本发明是关于(载体)疫苗领域,且特别地是关于用于通过含有所关注外源性基因的副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒来表达该外源性基因的核苷酸序列的增强布置。本发明另外是关于适于表达所关注基因,尤指抗原编码序列的相关表达盒及载体。本发明的该等病毒载体可用于产生免疫原性组合物或疫苗。
背景技术:
副粘病毒科的副粘病毒是造成许多流行动物及人类疾病的负义、单链、rna病毒。副粘病毒的实例是感染家禽及其他禽类物种的新城疫病毒(newcastlediseasevirus)或引起人类疾病的麻疹病毒。该等病毒当前包括49个物种且分成7个属,其中麻疹病毒(morbillivirus)属具有7个物种。
犬瘟热(cd)是狗及其他动物的高度感染性发热疾病。其死亡率较高,介于30%与80%之间。患有cd的狗通常具有永久性中枢神经系统损害。cd的确立病因是感染副粘病毒科的成员-麻疹病毒属(称为cd病毒(cdv))。一般而言,副粘病毒是含有18-20kb单链负极性rna基因组的包膜病毒。该基因组编码5至7个结构蛋白,该等结构蛋白包含融合(f)及血凝素-神经胺酸酶(hn)或血凝素(h)糖蛋白。膜糖蛋白血凝素(h)负责将病毒附接至宿主细胞,且融合糖蛋白(f)引起病毒与感染细胞之间或感染细胞与相邻未感染细胞之间的膜融合。
副粘病毒科成员的基因组末端由基因外区域(称为3′-前导体(leader)及5′-尾随体(trailer))组成:3′-前导体区域含有基因组启动子,且尾随体编码反基因组(其是全长正义复制中间体)的3′端且含有反基因组启动子。每一基因始于保守基因起始(gs)序列且止于保守基因末端(ge)序列。转录始于3′-前导体区域且以依序方式通过起止机制继续进行,个别基因通过该机制转录成个别、单独mrna。通过非编码基因间序列(igs)来分离基因,该等序列对于一些属(呼吸道病毒(respirovirus)、麻疹病毒及亨尼病毒(henipavirus))而言在不同基因接头处长度及序列保守且对于其他属(腮腺炎病毒(rubulavirus)、禽腮腺炎病毒(avulavirus)、肺炎病毒(pneumovirus)及间质肺炎病毒(metapneumovirus))而言序列或长度不保守。
对于cdv而言,发现f及h糖蛋白存在于病毒包膜中及感染细胞表面上。通过自使用其他麻疹病毒成员的分析进行推断,cdvf及h糖蛋白似乎对于cdv感染及其免疫生物学较为重要且是必要的。已研发基于痘病毒的重组cdv疫苗来保护及治疗狗(us5,756,102)。美国专利申请案ussn09/587,964揭示基于dna质粒的表达cdv抗原的疫苗。
wang等人(vaccine30:5067–5072(2012))已通过使用反向基因学生成表达狂犬病毒糖蛋白的重组cdv疫苗菌株。
然而,实践中可见的缺点在于,此一病毒菌株(可能通过重复非编码区序列之间的同源重组介导)可随时间失去插入基因。
因此,强烈需要容许将外来遗传稳定插入副粘病毒科病毒基因组的表达系统。
另外,犬瘟热病毒及犬细小病毒(cpv)是犬科动物及其他肉食性动物中具有全球分布的两种主要病原体。该两种病毒在肉食性动物群体中的流行病学及其成功控制高度取决于易感宿主的主动免疫化。接种疫苗方案最通常包括使用尤其含有减毒活犬细小病毒及犬瘟热病毒组分的多价疫苗。然而,成功免疫化取决于年龄类别、先前免疫状态及母源免疫性的存在。强烈需要寻找抵抗犬科动物的主要病原体(例如犬瘟热病毒及犬细小病毒)的改良疫苗。
技术实现要素:
通过说明及申请专利范围中所描述的实施例来达成上述技术问题的解决方案。
因此,根据申请专利范围来实施不同方面的发明。
本发明是基于以下令人吃惊的发现,将包括在5′端侧接有cdv病毒中核蛋白(n)基因的5′非编码区的外来基因的表达盒插入cdv病毒基因组的磷蛋白(p)基因与基质蛋白(m)基因之间(参见图1)会产生容许即使在长时间段内亦容纳、维持及表达外来基因的病毒载体。此容许生成遗传稳定的基于转基因副粘病毒科的载体(例如基于cdv的载体)。
在第一方面中,本发明由此提供用于插入副粘病毒科病毒的两个相邻必需基因(1;2)之间的表达盒,该插入使得第一基因(1)位于表达盒的3′方向上且第二基因(2)位于5′方向上,其中该表达盒包括
-第一核苷酸序列,其中该第一核苷酸序列是所关注核苷酸序列,及
-第二核苷酸序列,其侧接于第一核苷酸序列的5′端,其中该第二核苷酸序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群。
本发明表达盒优选是rna分子。优选地,该表达盒是经分离表达盒。
本发明表达盒优选地进一步包括
-第三核苷酸序列,其侧接于第一核苷酸序列的3′端,其中该第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群。
在一具体方面中,本发明使用cdv的莱德利(lederle)疫苗菌株(以登录号vr-128寄存于atcc)作为骨架(由基因库登录号dq903854.1、ay288311或ay286480代表的基因型)或使用其至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的相同序列(例如来自通过其其他传代衍生的病毒(例如犬瘟热病毒,莱德利无毒,目录号nr-3845,biodefenseandemerginginfectionsresearchresourcesrepository,p.o.box4137,manassas,va20108-4137,usa)。
图2中的质粒图例示性展示用以生成本发明载体的dna构建体。
本发明载体尤其可用于对哺乳动物,尤指猪接种疫苗。
本发明另外是关于用于针对cdv及另一病毒(尤其cdv及另一犬病毒(例如cpv))进行双重免疫化的载体。此双重免疫化载体表达来自载体骨架的cdv抗原及作为转基因插入的其他犬抗原(例如cpvvp2)。
本发明由此还提供包括所关注异源性rna序列的犬瘟热病毒(cdv)载体,该所关注异源性rna序列优选地位于cdv的p基因与m基因之间,且其中该所关注异源性rna序列编码犬细小病毒(cpv)vp2蛋白。
另外,本发明涵盖用于在猪中诱导针对猪流感病毒或猪流行性腹泻病毒的免疫反应的载体。因此,在本发明的上下文中,还提供包括具有异源性rna序列的表达盒的副粘病毒科病毒载体,该异源性rna序列编码猪流感病毒的h3-亚型血凝素或猪流行性腹泻病毒的纤突蛋白(spikeprotein)。
本发明另外是关于包括该等载体的哺乳动物宿主细胞及使用该等宿主细胞生成载体疫苗的方法以及包括本发明的cdv载体的免疫原性组合物及疫苗。
具体实施方式
本发明解决了先前技术中的固有问题且提供最新技术的显著进步。
本发明通过活体外数据展示根据本文提供的示例内容所产生编码2b或2ccpv基因型vp2蛋白的cdv重组体(亦即cdv载体)的探究。该等病毒关于vero细胞中的产生展示良好生长动力学,且在滚瓶中于感染后6天达到峰效价。该等重组体展示转基因(vp2)的强表达特性,如通过免疫荧光及蛋白印迹所测定,此特性将该等重组体量化为双重cdv-cpv疫苗候选物。另外,在vero细胞中针对20个细胞传代测试该等病毒的遗传稳定性。两种病毒保持完全遗传稳定,从而指示其易于进行疫苗生物处理。
本发明通过活体内结果进一步证实,本发明cdv载体可复制于猪宿主中,从而靶向淋巴细胞。通过对各种器官采样并测试,在接种疫苗动物的淋巴结的脾或扁桃体中检测病毒。重要的是,所有前哨动物皆保持血清阴性直至研究结束,从而指示重组cdv病毒在接种疫苗后并不在动物之间扩散。
关于效能,使用针对犬细小病毒2血清转化的cdv-vp2(如通过cpv病毒中和测试所量测)对所有动物接种疫苗。在第2接种疫苗的后检测到中和抗体效价的特定增加(参见图6)。中和抗体在第二免疫化的后21天的含量达到1:40至1:400的值,根据文献,此含量代表真实宿主(犬科动物)中的保护效价范围(glover等人,2012;taguchi等人,2011)。
另外,使用编码猪流感病毒的h3-亚型血凝素(h3)的本发明cdv载体使得在h3n2-母源抗体阳性(h3n2-mda阳性)仔猪中产生活性免疫性,尽管存在该被动存在的母体免疫性。
另外,将编码猪流行性腹泻病毒(pedv)的纤突蛋白的本发明cdv载体经鼻内施用母猪,然后经由抗体阳性初乳摄入仔猪发生被动免疫化,如通过在使用pedv攻击的后临床体征、致命性及病毒脱落的发生率或严重程度有所减小可见。
通常,本发明提供用于插入副粘病毒科病毒的两个相邻必需基因(1;2)之间的表达盒(在下文中亦称为“本发明表达盒”),该插入使得第一基因(1)位于表达盒的3′方向上且第二基因(2)位于5′方向上,其中该表达盒包括
-第一核苷酸序列,其中该第一核苷酸序列是所关注核苷酸序列,及
-第二核苷酸序列,其侧接于第一核苷酸序列的5′端,其中该第二核苷酸序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群,及
-第三核苷酸序列,其侧接于第一核苷酸序列的3′端,其中该第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群。
优选地,该第三核苷酸序列由以下组成:
-选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的3′非编码区,及
-侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中侧接于该3′非编码区的5′端的该序列编码用于开始或增强翻译的共有序列,且其中该用于开始或增强翻译的共有序列视情况是kozak序列。
根据另一优选方面,本发明表达盒由以下组成:
-该第一至第三核苷酸序列,及
-侧接于第二核苷酸序列的5′端或侧接于该第三核苷酸序列的3′端的另一核苷酸序列,其中该另一核苷酸序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。
副粘病毒科病毒的该两个相邻基因(1;2)优选地选自由副粘病毒科病毒的必需基因组成的群,和/或
副粘病毒科病毒的其他必需基因是
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、h及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、hn及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、g及l基因。
根据一示例性实施方式,本发明提供用于插入副粘病毒科病毒的p基因与m基因之间的表达盒,其中
-该由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的p基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的n、m、f、h及l基因组成的群,且
-该由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的m基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的h、p、f、l及n基因组成的群。
优选地,该第二核苷酸序列是选自副粘病毒科病毒中位于表达盒的3′方向上的必需基因的基因的5′非编码区,不包含第一基因(1)的5′非编码区,和/或
该第三核苷酸序列包括副粘病毒科病毒中位于表达盒的5′方向上的必需基因的3′非编码区或由其组成,不包含第二基因(2)的3′非编码区。
根据另一优选方面,本发明表达盒的该第一核苷酸序列可操作地连接至该第三核苷酸序列中所包含的基因起始(gs)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。
本发明表达盒的该第一至第三核苷酸序列及该另一核苷酸序列优选是rna序列,从而该第一核苷酸序列然后是第一rna序列,该第二核苷酸序列是第二rna序列,该第三核苷酸序列是第三rna序列,且该另一核苷酸序列是另一rna序列。
在一实例中,本发明表达盒包括
-第一rna序列,其中该第一rna序列是所关注rna序列,及
-第二rna序列,其侧接于第一rna序列的5′端,其中该第二rna序列是副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区,及
-第三rna序列,其侧接于第一rna序列的3′端,其中该第三rna序列由以下组成:
-选自由以下组成的群的基因的3′非编码区:副粘病毒科病毒的血凝素(h)基因、副粘病毒科病毒的磷蛋白(p)基因、副粘病毒科病毒的融合蛋白(f)基因、副粘病毒科病毒的大聚合酶蛋白(l)基因及副粘病毒科病毒的核蛋白(n)基因,及
-侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中该侧接于该3′非编码区的5′端的序列编码kozak序列,及
-视情况另一侧接于第二核苷酸序列的5′端或侧接于该第三核苷酸序列的3′端的rna序列,其中该另一核苷酸序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。
出于阐释目的,如本文结合本文所提供的实例性具体序列所阐述rna序列的布置的示意图标在图3中给出。
优选地,本发明表达盒是非天然的和/或包含于经分离副粘病毒科病毒载体的基因中。
如本文所提及的副粘病毒科病毒尤其是麻疹病毒属病毒,且其中麻疹病毒属病毒优选地选自由以下组成的群:犬瘟热病毒(cdv)、猫麻疹病毒(femv)及小反刍兽疫病毒(pprv),且其中麻疹病毒属病毒最佳地是犬瘟热病毒(cdv)。举例而言,在cdv选择为副粘病毒科病毒的情形下,则下文所阐述的副粘病毒科病毒载体尤其是cdv载体。
根据另一方面,本发明另外是关于包括本发明表达盒的副粘病毒科病毒载体,且其中该副粘病毒科病毒载体亦在本文中称为“本发明的副粘病毒科病毒载体”。本发明的副粘病毒科病毒载体优选是经分离副粘病毒科病毒载体。
在一优选方面中,本发明是关于该副粘病毒科病毒载体或本发明表达盒,其中
-该5′非编码区是副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区,和/或
-该3′非编码区是副粘病毒科病毒的h基因的3′非编码区,
和/或其中该表达盒插入副粘病毒科病毒的p基因与m基因之间。
因此,本发明亦是关于包括插入副粘病毒科病毒的两个相邻必需基因(1;2)之间的rna序列的副粘病毒科病毒载体,该插入使得第一基因(1)位于该插入rna序列的3′方向上且第二基因(2)位于5′方向上,且其中该插入rna序列包括以下或由其组成:
-第一rna序列,其中该第一rna序列是所关注核苷酸序列,及
-第二rna序列,其侧接于第一rna序列的5′端,其中该第二rna序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群,及
-第三rna序列,其侧接于第一rna序列的3′端,其中该第三rna序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群。
优选地,该第一rna序列可操作地连接至该第三rna序列中所包含的基因起始(gs)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。
根据一尤佳方面,副粘病毒科病毒的该两个相邻基因(1;2)是选自由副粘病毒科病毒的必需基因组成的群:
和/或副粘病毒科病毒的其他必需基因是
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、h及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、hn及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、g及l基因。
根据另一优选方面,本发明的副粘病毒科病毒载体的该第三rna序列由以下组成:
-选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的3′非编码区,及
-侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中侧接于该3′非编码区的5′端的该序列编码用于开始或增强翻译的共有序列,且其中该用于开始或增强翻译的共有序列视情况是kozak序列。
在一实例中,其中副粘病毒科病毒的该两个相邻必需基因(1;2)是副粘病毒科病毒的p基因及m基因,且
-该由副粘病毒科病毒中除第一基因(1)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的p基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的n、m、f、h及l基因组成的群,且
-该由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的m基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的h、p、f、l及n基因组成的群。
在本发明的副粘病毒科病毒载体的背景中,优选地
-该第二核苷酸序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自副粘病毒科病毒中位于表达盒的3′方向上且除第一基因(1)外的必需基因,此特定而言意指并不个别地选择第一基因(1)的5′非编码区,和/或
-该第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自副粘病毒科中位于表达盒的5′方向上且除第二基因(2)外的必需基因,此特定而言意指并不个别地选择第二基因(2)的3′非编码区。
另外优选地,就本发明的副粘病毒科病毒载体而言,
-该5′非编码区是副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区,和/或
-该3′非编码区是副粘病毒科病毒的h基因的3′非编码区。
优选地,本发明的表达盒或副粘病毒科病毒载体特定而言包括
-第一rna序列,其中该第一rna序列是所关注rna序列,及
-第二rna序列,其侧接于第一rna序列的5′端,其中该第二rna序列是副粘病毒科病毒的核蛋白(n)基因的5′非编码区,及
-第三rna序列,其侧接于第一rna序列的3′端,其中该第三rna序列由以下组成:
副粘病毒科病毒的h、hn、f或l基因的3′非编码区,及
侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中该侧接于该3′非编码区的5′端的序列编码kozak序列。
根据另一优选方面,本发明的副粘病毒科病毒载体进一步包括
-侧接于第二rna序列的5′端的第四rna序列,其中该第四rna序列是副粘病毒科病毒的基因间序列,和/或
-侧接于第四rna序列的3′端的第五rna序列,其中该第五rna序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。
优选地,本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的该第三rna序列包括副粘病毒科病毒的h基因的3′非编码区或由其组成,和/或该表达盒优选地插入副粘病毒科病毒的p基因与m基因之间。
根据一尤佳方面,本发明亦是关于
(a)本发明表达盒,其包括
-第一rna序列,其中该第一rna序列是异源性或外源性所关注rna序列,及
-第二rna序列,其侧接于第一rna序列的5′端,其中该第二rna序列是cdv的n基因的5′非编码区,及
-第三rna序列,其侧接于第一rna序列的3′端,其中该第三rna序列由以下组成:
副粘病毒科病毒的h、hn、f或l基因的3′非编码区,及
侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中该侧接于该3′非编码区的5′端的序列编码kozak序列,
且其中该表达盒优选地进一步包括
-第四rna序列,其侧接于第二rna序列的5′端,其中该第四rna序列是cdv的基因间序列,或
-第五rna序列,侧接于第三rna序列的3′端,其中该第五rna序列是cdv的基因间序列,
且个别地,本发明亦是关于
(b)本发明的副粘病毒科病毒载体包括(a)的表达盒,其中此载体亦在本文中称为“本发明cdv载体”。
优选地,本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的该第一核酸序列可操作地连接至该第三rna序列中所包含的基因起始(gs)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。
在本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的背景中,该副粘病毒科病毒优选是cdv且cdv基因的该5′非编码区是选自由以下组成的群:
cdv的n基因的5′非编码区,其中cdv的n基因的5′非编码区优选地由与seqidno:1的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的p基因的5′非编码区,其中cdv的p基因的5′非编码区优选地由与seqidno:2的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的m基因的5′非编码区,其中cdv的m基因的5′非编码区优选地由与seqidno:3的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的f基因的5′非编码区,其中cdv的f基因的5′非编码区优选地由与seqidno:4的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的h基因的5′非编码区,其中cdv的h基因的5′非编码区优选地由与seqidno:5的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,及
