应的核酸感受器。病理性炎症反应可以由源自宿主细胞或细胞内微生物的核酸诱发。这些核酸是一类damp，可以激活几种胞质prr和核酸感应tlr，包括至少四种不同的tlr，即tlr3、tlr7、tlr8和tlr9。这些不适当的tlr激活会引起病理性炎症反应，从而导致炎性和自身免疫性疾病。(leeetal.，nucleicacid-bindingpolymersasanti-inflammatoryagents，procnatlacadsciusa，aug2011，108(34)page14055-14060)

tlr是跨膜蛋白，其包含富含亮氨酸的重复序列的胞外结构域和胞内toll/白细胞介素-1受体结构域(leulierandlemaitre，nat.rev.genet.9：165-178(2008))。已经鉴定出几种tlr用于识别特定的分子模式。例如，tlr2、tlr4、tlr5、tlr6和tlr11识别细菌外膜分子，例如脂多糖、肽聚糖和脂磷壁酸。tlr3、tlr7、tlr8和tlr9识别细菌、病毒或内源核酸(kawaiandakira，semin.immunol.19：24-32，2007)。tlr位于不同的细胞位置，例如细胞表面或内体。tlr3、tlr7、tlr8和tlr9主要位于内体区室中(kawaiandakira，semin.immunol.19：24-32，2007)。可诱发干扰素的蛋白质aim2(absentinmelanoma2，黑色素瘤2中不存在)通过参与防御细菌和病毒dna(已知具有两个寡核苷酸结合域)而参与炎症反应。

一些prr抑制剂或特定的tlr拮抗剂已显示出减轻炎症的作用。但是，由于prr功能的阻断，它们可能通过阻止免疫系统作为炎症防御进行反应而产生不利影响。可以用具有强核酸结合亲和力而又不阻碍prr功能的阳离子材料治疗由核酸(例如多种核酸感应prr的激活)引起的炎症。阳离子材料，即阳离子核酸清除剂，可以去除病原性核酸以抑制炎症，而不会干扰正常的细胞免疫功能。核酸与阳离子核酸清除剂形成复合物后，核酸与核酸感应prr的之间的相互作用被破坏，从而限制了炎症活动。阳离子核酸清除剂可以结合和中和核酸，而与核酸的序列、结构或化学性质无关，从而抑制多个核酸感应prr的激活，而无需直接与核酸感应prr相互作用。

sullenger等(wo2014/169043a1，anti-inflammatoryagentsandmethodsofusingthesame，公开于2014年10月16日)公开了通过使用阳离子聚合物来中和促炎核酸作用的方法以及通过筛选核酸结合聚合物的组合文库来识别抗炎阳离子聚合物的方法。moreno等(scavengingdamageandpathogenassociatedmolecules.currenttrendsinbiomedicalengineering&biosciences，vol2，issuel，march2017)和eppensteiner等(immunothromboticactivityofdamage-associatedmolecularpatternsandextracellularvesiclesinsecondaryorganfailureinducedbytraumaandsterileinsults，frontimmunol.2018feb8；9：190.doi：10.3389/fimmu.2018.00190)讨论了核酸结合阳离子聚合物的用途，例如聚酰胺胺树状聚合物、溴化海地美铵和含β-环糊精的聚合物，用于中和游离dna、rna和无机聚磷酸盐激活核酸感应tlr和固有的凝血级联反应的能力。

美国专利号9,468,650b2(sullenger等，inhibitionofendosomaltoll-likereceptoractivation)公开了一种通过向患者施用与负责诱发激活的核酸结合的聚(酰胺胺)(pamam)来抑制核酸诱发的tlr3或tlr9的激活从而治疗炎症或免疫反应的方法。

尽管有先前的努力，目前仍需要能够以更低的毒性提供类似功能的化合物。还需要用这种更低毒性化合物治疗各种炎性疾病，例如自身免疫性疾病、移植免疫和损伤后炎症。现在，本发明满足了这些需求并提供了本领域先前未公开的可行的改进。