cdv的l基因的5′非编码区,其中cdv的l基因的5′非编码区优选地由与seqidno:6的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
在本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的背景内,该副粘病毒科病毒优选是cdv且cdv基因的该3′非编码区是选自由以下组成的群:
cdv的h基因的3′非编码区,其中cdv的h基因的3′非编码区优选地由与seqidno:7的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的n基因的3′非编码区,其中cdv的n基因的3′非编码区优选地由与seqidno:8的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的p基因的3′非编码区,其中cdv的p基因的3′非编码区优选地由与seqidno:9的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的m基因的3′非编码区,其中cdv的m基因的3′非编码区优选地由与seqidno:10的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的f基因的3′非编码区,其中cdv的f基因的3′非编码区优选地由与seqidno:11的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,及
cdv的l基因的3′非编码区,其中cdv的l基因的3′非编码区优选地由与seqidno:12的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
优选地,本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的该第二核苷酸序列或该第二rna序列是cdv的n基因的5′非编码区,且其中cdv的n基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:1的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
就本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体而言,优选地
-选自由副粘病毒科病毒中除第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的该3′非编码区是cdv的h基因的3′非编码区,且其中cdv的h基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:7的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,和/或
-该侧接于该3′非编码区序列的5′端的序列编码长5至8个核苷酸的kozak序列,且其中kozak序列优选地由与seqidno:13的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
优选地,本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的该基因间序列是cdv的基因间序列,且其中cdv的该基因间序列优选地由与seqidno:14的序列至少66%相同的rna序列组成或包括该序列。
优选地,如本文在本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的背景中所阐述的该所关注核苷酸序列是所关注基因或抗原编码序列,和/或该所关注核苷酸序列优选是非天然和/或重组序列。
特定而言,该所关注核苷酸序列优选是重组和/或异源性和/或外源性序列。
该所关注核苷酸序列优选地编码来自致病原的抗原,其中致病原优选是能够感染宠物动物(例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物)或能够感染产食性动物(例如猪或牛)的致病原。
根据本发明的一优选方面,副粘病毒科病毒是能够感染第一生物科的动物的副粘病毒科病毒且所关注核苷酸序列编码来自能够感染该第一生物科的动物的致病原的抗原,且其中该致病原优选地不同于该副粘病毒科病毒。
该第一生物科的该动物优选地选自由以下组成的群:犬科动物、猫科动物及猪科动物,且其中该第一生物科的该动物最佳是犬类、猫类或猪类(例如狗、猫或猪)。
视情况,该能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒是cdv且该能够感染该第一生物科的动物的致病原是犬细小病毒(cpv)或,
视情况该能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒是拉帕丹密考克墨西哥病毒(lapiedadmichoacánmexicovirus)(lpmv)且该能够感染该第一生物科的动物的致病原是猪流感病毒(swiv)。
作为另一优选选择,该能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒是拉帕丹密考克墨西哥病毒(lpmv)且该能够感染该第一生物科的动物的致病原是猪流行性腹泻病毒(pedv)。
根据一尤佳方面,该所关注核苷酸序列编码来自犬细小病毒(cpv)、猫细小病毒(fpv)或猪流感病毒(swiv)的抗原。
作为另一优选选择,该所关注核苷酸序列优选地编码来自猪流行性腹泻病毒(pedv)的抗原。
该所关注核苷酸序列优选地编码
-原小病毒(protoparvovirus)衣壳蛋白,且其中该原小病毒衣壳蛋白优选地选自由以下组成的群:肉食性动物原小病毒1(cpv或fpv)衣壳蛋白、灵长类动物原小病毒1衣壳蛋白、啮齿类动物原小病毒1衣壳蛋白、啮齿类动物原小病毒2衣壳蛋白、有蹄动物细小病毒1(ppv)衣壳蛋白,或
-流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素和/或其中该流感病毒视情况选自由以下组成的群:流感a病毒、流感b病毒及流感c病毒,且其中流感a病毒优选地选自流感病毒h3n2、h3n1、h1n1、h1n2、h2n1、h2n3及h911的群。
作为另一优选选择,该所关注核苷酸序列编码冠状病毒纤突(s)蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白优选地选自由以下组成的群:羊驼冠状病毒(alpacacoronavirus)s蛋白、α冠状病毒(alphacoronavirus)1s蛋白、人类冠状病毒(humancoronavirus)229es蛋白、人类冠状病毒nl63s蛋白、猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)s蛋白、人类冠状病毒oc43s蛋白、人类冠状病毒hku1s蛋白、鼠类冠状病毒(murinecoronavirus)s蛋白、严重急性呼吸症候群相关冠状病毒(severeacuterespiratorysyndrome-relatedcoronavirus,sars-cov)s蛋白、中东呼吸症候群相关冠状病毒(middleeastrespiratorysyndrome-relatedcoronavirus,mers-cov)s蛋白及禽感染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,ibv)s蛋白。
特定而言,该所关注核苷酸序列编码
-犬细小病毒(cpv)vp2蛋白,且其中该cpvvp2蛋白优选地包括与seqidno:35的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成;或
-h3-亚型血凝素(h3),尤指猪流感病毒的h3,且其中该h3优选地包括与seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成。
作为另一优选选择,该所关注核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突(s)蛋白,且其中该pedvs蛋白优选地包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成。
更佳地,该所关注核苷酸序列编码
-犬细小病毒(cpv)vp2蛋白,且其中该编码cpvvp2蛋白的序列特定而言由与seqidno:15的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列;或
-h3-亚型血凝素(h3),优选地猪流感病毒的h3,且其中该编码h3的序列优选地由与seqidno:16的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
作为另一优选选择,该所关注核苷酸序列编码猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突(s)蛋白,且其中该编码pedvs蛋白的序列优选地由与seqidno:37或seqidno:38的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
根据本发明的另一优选方面,该表达盒由以下组成或该副粘病毒科病毒载体包括以下:
-具有与seqidno:17或seqidno:18的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸,或
-具有与seqidno:19或seqidno:20的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸。
作为另一优选选择,该表达盒由具有与seqidno:39或seqidno:40的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸组成或该副粘病毒科病毒载体包括该多核苷酸。
优选地,本发明的副粘病毒科病毒载体包括
-与seqidno:21的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列;或
-与seqidno:22的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列。
作为另一优选选择,本发明的副粘病毒科病毒载体包括与seqidno:41的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列。
根据另一优选方面,本发明的副粘病毒科病毒载体进一步包括
-第六rna序列,其侧接于第四rna序列的5′端,其中该第六rna序列由与seqidno:23的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,和/或
-第七rna序列,其侧接于第五rna序列的3′端,其中该第七rna序列由与seqidno:24的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
本发明另外提供犬瘟热病毒载体,其在本文中亦称为“双重cdv-cpv免疫化载体”,其中该载体包括所关注异源性rna序列,其中该所关注异源性rna序列优选地位于cdv的p基因与m基因之间,且其中该所关注异源性rna序列编码犬细小病毒(cpv)vp2蛋白,且其中该编码cpvvp2蛋白的序列视情况由与seqidno:15的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
且其中优选地该所关注异源性rna序列可操作地连接至位于该异源性rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列,其中该gs序列最佳地包含于cdv的h基因的外源性3′非编码区中;和/或连接至cdv的基因组启动子。
作为另一优选选择,该所关注异源性rna序列编码包括与seqidno:35的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的cpvvp2蛋白。
特定而言,双重cdv-cpv免疫化载体中的该所关注异源性rna序列可操作地连接至
-cdv的h基因的外源性3′非编码区,尤指其中所包含的gs序列,其中cdv的h基因的该外源性3′非编码区优选地侧接于该编码cpvvp2蛋白的所关注异源性rna序列的3′端,和/或
-cdv的基因组启动子。
本发明另外提供编码本发明表达盒或本发明的副粘病毒科病毒载体的核酸分子,其中该核酸分子优选是dna分子,且其中该核酸分子优选是经分离核酸分子。
另外,本发明提供dna分子,在下文中亦称为“本发明dna分子”,其中该分子包括
(i)编码所关注多肽的dna序列,
(ii)侧接于(i)中序列的3′端且与seqidno:25的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,
(iii)侧接于(i)中序列的5′端且与seqidno:26的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,及(iv)侧接于(iii)中序列的5′端且与seqidno:27的所选序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
本发明dna分子优选地进一步包括
(v)侧接于(ii)中序列的5′端且与seqidno:28的序列至少66%相同的dna序列,和/或
(vi)侧接于(iv)中序列的3′端且与seqidno:28的序列至少66%相同的dna序列。
优选地,本发明dna分子是经分离dna分子。
根据另一优选方面,本发明dna分子进一步包括
(vii)侧接于(v)中序列的3′端且与seqidno:29的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,和/或
(viii)侧接于(vi)中序列的5′端且与seqidno:30的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
优选地,(i)的序列是
-编码犬细小病毒(cpv)vp2蛋白的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:31的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,或
-编码h3-亚型血凝素(h3),优选地猪流感病毒的h3的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:32的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
作为另一优选选择,(i)的序列是编码pedvs蛋白的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:42或43的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
根据另一优选方面,本发明dna分子包括
-与seqidno:33的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,或
-与seqidno:34的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
作为另一优选选择,本发明dna分子包括与seqidno:44的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
本发明另外提供哺乳动物宿主细胞,其含有
-本发明表达盒,
-本发明的副粘病毒科病毒载体或本文所阐述的双重cdv-cpv免疫化载体,或
-本发明dna分子,
且其中该哺乳动物宿主细胞优选是经分离哺乳动物宿主细胞。
本发明还提供
-本发明表达盒,
-本发明的副粘病毒科病毒载体,或
-本发明dna分子
其用作药剂,优选地疫苗。
另外,在本发明的上下文中,提供包括本发明dna分子的dna构建体,其中该dna构建体尤其是dna载体(例如质粒)。本发明dna分子可插入其中的dna载体或质粒为本领域技术人员所了解。如本文所阐述的dna构建体优选是经分离dna构建体。如本文中所使用,术语“包括dna分子”特定而言理解为等效于术语“包括dna分子序列”。
另外,本发明提供本文所阐述dna构建体的rna转录物,其中该rna转录物优选是经分离rna转录物。
本发明还提供经本文所阐述的dna构建体转染的细胞,其中该细胞优选是经分离细胞。
另外,本发明提供经本文所提及的rna转录物转染的细胞,其中该细胞优选是经分离细胞。
优选地,细胞或哺乳动物宿主细胞分别是vero细胞。
另外,在本发明的上下文中,提供制备含有异源性基因的感染性副粘病毒科病毒,尤指用于制备本发明的副粘病毒科病毒载体的方法,其中该方法包括以下步骤:
a.提供表达异源性rna聚合酶的宿主细胞;
b.使用本文所阐述的dna构建体转染宿主细胞,且其中通过异源性rna聚合酶转录dna构建体中所包含的本发明dna分子,及
c.分离该等细胞所产生的病毒。
因副粘病毒科病毒具有负链rna基因组,故需要在经转染细胞中存在rna聚合酶,优选地t7rna聚合酶或由副粘病毒科病毒编码的rna聚合酶。最佳使用t7rna聚合酶。可(例如)通过共转染编码及表达rna聚合酶的质粒或通过使用rna聚合酶蛋白渗透细胞来提供存在于经转染细胞中的rna聚合酶。根据本发明,就此而言,使用产生rna聚合酶的转基因细胞尤佳,例如将dna构建体转染至表达t7聚合酶的bhk-21细胞中或转染至bsr-t7/5细胞中。或者,亦可使用编码rna聚合酶且在转染至宿主细胞中时翻译成rna聚合酶的mrna来转染细胞。
根据另一方面,本发明另外提供本发明的副粘病毒科病毒载体或本文所阐述细胞的用途,其用于制造免疫原性组合物或疫苗。
在再一方面中,本发明还提供免疫原性组合物,其在本文中亦称为“本发明的免疫原性组合物”,其中该免疫原性组合物包括
a.本发明的副粘病毒科病毒载体,其中该载体视情况是感染性和/或减毒病毒或其中该载体视情况是减毒和/或经修饰活病毒,及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包括多个由该载体表达的重组蛋白的病毒样颗粒,及
c.视情况医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,优选地该载剂适于口服、真皮内、肌内或鼻内施用。
优选地,该由载体表达的重组蛋白是
-细小病毒vp2抗原,例如cpvvp2蛋白,或
-流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素(例如h3)。
特定而言,应理解,本文所用的词组“由该载体表达”或“由载体表达”分别尤其等效于“表达于感染载体的细胞中”或“表达于感染该载体的细胞中”。
根据另一优选方面,本发明的免疫原性组合物包括以下或由其组成:
a.任一上文所提及编码cpvvp2蛋白的载体,且其中该载体优选是cdv载体,尤指本发明cdv载体或如本文所阐述的双重cdv-cpv免疫化载体,及
b.包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的多肽,其中该多肽优选是由该载体表达的重组蛋白,
c.及视情况医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,其中该载剂优选地适于口服、真皮内、肌内或鼻内施用。
作为另一优选选择,该由该载体表达的重组蛋白是冠状病毒s蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白视情况是尤其包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
本发明还提供疫苗或医药组合物,其在下文中亦称为“本发明的疫苗或医药组合物”,其中该疫苗或医药组合物包括
a.本发明的上下文中的本文所阐述的任一载体,及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包括多个由该载体表达的重组蛋白的病毒样颗粒,及
c.医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,其中该载剂优选地适于口服、真皮内、肌内或鼻内施用,且
d.视情况该疫苗进一步包括佐剂,
且其中该由载体表达的重组蛋白优选是
-细小病毒vp2抗原,例如cpvvp2蛋白,或
-流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素(例如h3)。
优选地,本发明的疫苗或医药组合物包括以下或由其组成:
a.任一上文所提及编码cpvvp2蛋白或流感病毒血凝素的载体,且其中该载体优选是cdv载体,尤指本发明cdv载体或如本文所阐述的双重cdv-cpv免疫化载体,及
b.包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的多肽,其中该多肽优选是由该载体表达的重组蛋白,及
c.医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,优选地该载剂适于口服、真皮内、肌内或鼻内施用,
d.及视情况选用的佐剂。
作为另一优选选择,该本发明的疫苗或医药组合物中所包含由该载体表达的重组蛋白是冠状病毒s蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白视情况是尤其包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
本发明另外提供制备用于减小一或多种与感染有关或由其引起的临床体征的发生率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的方法,其包括下列步骤:
a.使用本发明的上下文中的任一本文所阐述载体感染哺乳动物宿主细胞,
a.在适宜条件下培养感染细胞,
b.收集感染细胞培养物,
c.视情况纯化步骤c)的所收集感染细胞培养物
d.视情况混合该所收集感染细胞培养物与医药上可接受的载剂,
且其中该免疫原性组合物或疫苗优选地减小一或多种与以下感染有关或由其引起的临床体征的严重程度:
-cdv及cpv的感染,或
-流感病毒的感染,其中该流感病毒视情况选自由以下组成的群:流感a病毒、流感b病毒及流感c病毒,且其中流感a病毒优选地选自流感病毒h3n2、h3n1、h1n1、h1n2、h2n1、h2n3及h911的群。
作为另一优选选择,该免疫原性组合物或疫苗会减小一或多种与冠状病毒感染有关或由其引起的临床体征的严重程度,其中该冠状病毒视情况选自由以下组成的群:羊驼冠状病毒、α冠状病毒1、人类冠状病毒229e、人类冠状病毒nl63、猪流行性腹泻病毒(pedv)、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒hku1、鼠类冠状病毒、严重急性呼吸症候群相关冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸症候群相关冠状病毒(mers-cov)及禽感染性支气管炎病毒(ibv)。
本发明亦是关于
-本发明的免疫原性组合物或
-本发明的疫苗或医药组合物
其用于减小或预防动物中由至少一种病原体的感染引起的临床体征或疾病的方法中或用于治疗或预防动物中至少一种病原体的感染的方法中,优选地该动物是宠物动物(例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物)或产食性动物(例如猪),且其中至少一种病原体的该感染优选是
-cdv和/或cpv的感染,其中该感染最佳是cdv和/或cpv的感染,或
-猪流感病毒的感染,其中猪流感病毒视情况是亚型h3流感病毒,且其中该亚型h3流感病毒优选是亚型h3n2或h3n1的猪流感病毒。
作为另一优选选择,至少一种病原体的该感染是pedv感染。
特定而言,本发明亦是关于用于以下方法中的本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物:
-诱导动物,优选地犬中的针对cpv及cdv的免疫反应,或
-诱导猪中的针对猪流感病毒的免疫反应,其中猪流感病毒视情况是亚型h3流感病毒,且其中该亚型h3流感病毒优选是亚型h3n2或h3n1的猪流感病毒。
作为另一优选选择,本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物是用于在猪、尤佳地怀孕母猪中诱导针对pedv的免疫反应的方法中。
在一方面中,本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物是用于减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法中,其中仔猪拟通过已施用免疫原性组合物的母猪来哺乳,且其中该母猪优选是在该母猪已怀孕,尤指怀有该仔猪的同时已施用免疫原性组合物的母猪。
根据本发明的一尤佳方面,在该用途中,本发明的免疫原性组合物或疫苗或本发明的医药组合物拟经黏膜,优选地经鼻内(例如)施用该母猪。
另外,本发明提供对动物(例如宠物动物,例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物;或产食性动物,包含猪)针对由该动物中的至少一种病原体引起的临床疾病实施免疫的方法,该方法包括向动物施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物的步骤,其中该免疫原性组合物或疫苗不会引起感染临床体征,但能够诱导针对病原性形式的该至少一种病原体使动物免疫化的免疫反应,且其中该至少一种病原体优选是cdv或cpv或swiv或最佳地cdv及cpv。
本发明另外提供在母猪中诱导产生pedv特异性抗体的方法,其中该方法包括向该母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物,该等组合物或疫苗尤其包括编码包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白的本发明副粘病毒科病毒载体。
另外,本发明尤其提供减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法,其中该方法包括
-向母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物,该等组合物或疫苗尤其包括编码包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白的本发明副粘病毒科病毒载体,及
-使该仔猪由该母猪哺乳。
优选地,该母猪是正怀孕,尤指怀有该仔猪的母猪。
更佳地,该减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法包括以下步骤:
-向怀有该仔猪的母猪施用本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物,该等组合物或疫苗尤其包括编码包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白的本发明副粘病毒科病毒载体,
-使该母猪生下该仔猪,及
-使该仔猪由该母猪哺乳。
优选地,将本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物经肌内或经黏膜(例如通过鼻内施用)施用动物。
最佳地,在该减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法中,将该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物经黏膜,优选地经鼻内施用该母猪。
根据再一优选方面,本发明还提供一种试剂盒,其用于在动物中针对至少一种病原体诱导免疫反应,或用于针对与至少一种病原体有关的疾病对动物(优选地宠物动物,例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物;或产食性动物,例如猪或牛)接种疫苗和/或减小动物中与至少一种病原体有关或由其引起的一或多种临床体征的发生率或严重程度,该试剂盒包括:
a)注射器或分配器,其能够向该动物施用疫苗;及
b)本发明的免疫原性组合物或本发明的疫苗或医药组合物,及
c)视情况选用的说明书,
其中该至少一种病原体优选地是cdv或cpv或swiv或pedv,且其中该至少一种病原体最佳是cdv及cpv。
定义
除非另有定义,否则本文所用的所有技术及科学术语皆具有与申请时熟习本发明所属技术领域者通常所理解含义相同的含义。术语的含义及范围应清楚;然而,倘若存在任何潜在歧义,则本文所提供的定义优先于任一字典或外在的定义。另外,除非上下文另外需要,否则单数术语包含复数形式且复数术语包含单数。在本文中,除非另外陈述,否则使用“或”意指“和/或”。另外,使用术语“包含(including)”以及其他形式(例如“包含(includes)”及“包含(included)”)不具有限制意义。本文所提及的所有专利及出版物皆以引用方式并入本文中。
除非另外指示,否则本发明的实践将采用病毒学、分子生物学、微生物学、重组dna技术、蛋白质化学及免疫学的习用技术,其皆在本领域的技术范围内。该等技术充分阐释于文献中。例如参见sambrook,fritsch&maniatis,molecularcloning:alaboratorymanual,第i、ii及iii卷,第二版(1989);dnacloning,第i及ii卷(d.n.glover编辑,1985);oligonucleotidesynthesis(m.j.gait编辑,1984);nucleicacidhybridization(b.d.hames及s.j.higgins编辑,1984);animalcellculture(r.k.freshney编辑,1986);immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986);perbal,b.,apracticalguidetomolecularcloning(1984);丛书methodsinenzymology(s.colowick及n.kaplan编辑,academicpress,inc.);proteinpurificationmethods-apracticalapproach(e.l.v.harris及s.angal编辑,irlpress,oxforduniversitypress);及handbookofexperimentalimmunology,第i-iv卷(d.m.weir及c.c.blackwell编辑,1986,blackwellscientificpublications)。
在详细阐述本发明的前,应理解,本发明并不限于特定dna、多肽序列或制程参数,此乃因该等项当然可有所变化。亦应理解,本文所用的术语仅是出于阐述本发明特定实施例的目的,而非意欲为限制性。必须注意,除非内容另外明确指出,否则本说明书及随附申请专利范围中所用的单数形式“一(a、an)”及“该(the)”包含多个指涉对象。因此,举例而言,所提及的“一种抗原”包含两种或更多种抗原的混合物,所提及的“一种赋形剂”包含两种或更多种赋形剂的混合物及诸如此类。
副粘病毒科定义
特定而言,应理解,本文所用的术语“副粘病毒科病毒”等效于如通常用于副粘病毒科病毒的背景中的术语“副粘病毒”。
本文所用的术语“副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区”特别地是关于优选指感染性副粘病毒科病毒的可表达n基因的rna序列,该rna序列侧接于编码序列的5′端(亦即与终止密码子互补的rna三联体的5′端)且包括该基因的基因端序列。因此,更特定而言,本文所提及的“5′非编码区序列”是与优选指感染性副粘病毒科病毒的可表达n基因的整个5′非编码序列相同的rna序列。亦更特定而言,本文所提及的“5′非编码区”是与副粘病毒科病毒的n基因的非编码序列相同的rna序列,其中该非编码序列侧接(a)编码序列及(b)连结该n基因与p基因的基因间序列。
如本文中所使用,术语副粘病毒科病毒的特定基因(例如h基因)的“3′非编码区”特别地是关于优选指感染性副粘病毒科病毒的可表达特定基因(例如h基因)的rna序列,该rna序列侧接于编码序列的3′端(亦即与起始密码子互补的rna三联体的3′端)且包括该基因的基因起始序列。因此,更特定而言,本文所提及的“3′非编码区序列”是与优选指感染性副粘病毒科病毒的可表达特定基因(例如h基因)的整个3′非编码序列相同的rna序列。亦更特定而言,本文所提及的“3′非编码区”是与副粘病毒科病毒的特定基因(例如h基因)的非编码序列相同的rna序列,其中该非编码序列侧接(a)编码序列及(b)连结该基因与3′方向上的下一个基因的基因间序列。
如本文中所使用,术语“基因间区域”特别地是指连接副粘病毒科病毒基因的5′端与副粘病毒科病毒5′方向上的相邻基因的3′起点的rna序列。
本文所用的术语“基因起始序列”特别地是等同术语“基因起始信号”。
应理解,如本文中分别使用的术语“副粘病毒科病毒的基因组启动子”等同术语“副粘病毒科病毒的基因组前导序列”,且术语“cdv的基因组启动子”等同术语“cdv的基因组前导序列”。
分子生物学定义
如本文所阐述的词组“侧接于……的5′端的序列”尤其等效于词组“与……的5′端共价连接的序列”或个别地词组“其中其3'末端核苷酸与……的5′末端核苷酸共价连接的序列”,且其中尤其应理解,该两个末端核苷酸共价连接于附接至戊糖的5'碳的磷酸根基与相邻戊糖的3'碳原子之间。
如本文所阐述的词组“侧接于……的3′端的序列”尤其等效于词组“与……的3′端共价连接的序列”或个别地词组“其中其5'末端核苷酸与……的3′末端核苷酸共价连接的序列”,且其中尤其应理解,该两个末端核苷酸共价连接于戊糖的3'碳原子与附接至相邻戊糖的5'碳的磷酸根基之间。
应理解,如本发明的上下文中所使用,术语“kozak序列”特别地是关于编码参与通过核糖体识别翻译起始位点的mrna序列的核苷酸序列。优选地,在本发明的上下文中,编码kozak序列的rna序列是可转录成侧接于其中起始密码子(aug)的5′端的mrna分子序列且用于引发翻译过程的rna序列。
业内已知的术语“载体”是指用于将遗传物质传递至宿主细胞中的多核苷酸构建体、通常质粒或细菌人工染色体。载体可为(例如)细菌、病毒、噬菌体、细菌人工染色体、黏粒或质粒。本文所用的载体可由dna或rna构成或含有二者。在一些实施例中,载体是由dna构成。在一些实施例中,载体是感染性病毒。此一病毒载体含有以携载外来基因的方式操纵的病毒基因组,该外来基因在细胞培养物或宿主动物中皆无病毒载体复制功能。根据本发明的特定方面,载体可用于各种方面,例如仅传递遗传物质、用于转染宿主细胞或生物体、用作疫苗(例如dna疫苗)或用于基因表达目的。基因表达是阐述蛋白质在细胞中的生物合成(如通过称为基因的特定多核苷酸序列所引导)的术语。在一具体方面中,载体可为“表达载体”,其是在存在于适当环境中时能够引导表达由通过载体携载的一或多种基因编码的蛋白质的载体。
载体及制备和/或使用表达载体(或重组体)的方法可尤其根据或类似于关于dna表达载体揭示于以下文献中的方法:美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、pct公开案wo94/16716、wo96/39491、wo95/30018;paoletti,“applicationsofpoxvirusvectorstovaccination:anupdate”,pnasusa93:11349-11353,1996年10月;moss,“geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression,vaccination,andsafety”,pnasusa93:11341-11348,1996年10月;smith等人,美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒);richardson,c.d.(编者),methodsinmolecularbiology39,“baculovirusexpressionprotocols”(1995humanapressinc.);smith等人,“productionofhumanbetainterferonininsectcellsinfectedwithabaculovirusexpressionvector”,molecularandcellularbiology,1983年12月,第3卷,第12期,p.2156-2165;pennock等人,“strongandregulatedexpressionofescherichiacolib-galactosidaseininfectcellswithabaculovirusvector”,molecularandcellularbiology,1984年3月,第4卷,第3期,p.406;epa0370573;1986年10月16日提出申请的美国申请案第920,197号;欧洲专利申请案第265785号;美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒);roizman,“thefunctionofherpessimplexvirusgenes:aprimerforgeneticengineeringofnovelvectors”,pnasusa93:11307-11312,1996年10月;andreansky等人,“theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplexvirusestothetreatmentofexperimentalbraintumors”,pnasusa93:11313-11318,1996年10月;robertson等人,“epstein-barrvirusvectorsforgenedeliverytoblymphocytes”,pnasusa93:11334-11340,1996年10月;frolov等人,“alphavirus-basedexpressionvectors:strategiesandapplications”,pnasusa93:11371-11377,1996年10月;kitson等人,j.virol.65,3068-3075,1991;美国专利第5,591,439号、第5,552,143号;wo98/00166;1996年7月3日提出申请的允许美国申请案第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒);grunhaus等人,1992,“adenovirusascloningvectors”,seminarsinvirology(第3卷)p.237-52,1993;ballay等人,embojournal,第4卷,p.3861-65,graham,tibtech8,85-87,1990年4月;prevec等人,j.genvirol.70,42434;pctwo91/11525;felgner等人(1994),j.biol.chem.269,2550-2561,science,259:1745-49,1993;及mcclements等人,“immunizationwithdnavaccinesencodingglycoproteindorglycoproteinb,aloneorincombination,inducesprotectiveimmunityinanimalmodelsofherpessimplexvirus-2disease”,pnasusa93:11414-11420,1996年10月;及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号及第5,580,859号以及wo90/11092、wo93/19183、wo94/21797、wo95/11307、wo95/20660;tang等人,nature;及furth等人,analyticalbiochemistry。亦参见wo98/33510;ju等人,diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统);sanford等人,美国专利第4,945,050号;fischbach等人(intracel);wo90/01543;robinson等人,seminarsinimmunology,第9卷,pp.271-283(1997),(dna载体系统);szoka等人,美国专利第4,394,448号(将dna插入活细胞中的方法);mccormick等人,美国专利第5,677,178号(致细胞病变病毒的用途);及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体);以及本文中所引用的其他文件。
术语“病毒载体”阐述通过重组dna技术以其进入宿主细胞中会产生特定生物活性(例如表达由载体携载的转基因)的方式操纵的基因修饰病毒。在一具体方面中,转基因是抗原。病毒载体可或可不在靶细胞、组织或生物体中为复制竞争性。特定而言,应理解,本文所用的术语“病毒载体(viralvector)”等效于术语“病毒载体(virusvector)”。
可使用业内熟知的任何适宜基因改造技术来生成病毒载体,包含(但不限于)细胞培养物中的限制性内核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化、dna测序、转染的标准技术,例如如sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress,n.y.(1989))或k.maramorosch及h.koprowski(methodsinvirologyvolumeviii,academicpressinc.london,uk(2014))中所阐述。
病毒载体可纳入来自任一已知生物体的基因组的序列。该等序列可以其天然形式纳入或可以任一方式进行改质以获得期望活性。举例而言,序列可包括插入、缺失或取代。
病毒载体可包含用于所关注两种或更多种蛋白质的编码区。举例而言,病毒载体可包含用于第一所关注蛋白的编码区及用于第二所关注蛋白的编码区。第一所关注蛋白及第二所关注蛋白可相同或不同。在一些实施例中,病毒载体可包含用于所关注第三蛋白或第四蛋白的编码区。所关注第三蛋白及第四蛋白可相同或不同。由一种病毒载体编码的所关注两种或更多种蛋白质的总长度可有所变化。举例而言,两种或更多种蛋白质的总长度可为至少约200个氨基酸。至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸或更长。
术语“病毒载体”及“病毒构建体”可互换使用。
本文所用的术语“构建体”是指重组核酸(例如质粒)、bac或人工生成的重组病毒。
术语“质粒”是指独立于细菌宿主细胞内的细菌染色体复制的细胞质dna。在本发明的一具体方面中,术语“质粒”和/或“转移质粒”是指可用于构建(例如)用于插入病毒载体中的表达盒的重组dna技术的组件。在另一具体方面中,术语“质粒”可用于指示可用于dna接种疫苗目的的质粒。