技术实现要素：

本发明目前提供了阳离子核酸清除试剂，以有效地抑制多种核酸感应模式识别受体(prr)的激活，用以治疗由核酸通过prr的激活而引起的炎症或免疫反应。这些清除剂的毒性小于本领域已知的其他清除剂。

本发明还提供了抑制模式识别受体(prr)的激活以治疗由prr诱发的炎症或免疫反应的方法，该方法包括：以使对激活的抑制生效的量和条件向有需要的患者施用包含阳离子核酸聚合物的清除剂，其中，prr由核酸激活，而该清除剂结合核酸。优选地，prr是细胞质prr或tlr。在一个实施方案中，prr是tlr3、tlr7、tlr8、tlr9或aim2(在黑素瘤2中不存在)。在本方法中，该试剂以不依赖于核酸的序列、结构或化学的方式结合核酸，并且该试剂是本文公开的水溶性阳离子聚合物、阳离子纳米颗粒或阳离子微粒中的一种。

在一个优选的实施方案中，所述试剂是树枝化聚合物，其包含聚酯主链和树枝状阳离子侧链，其中，聚酯主链包含聚(α-溴-3-己内酯)，其中，树枝状阳离子侧链包含炔丙基核心和树枝状聚酰胺胺。在另一个实施方案中，所述试剂是聚多巴胺-合成锂皂石(polydopamine-laponite)。所述试剂可以包括聚(ε-己内酯)-嵌段-聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](pcl-b-pdmaema)嵌段共聚物。这些试剂可以以微粒或薄片的形式提供。

有利地，本方法还包括在施用该试剂之前将患者暴露于核酸的步骤。通常，在施用该试剂之前，患者已经暴露于核酸。

通常，核酸是病原体衍生的或从患者的死亡或受损细胞释放的。该方法进一步包括通过测量患者体内的tnf-α(肿瘤坏死因子-α)或il-6(白介素6)的产生来检测对tlr3或tlr9的激活的抑制，通过测量tnf-α或ifn-α的水平来检测对tlr3或tlr9的激活的抑制、使用受体细胞(涉及poly(i:c)或cpg)检测对tlr3或tlr9的激活的抑制，或者通过测量il-1β的产生或caspaseip20表达来检测对aim2的激活的抑制。

所述试剂的施用导致患者的急性炎症反应减少，并且所述试剂不影响脂多糖介导的炎症。该试剂的施用可用于治疗患有选自类风湿性关节炎、脊髓损伤、牛皮癣、系统性红斑狼疮、炎性肠病、外伤性脑损伤、传染病、心血管疾病、癌症细菌性败血症、多发性硬化症、慢性阻塞性肺疾病和肥胖症的疾病的患者。

本方法还可以通过向有需要的患者施用本文公开的一种试剂来预防或抑制血栓性疾病的发展，其中，所述试剂结合负责引发该疾病或使该疾病发展的核酸。以实现所述预防或抑制的量和条件施用该试剂。在附图和本文的详细描述中阐述了本发明的优选实施例的细节。在了解了本发明的这些细节的情况下，许多其他的创新和改变对于本领域的普通技术人员而言将变得显而易见并且可实施。

附图说明

通过以下结合附图的详细描述，本发明构思的其他特征、其性质和各种优点将更加明显：

图1示出：(a)使用由mtt阵列测试的pcl-g-pamam的raw264.7鼠巨噬细胞的细胞活力；(b)通过ramos-blue^tm报告细胞测试的pcl-g-pamam的tlr9抑制作用；(c)和(d)pcl-g-pamam抑制滑液衍生的原代巨噬细胞分泌tnf-α或ifn-α的活性。

图2：(a)图像显示了在整个cia模型大鼠中pcl-g-pamam荧光信号的演变；(b)和(c)图像显示了pcl-g-pamam荧光信号在器官中的分布。(b)注射后2h和(c)注射后9h。1-胸腺；2-心脏；3肺；4-肝；5和6-肾脏；7-胰腺；8-脾；9-膀胱；10和11-前爪；12和13-后爪。