如本文中所使用,术语“核酸”及“多核苷酸”可互换使用且是指任一核酸。术语“核酸序列”应理解为等效于术语“核苷酸序列”。术语“核苷酸序列”应理解为等效于术语“多核苷酸序列”。
本文所用的术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“rna序列”或“dna序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段及部分且是指基因组或合成起源的dna或rna,其可为单链或双链且代表有义或反义链。序列可为非编码序列、编码序列或二者的混合物。本发明核酸序列可使用本领域技术人员熟知的标准技术制得。
术语“核酸”及“多核苷酸”亦特定而言包含由除5个生物碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)外的碱基构成的核酸。
如本文中所使用,术语“启动子”或“启动子序列”意指允许结合rna聚合酶且引导转录基因的核苷酸序列。通常,启动子位于基因中邻近基因的转录起始位点的5'非编码区中。启动子内用于引发转录的序列组件的特征通常在于共有核苷酸序列。启动子的实例包含(但不限于)来自细菌、酵母、植物、病毒及动物(例如哺乳动物(包含马、猪、牛及人类)、鸟或昆虫)的启动子。启动子可为诱导型、抑制型和/或组成型。诱导型启动子引发在其控制下因应于培养条件的一定变化(例如温度变化)增加来自dna的转录程度(ptashne,2014)。本领域技术人员熟知的启动子的实例是(例如)sv40大t、hcmv及mcmv立即早期基因1、人类延长因子α启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子。
术语“互补核苷酸序列”阐述多核苷酸(例如dna或rna)的两条配对链的一条链。互补链的核苷酸序列映现其配对链的核苷酸序列,从而对于每一腺苷而言其含有胸腺嘧啶(或对于rna而言含有尿嘧啶),对于每一鸟嘌呤而言其含有胞嘧啶,且反的亦然。举例而言,5’-gcatac-3’的互补核苷酸序列是3’-cgtatg-5’或对于rna而言是3’-cguaug-5’。
本文所用的术语“基因”、“所关注基因”具有相同含义且是指编码所关注产物的任一长度的多核苷酸序列。基因可进一步包括位于编码序列的前(5′非编码或未翻译序列)及的后(3′非编码或未翻译序列)的调控序列。所选序列可为全长或截短、融合或加标签基因,且可为cdna、基因组dna或dna片段。通常应理解,编码多肽或rna的基因组dna可包含自成熟信使rna(mrna)剪接且由此不存在于编码相同多肽或rna的cdna中的非编码区(亦即内含子)。其可为天然序列、亦即天然形式,或可经突变,或包括衍生自不同来源的序列或另外视需要经修饰。该等修饰包含密码子优化以优化在所选宿主细胞中的密码子使用或优化加标签。另外,其可包含去除或添加顺式作用位点(例如(隐性)剪接供体、受体位点及分支点、多聚腺苷酸化信号、tata-盒、chi位点、核糖体进入位点、重复序列、二级结构(例如茎环)、用于转录因子或其他调控因子的结合位点、限制酶位点等)以得到仅少数(但不限于)实例。所选序列可编码分泌、细胞质、细胞核、膜结合或细胞表面多肽。
本文所用的“必需基因(essentialgene)”或“必需基因(essentialgenes)”分别尤其意欲涵盖专用于宿主细胞中的复制的基因。
本文所用的术语“所关注核苷酸序列”是较所关注基因更一般的术语,此乃因其未必包括基因,但可包括基因的要素或部分或其他基因信息(例如ori(复制起点))。所关注核苷酸序列可为任一dna或rna序列,不论其是否包括编码序列。
术语“转录”阐述mrna在细胞中的生物合成。
本文所用的术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译核酸序列。根据本发明的具体方面,术语“表达”是指在宿主细胞内转录和/或翻译异源性和/或外源性核酸序列。可基于存在于细胞中的相应rna或mrna的量或由所选序列所编码期望多肽的量来测定期望产物在宿主细胞中的表达程度。举例而言,可通过核酸印迹杂交(northernblothybridization)、核糖核酸酶rna保护、原位杂交至细胞rna或通过rtqpcr(逆转录且随后定量pcr)来量化自所选序列转录的mrna。可通过各种方法来量化自所选序列表达的蛋白质,例如通过elisa、通过蛋白印迹、通过放射免疫分析、通过免疫沉淀、通过分析蛋白质的生物活性或通过免疫染色蛋白质且随后进行facs分析。
术语“表达盒”或“转录单元”或“表达单元”定义载体、构建体或多核苷酸序列内含有一或多种拟转录基因的区域,其中编码转录基因的核苷酸序列以及含有含于表达盒内的调控组件的多核苷酸序列彼此可操作地连接。其是转录自激活子且通过至少一个多聚腺苷酸化信号来终止转录。在一具体方面中,其是转录自一个单一启动子。因此,不同基因至少以转录方式连接。可转录一种以上蛋白质或产物且自每一转录单元(多顺反子转录单元)表达。每一转录单元包括转录及翻译任一含于该单元内的所选序列所需的调控组件。另外,每一转录单元可含有相同或不同的调控组件。举例而言,每一转录单元可含有可用于转录单元内基因的功能连接的相同终止子、ires组件或内含子。载体或多核苷酸序列可含有一个以上的转录。
术语“病毒效价”是每一体积病毒制剂中的感染性单元的量度。病毒效价是生物程序中的终点且定义为平行实施的某一比例测试展示效应的稀释度(reed及muench,1938)。具体而言,组织培养感染剂量50/毫升(tcid50/ml)给出病毒制剂的如下稀释度:以该稀释度平行接种的诸多细胞培养物中的50%发生感染。
“转录调控组件”通常包括拟表达基因序列上游的启动子、转录起始及终止位点及多聚腺苷酸化信号。
术语“转录起始位点”是指构建体中对应于纳入一级转录物(亦即mrna前体)中的第一核酸的核酸。转录起始位点可与启动子序列重迭。
“终止信号”或“终止子”或“多聚腺苷酸化信号”或“polya”或“转录终止位点”或“转录终止组件”是如下信号序列:其在真核mrna的3'端的特定位点处引起裂解且在经裂解3'端转录后纳入约100-200腺嘌呤核苷酸的序列(polya尾部),且由此使得rna聚合酶终止转录。多聚腺苷酸化信号包括裂解位点上游的约10-30个核苷酸的序列aataaa及位于下游的序列。已知各种多聚腺苷酸化组件,例如tkpolya、sv40晚期及早期polya、bghpolya(例如阐述于美国专利第5,122,458号中)或仓鼠生长激素polya(wo2010010107)。
“翻译调控组件”包括用于每一拟表达个别多肽的翻译起始位点(aug)、终止密码子及polya信号。内核糖体进入位点(ires)可包含于一些构建体中。为优化表达,可设计去除、添加或改变拟表达核酸序列的5'-和/或3'-未翻译区以消除任何潜在额外不适当替代翻译起始密码子或其他可在转录或翻译层面上干扰或减小表达的序列。可将共有核糖体结合位点(kozak序列)插入紧邻起始密码子的上游处以增强翻译且由此增强表达。增加此核糖体结合位点周围的a/u含量可增进更有效的核糖体结合。
根据定义,在来自不同(病毒)物种时,插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各别蛋白质或rna称为关于宿主细胞的“外源性”、“外源性序列”、“外源性基因”、“外源性编码序列”。如本文针对所关注序列或基因(例如抗原)所使用,术语“外源性”意指,该所关注序列或基因、具体而言该抗原表达于其天然物种背景的外。因此,cpvvp2抗原是关于副粘病毒科病毒载体的外源性抗原的一种实例(参见实例2)。如本文中所使用,术语“外源性rna”或“外源性核酸序列”特别地是指自外部来源(例如自重组序列)引入副粘病毒科病毒的基因组中的核酸序列。该外部来源的实例包括副粘病毒科病毒序列以及非副粘病毒科病毒衍生序列。更特定而言,引入外源性核酸序列使得基因组或基因分别具有非天然部分。如本文中所使用,术语“外源性rna”由此特别地是指非天然地发现于副粘病毒科病毒基因组中的核苷酸序列。该非天然部分或非天然发现序列分别亦可源自将一个天然核苷酸序列插入另一天然核苷酸序列中。
根据定义,插入宿主细胞中的每一多核苷酸序列或每一基因及由此编码的各别蛋白质或rna关于宿主细胞称为“异源”、“异源序列”、“异源基因”、“异源编码序列”、“转基因”或“异源蛋白”。即使拟引入序列或拟引入基因与宿主细胞的内源性序列或内源性基因相同,此定义亦适用。举例而言,根据定义,较副粘病毒科野生型病毒以不同位点或修饰形式引入副粘病毒科病毒载体中的副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区是异源性序列。如本文针对所关注序列或基因(例如抗原)所使用,术语“异源性”意指,该所关注序列或基因、具体而言该抗原表达于其天然亚物种背景的外。
术语“非天然”意指并不天然出现于此背景中的任一所关注序列或基因(例如抗原),例如来自不同物种的混合序列或所关注序列或基因(例如抗原)或因人工突变、插入、缺失或诸如此类而并非天然产物的所关注序列或基因(例如抗原)。
在本发明的整个说明书中,术语“重组”可与术语“非天然”、“异源性”及“外源性”互换使用。因此,“重组”蛋白是自异源性或外源性多核苷酸序列表达的蛋白质。如针对病毒所用的术语重组体意指通过人工操纵病毒基因组产生的病毒。包括异源性或外源性序列(例如外源性抗原编码序列)的病毒是重组病毒。术语重组病毒及术语非天然病毒可互换使用。
因此,术语“异源性载体”意指包括异源性或外源性多核苷酸序列的载体。术语“重组载体”意指包括异源性或重组多核苷酸序列的载体。
如本文中所使用,术语“可操作地连接”用于阐述调控组件与基因或其编码区之间的连接。通常,基因表达是在一或多种调控组件(例如(但不限于)组成型或可诱导启动子、组织特异性调控组件及增强子)的控制下进行。基因或编码区可视为与调控组件“可操作地连接”或“操作性连接”或“可操作地缔合”,此意味着该基因或编码区由调控组件控制或影响。举例而言,若启动子影响编码序列的转录或表达,则启动子可操作地连接至编码序列。
特定而言,应理解,在本发明的上下文中,术语“与序列[……]相同”等效于术语“与序列具有[……]序列相同性”。
如本文中所使用,特定而言,应理解,术语“与seqidno:y的序列至少x%相同”分别等效于术语“在seqidno:y的长度上与seqidno:y的序列至少x%相同”或术语“在seqidno:y的整个长度上与seqidno:y的序列至少x%相同”。在此背景中,“x”是66至100的任一数量,尤指选自66至100的任一整数,从而“x%序列相同性”代表本文所提及序列相同性百分比中的任一者。个别地,此背景中的“y”是选自1至36z任一整数,从而“seqidno:y”代表所本文提及的任一seqidno。
另外应理解,如本文所阐述,术语“与至少99%相同”亦(在该范围的一个极端)分别包括且是关于术语“100%相同”或“与序列相同”。
业内已知的“序列相同性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列、亦即参考序列与拟与参考序列进行比较的给定序列之间的关是。通过在将序列最佳地比对以产生最高序列相似性程度的后比较给定序列与参考序列来测定序列相同性,如通过该等序列串之间的匹配所测定。在该比对时,基于逐个位置来确定序列相同性,举例而言,若在一个位置处核苷酸或氨基酸残基相同,则该等序列在该位置处“相同”。然后将该等位置相同性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以得到序列相同性%。序列相同性可易于通过已知方法来计算,包含(但不限于)阐述于以下文献中的方法:computationalmolecularbiology,lesk,a.n.编辑,oxforduniversitypress,newyork(1988),biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.编辑,academicpress,newyork(1993);computeranalysisofsequencedata,parti,griffin,a.m.及griffin,h.g.编辑,humanapress,newjersey(1994);sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheinge,g.,academicpress(1987);sequenceanalysisprimer,gribskov,m.及devereux,j.编辑,m.stocktonpress,newyork(1991);及carillo,h.及lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988),其教示内容以引用方式并入本文中。设计用于测定序列相同性的优选方法以得到所测试序列之间的最大匹配。将测定序列相同性的方法编成测定给定序列间的序列相同性的公开获得的计算机程序。该等程序的实例包含(但不限于)gcg程序包(devereux,j.等人,nucleicacidsresearch,12(1):387(1984))、blastp、blastn及fasta(altschul,s.f.等人,j.molec.biol.,215:403-410(1990)。blastx程序可自ncbi及其他来源公开获得(blastmanual,altschul,s.等人,ncvinlmnihbethesda,md20894,altschul,s.f.等人,j.molec.biol.,215:403-410(1990),其教示内容以引用方式并入本文中)。该等程序最佳地使用默认空位权重比对序列以在给定序列与参考序列之间产生最高序列相同性程度。作为阐释,对于多核苷酸具有与参考核苷酸序列具有至少(例如)85%,优选地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%“序列相同性”的核苷酸序列而言,预计给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同,只是给定多核苷酸序列可包含最高15,优选地最高10、甚至更佳地最高5个点突变/参考核苷酸序列的100个核苷酸。换言的,在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85%,优选地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%、99.9%相同性的核苷酸序列的多核苷酸中,参考序列中最高15%,优选地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%的核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代,或参考序列中全部核苷酸中最高15%,优选地10%、9%、8%、7%、6%、甚至更佳地5%、4%、3%、2%、1%、0.1%数量的核苷酸可插入参考序列中。参考序列的该等突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置,其是个别地散布在参考序列中的各核苷酸之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。类似地,对于多肽具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)85%,优选地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列相同性的给定氨基酸序列而言,预计多肽的给定氨基酸序列与参考序列相同,只是给定多肽序列可包含最高15,优选地最高10、9、8、7、6、甚至更佳地最高5、4、3、2、1个氨基酸改变/参考氨基酸序列的100个氨基酸。换言的,为获得与参考氨基酸序列具有至少85%,优选地90%、91%、92%、93%、94%、甚至更佳地95%、96%、97%、98%、99%序列相同性的给定多肽序列,参考序列中最高15%,优选地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%的氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代,或可将占参考序列中的总氨基酸残基数的最高15%,优选地最高10%、9%、8%、7%、甚至更佳地最高5%、4%、3%、2%、1%的数量的氨基酸插入参考序列中。参考序列的该等改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或在彼等末端位置之间的任何位置,其是个别地散布在参考序列中的各残基之间或在参考序列内呈一或多个邻接基团形式。优选地,不同残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而,在测定序列相同性时,并不包含保守取代作为匹配。
术语“序列相同性”或“相同性百分比”可在本文中互换使用。出于本发明目的,在本文中应明确,为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比相同性,出于最佳对比目的对比该等序列(举例而言,可将间隙引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基或核酸序列进行最佳对比)。然后比较相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸残基。在第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时,则该等分子在该位置相同。两个序列之间的相同性%是该等序列所共享的相同位置数的函数(亦即,相同性%=相同位置数/总位置(亦即重迭位置)数×100)。优选地,两个序列具有相同长度。
可在两个所比较序列的整个长度中或在两个序列的片段中实施序列对比。通常,在两个所比较序列的全长中实施对比。然而,可在(例如)20、50、100或更多个邻接氨基酸残基的区域中实施序列相同性测定。
本领域技术人员应知晓,实际上,可利用若干不同计算机程序来测定两个序列之间的相同性。举例而言,两个序列之间的序列对比及相同性百分比的测定可使用数学算法来达成。在一优选实施例中,使用needleman及wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法(其已纳入accelrysgcg软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的gap程序中)、使用blosum62矩阵或pam250矩阵及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6)来测定两个氨基酸或核酸序列之间的百分比相同性。本领域技术人员应了解,所有该等不同参数将产生略微不同的结果,但在使用不同算法时两个序列的整体百分比相同性并不显著改变。
可进一步使用本发明的蛋白质序列及核酸序列作为“询问序列”来实施针对公共数据库的检索,以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-10的blastn及blastp程序(2.0版)实施该等检索。可使用blastp程序、评分=50、字长=3实施blast蛋白质检索以获得本发明的蛋白质分子的同源氨基酸序列。为获得用于对比目的的空位比对,可如altschul等人(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所阐述来利用空位blast。在利用blast及空位blast程序时,可使用各别程序(例如blastp及blastn)的预设参数。参见国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的主页。
疫苗定义
“免疫原性或免疫组合物”是指包括至少一种抗原或其免疫原性部分的物质的组合物,其在宿主中引发细胞或抗体调介的对组合物的免疫反应的免疫学反应。
本文使用的术语“抗原”在业内已众所周知,且包含具有免疫原性的物质(亦即免疫原)以及诱导免疫学不反应性或无反应性(亦即身体的防御机制对外来物质无反应)的物质。如本文中所使用,术语“抗原”欲指含有或包括表位的全长蛋白质以及其肽片段。
术语“产食性动物”意指用于人类消费的动物,例如猪、牛、家禽、鱼及诸如此类,优选地产食性动物意指猪及牛、最佳地猪。
本文所用的“免疫原性组合物”可是指多肽或蛋白质,例如引发如本文所阐述的免疫学反应的病毒表面蛋白。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”是指蛋白质或多肽的片段或截短和/或取代形式,其包含一或多个表位且由此引发本文所阐述的免疫学反应。一般而言,该等截短和/或取代的形式或片段将包括来自全长蛋白质的至少六个邻接氨基酸。该等片段可使用任一数量的业内熟知的表位定位技术来鉴别。例如参见epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,第66卷(glenne.morris编辑,1996)humanapress,totowa,newjersey。举例而言,线性表位可通过在固体载体上同时合成大量肽(该等肽对应于蛋白质分子的部分)且使肽与抗体反应同时肽仍附接至载体来测定。业内已知且阐述该等技术,例如参见美国专利第4,708,871号;geysen等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81:3998-4002;及geysen等人(1986)molec.immunol.23:709-715。类似地,通过使用(例如)x射线结晶学及二维核磁共振测定氨基酸的空间构形来容易地鉴别构形表位。参见epitopemappingprotocols(见上文)。该定义内亦包含合成抗原,例如多表位、侧接表位及其他重组或合成源抗原。例如参见bergmann等人(1993)eur.j.immunol.23:2777-2781;bergmann等人(1996),j.immunol.157:3242-3249;suhrbier,a.(1997),immunol.andcellbiol.75:402-408;及gardner等人,(1998)12thworldaidsconference,geneva,switzerland,1998年6月28日至7月3日。(其教示及内容皆以引用方式并入本文中。)
本文所用的术语“疫苗”是指包括至少一种在动物中诱导免疫学反应的免疫活性组分且可能但不一定包括一或多种增强活性组分的免疫学活性的额外组分的医药组合物。疫苗可另外包括医药组合物的其他典型组分。通过区别,疫苗的免疫学活性组分可包括呈其原始形式的完整病毒颗粒或所谓经修饰活疫苗(mlv)中的减毒颗粒或通过适当方法在所谓死疫苗(kv)中灭活的颗粒。在另一形式中,疫苗的免疫学活性组分可包括生物体的适当组件(亚单位疫苗),其中该等组件是通过以下方式生成:通过破坏整个颗粒或含有该等颗粒的生长培养物及视情况随后的纯化步骤以产生期望结构,或通过合成方法,包含使用基于(例如)细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种的适宜系统的适当操纵加上视情况随后的分离及纯化程序,或通过使用适宜医药组合物直接纳入遗传物质来诱导需要疫苗的动物中的合成过程(多核苷酸疫苗接种)。疫苗可包括一种或同时一种以上的上述组件。如在本发明的具体方面中所使用,“疫苗”是指活疫苗或活病毒,亦称为重组疫苗。在本发明的另一具体方面中,“疫苗”是指包含类病毒颗粒(vlp)的灭活或死病毒。因此,疫苗可为亚单位疫苗或死(kv)或灭活疫苗。
术语感染复数“(m.o.i.)”阐述多少感染单位,例如,每个细胞使用病毒制剂的tcid50以感染培养的细胞。举例而言,0.01的m.o.i.意指对于培养容器中的每100个细胞,接种一个感染单位。
术语“dna接种疫苗”或“多核苷酸接种疫苗”意指使用适宜医药组合物直接接种遗传物质。
灭活的各种物理及化学方法为业内已知。术语“灭活”是指先前有毒力或无毒力的病毒或细菌经辐照(紫外线(uv)、x射线、电子束或γ辐射)、加热或化学处理以灭活或杀死该病毒或细菌,同时保留其免疫原性。适宜灭活剂包含β-丙内酯、二元或β-或乙酰基-次乙亚胺、戊二醛、臭氧及福尔马林(formalin)(甲醛)。
对于由福尔马林或甲醛灭活,通常将甲醛与水及甲醇混合以产生福尔马林。添加甲醇可防止灭活过程中的降解或交叉反应。一个实施例使用约0.1%至1%的37%甲醛溶液来灭活病毒或细菌。至关重要的是,调节福尔马林的量以确保材料灭活,但不会多至发生高剂量的副效应。
更特定而言,术语“灭活”在病毒的上下文中意指该病毒不能在活体内或活体外复制,且分别,术语“灭活”在细菌的上下文中意指细菌不能在活体内或活体外复制。举例而言,术语“灭活”可是指已经在活体外繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活以使其不再能够复制的病毒。在另一实例中,术语“灭活”可以指已经繁殖且然后使用化学或物理方式使其灭活的细菌,从而产生细菌、细菌的片段或组分的悬浮液,例如产生可用作疫苗的组份的菌苗。
如本文中所使用,术语“灭活”、“杀死”或“kv”可互换使用。
术语“活疫苗”是指包括活生物体或复制胜任病毒或病毒载体的疫苗。
“医药组合物”基本上由一或多种能够改变其所施用的生物体或生物体中或上面存活的生物体的生理学(例如免疫学)功能的成分组成。该术语包含(但不限于)抗生素或抗寄生虫剂以及通常用于实现某些其他目的(例如但不限于处理性状、不孕性、稳定性、经肠或非经肠途径(例如经口、鼻内、静脉内、肌内、皮下、真皮内或其他适宜途径)施用组合物的可行性、施用后耐受性或受控释放性质)的其他成分。该医药组合物的一个非限制性实例仅仅是用于显示目的给出,可如下所述来制备:将经感染细胞培养物的细胞培养物上清液与稳定剂(例如亚精胺和/或牛血清白蛋白(bsa))混合且随后将混合物通过其他方法进行冻干或去水。在疫苗接种的前,然后将混合物在水溶液(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs))或非水溶液(例如油乳液、基于铝的佐剂)中再水化。
如本文中所使用,“医药或兽医学可接受的载剂”包含任何及全部溶剂、分散介质、涂覆剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及诸如此类。在一些优选实施例及尤其包含冻干的免疫原性组合物的彼等中,用于本发明的稳定剂包含用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施例中,本发明的免疫原性组合物含有佐剂。本文所用的“佐剂”可包含氢氧化铝及磷酸铝、皂素,例如quila、qs-21(cambridgebiotechinc.,cambridgema)、gpi-0100(galenicapharmaceuticals,inc.,birmingham,al)、油包水型乳液、水包油型乳液、水包油包水型乳液。特定而言,乳液可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(europeanpharmacopea)型);类异戊二烯油,例如角鲨烷或角鲨烯;由烯烃(特定而言异丁烯或癸烯)寡聚产生的油;酸或含有直链烷基的醇的酯,更特定而言植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、三-(辛酸甘油酯/癸酸甘油酯)或丙二醇二油酸酯;具支链脂肪酸或醇的酯,特定而言异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂,特定而言是以下的酯:山梨醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸(其视情况经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,特定而言pluronic产品,尤其l121。参见hunter等人,thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants(stewart-tull编辑,d.e.s.),johnwileyandsons,ny,第51-94页(1995)及todd等人,vaccine15:564-570(1997)。实例性佐剂是由m.powell及m.newman编辑的“vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach”,plenumpress,1995的第147页上阐述的spt乳液及同一本书第183页上阐述的乳液mf59。
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。该等化合物以术语卡波姆(carbomer)为人所知(phameuropa,第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员亦可参照美国专利第2,909,462号,其阐述与具有至少3个,优选地不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的该等丙烯酸聚合物,至少三个羟基的氢原子由具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是含有2至4个碳原子的基团,例如乙烯基、烯丙基及其他烯是不饱和基团。不饱和基团可自身含有其他取代基,例如甲基。以名称
其他适宜佐剂包含(但不限于)尤其ribi佐剂系统(ribiinc.)、嵌段共聚物(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、单磷酰脂质a、阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(e.coli)(重组或其他)的热不稳定肠毒素、霍乱毒素、ims1314或胞壁酰二肽或其天然或重组细胞介素或其类似物或内源细胞介素释放的刺激剂等。
预计佐剂可以每剂量约100μg至约10mg的量,优选地以每剂量约100μg至约10mg的量、更佳地以每剂量约500μg至约5mg的量、甚至更佳地以每剂量约750μg至约2.5mg的量及最佳地以每剂量约1mg的量添加。或者,以最终产物的体积计,佐剂可为约0.01%至50%的浓度,优选为约2%至30%的浓度,更佳为约5%至25%的浓度,仍更佳为约7%至22%的浓度,且最佳为10%至20%的浓度。
“稀释剂”可包含水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油及诸如此类。等渗剂可尤其包含氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。稳定剂尤其包含白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
“分离”意指自其天然状态“由人手”改变,亦即若其在自然界中存在,则其已经改变或自其初始环境中取出,或两者兼而有的。举例而言,天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽并非“分离的”,但自其天然状态的共存物质分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”,如本文所用的术语。
“减毒”意指降低病原体的毒性。在本发明中,“减毒”与“无毒”同义。在本发明中,减毒病毒是毒性已降低从而不会引起感染的临床体征但能够在目标哺乳动物中诱导免疫反应者,但亦可意指与感染非减毒病毒或病原体且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比在感染减毒病毒,尤指所主张的副粘病毒科病毒载体的动物中临床体征的发生率或严重程度有所降低。在此上下文中,术语“减小(reduce/reduced)”意指与如上文所定义的对照组相比减小至少10%,优选地25%、甚至更佳地50%、仍更佳地60%、甚至更佳地70%、仍更佳地80%、甚至更佳地90%及最佳地100%。因此,减毒的无毒病原体(例如所主张的减毒的病毒载体,尤指所主张的副粘病毒科病毒载体(优选地cdv载体))适于产生经修饰的活疫苗(mlv)或经修饰的活免疫原性组合物。
在本文中,“有效剂量”意指(但不限于)引起或能够引发免疫反应且在施用抗原的动物中使得减少临床症状的量。
如本文中所使用,术语“有效量”在组合物的背景中意指能够诱导免疫反应且降低动物的疾病的感染或事件的严重程度的免疫原性组合物的量。特定而言,有效量是指每剂量的菌落形成单位(cfu)。或者,在疗法的背景中,术语“有效量”是指足以减轻或改善疾病或病症或其一或多种症状的严重程度或持续时间、防止疾病或病症进展、引起疾病或病症消退、防止与疾病或病症相关的一或多种症状的复发、发展、发作或进展或增强或改良另一疗法的预防或治疗的疗法的量。
“免疫反应”或“免疫学反应”意指(但不限于)对所关注的(免疫原性)组合物或疫苗发生细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常,免疫或免疫学反应包含(但不限于)以下效应中的一或多者:产生或活化特异性针对所关注组合物中所包含的一或多种抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、阻抑性t细胞和/或细胞毒性t细胞。优选地,宿主将展示治疗性或保护性免疫(记忆)反应,从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度降低。该保护将通过症状数量的减少、症状严重程度的降低或无与病原体感染有关的一或多种症状、病毒血症发作的延迟、病毒持久性降低、整体病毒负荷的降低和/或病毒排泄的降低来展现。
“保护抵抗疾病”、“保护免疫性”、“功能免疫性”、“临床症状的减少”、“中和抗体的诱导/产生和/或血清转化”及类似片语意指通过施用本发明的一或多种治疗性组合物或其组合而产生的针对疾病或病状的部分或完全反应,其导致比已暴露于疾病或感染的未经免疫个体所预计较不有害的效应。亦即,在经疫苗接种的个体中,感染的有害效应的严重程度减轻。在经疫苗接种的个体中,感染可经减轻、减缓或可能完全预防。在本文中,若意指完全预防感染,则对其进行具体说明。若未陈述完全预防,则该术语包含部分预防。
术语“中和抗体”是关于能够通过中和或抑制传染原(通常是病毒,例如cdv或cpv)的生物效应来防止其感染细胞的抗体。中和可发生于抗体结合至特定病毒抗原以阻断病原体进入其宿主细胞时。在一实例中,其防止病毒结合至其受体且使其遗传物质进入细胞内部。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”可在本文中互换使用,其包含全抗体及其任一抗原结合片段(抗原结合部分)或单链同族物。“抗体”包括至少一条重(h)链及一条轻(l)链。在天然igg中,举例而言,该等重链及轻链由二硫键互连且存在两个配对的重链及轻链,该两个链亦由二硫键互连。每一重链包括重链可变区(在本文中缩写为vh)及重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域ch1、ch2及ch3。每一轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为vl)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域cl。vh及vl区域可进一步再分成超变区(称为互补决定区(cdr))及更保守的区域(称为框架区(fr)或接合(j)区(在重链及轻链中分别为jh或jl)),二者间杂排列。每一vh及vl由三个cdr、三个fr及j结构域构成,该等区域自氨基-末端至羧基-末端以下列顺序布置:fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、j。重链及轻链的可变区与抗原结合。抗体的恒定区可调介免疫球蛋白与宿主组织或因子(包含免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)或体液因子(例如经典补体系统的第一组分(clq)))的结合。
在本文中,“临床体征的发生率和/或严重程度的降低”或“临床症状的减少”意指(但不限于)与野生型感染相比,减少组中感染个体的数量、减少或消除展现感染的临床体征的个体的数量或降低一或多个个体中存在的任何临床体征的严重程度。举例而言,其应是指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾的症状的任何临床体征减少。优选地,与未接受组合物且被感染的个体相比,接受本发明的治疗性组合物的一或多个个体的该等临床体征减少至少10%。更佳地,接受本发明组合物的个体的临床体征减少至少20%,优选至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。
术语“增加的保护”在本文中意指(但不限于)相对于未经疫苗接种的个体对照组,经疫苗接种的个体组的一或多种与由传染原感染相关的临床症状在统计学上显著减轻。术语“临床症状的统计学显著减轻”意指(但不限于)经疫苗接种的个体组的至少一种临床症状的发病频率比在攻击传染原后未经疫苗接种的对照组中低至少10%,优选20%、更佳30%、甚至更佳50%且甚至更佳70%。
“持久保护”应是指持续至少3周、但更佳地至少3个月、仍更佳地至少6个月的改良的效能。在牲畜的情形下,最佳地,持久保护应持续直至动物出售用于肉类的平均年龄。
术语由病毒诱导的“病毒血症的减轻”意指(但不限于)进入动物血流的病毒减少,其中与未接受本发明组合物且可被感染的动物相比,接受该组合物的动物的血清中的病毒血症程度、即每毫升血清的病毒dna或rna拷贝数或每公合血清的噬菌斑形成菌落数减少至少50%。更佳地,接受本发明组合物的动物的病毒血症程度降低至少90%,优选至少99.9%、更佳至少99.99%、且甚至更佳至少99.999%。
如本文中所使用,术语“病毒血症”特定而言应理解为病毒颗粒在动物、特定而言哺乳动物、鸟或昆虫的血流中复制和/或循环的病状。
“安全性”是指在疫苗接种后,在经疫苗接种的动物中不存在不良后果,包含(但不限于):基于病毒的疫苗潜在地逆转成有毒力、临床上显著的副效应,例如持久性、全身性疾病或在疫苗施用位点不可接受的发炎。
本文所用的术语“接种疫苗(vaccination或vaccinating)”或其变化形式意指(但不限于)包含施用本发明的免疫原性组合物的过程,在施用动物时,其引发或能够引发(直接或间接)该动物的免疫反应。
在本发明的上下文中,“死亡率”是指由感染引起的死亡,且包含感染如此严重以致于将动物安乐死以防止痛苦并为其生命提供人道结局的情况。
制剂
施用组合物的个体优选是动物,包含(但不限于)牛、马、绵羊、猪、家禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠及大鼠,最佳哺乳动物是猪。
本发明制剂包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。疫苗包括有效免疫量的一或多种免疫原性组合物及生理上可接受的媒剂。制剂应适用于施用方式。
免疫原性组合物(若需要)亦可含有极少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂。口服制剂可包含标准载剂,例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
治疗方法
优选施用途径包含(但不限于)鼻内、经口、真皮内及肌内。期望在饮用水中、最佳以单一剂量施用。本领域技术人员将认识到,本发明组合物亦可以一个、两个或更多个剂量通过其他施用途径来施用。举例而言,该等其他途径包含皮下、皮内、腹膜内、皮内,且根据治疗的期望持续时间及有效性,本发明组合物可以例如每日计一次或若干次、亦间歇地以不同剂量(例如约103至108tcid50(参见上述病毒效价))施用若干天、若干周或若干月。在本发明的一具体方面中,剂量是约103至108tcid50,尤其对于活病毒/活疫苗。
若期望,组合物可提供于可包含含有活性成分的一或多种单位剂型的包装或分配器装置中。包装可(例如)包括金属或塑料箔,例如泡罩包。包装或分配器装置可带有用于施用,优选地施用哺乳动物,尤指猪的说明书。该(等)容器可附带有监管医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告,该公告显示该机构已批准用于人类施用的制造、使用或销售。
序列概述
本发明由此详述及揭示下列序列,其中序列表中的序列是以5’-端至3’-端方向自左向右呈现,且其中:
seqidno:1(rna)对应于cdv的n基因的5′非编码区,
seqidno:2(rna)对应于cdv的r基因的5′非编码区,
seqidno:3(rna)对应于cdv的m基因的5′非编码区,
seqidno:4(rna)对应于cdv的f基因的5′非编码区,
seqidno:5(rna)对应于cdv的h基因的5′非编码区,
seqidno:6(rna)对应于cdv的l基因的5′非编码区,
seqidno:7(rna)对应于cdv的h基因的3′非编码区,
seqidno:8(rna)对应于cdv的n基因的3′非编码区,
seqidno:9(rna)对应于cdv的p基因的3′非编码区,
seqidno:10(rna)对应于cdv的m基因的3′非编码区,
seqidno:11(rna)对应于cdv的f基因的3′非编码区,
seqidno:12(rna)对应于cdv的l基因的3′非编码区,
seqidno:13(rna)对应于编码kozak序列的序列,
seqidno:14(rna)对应于cdv的基因间序列,
seqidno:15(rna)对应于编码cpv的vp2蛋白的序列,
seqidno:16(rna)对应于编码h3-亚型血凝素的序列,
seqidno:17(rna)对应于seqidno:14、1、15、13及7的组合,
seqidno:18(rna)对应于seqidno:1、15、13、7及14的组合,
seqidno:19(rna)对应于seqidno:14、1、16、13及7的组合,
seqidno:20(rna)对应于seqidno:1、16、13、7及14的组合,
seqidno:21(rna)对应于seqidno:14、1、15、13、7及14的组合,
seqidno:22(rna)对应于seqidno:14、1、16、13、7及14的组合,
seqidno:23(rna)对应于包括cdv的m、f、h及l基因的序列,
seqidno:24(rna)对应于包括cdv的n及p基因的序列,
seqidno:25对应于seqidno:1的dna反向互补链,
seqidno:26对应于seqidno:13的dna反向互补链,
seqidno:27对应于seqidno:7的dna反向互补链,
seqidno:28对应于seqidno:14的dna反向互补链,
seqidno:29对应于seqidno:23的dna反向互补链,
seqidno:30对应于seqidno:24的dna反向互补链,
seqidno:31对应于seqidno:15的dna反向互补链,
seqidno:32对应于seqidno:16的dna反向互补链,