图3显示了在cia模型大鼠中阳离子树枝化聚合物的体内抗炎活性。(a)分析pcl-g-pamam抗炎活性的实验时间表的示意图；(b)ra模型大鼠、384-g2(pcl-g-pamam-1)和384-g3(pcl-g-pamam-2)处理的大鼠(n＝6-9)，在首次免疫后13天的平均疾病评分，两种聚合物均通过静脉内注射，每天20mg/kg；(c)对照组、cia模型组、384-g3和384-g2治疗组的左后爪踝关节的micro-ct图像；(d)对照组、cia模型组、384-g3和384-g2治疗组左后爪的踝关节的h&e染色图像。

图4：(a)ζ电位；(b)合成锂皂石(la)、多巴胺改性的合成锂皂石(la-da)、pei接枝的合成锂皂石(la-da-pei)的直径；(c)由mtt阵列在小鼠胚胎成纤维细胞上测试的使用la-da-pei的细胞活力。

图5：上图：(a)通过ramos-blue^tm报告细胞测试的la-da-pei的tlr3抑制作用。下图：polya：t和基因组dna对正常人原代角质形成细胞的aim2激活以及pcl-g-pamam的aim2抑制作用。

图6：通过ramos-blue^tm报告细胞测试的la-da-pei的tlr9抑制作用。

图7：(a)通过mtt阵列在小鼠胚胎成纤维细胞上测试的使用pcl-b-pdmaema嵌段共聚物微颗粒(mp)的细胞活力；(b)由ramos-blue^tm报告细胞测试的mp的tlr9抑制作用。

图8：(a)通过picogreen阵列测试的暴露于含有不同浓度的mp的50μmh2o2并持续24h的人星形胶质细胞和小胶质细胞上清液中的dna水平；(b)通过elisa阵列测试的暴露于含有不同浓度的mp的50μmh2o2并持续24h的人星形胶质细胞和小胶质细胞上清液中的tnf-α水平。

具体实施方式

在整个说明书中，本文提供的优选实施方案和实施例应被认为是示例性的，而不是对本发明的限制。

现在，本发明提供了新的阳离子核酸清除剂，包括水溶性阳离子聚合物、阳离子纳米颗粒和阳离子微粒，作为抗炎剂，优选在药学上可接受的组合物中。这些试剂是对美国专利号9,468,650b2中公开的试剂的改进，因此该专利因其相关和共有特征的公开而通过引用而全文并入本文。

现在，可以用具有强核酸结合亲和力和低毒性的阳离子材料治疗由核酸引起的炎症，例如多种核酸感应prr的激活。本发明提供了一种更有效和安全的方法来治疗由病原性核酸引起的炎症。上述阳离子材料，即阳离子核酸清除剂，去除了病原性核酸，从而抑制炎症而不干扰正常的细胞免疫功能。

本文公开的三种类型的阳离子核酸清除剂可以有效地抑制针对核酸的炎性反应的激活，以治疗各种炎性疾病。常见的prr抑制剂可导致免疫抑制和感染风险增加，因为常见的prr抑制剂可完全阻断特定prr的正常功能。细胞中核酸感受器的冗余也可能极大损害典型prr抑制剂的治疗效果。核酸清除剂可以防止多种核酸感应prr的同时激活且不干扰细胞的正常免疫功能。因此，本文公开的阳离子核酸清除剂可以在自身免疫性疾病、移植免疫和损伤后炎症中通过靶向由核酸诱发的炎症反应来用作抗炎剂，例如用于治疗类风湿性关节炎、脊髓损伤、牛皮癣、系统性红斑狼疮、炎症性肠病和外伤性脑损伤的抗炎剂。