seqidno:33对应于seqidno:21的dna反向互补链,
seqidno:34对应于seqidno:22的dna反向互补链,
seqidno:35对应于cpvvp2的氨基酸序列,
seqidno:36对应于h3-亚型血凝素的氨基酸序列,
seqidno:37(rna)对应于编码pedvs蛋白的序列,
seqidno:38(rna)对应于编码pedvs蛋白的序列,
seqidno:39(rna)对应于seqidno:14、1、38、13及7的组合,
seqidno:40(rna)对应于seqidno:1、38、13、7及14的组合,
seqidno:41(rna)对应于seqidno:14、1、38、13、7及14的组合,
seqidno:42对应于seqidno:37的dna反向互补链,
seqidno:43对应于seqidno:38的dna反向互补链,
seqidno:44对应于seqidno:41的dna反向互补链,
seqidno:45对应于pedvs蛋白的氨基酸序列。
附图说明
下列图式形成本说明书的一部分且包含其以进一步阐释本发明的某些方面。可通过参照该等图式中的一或多者结合本文所呈现具体实施例的详细说明来更佳地理解本发明。
图1.携载犬细小病毒vp2转基因的犬瘟热病毒(cdv)载体基因组的组织的示意图式。
图2.用于生成(拯救)具有外源性rna序列布置的cdv重组载体的dna构建体(质粒)图,其中各别质粒dna序列称为“h基因起始utr”、“kozak序列”、“cpv-vp2”及“n基因utr”。
图3.rna序列在5’端至3’端方向上自左至右的实例性布置的示意图式:(a.)基本原理方案,(b.)副粘病毒科病毒载体中的布置,(c.)编码犬细小病毒(cpv)vp2的cdv载体中的布置,且其中(d.)及(e.)图解说明如由序列表的seqidno所指示的序列的各别布置。
图4.在上清液部分中量测的病毒效价(tcid50)。效价代表在感染后6天期间自感染后第1天开始每24小时采样的上清液中的病毒生长;“sd”=“研究日期”。
图5.在研究过程期间使用cdv-vp2重组体接种疫苗的动物的cdv中和效价。y轴指示中和分析中的病毒(衍生自莱德利菌株的cdv菌株)的血清的最大稀释度。在研究第0天(sd0)于第1接种疫苗的前、在研究第21天(sd21)于第2接种疫苗的前及在研究第42天(sd42)于第二接种疫苗的后三周量测中和效价(vnt[病毒中和测试]效价)。个别动物以代号指定。
图6.在研究过程期间使用cdv-vp2重组体接种疫苗的动物的犬细小病毒中和抗体效价。y轴指示中和分析中的病毒(cpv)的血清的最大稀释度。在研究第0天(sd0)于第1接种疫苗的前、在研究第21天(sd21)于第2接种疫苗的前及在研究第42天(sd42)于第二接种疫苗的后三周量测中和效价(vnt[病毒中和测试]效价)。个别动物以代号指定。
图7.如通过来自使用cdv-h3重组体接种疫苗的动物的试样的h3-亚型血凝素(h3)特异性elisa测试所测定的抗体含量。y轴指示在两个时间点1:500试样稀释液的od值所代表的读出,该两个时间点亦即在研究第0天(sd0)于第1接种疫苗的前及在研究第45天(sd45)于第二接种疫苗的后自动物获取试样。
图8.在使用cdv-h3重组体对h3n2-mda阳性仔猪接种疫苗的后的ifnγ-elispot分析的结果。y轴指示接种疫苗动物(左侧条,代表6只动物的平均值)及非接种疫苗动物(右侧条,代表三只动物的平均值)中的ifnγ产生细胞数/百万pbmc(y轴)。
实施例
本发明包含下列实施例以证实本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解,下列实施例中所揭示的技术代表本发明者发现在实践本发明中运行良好的技术,且由此可认为构成其实践的优选方式。然而,本领域技术人员借助于本揭示内容应了解,可对所揭示特定实施例作出多种改变且仍获得相同或类似结果,此并不背离本发明的精神及范围。
实施例1:
a)通过cdv载体的cpv-vp2表达
在使用衍生自莱德利疫苗菌株且在p基因与m基因之间插入seqidno:17的序列的cdv骨架(该载体由此包括seqidno:21的序列)的活体外研究中,可展示犬细小病毒(类型2b)vp2蛋白在cdv相关荧光焦点中的细胞内表达。亦达成编码犬细小病毒类型2c(cpv-2c)vp2蛋白的相应cdv载体(亦即位于区别在于该序列编码cpvvp2)的各别结果。通过免疫荧光针对两种载体所获得的结果指示,cpv的vp2蛋白强烈表达于所有cdv感染合胞体中。与cdv抗原不同,vp2累积于感染细胞的细胞核中且部分地累积于细胞质中,其在合胞体发育过程期间有所变化且可指示,cpv-vp2具有瞬时核输送,但通过常规搜索在vp2基因内检测到并无假定核局部化序列,且亦未公开于科学文献中。
b)遗传稳定性
通过涉及冷冻-解冻循环的连续传代在每一传代结束时于vero细胞是(亦即cdv产生细胞是)中评估实施例1a)的两个cdv载体。为评价重组体的遗传稳定性,在vero细胞中实施20个连续细胞传代。重组纯是的测序揭示所插入cpvvp2序列及侧接区的全遗传稳定性。编码两种蛋白质(在氨基酸层面上)的序列(包括突变)保留不变。另外,使用免疫荧光(if)及蛋白印迹(wb)可证实,强vp2表达在所有传代数期间存在于感染cdv-vp2重组体的细胞中。
c)活体外生长
在vero细胞中生长实施例1a)及b)中所阐述的两种cdv载体。在感染后144小时达到两个重组体在滚瓶系统中的峰效价且效价在冷冻/解冻循环的后显著增加,从而指示细胞与病毒发生缔合(类似于亲代cdv病毒)。在与亲代经典cdv-mlv比较时,所生成cdv重组疫苗候选物具有生物处理可接受的极类似端效价。
总而言的,两种cdv载体皆在vero细胞中展示良好生长产生动力学,且在感染后6天于滚瓶中达到峰效价。两种载体皆展示转基因(vp2)的强表达特性,如通过if及wb所测定,且将其量化为双重cdv-cpv疫苗候选者。另外,在vero细胞中针对20个细胞传代来测试两种病毒的遗传稳定性。两种病毒皆保持完全遗传稳定,从而指示其易于进行疫苗生物处理。
实施例2:
猪中的活体内效能研究:
出于此实验的目的,在研究第0天(sd)使用1×105tcid50的实施例1编码cpv-2bvp2(cdv-vp2-2b)的重组cdv载体,对一组6只仔猪接种疫苗,并在sd21使用2×104tcid50追加接种。这两次接种均在颈部肌内(im)进行(每一剂量2ml体积)。
4只动物用作阴性对照且在颈中接种vero细胞均质物(2ml)。3只动物用作前哨且不接受任一治疗。
纳入准则:
·临床上健康且就年龄而言发育正常的猪
排除准则:
·具有如通过研究负责人或指定人员所评价干扰研究的损伤、先天性异常或临床疾病体征的猪
·具有弱身体条件(体重<5kg)的猪
将所有研究动物饲养于适用于其年龄的设施中且保持于相同控制条件下。该屋具有适用于动物年龄的平坦地板或替代地部分地多孔性地板且具有4个各自大约20m2的围栏。在接种疫苗的前,自该组取出前哨动物,饲养于单独围栏中,且在接种疫苗的后12h再分组。
出于生物安全原因,屋处于负压(-75pa)下。根据动物年龄的需求使用室温。通风速率大约为9/h。动物接受12h的>80lux光且在12h内无光。提供用于动物的环境丰富化。随意提供适当质量的水及饲料且根据猪在其年龄及标准程序下的需求来进行管控。
结果展示,cdv载体在猪宿主中以受限方式进行复制,从而靶向淋巴细胞。主要在淋巴结、脾或扁桃体中检测病毒。
另外,实施血清病毒中和测试以在测试动物中分别量测cdv及cpv的中和抗体。
在下文中,给出cdv的血清中和测试的方案:
在中和测试的前1天的细胞制备
·胰蛋白酶化高度铺满的vero细胞并将其再悬浮于适当体积的含有5%fcs的mem鹰氏培养基(earle’smedia)中
·对悬浮液中的细胞进行计数并调节至7×105个细胞/10ml/96孔板
·一个板足以用于4个试样。
·将100μl细胞悬浮液/孔接种至96孔板的所有孔中
·将板在37℃下于co2培育器中培育16-24h
血清试样的极限稀释
·使用无菌pbs以1:4预稀释试样
·将预稀释血清在56℃下灭活30分钟
·向来自第1-11行的空96孔板的每一孔中添加60μl补充有1%100×pen/strep的mem鹰氏培养基
·向第1行(a1-h1)中再添加36μl补充有1%100×pen/strep的mem鹰氏培养基
·向第1行中添加24μl热灭活血清试样(对应于1:5稀释)
(对于每一血清试样而言,将24μl添加至第1行的3个孔中以一式三份测试血清)
·通过在管柱间转移60μl来对血清实施两倍连续稀释
·重复该过程直至第11行(对应于1:5120稀释)
·自最后一行弃除60μl
cdv-病毒的稀释
·将cdv-病毒在补充有1%100×pen/strep的mem鹰氏培养基中稀释至200tcid50/100μl,计算6ml/96孔板。
血清试样与cdv-病毒的一起培育
·向96孔板的第1-11行中含有血清稀释液的所有孔中添加60μl经稀释病毒。在第11行中开始添加病毒。
·轻微搅动板并在37℃、5%co2下培育2小时
在v.d.s细胞中培育血清试样+/-cdv-病毒
·自96孔板中的1天龄v.d.s细胞去除60μl培养基
·在完成2小时培育时间的后,将每一孔的100μl血清-病毒混合物转移至v.d.s细胞板第1-11行的相应孔中
·向第12行的所有孔中添加100μl含有1%100×pen/strep的mem鹰氏培养基(=仅含细胞的对照)
·将板在37℃、5%co2下培育3天
·光显微术读数结果可观察到病毒诱导的致细胞病变效应。
cdv血清中和测试的结果呈现于图5中。所有动物在研究开始时皆并无cdv中和抗体(sd0)。在第一免疫化的后三周(sd21,在第二免疫化时),一只动物具有针对cdv的中和抗体。在第二免疫化的后21天(sd42),所有经cdv-vp2接种疫苗的动物(一只除外)皆产生显著含量的针对犬瘟热病毒的中和抗体。结合cpv血清中和测试结果(其中所有动物皆对接种疫苗具有强烈反应,包含在sd42时并无cdv中和抗体的动物)及另一正交是列测试(参照实施例3)可推断出,此一种动物成功地接种疫苗,但关于cdv的免疫反应已转变为细胞反应。
分别实施关于cpv的血清中和测试,其结果呈现于图6中。就效能而言,所有使用cdv-vp2接种疫苗的动物皆针对犬细小病毒2发生血清转化。在第2接种疫苗的后检测到中和ab效价的特定增加(参见图6)。中和抗体在第二免疫化的后21天(sd42)的含量达到1:40至1:400的值,根据文献,此含量代表真实宿主(犬科动物)中的保护效价范围(glover等人,2012;taguchi等人,2011)。
重要的是,所有前哨动物皆保持cdv及cpv血清阴性直至研究结束,从而指示重组cdv病毒并不在接种疫苗后自接种疫苗动物扩散至未接种疫苗动物。
实施例3:
h3n2-mda阳性仔猪中的免疫原性
在此研究中,采用血凝素(ha)特异性iggelisa及ifnγ-elispot分析来探究经编码swivh3的cdv载体接种疫苗的猪流感母源抗体(mda)阳性动物的体液及细胞免疫反应。
根据实施例2,对动物接种疫苗,不同的处在于:包含于cdv骨架中的嵌段具有seqidno:19的序列(因此,载体包括编码swiv的h3的seqidno:22的序列),将载体(在下文中称为cdv-h3)施用5只h3n2-mda阳性仔猪(mda+动物))及一只视为(几乎)h3n2血清阴性(或分别具有低mda)的仔猪,及使用三只仔猪作为阴性对照。
a)ha特异性iggelisa
在下文中,所用elisa方案提供如下:
使用含于ph9.6碳酸盐缓冲液中的1μg/ml重组流感血凝素蛋白(trenzyme)涂覆平底96孔板(nuncmaxisorp44-2404-21号),在4℃下过夜。第二天,弃除涂层抗原,使用洗涤缓冲液(50mmtris/0.14mnacl/0.05%tween20,ph8.0)将板洗涤5次,随后每孔使用200μl阻断缓冲液(50mmtris/0.14mnacl/1%bsa,ph8.0)在室温下培育1h。在试样/偶联物稀释剂(50mmtris/0.14mnacl/0.05%tween20/1%bsa)中制备试样稀释液。然后将100μl/孔的试样及对照物(一式两份)分配至指定孔中,将覆盖板在室温下培育1小时。使用洗涤缓冲液将板洗涤5次。然后,向每一孔中添加100μl1:100.00稀释的hrp-偶联山羊α-猪igg-h+l检测抗体(southernbiotech,目录号6050-05),且将覆盖板在室温下于暗处培育1小时。在洗涤步骤(使用洗涤缓冲液洗涤5次)的后,添加100μl/孔的tmb底物溶液(pod,现成即用;sigmat4444号),分析板在室温下于暗处培育5-15min。通过添加50μl/孔的终止溶液(2n硫酸)来停止反应且在450nm下于elisa读数仪(synergy2,biotek)上量测吸亮度。
使用此elisa,通过自研究第45天(sd45)的动物获取的试样看到,若mda的基线含量为中等(<od1.0且>od0.2),则动物针对接种疫苗具有中等反应性(动物1及5,参见图7),但动物2除外,其主要具有细胞介导的免疫反应(请参见下文)。具有低mda(<od0.2)的动物4展示高抗体反应。与的相比,具有高于od1.0的高mda含量的两只动物(动物3及6)并不展示在接种疫苗时特异性h3抗体的增加。
b)ifnγ-elispot
另外,使用elispot量测来自cdv-h3接种疫苗动物的细胞免疫反应。
在下文中,所用elispot分析的方案提供如下:
使用经纯化抗ifn-γ抗体将elispot板(96孔)涂覆至少12h。将pbmc解冻,在pbs(无钙,无镁)洗涤两次,使用台盼蓝计数,并在rpmi培养基中调节以分配为3×105个细胞/孔。在使用pbs深度洗涤含有涂层抗体的板的后,将板在37℃及5%co2下阻断至少1小时。添加含有3μg/ml多株活化剂cona(ifnγ释放的阳性对照)或含有不同浓度抗原的细胞培养基,随后接种pbmc。将仅含培养基或未刺激细胞的孔用作阴性对照。在刺激48h的后,使用水将板洗涤前两次,然后使用pbs/0.01%tween20洗涤。使用检测生物素化抗ifnγ抗体将板在室温下培育1.5h,稀释于pbs/0.01%tween20/0.1%bsa中。随后,将稀释于pbs/0.01%tween20/0.1%bsa中的链霉抗生物素蛋白(streptavidin)-碱性磷酸酶添加至板中(在暗处,培育45min)。最后,使用nbt及磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚基酯作为碱性磷酸酶的底物(显影期亦发生于暗处)。该等底物系统产生蓝色至紫色不溶性nbt二甲臢(diformazan)最终产物且可在读板仪中量测。在使用自来水深度洗涤的后,将板过夜以确保完全干燥。使用c.t.l.elispot读数仪实施斑点计数。
在分析中,使用重组h3蛋白来刺激来自使用cdv-h3重组体接种疫苗的动物的经分离pbmc。如图8中所展示,在使用两个注射接种疫苗的动物的试样(在研究第28天(sd28)获取的试样)中,检测到显著多于非接种疫苗动物的pbmc中的ifnγ产生细胞。细胞免疫性的该诱导已知可改良疫苗效能及病原体在感染后的更迅速清除。另外,经重组表达猪流感病毒的血凝素(h3)的cdv接种疫苗的动物生成显著t细胞反应,尽管在接种疫苗动物中存在强(猪流感)母体免疫性。在幼小动物中预先存在的母体免疫性的存在通常会干扰主动免疫且是幼年动物中疫苗失败的主要病因。该等发现重要地暗示了接种疫苗生物体中的cdv生物学特性,尽管存在被动存在的母体免疫性,但仍产生主动免疫性。
实施例4:
疫苗效能研究
猪流行性腹泻(ped)是可具有巨大经济影响的高度传染性猪疾病。尽管所有年龄种类的猪皆易于感染,但严重临床体征及死亡主要见于哺乳仔猪中。致病因子是ped病毒(pedv),该病毒是冠状病毒科(coronaviridae)病毒家族内的α冠状病毒(alphacoronavirus)属的包膜、单链阳性rna病毒。在欧洲,pedv首次在英格兰出现于1970年代后期。然后,其扩散至整个欧洲而引起偶发性爆发。在1990年代后期,pedv已自欧洲养猪场消失,如通过极低血清盛行率及不存在疾病报导所证实。爆发性及地方性感染仍报导于亚洲,其中该疾病高度影响工业化养猪场的生产力。自2005开始,ped病例再次报导于欧洲(亦即意大利)。在2013年极高毒性pedv引入美国的后,病例亦报导于中欧(包含德国及周边国家)。后续病例是由相关但不同的pedv菌株(所谓的s-indel菌株)引起。在德国,自2014年5月开始在哺乳猪中报导高发病率及可变致死性的病例。
在此研究中,以载体疫苗(在下文中分别称为“cdv_pedv-纤突疫苗”或“cdvpedv-纤突载体疫苗”)形式测试衍生自莱德利疫苗菌株且在p基因与m基因之间插入seqidno:38的序列(编码pedv纤突蛋白)的cdv骨架(载体由此包括seqidno:41的序列),该研究包含6头母猪及其后代。
通过靶向s-基因的rt-qpcr检查所有动物的pedv及pedv特异性抗体。在研究中仅招募阴性动物。
三个治疗组(参见下文)接收随机分配的动物:
组1(阴性对照):两头母猪(指定为1号及2号),未接种疫苗
组2(阳性对照):两头母猪(指定为3号及4号),未接种疫苗
组3(cdv_pedv-纤突):两头母猪(指定为5号及6号),使用cdv_pedv-纤突载体疫苗接种疫苗
组3的两头母猪的接种疫苗是根据下列方案进行,其中通过终点滴定定义的cdv_pedv-纤突疫苗的储积液效价(stocktiter)为7.94×104tcid50/ml:
在预计分娩日期的前9周:使两头母猪中的每一者经鼻内接受4ml疫苗(每一鼻孔2ml)
在预计分娩日期的前6周:使两头母猪中的每一者经鼻内接受4ml疫苗(每一鼻孔2ml)
在预计分娩日期的前3周:使两头母猪中的每一者经鼻内接受4ml各别疫苗(每一鼻孔2mll)且另外经肌内接受2ml。
对组1的母猪所生育的仔猪(1号母猪的13头仔猪及2号母猪的12头仔猪)经口模拟接种。使用pedv领域菌株(在下文中称为“pedveu”)在生命的4天龄时经口攻击组2(3号母猪的12头仔猪及4号母猪的14头仔猪)及组3(5号母猪的5头仔猪及6号母猪的15头仔猪)的母猪所生育的仔猪。
为接种组2及3的仔猪,使用细胞培养适应性pedveu。效价为2.15×105tcid50/ml。经口接种组2及3的仔猪。在此情形下,使用2ml注射器使每一仔猪接受1ml1:10经稀释病毒储备液(效价为2.15×104tcid50)。
使用1ml细胞培养基以2ml注射器经口模拟接种组1的仔猪。
在整个试验期间,在rt-qpcr分析中,在接种当天及在接种后(pi)第1至10天以及在接种后第14、17及20/21天获取所有动物的直肠拭子(不含培养基的copan普通拭子)。在接种的前及攻击后两天自每一母猪的4头仔猪获取其他直肠拭子以用于细菌学检验。此外,使用确立的标准化累积评分系统每天记录指示ped的临床体征(参见下文)。在接种的日及接种后第14及20/21天(试验末日)或在各别动物的安乐死或死亡的日获取血样。
临床监测
使用确立的累积临床评分来每天监测指示ped的临床体征(参见下表)。
表1:指示ped的临床体征的累积临床评分
试样制备及核酸萃取
将直肠拭子浸没于1ml达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)中并在室温下培育1小时。使用qiampviralrnamini试剂盒(qiagen)或nucleomagvet-kit与kingfisher萃取平台的组合萃取病毒rna。将rna储存于-20℃下直至进一步使用。
将试样在室温下以2031×g离心20min以获得血清。等分所得血清并储存于-20℃下。
病毒检测
为检测pedv脱落,使用靶向pedv的s-基因的rt-qpcr-系统,如先前所阐述(stadler等人,bmcvetres.11:142(2015))。测试获取于接种后第0至7天及接种后第10及20/21天的试样的pedv-基因组。使用内部标准来计算基因组拷贝量/μl。
抗体检测
使用所有血清根据生产商手册来实施商业间接elisa(ingezimpedv,ingenasa,madrid,spain)。
细菌学
在接种后第0及2天获取每窝4头仔猪的粪便拭子以用于差异细菌学分析。
统计学
使用shapiro-wilk测试来进行常态性测试且实施mann-whitney秩和测试(如在软件包装中所实施)。使用sigmaplot软件测试统计学显著性。
结论
血清中的抗体检测:
cdv组的所有仔猪皆在攻击接种的前因抗体阳性初乳摄入而在elisa(检测针对pedv纤突蛋白的抗体)中展示阳性结果,而阳性及阴性对照组的所有动物皆展示明确阴性结果。
在接种后第14天,阳性对照组中的所有仔猪(三头除外)发生血清转化,而疫苗组中的所有动物皆在血清试样中展示较高量的pedv特异性igg。
在研究结束时,cdv组及阳性对照组的所有仔猪皆在elisa中展示强烈阳性结果。阴性对照中的动物在整个试验期间皆不发生血清转化。
在另一研究中亦可看到,在经由鼻内途径仅向母猪接种疫苗两次时,同样达成各别抗体结果。
细菌学:
获取于接种后第0及2天的粪便拭子不展示任一病原性细菌。细菌菌群在感染时并不发生显著变化。
临床体征:
阳性对照组(组2)的仔猪在7天内明确展示指示pedv的临床体征,其中首先在24hpi时发生呕吐且随后发生腹泻。因严重脱水及临床评分值超过6(人道终点),26头仔猪中的8头必须实施安乐死。可在36hpi时检测到指示pedv的第一临床体征。
总而言的,cdv载体接种疫苗及pedv攻击仔猪(组3)关于一般行为的临床体征优选,且组3中的20猪中仅2头(10%)因严重脱水及临床评分值超过6必须实施安乐死(与的相比,组2的仔猪为31%)。
阴性对照中的动物在整个试验期间保持健康。
病毒脱落:
可在攻击组之间检测到病毒脱落的明确差异。在接种后第1天,所有经攻击仔猪针对直肠拭子中的病毒基因组皆为阳性,但cdv-pedv接种组中的动物显示显著降低的pedv基因组拷贝数(平均ct值32,79),而在攻击组(平均ct值26,65)。