prr是免疫系统的关键组成部分，可提供自我保护以保护身体免受有害刺激(例如病原体和受损细胞)的侵害。各种prr，包括rig-i样受体(rlr)、dsrna依赖性蛋白激酶r(pkr)、irf的dna依赖性激活剂(dai)和tlr，都可以识别病原体和受损细胞的多种产物pamp和damp(lotzeetal，immunol.reviews220：60-81(2007))。tlr在宿主先天和后天免疫以及各种疾病(包括传染病、炎性疾病和自身免疫性疾病)的发病机理中起着核心作用。tlr3、tlr7、tlr8和tlr9位于核内体中，并可以被微生物和宿主核酸激活。aim2(黑色素瘤2中不存在)通过有助于抵抗细菌和病毒dna参与炎症反应。

本发明的水溶性阳离子聚合物是一系列水溶性树枝化聚合物，其包含聚酯主链和树枝状阳离子侧链。水溶性树枝化聚合物的聚酯主链是通过聚(α-溴-3-己内酯)的叠氮化反应合成的。水溶性树枝化聚合物的树枝状阳离子侧链是含有炔丙基核的树枝状聚酰胺胺侧链。树枝化聚合物对核酸具有高结合亲和力和低细胞毒性，可用作抗炎药，在清除核酸方面具有优势，例如是有效抑制多种核酸感受器激活的试剂。在一个实施例中，本发明的水溶性树突化聚合物可以有效抑制b细胞、人原代角质形成细胞和人胚肾293细胞中多种核酸感应prr(包括tlr3、tlr9和aim2)的激活。

本发明的阳离子纳米粒子是包括阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石的聚阳离子接枝纳米粒子，其表面积大且电荷密度高，在清除核酸方面具有优势。合成锂皂石是类似于合成近晶粘土的合成层状硅酸盐，在中性ph下可降解成无毒产品。本发明的阳离子纳米颗粒对核酸具有高结合亲和力，其可以用作在清除核酸方面提供优势的抗炎剂，例如是有效抑制多种核酸感应prr激活的试剂。在一实施例中，阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石可有效抑制病原性核酸诱发的b细胞的激活。

本发明的阳离子微粒是通过聚(ε-己内酯)-嵌段-聚[甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯](pcl-b-pdmaema)的自组装而生成的嵌段共聚物。该微粒的相对较大的尺寸防止了本发明的阳离子微粒被免疫细胞内化。因此，本发明的阳离子微粒提供了在炎症部位连续清除核酸而不被周围的细胞内化的优点。特别地，本发明的阳离子微粒具有较高的电荷密度和较低的全身毒性的优点，这有利于减少涉及将免疫细胞募集到局部损伤部位的快速、广泛的免疫激活。本发明的阳离子微粒对核酸具有高结合亲和力，其可用作抗炎剂，在清除核酸方面具有优势，例如是有效抑制多种核酸感应prr激活的试剂。在一实施例中，本发明的阳离子微粒可有效抑制病原性核酸对b细胞的激活和h2o2诱发的细胞损伤对小胶质细胞的激活。另外，通过腹膜内注射、皮下注射或口服递送，阳离子微粒在小鼠中高达200mg/kg都没有表现出显着的体内毒性。

有利地，本发明的阳离子核酸清除剂对以kd表示的核酸的结合亲和力在pm至μm的范围内，优选小于或等于3×10⁸m^-1；用结合常数(k)表示，结合亲和力有利地等于或大于7×10⁸m^-1，优选等于或大于5×10⁹m^-1。因此，与序列无关的阳离子核酸清除剂的结合亲和力可以是例如约7×10⁹m^-1。“k”和“kd”可以通过本领域已知的方法来确定，包括表面等离振子共振、例如biacore的实时结合测定法或等温滴定量热法(itc)。

本发明优选的阳离子核酸清除剂同时限制了包括tlr3、tlr9和aim2在内的多种prr的激活。

本发明还提供一种控制(抑制或预防)与多种tlr(包括tlr3、tlr9和aim2)激活相关的自身免疫和/或炎症反应的方法。这种反应在与患者循环中游离核酸的存在相关的疾病/病症的发病中起作用，游离核酸可以是病原体衍生的(例如，病毒或细菌衍生的)核酸或从死亡或受损的宿主细胞释放的核酸。使用本发明的阳离子核酸清除剂可以治疗的特定疾病/病症包括类风湿性关节炎、脊髓损伤、牛皮癣、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、外伤性脑损伤、传染病、心血管疾病、癌症细菌败血症、多发性硬化症、慢性阻塞性肺疾病和肥胖症。

本发明阳离子核酸清除剂的另一发明是抵消从细胞释放并随后诱发血栓形成的dna和rna分子的作用(kannemeieretal，proc.natl.acad.sci.104：6388-6393(2007)；fuchsetal，proc.natl.aad.sci.publishedonlinebeforeprintaug.23，2010)。由于本文所述的阳离子核酸清除剂可以结合rna和dna分子并将其与其他潜在的结合对象屏蔽，因此可以使用此类核酸清除剂来抑制dna和rna分子结合并激活凝血因子和血小板的能力，从而限制核酸引起的病理性血液凝固。因此，本文所述的核酸清除剂代表了用于防止多种血栓性疾病(包括心肌梗塞、中风和深静脉血栓形成)的诱发和发展的新实体。

本发明的阳离子核酸清除剂或其药学上可接受的盐可以通过任何途径给予患者，只要在例如血流中达到有效水平。最佳剂量方案将取决于例如阳离子核酸清除剂、患者和所寻求的效果。通常，阳离子核酸清除剂将通过口服、经皮、iv、im、ip或sc给药。当癌症是要治疗的疾病时，阳离子核酸清除剂还可以例如直接施用于靶部位，例如直接施用于肿瘤(例如脑肿瘤)。有利地，一旦出现临床症状就施用该核酸结合剂，并根据需要重复施用。

可以将本发明的阳离子核酸清除剂或其药学上可接受的盐与载体、稀释剂或赋形剂一起配制以产生药物组合物。本发明的组合物的精确性质将至少部分取决于核酸结合剂的性质和给药途径。最佳剂量方案可以由本领域技术人员容易地建立，并且可以随核酸结合剂、患者和所寻求的效果而变化。

应当理解，本发明的治疗方法在人类医学和兽医学领域都是有用的。因此，待治疗的患者(受试者)可以是哺乳动物，优选是人类。针对兽医的目的，受试者可以是例如农场动物，例如牛、猪、马、山羊或绵羊、或诸如狗或猫的宠物。

本发明还涉及识别适用于上述方法的核酸结合剂的方法，所述方法包括：i)在存在和不存在测试试剂的情况下，将含有prr的细胞与第一prr激动剂一起培养，ii)获得来自步骤(i)的培养物的上清液样品；iii)分析样品中是否存在由prr激活引发的细胞内信号传导事件的产物，以及iv)用具有与第一激动剂不同的序列、结构或化学性质的第二prr激动剂重复步骤(i)-(iii)；其中，以与所使用的prr激动剂的序列、结构或化学性质无关的方式抑制prr激动剂激活的测试试剂是候选的核酸结合剂。

示例

下列示例说明了本发明的优点和优势。

示例l：水溶性树枝化聚合物的产生

本发明的水溶性阳离子聚合物是一系列水溶性树枝化聚合物，其包含聚酯主链和树枝状阳离子侧链。通过将α-溴-3-己内酯的开环聚合而得到的聚(α-溴-3-己内酯)叠氮化来合成水溶性树枝化聚合物的聚酯主链。水溶性树枝化聚合物的树枝状阳离子侧链是含有炔丙基核的树枝状聚酰胺胺侧链，其是通过发散合成法从核中组装并通过一系列反应向外延伸而合成的。随后，通过合成的聚酯主链与合成的树枝状阳离子侧链之间的点击反应，生成本发明的水溶性树枝化聚合物。聚(α-溴-3-己内酯)的聚合度可以为70至400。接枝到聚合物上的pamam树枝状聚合物侧链可以为50％至100％。pamam的生成可以是1到3。每个重复单元中的氨基可以是2到8。