同样,而在接种后接下来5天,cdv组的直肠拭子中的基因组负荷极类似于阳性对照,自接种后第7天开始,通过接种疫苗母猪保护的仔猪中的病毒基因组的可检测量下降到阈值之下,而阳性对照组中的所有动物仍脱落pedv。
在阴性对照组的拭子中不能检测到pedv基因组。
总而言的,研究结果表明,与阳性对照相比,由经cdvpedv-纤突重组疫苗接种疫苗的母猪所生的仔猪展示减少的临床体征,且特定而言,发现可在pedv攻击后大大改良仔猪的死亡率/致命性。此外,在pedv攻击后病毒脱落显著降低。
根据本揭示内容无需过多实验即可获得并实施本文所揭示及主张的所有组合物及方法。尽管本发明的组合物及方法已根据优选实施例予以阐述,但本领域技术人员应明了,可改变该等组合物及方法及本文所阐述方法的步骤或步骤的顺序,此并不背离本发明的概念、精神及范围。更特定而言,应明了,某些在化学及生理上皆相关的试剂可代替本文所阐述试剂且同时可达成相同或类似结果。本领域技术人员显而易见的所有该等类似替代物及修改皆视为涵盖于由随附申请专利范围所界定的本发明的精神、范围及概念内。
本文亦公开下列条款:
1.一种表达盒,其用于插入副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒的两个相邻必需基因(1;2)之间,从而该第一基因(1)位于该表达盒的3′方向上且该第二基因(2)位于5′方向上,其中该表达盒包括
-第一核苷酸序列,其中该第一核苷酸序列是所关注核苷酸序列,及
-第二核苷酸序列,其侧接于该第一核苷酸序列的5′端,其中该第二核苷酸序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除该第一基因(1)外的必需基因组成的群,及
-第三核苷酸序列,其侧接于该第一核苷酸序列的3′端,其中该第三核苷酸序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群。
2.如条款1的表达盒,其中该表达盒由以下组成:
-该第一核苷酸序列,及
-该第二核苷酸序列,及
-该第三核苷酸序列,及
-另一核苷酸序列,其侧接于该第二核苷酸序列的5′端或侧接于该第三核苷酸序列的3′端,其中该另一核苷酸序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。
3.如条款1或2的表达盒,其中该第三核苷酸序列由以下组成:
-选自由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的3′非编码区,及
-侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中侧接于该3′非编码区的该5′端的该序列编码用于开始或增强翻译的共有序列,且其中该用于开始或增强翻译的共有序列视情况是kozak序列。
4.如条款1至3中任一项的表达盒,其中副粘病毒科病毒的该两个相邻基因(1;2)是选自由副粘病毒科病毒的必需基因组成的群,和/或
其中副粘病毒科病毒的其他必需基因是
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、h及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、hn及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、g及l基因。
5.如条款1至4中任一项的表达盒,其用于插入副粘病毒科病毒的该p基因与该m基因之间,其中
-该由副粘病毒科病毒中除该第一基因(1)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的该p基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的n、m、f、h及l基因组成的群,且
-该由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的该m基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的h、p、f、l及n基因组成的群。
6.如条款1至5中任一项的表达盒,其中
-该第二核苷酸序列是选自副粘病毒科病毒中位于该表达盒的3′方向上的必需基因的基因的5′非编码区,不包含该第一基因(1)的5′非编码区,和/或
-该第三核苷酸序列包括副粘病毒科病毒中位于该表达盒的5′方向上的必需基因的3′非编码区或由其组成,不包含该第二基因(2)的3′非编码区。
7.如条款1至6中任一项的表达盒,其中该第一核苷酸序列可操作地连接至该第三核苷酸序列中所包含的基因起始(gs)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。
8.如条款1至7中任一项的表达盒,其中该核苷酸序列是rna序列。
9.一种副粘病毒科病毒载体,其包括如条款1至8中任一项的表达盒。
10.如条款1至8中任一项的表达盒或如条款9的副粘病毒科病毒载体,其中
-该5′非编码区是副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区,和/或
-该3′非编码区是副粘病毒科病毒的h基因的3′非编码区,
和/或其中该表达盒插入副粘病毒科病毒的p基因与m基因之间。
11.一种副粘病毒科病毒载体,其包括插入副粘病毒科病毒的两个相邻必需基因(1;2)之间的rna序列,该插入使得该第一基因(1)位于该插入rna序列的3′方向上且该第二基因(2)位于5′方向上,且其中该插入rna序列包括以下或由其组成:
-第一rna序列,其中该第一rna序列是所关注核苷酸序列,及
-第二rna序列,其侧接于该第一rna序列的5′端,其中该第二rna序列是基因的5′非编码区,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除该第一基因(1)外的必需基因组成的群,及
-第三rna序列,其侧接于该第一rna序列的3′端,其中该第三rna序列包括基因的3′非编码区或由其组成,其中该基因是选自由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群。
12.如条款11的副粘病毒科病毒载体,其中该第三rna序列由以下组成:
-选自由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的3′非编码区,及
-侧接于该3′非编码区的5′端的序列,其中侧接于该3′非编码区的该5′端的该序列编码用于开始或增强翻译的共有序列,且其中该用于开始或增强翻译的共有序列视情况是kozak序列。
13.如条款11或12的副粘病毒科病毒载体,其进一步包括
-第四rna序列,其侧接于该第二rna序列的5′端,其中该第四rna序列是副粘病毒科病毒的基因间序列,和/或
-第五rna序列,其侧接于该第四rna序列的3′端,其中该第五rna序列是副粘病毒科病毒的基因间序列。
14.如条款11至13中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中副粘病毒科病毒的该两个相邻基因(1;2)是选自由副粘病毒科病毒的必需基因组成的群,和/或
其中副粘病毒科病毒的其他必需基因是
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、h及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、hn及l基因,或
-副粘病毒科病毒的n、p、m、f、g及l基因。
15.如条款11至14中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中副粘病毒科病毒的该两个相邻必需基因(1;2)是副粘病毒科病毒的该p基因及该m基因,且其中
-该由副粘病毒科病毒中除该第一基因(1)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的该p基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的n、m、f、h及l基因组成的群,且
-该由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群是由副粘病毒科病毒中除副粘病毒科病毒的该m基因外的必需基因组成的群,且其中该基因视情况选自由副粘病毒科病毒的h、p、f、l及n基因组成的群。
16.如条款11至15中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中
-该第二核苷酸序列是选自副粘病毒科病毒中位于该表达盒的3′方向上的必需基因的基因的5′非编码区,不包含该第一基因(1)的5′非编码区,和/或
-该第三核苷酸序列包括副粘病毒科病毒中位于该表达盒的5′方向上的必需基因的3′非编码区或由其组成,不包含该第二基因(2)的3′非编码区。
17.如条款11至16中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中
-该5′非编码区是副粘病毒科病毒的n基因的5′非编码区,和/或
-该3′非编码区是副粘病毒科病毒的h基因的3′非编码区。
18.如条款11至17中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中
该第一rna序列可操作地连接至该第三rna序列中所包含的基因起始(gs)序列和/或副粘病毒科病毒的基因组启动子。
19.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该副粘病毒科病毒是麻疹病毒(morbillivirus)属病毒,且其中该麻疹病毒病属毒优选地选自由以下组成的群:犬瘟热病毒(cdv)、猫麻疹病毒(femv)及小反刍兽疫病毒(pprv),且其中该麻疹病毒属病毒最佳是犬瘟热病毒(cdv)。
20.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该副粘病毒科病毒是cdv,且其中cdv基因的该5′非编码区是选自由以下组成的群:
cdv的n基因的5′非编码区,其中cdv的n基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:1的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的p基因的5′非编码区,其中cdv的p基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:2的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的m基因的5′非编码区,其中cdv的m基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:3的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的f基因的5′非编码区,其中cdv的f基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:4的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的h基因的5′非编码区,其中cdv的h基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:5的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,及
cdv的l基因的5′非编码区,其中cdv的l基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:6的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
21.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该副粘病毒科病毒是cdv,且其中cdv基因的该3′非编码区是选自由以下组成的群:
cdv的h基因的3′非编码区,其中cdv的h基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:7的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的n基因的3′非编码区,其中cdv的n基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:8的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的p基因的3′非编码区,其中cdv的p基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:9的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的m基因的3′非编码区,其中cdv的m基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:10的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,
cdv的f基因的3′非编码区,其中cdv的f基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:11的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,及
cdv的l基因的3′非编码区,其中cdv的l基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:12的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
22.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该第二核苷酸序列或该第二rna序列是cdv的n基因的该5′非编码区,且其中cdv的n基因的该5′非编码区优选地由与seqidno:1的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
23.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中
-选自由副粘病毒科病毒中除该第二基因(2)外的必需基因组成的群的基因的该3′非编码区是cdv的h基因的该3′非编码区,且其中cdv的h基因的该3′非编码区优选地由与seqidno:7的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,和/或
-该侧接于该3′非编码区序列的该5′端的序列编码长5至8个核苷酸的kozak序列,且其中该kozak序列优选地由与seqidno:13的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同rna序列组成或包括该序列。
24.如条款2至8及19至23中任一项的表达盒或如条款9及13至23中任一项的副粘病毒科病毒载体,其中副粘病毒科病毒的该基因间序列是cdv的基因间序列,且cdv的其中该基因间序列优选地由与seqidno:14的序列至少66%相同的rna序列组成或包括该序列。
25.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列是所关注基因或抗原编码序列,和/或其中该所关注核苷酸序列是非天然和/或重组序列。
26.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列是重组和/或异源性和/或外源性序列。
27.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列编码来自致病原的抗原,其中该致病原优选是能够感染宠物动物、例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物或能够感染产食性动物、例如猪或牛的致病原。
28.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中
-该副粘病毒科病毒是能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒,且
-该所关注核苷酸序列编码来自能够感染该第一生物科的动物的致病原的抗原,且其中该致病原优选地不同于该副粘病毒科病毒,
且其中该第一生物科的该动物优选地选自由以下组成的群:犬科动物、猫科动物及猪科动物,且其中该第一生物科的该动物最佳是犬类、猫类或猪类,例如狗、猫或猪。
29.如条款28的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中
-该能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒是cdv且
–该能够感染该第一生物科的动物的致病原是犬细小病毒(cpv),
或其中
-该能够感染第一生物科动物的副粘病毒科病毒是拉帕丹密考克墨西哥病毒(lapiedadmichoacánmexicovirus,lpmv),且
-该能够感染该第一生物科的动物的致病原是猪流感病毒(swiv)或猪流行性腹泻病毒(pedv)。
30.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列编码来自犬细小病毒(cpv)、猫细小病毒(fpv)、猪流感病毒(swiv)或猪流行性腹泻病毒(pedv)的抗原。
31.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列编码
-原小病毒(protoparvovirus)衣壳蛋白,且其中该原小病毒衣壳蛋白优选地选自由以下组成的群:肉食性动物原小病毒1(cpv或fpv)衣壳蛋白、灵长类动物原小病毒1衣壳蛋白、啮齿类动物原小病毒1衣壳蛋白、啮齿类动物原小病毒2衣壳蛋白、有蹄动物细小病毒1(ppv)衣壳蛋白;或
--流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素和/或其中该流感病毒视情况选自由以下组成的群:流感a病毒、流感b病毒及流感c病毒,且其中该流感a病毒优选地选自流感病毒h3n2、h3n1、h1n1、h1n2、h2n1、h2n3及h911的群;或
-冠状病毒纤突(s)蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白优选地选自由以下组成的群:羊驼冠状病毒(alpacacoronavirus)s蛋白、α冠状病毒(alphacoronavirus)1s蛋白、人类冠状病毒(humancoronavirus)229es蛋白、人类冠状病毒nl63s蛋白、猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)s蛋白、人类冠状病毒oc43s蛋白、人类冠状病毒hku1s蛋白、鼠类冠状病毒(murinecoronavirus)s蛋白、严重急性呼吸症候群相关冠状病毒(severeacuterespiratorysyndrome-relatedcoronavirus,sars-cov)s蛋白、中东呼吸症候群相关冠状病毒(middleeastrespiratorysyndrome-relatedcoronavirus,mers-cov)s蛋白及禽感染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,ibv)s蛋白。
32.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列编码
-犬细小病毒(cpv)vp2蛋白,且其中该cpvvp2蛋白优选地包括与seqidno:35的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成;或
-h3-亚型血凝素(h3),尤指猪流感病毒的h3,且其中该h3优选地包括与seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成;或
-猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突(s)蛋白,且其中该pedvs蛋白优选地包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成。
33.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该所关注核苷酸序列编码
-犬细小病毒(cpv)vp2蛋白,且其中该编码cpvvp2蛋白的序列优选地由与seqidno:15的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列;或
-h3-亚型血凝素(h3),优选地猪流感病毒的h3,且其中该编码h3的序列优选地由与seqidno:16的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列;或
-猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突(s)蛋白,且其中该编码pedvs蛋白的序列优选地由与seqidno:37或seqidno:38的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