如图1所示，测试了pcl-g-pamam(聚(ε-己内酯)-接枝的聚(酰胺胺))清除核酸和治疗类风湿性关节炎的用途。图1-(a)显示了使用mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑鎓溴化物)阵列测定的使用pcl-g-pamam的raw264.7鼠巨噬细胞的细胞活力。图1-(b)显示了由ramos-blue^tm报告细胞(购自invivogen，ramos-blue^tm细胞是稳定表达可诱发nf-κb/ap-1的seap(分泌的胚胎碱性磷酸酶)报告基因)的b淋巴细胞系)测试的pcl-g-pamam的tlr9抑制作用。图1-(c)显示了在抑制滑液衍生的原代巨噬细胞的tnf-α分泌中pcl-g-pamam的活性。图1-(d)显示了在抑制滑液衍生的原代巨噬细胞的ifn-α分泌中pcl-g-pamam的活性。图2显示了在整个cia(胶原诱发的关节炎)模型大鼠中pcl-g-pamam的荧光信号的演变。图2中的图像显示了在两个时间点(2小时和9小时)注射后在不同器官中pcl-g-pamam的荧光信号的分布。图3显示了在cia模型大鼠中阳离子树状化聚合物的体内抗炎活性。使用两种pcl-g-pamam聚合物测试抗炎活性，即，384-g2(pcl-g-pamam-1、pcl384-g-pamam第二代)和384-g3(pcl-g-pamam-2、pcl384-g-pamam第三代)。每天通过静脉内注射20mg/kg剂量的两种聚合物。

示例2：聚阳离子接枝的纳米颗粒的产生

本发明的阳离子纳米粒子是聚阳离子接枝的纳米粒子，其包括通过多巴胺介导的合成锂皂石的表面改性而合成的阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石。合成锂皂石是类似于合成近晶粘土的合成层状硅酸盐，其在中性ph下可降解成无毒产品。为了将聚多巴胺引入到合成锂皂石的表面，将多巴胺添加到含有合成锂皂石的碱性溶液中。阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石是通过聚乙烯亚胺(pei)和聚多巴胺之间的michael加成反应生成的。通过离心除去未反应的pei和聚多巴胺，并反复洗涤。改性后，合成锂皂石的ζ电位从-40mv显着增加至30mv，表明合成锂皂石的改性。合成锂皂石可以改变为任何其他无机颗粒，包括石墨烯、介孔二氧化硅纳米颗粒、或海泡石。图4a和4b显示了合成锂皂石(la)、多巴胺改性的合成锂皂石(la-da)和pei接枝的合成锂皂石(la-da-pei)的ζ电位和直径。图4c显示了通过mtt阵列测试的la-da-pei在小鼠胚胎成纤维细胞上的细胞活力。

示例3：阳离子微粒的产生

本发明的阳离子微粒是通过聚(ε-己内酯)-嵌段-聚[甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯](pcl-b-pdmaema)的自组而合成的嵌段共聚物。在搅拌的同时，将甲醇(pdmaema的选择性溶剂)逐渐添加到含有pcl-b-pdmaema的thf(四氢呋喃)溶液中。在完成甲醇的添加后立即使溶液静置至少1小时。随后，将溶液用水透析3天。(wangetal.，afacilewaytopreparecrystallineplateletsofblockcopolymersbycrystallization-drivenself-assembly，polymer，54(25)，page6760，2013)。