34.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,其中该表达盒由以下组成或该副粘病毒科病毒载体包括以下:
-具有与seqidno:17或seqidno:18的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸;或
-具有与seqidno:19或seqidno:20的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸;或
-具有与seqidno:39或seqidno:40的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列的多核苷酸。
35.如前述条款中任一项的副粘病毒科病毒载体,其包括
-与seqidno:21的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列;或
-与seqidno:22的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列;或
-与seqidno:41的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列。
36.如条款13至35中任一项的副粘病毒科病毒载体,其进一步包括
-第六rna序列,其侧接于该第四rna序列的5′端,其中该第六rna序列由与seqidno:23的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列,和/或
-第七rna序列,其侧接于该第五rna序列的3′端,其中该第七rna序列由与seqidno:24的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
37.一种cdv载体,其包括所关注异源性核苷酸序列,其中该所关注异源性核苷酸序列编码犬细小病毒(cpv)vp2蛋白。
38.如条款37的cdv载体,其中该编码cpvvp2蛋白的所关注异源性核苷酸序列由与seqidno:15的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的rna序列组成或包括该序列。
39.如条款37或38的cdv载体,其中该cpvvp2蛋白包括与seqidno:35的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成。
40.如条款37至39中任一项的cdv载体,其中
-该所关注异源性核苷酸序列位于cdv的p基因与m基因之间;和/或
-该所关注异源性核苷酸序列可操作地连接至位于该异源性rna序列的3′方向上的基因起始(gs)序列和/或cdv的基因组启动子。
41.如条款40的cdv载体,其中该gs序列包含于cdv基因的外源性3′非编码区中,且其中cdv基因的该外源性3′非编码区优选地侧接于该所关注异源性核苷酸序列的3′端,和/或
其中该所关注异源性核苷酸序列是所关注rna序列。
42.一种核酸分子,其编码如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体,且其中该核酸分子优选是dna分子。
43.如条款42的dna分子,尤指dna分子,其中该分子包括
(i)编码所关注多肽的dna序列,
(ii)侧接于(i)中序列的3′端且与seqidno:25的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,
(iii)侧接于(i)中序列的5′端且与seqidno:26的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,及
(iv)侧接于(iii)中序列的5′端且与seqidno:27的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
44.如条款43的dna分子,其进一步包括
(v)侧接于(ii)中序列的5′端且与seqidno:28的序列至少66%相同的dna序列,和/或
(vi)侧接于(iv)中序列的3′端且与seqidno:28的序列至少66%相同的dna序列。
45.如条款44的dna分子,其进一步包括
(vii)侧接于(v)中序列的3′端且与seqidno:29的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,和/或
(viii)侧接于(vi)中序列的5′端且与seqidno:30的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
46.如条款42至45中任一项的dna分子,其中(i)的该序列是
-编码犬细小病毒(cpv)vp2蛋白的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:31的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列,或
-编码h3-亚型血凝素(h3),优选地猪流感病毒的h3的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:32的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列;或
-编码pedvs蛋白的dna序列,且其中该序列优选是与seqidno:41的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
47.如条款42至46中任一项的dna分子,其中该dna分子包括
-与seqidno:33的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列;或
-与seqidno:34的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列;或
-与seqidno:42的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的dna序列。
48.一种哺乳动物宿主细胞,其含有如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体或dna酸分子。
49.如前述条款中任一项的表达盒或副粘病毒科病毒载体或核酸分子,其用作药剂,优选地作为疫苗。
50.一种dna构建体,其包括如条款42至47中任一项的dna分子。
51.一种rna转录物,其是如条款50的dna构建体的rna转录物。
52.一种细胞,其经如条款50的dna构建体转染。
53.一种细胞,其经如条款51的dna转录物转染。
54.一种制备含有异源性基因的感染性副粘病毒科病毒,尤指制备如条款9至41中任一项的副粘病毒科病毒载体的方法,其中该方法包括以下步骤:
a.提供表达异源性rna聚合酶的宿主细胞;
b.使用如条款50的dna构建体转染该宿主细胞,且其中该dna分子是通过异源性rna聚合酶转录,及
c.分离该等细胞所产生的病毒。
55.一种如条款9至41中任一项的载体或如条款48、52及53中任一项的细胞,其用于制造免疫原性组合物或疫苗。
56.一种免疫原性组合物,其包括:
如条款9至41中任一项的载体,其中该载体视情况是感染性和/或减毒病毒或该载体视情况是减毒和/或经修饰活病毒,及视情况
由该载体表达的重组蛋白和/或包括多个由该载体表达的重组蛋白的病毒样颗粒,及视情况
医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,其中该载剂优选地适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加。
57.如条款56的免疫原性组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是
-细小病毒vp2抗原,例如cpvvp2蛋白,或
-流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素,例如h3。
58.如条款56或57的免疫原性组合物,其包括以下或由其组成:
如条款37至41中任一项的cdv载体,且其中该载体优选是如条款19至36中任一项的载体,及视情况
多肽或重组蛋白,其包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成,及视情况
医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,其中该载剂优选地适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加。
59.如条款56或57的免疫原性组合物,其包括以下或由其组成:
如条款19至36中任一项的载体,且其中该cdv载体优选是如条款37至41中任一项的载体,及视情况
由该载体表达的重组蛋白,其中该重组蛋白包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成,及视情况
医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,其中该载剂优选地适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加。
60.如条款56的免疫原性组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是冠状病毒s蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白视情况是pedvs蛋白。
61.如条款56或60的免疫原性组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
62.一种疫苗或医药组合物,其包括
a.如条款9至41中任一项的载体,及
b.由该载体表达的重组蛋白和/或包括多个由该载体表达的重组蛋白的病毒样颗粒,及
c.医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,优选地该载剂适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加,且
d.视情况该疫苗进一步包括佐剂。
63.如条款62的疫苗或医药组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是
-细小病毒vp2抗原,例如cpvvp2蛋白,或
-流感病毒包膜蛋白,其中该包膜蛋白视情况是血凝素,例如h3。
64.如条款62或63的疫苗或医药组合物,其包括以下或由其组成:
a.如条款37至41中任一项的cdv载体,且其中该载体优选是如条款19至36中任一项的载体,及
b.多肽或重组蛋白,其包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成,及
c.医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,优选地该载剂适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加,
d.及视情况选用的佐剂。
65.如条款62或63的疫苗或医药组合物,其包括以下或由其组成:
a.如条款19至36中任一项的cdv载体,且其中该载体优选是如条款37至41中任一项的载体,及
b.由该载体表达的重组蛋白,其中该重组蛋白包括与seqidno:35或seqidno:36的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成,及
c.医药或兽医学可接受的载剂或赋形剂,优选地该载剂适于口服、真皮内、肌内或鼻内施加,
d.及视情况选用的佐剂。
66.如条款62的疫苗或医药组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是冠状病毒s蛋白,且其中该冠状病毒s蛋白视情况是pedvs蛋白。
67.如条款62或66的疫苗或医药组合物,其中由该载体表达的该重组蛋白是包括与seqidno:45的序列至少70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列或由其组成的pedvs蛋白。
68.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其中该载体是如条款27的载体。
69.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其中该载体是如条款28的载体。
70.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其中该载体是如条款29的载体。
71.一种制备用于减小一或多种与感染有关或由其引起的临床体征的发生率或严重程度的免疫原性组合物或疫苗的方法,其包括下列步骤:
a.使用如条款9至41中任一项的载体感染哺乳动物宿主细胞,
b.在适宜条件下培养该等感染细胞,
c.收集感染细胞培养物,
d.视情况纯化步骤c)的该等所收集感染细胞培养物,
e.视情况混合该所收集感染细胞培养物与医药上可接受的载剂。
72.如条款71的方法,其中该免疫原性组合物或该疫苗减小了,特别是在动物中,一或多种与以下因素有关或由其引起的临床体征的严重程度:
-犬瘟热病毒(cdv)和/或犬细小病毒(cpv)的感染,或
-流感病毒的感染,其中该流感病毒视情况选自由以下组成的群:流感a病毒、流感b病毒及流感c病毒,且其中该流感a病毒优选地选自流感病毒h3n2、h3n1、h1n1、h1n2、h2n1、h2n3及h911的群,或
-冠状病毒感染,其中该冠状病毒视情况选自由以下组成的群:羊驼冠状病毒、α冠状病毒1、人类冠状病毒229e、人类冠状病毒nl63、猪流行性腹泻病毒(pedv)、人类冠状病毒oc43、人类冠状病毒hku1、鼠类冠状病毒、严重急性呼吸症候群相关冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸症候群相关冠状病毒(mers-cov)及禽感染性支气管炎病毒(ibv)。
73.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如62至67条款中任一项的疫苗或医药组合物,其用于减少或预防动物中通过至少一种病原体的感染引起的临床体征或疾病的方法中,或用于治疗或预防动物的至少一种病原体感染的方法中,优选地该动物是宠物动物、例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物或产食性动物、例如猪。
74.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其用于条款73,其中至少一种病原体的该感染是
-cdv和/或cpv的感染,或
-猪流感病毒的感染,其中该猪流感病毒视情况是亚型h3流感病毒,且其中该亚型h3流感病毒优选是亚型h3n2或h3n1的猪流感病毒,或
-pedv感染。
75.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或疫苗或如条款62至67中任一项的医药组合物,其用于以下方法中:
诱导动物,优选地犬中的针对cpv及cdv的免疫反应,或
诱导猪中的针对猪流感病毒的免疫反应,其中该猪流感病毒视情况是亚型h3流感病毒,且其中该亚型h3流感病毒优选是亚型h3n2或h3n1的猪流感病毒,或
诱导猪、尤佳地怀孕母猪中的针对pedv的免疫反应。
76.如条款56、60及61中任一项的免疫原性组合物或如条款62、66及67中任一项的疫苗或医药组合物,其用于减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法中,其中该仔猪拟通过已施用免疫原性组合物的母猪来哺乳。
77.如条款76的应用免疫原性组合物,其中该已施用免疫原性组合物的母猪是在该母猪已怀孕,尤指怀有该仔猪的同时已施用免疫原性组合物的母猪。
78.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其用于条款73至77中的任一者,其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物拟经黏膜,优选地经鼻内来施用。
79.如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物,其用于条款75至77中的任一者,其中该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物拟经黏膜,优选地经鼻内施用该母猪。
80.一种针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对该动物实施免疫的方法,该动物是例如宠物动物、例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物或产食性动物、包含猪,该方法包括向该动物施用如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗或医药组合物的步骤,其中该免疫原性组合物或疫苗不会引起感染的临床体征,但能够诱导针对病原性形式的该至少一种病原体使该动物免疫化的免疫反应。
81.如条款80的方法,
其中该至少一种病原体是cdv或cpv或swiv或pedv,或
其中该至少一种病原体是cdv及cpv。
82.一种在母猪中诱导产生pedv特异性抗体的方法,其中该方法向该母猪包括施用如条款56、60及61中任一项的免疫原性组合物或如条款62、66及67中任一项的疫苗或医药组合物。
83.一种减少或预防仔猪中由pedv感染引起的临床体征或疾病的方法,其中该方法包括
-向母猪施用如条款56、60及61中任一项的免疫原性组合物或如条款62、66及67中任一项的疫苗或医药组合物,及
-使该仔猪由该母猪哺乳。
84.如条款83的方法,其中该母猪是正怀孕,尤指怀有该猪的母猪。
85.如条款83或84的方法,其包括以下步骤:
-向怀有该仔猪的母猪施用如条款56、60及61中任一项的免疫原性组合物或如条款62、66及67中任一项的疫苗或医药组合物,
-使该母猪生下该仔猪,及
-使该仔猪由该母猪哺乳。
86.如条款82至85中任一项的方法,其中将该免疫原性组合物或该疫苗或医药组合物经黏膜,优选地经鼻内施用该母猪。
87.一种试剂盒,其用于在动物中针对至少一种病原体诱导免疫反应,或用于针对与至少一种病原体有关的疾病对动物,优选地宠物动物、例如犬或猫和/或任一其他家畜或野生肉食性动物或食用动物、例如猪或牛接种疫苗和/或减小动物中与至少一种病原体有关或由其引起的一或多种临床体征的发生率或严重程度,该试剂盒包括:
a)注射器或分配器,其能够向该动物施用疫苗;及
b)如条款56至61中任一项的免疫原性组合物或如条款62至67中任一项的疫苗,及
c)视情况选用的说明书,
且其中该至少一种病原体优选是cdv和/或cpv
或其中该至少一种病原体视情况是swiv或pedv。
88.如条款71或72的方法、如条款73至79中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物、如条款80至86中任一项的方法或如条款87的试剂盒,其中该免疫原性组合物是如条款68的免疫原性组合物,且其中该至少一种病原体是由该所关注核苷酸序列编码的抗原所来自的该致病原。
89.如条款71或72的方法、如条款73至79中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物、如条款80至86中任一项的方法或如条款87的试剂盒,其中该免疫原性组合物是如条款69的免疫原性组合物,且其中该至少一种病原体是该副粘病毒科病毒且由该所关注核苷酸序列编码的抗原是来自该致病原。
90.如条款71或72的方法、如条款73至79中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物、如条款80至86中任一项的方法或如条款87的试剂盒,其中该免疫原性组合物是如条款70的免疫原性组合物,且其中该至少一种病原体是该副粘病毒科病毒且由该所关注核苷酸序列编码的抗原是来自该致病原。
91.如条款71或72的方法、如条款73至79中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物、如条款80至86中任一项的方法或如条款87的试剂盒,其中该免疫原性组合物是如条款70的免疫原性组合物,且其中该至少一种病原体是cdv及cpv。
92.如条款72、80、81及88至91中任一项的方法,其中该动物是犬,且其中该犬优选是狗。
93.如条款72、80、81及88至91中任一项的方法,其中该动物是猫类,且其中该猫类优选是猫。
94.如条款73至75及88至91中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物,其中该动物是犬,且其中该犬优选是狗。
95.如条款73至75及88至91中任一项的免疫原性组合物或疫苗或医药组合物,其中该动物是猫类,且其中该猫类优选是猫。
96.如条款87及88至91中任一项的试剂盒,其中该动物是犬,且其中该犬优选是狗。
97.如条款87及88至91中任一项的试剂盒,其中该动物是猫类,且其中该猫类优选是猫。
参考文献
下列参考文献以提供实施例性程序或其他补充本文所阐述者的细节的程度明确地以引用方式并入本文中。
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