示例4：水溶性树枝化聚合物对核酸感受器激活的抑制

示例1中制备的水溶性树枝化聚合物可以有效地抑制b细胞、人原代角质形成细胞和人胚肾293细胞中多种核酸感受器(包括tlr3，tlr9和aim2)的激活。

为了tlr9抑制，将10μl的20μg/ml的cpgodn(cpg寡脱氧核苷酸，短单链合成dna分子，其含有胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(“c”)以及跟随其后的鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(“g”)；“p”指的是相继核苷酸之间的磷酸二酯链接)和10μl的不同浓度的聚合物溶液加入96孔板中的180μl的ramos-blue^tm细胞悬液(2x10⁶个细胞/ml)(ramos-blue^tm细胞为b细胞)中。对照组中，使用pbs(磷酸盐缓冲盐水)代替聚合物溶液。在将板在37℃、5％co2条件下的培养箱中培养24小时后，将160μl的quanti-blue^tm(购自invivogen，quanti-blue^tm是一种比色酶分析法，旨在确定诸如细胞培养物的上清液的生物样品中的任何碱性磷酸酶活性(ap))添加到96孔板中的40μl的细胞上清液中，并在37℃下培养1.5小时。分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)水平通过板读取装置在620nm处测定。对于tlr3抑制，使用tlr3激动剂poly(i:c)(聚肌苷酸：聚胞苷酸)代替cpgodn。图5的上图显示了由ramos-blue^tm报告细胞测试的la-da-pei的tlr9和tlr3抑制作用。

在正常人原代角质形成细胞上进行了aim2激活。首先用ifn-γ(100ng/ml)和tnf-α(10ng/ml)灌注正常人原代角质形成细胞24小时。然后用脂质体rnaimax以4μg/ml转染poly(da:dt)或人类基因组dna。聚合物同时以20μg/ml添加poly(da:dt)。通过il-1β水平监测aim2的激活。通过elisa阵列监测il-1β水平。图5的下图显示了polya:t和基因组dna对正常人原代角质形成细胞的aim2激活作用，以及pcl-g-pamam的aim2抑制作用。

示例5：阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石对核酸感受器激活的抑制作用

示例2中制备的阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石可有效抑制病原性核酸诱发的b细胞的激活。对于tlr9抑制，将10μl的cpgodn(20μg/ml)和不同的浓度的10μl的阳离子聚多巴胺接枝的合成锂皂石溶液添加到在96孔板中的180μl的ramos-blue^tm细胞悬浮液(2x10⁶个细胞/ml)(ramos-blue^tm细胞为b细胞)中。在对照组中，使用pbs代替聚合物溶液。将板在37℃、5％co2条件下的培养箱中培养24小时后，将160μl的quanti-blue添加到96孔板中的40μl的细胞上清液中，并在37℃培养1.5h。分泌的胚胎碱性磷酸酶(seap)水平通过板读取装置在620nm处测定。图6显示了由ramos-blue^tm报告细胞测试的la-da-pei的tlr9抑制作用。

示例6：pcl-b-pdmaema嵌段共聚物微粒对核酸感受器激活的抑制作用

示例3中制备的pcl-b-pdmaema嵌段共聚物微粒可有效抑制病原性核酸对b细胞的激活和h2o2诱发的细胞损伤对小胶质细胞的激活。如前所述，使用ramos-blue^tm报告细胞测试tlr9激活。图7显示了：(a)使用mtt阵列在小鼠胚胎成纤维细胞上测试的使用pcl-b-pdmaema嵌段共聚物微粒(mp)的细胞活力；(b)由ramosblue^tm报告细胞测试的mp的tlr9抑制作用。

关于h2o2诱发的细胞损伤引起的小胶质细胞激活，将人星形胶质细胞和小胶质细胞共培养并暴露于50μm的h2o2中24h。为了抑制随后的na诱发的炎症，将不同浓度的mp加入上清液中。分别通过picogreen阵列和elisa阵列监测dna和tnf-α水平。图8显示了：(a)通过picogreen阵列检测的在不同浓度的mp下暴露于50μm的h2o2中24小时的人星形胶质细胞和小胶质细胞的上清液中的dna水平；(b)通过elisa阵列检测的在不同浓度的mp下暴露于50μm的h2o2中24小时的人星形胶质细胞和小胶质细胞上清液中的tnf-α水平。

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